DE3586972T2

DE3586972T2 - Gereinigtes interleukin-1.

Info

Publication number: DE3586972T2
Application number: DE8585301752T
Authority: DE
Inventors: Douglas P Cerretti; Iii Paul J Conlon; David J Cosman; Kenneth H Grabstein; Thomas P Hopp; Shirley R Kronheim; Alf D Larsen; Carl J March; Virginia L Price
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Cistron Biotechnology Inc
Priority date: 1984-06-19
Filing date: 1985-03-13
Publication date: 1993-07-08
Anticipated expiration: 2005-03-14
Also published as: EP0456332B1; DE3586972D1; ATE195344T1; DK37293A; EP0165654B1; IE850614L; CA1341433C; AU579142B2; JP3009381B2; JP3217698B2; JPH09118697A; NZ211386A; CA1340978C; AU3986385A; EP0165654A2; DE3588224D1; DK37293D0; DK110485A; JPH10279598A; EP0165654A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Interleukin-1 (im folgenden /IL-1.) und insbesondere gereinigtes IL-1 und ein Verfahren zur Reinigung von IL-1 bis zur Homogenität IL-1, das formal in der Literatur als /Lymphocyt-aktivierender Faktor. oder /LAF. bekannt ist, ist ein Hormon, das im Laufe einer Immun-Ansprechreaktion von Makrophagen produziert wird. Dieser Proteinfaktor reguliert einen breiten Bereich von immunologischen und nicht-immunologischen Ansprechreaktionen. Zum Beispiel geht man davon aus, daß IL-1 als Mittler für Aktivitäten, die als endogenes oder Leukozyten-Pyrogen, B-Zellen aktivierender Faktor (BAF), Epidermiszellenthymozyt aktivierender Faktor (ETAF), endogener Leukozytenmittler (LEM), bei der rheumatoiden Artrithis aktiver Knochenresorptionsfaktor bezeichnet werden, und eine Vielfalt anderer Aktivitäten dient. Als solcher ist IL-1 für die therapeutische Vermittlung von Immun-Ansprechreaktionen, die hier so definiert sind, daß sie die obigen Aktivitäten einschließen, vielversprechend.
Obwohl Forscher viele der biologischen Eigenschaften von IL-1 identifiziert haben, wird die chemische Natur dieses Hormons nicht gut verstanden. Bis heute ist dies wenigstens teilweise durch die Unzugänglichkeit von ausreichenden Mengen an IL-1 in gereinigter Form, um die erforderlichen Untersuchungen durchzuführen, behindert worden.
In der Vergangenheit sind Versuche gemacht worden, sowohl aus Menschen als auch aus Mäusen gewonnenes IL-1 zu reinigen und teilweise zu charakterisieren. Zum Beispiel berichtete Mizel, 122 J. Immunol. 2167-2172 (1979) von der Herstellung von Mäuse-IL-1 aus der Makrophagen-Zellinie P388D&sub1;. Das IL-1 aus der Kulturflüssigkeit wurde einer Fällung mit Ammoniumsulfat, einer Säulenchromatographie mit Diethylaminoethyl (/DEAE.) -Cellulose, einer Ultrafiltration und einer Sephacryl S200-Säulenchromatographie unterzogen. Man fand, daß die resultierenden aktiven Fraktionen ein Molekulargewicht im Bereich von 12000 bis 16000 Dalton aufwiesen. Durch Isoelektrofokusierung ("IEF") in Polyacrylamidgelen fand man, daß der pI des IL-1 im Bereich von 5,0 bis 5,4 lag.
In einer anschließenden Mitteilung diskutierten Mizel et al., 126 J. Immunol. 834-837 (1981) die Reinigung von IL-1 aus derselben P388D&sub1;-Zellinie, die in Mizel, oben, verwendet wurde, bis zur "offensichtlichen Homogenität" durch Fällung mit Ammoniumsulfat, Phenyl-Sepharose-Chromatographie, Ultrogel AcA54- Gelfiltrationschromatographie und präparative Flachbett-IEF. Man fand, daß das resultierende IL-1 einen pI von etwa 4,9 bis 5,1 und ein Molekulargewicht von etwa 14000 Dalton aufwies.
Blyden et al., 118 J. Immunol., 1631-1638 (1977), beschrieben ein Protokoll für die Konzentrierung von IL-1, das durch Sephadex G-100-Säulenchromatographie aus peripheren Human-Blutleukozyten hergestellt worden war. Es wurde berichtet, daß dieses Verfahren in einer vier- bis fünffachen Konzentrierung des rohen IL-1 resultierte. DEAE-Bio-Gel A-Anionenaustauschchromatographie wurde eingesetzt, um das Albumin aus dem während der Herstellung des rohen IL-1 eingesetzten Serum zu entfernen. Daraufhin wurden die gesammelten aktiven Fraktionen an einer Hydroxyapatitsäule adsorbiert und dann auf ein CM-Bio-Gel-A-kationisches Austauscherharz aufgegeben. Die Forscher berichteten, daß durch diese Verfahren etwa 20% des ursprünglichen IL-1 wiedergewonnen wurden. Man fand, daß das resultierende IL-1 ein Molekulargewicht von etwa 13000 Dalton und einen pI von etwa 6,8 bis 7,2 aufwies.
Aus Human-Leukozyten von Togawa et al., 122, J. Immunol. 2112-2118 (1979) hergestelltes rohes IL-1 wurde zunächst durch Membranfiltration verarbeitet und dann auf eine Bio-Gel-P-100-Chromatographiesäule aufgegeben, was zwei Hauptmaxima der Aktivität offenbarte, eines im Bereich von 12000 bis 22000 Dalton und ein weiteres im Bereich von etwa 50000 bis 70000 Dalton. Aktive Fraktionen im Bereich des niedrigeren Molekulargewichts wurden zusammengegeben und dann auf eine Blue Sepharose-Säule, eine DEAE-Cellulos-Ionenaustauschchromatographiesäule und eine Hydroxylapatit-Chromatographiesäule aufgegeben. Togawa et al. entdeckten, daß wenn die niedrigermolekulare IL-1-Aktivität, die aus jedem dieser Verfahren resultierte, mit 2%igem Humanserum rekonstituiert, konzentriert und erneut an Bio-Gel-P-100 chromatographiert wurde, ein merklicher Teil der höhermolekularen Aktivität erschien.
Lachman, 42 Federation Proceedings 2639-2645 (1983) berichteten von der Herstellung von IL-1 aus peripheren Blutmonozyten oder leukämischen Zellen, die von Patienten mit akzuter monozytischer Leukämie oder akuter myelomonozytischer Leukämie erhalten worden waren. Hohlfaser-Diafiltration und Ultrafiltration wurden eingesetzt, um eine niedrigermolekulare Aktivität vom Großteil der Serumproteine abzutrennen. Diese Aktivität mit niedrigerem Gewicht wurde einer IEF in einem Ampholin- und Saccharosegradienten unterzogen. Als Ergebnis dieses Verfahrens wurde gefunden, daß die IL-1-Aktivität einen pI von etwa 6,8 bis 7,2 und ein Molekulargewicht von etwa 11000 Dalton aufwies. Lachman berichtete, daß die Gesamt-Rückgewinnung von IL-1-Aktivität aus den obigen Verfahren schlecht war, im Bereich von etwa 4%.
Die Zugänglichkeit von adäquaten Mengen an homogenem Human-IL-1 könnte bei Untersuchungen und der möglichen Behandlung von Autoimmun-Störungen, wie z. B. Artrithis und Lupus erythematosis wertvoll sein. Human-IL-1 in größerer Reinheit und größeren Mengen als bisher zugänglich könnte sich auch als nützlich bei der Erzielung einer erfolgreichen Wund- und Verbrennungsheilung erweisen.
Ein potentielles Verfahren zur Bereitstellung relativ großer Mengen von homogenem Human-IL-1 ist durch rekombinante DNA-Techniken. Rekombinante DNA-Techniken sind entwickelt worden, um wirtschaftlich ein gewünschtes Protein herzustellen, sobald das für das Protein codierende Gen isoliert und identifiziert worden ist. Eine Diskussion derartiger rekombinanter DNA-Techniken für die Proteinherstellung findet sich in den Verleger- und unterstützenden Artikeln in Band 196 von Science (April 1977). Um sich jedoch den in dieser Literaturstelle diskutierten rekombinanten DNA-Techniken bedienen zu können,, muß das Gen, das für Human-IL-1 codiert, zuerst isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft IL-1, die Reinigung von Human-IL-1 bis zur Homogenität und die Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung und partiellen Aminosäuresequenz des homogenen IL-1. Erfindungsgemäß wurden rohe Präparate von IL-1 durch eine Kombination von Ionenaustauschchromatographie- und Affinitätschromatographie-Verfahren gereinigt. Der Affinitätschromatographie-Teil des Reinigungsverfahrens bediente sich eines an eine unlösliche Matrix gekoppelten Farbstoff-Liganden. Auf der Grundlage des Standes der Technik wird angenommen, daß dasselbe Reinigungsverfahren erfolgreich für IL-1 aus anderen Säuger- Spezies, wie z. B. Maus-, Rinder- oder Schweine-IL-1, eingesetzt werden kann.
Sobald die Reinigung bis zur Homogenität erfolgt war, wurden die Aminosäurezusammensetzung und die Sequenz des IL-1-Moleküls analysiert. Die Aminosäurezusammensetzung des Moleküls wurde mit Hilfe eines Aminosäure-Analysiergeräts bestimmt. Die Aminosäuresequenz des N-terminalen Teils des IL-1-Moleküls wurde durch ein direktes Edman-Abbau-Verfahren und auch durch anfängliche Fraktionierung des Moleküls, Trennung der Fragmente durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie ("HPLC") und anschließende Analysierung der HPLC-Fraktionen, von denen gefunden wurden, daß sie IL-1-Peptide enthielten, durch das Edman-Abbau- Verfahren bestimmt.
Ein für Human-IL-1 codierendes Gen wurde mit einer synthetischen Oligonucleotid-Sonde, die einem Teil der Aminosäuresequenz von Human-IL-1, wie oben bestimmt, entsprach, aus einer cDNA-Bibliothek isoliert. Gesamt-Human-RNA wurde aus Zellen extrahiert, von denen angenommen wurde, daß sie relativ große Mengen an IL-1 produzieren. Aus dem Gesamt-RNA-Extrakt wurde polyadenylierte mRNA isoliert. Durch reverse Transkription von nach Größe aufgetrennter polyadenylierter mRNA mit reverser Transkriptase wurde eine cDNA-Bibliothek aufgebaut. Die DNA wurde mit DNA-Polymerase I doppelsträngig gemacht und in einen geeigneten Klonierungsvektor insertiert. Die resultierenden rekombinanten Klonierungsvektoren wurden zur Transformierung eines geeigneten Wirts eingesetzt.
Transformierte Wirte wurden identifiziert und zu Gruppen zusammengefaßt und zusammengegeben. Aus diesen Gruppen hergestellte Plasmid-DNA wurde mit der Oligonucleotid-Sonde, die radioaktiv markiert worden war, hybridisiert. Die Gruppe(n) von Klonen, die der Sonde ein positives Signal gab(en) wurde(n) identifiziert und dank wurde die mutmaßliche Gruppe unterteilt und das Hybridisierungs-Durchmustern wiederholt. Durch dieses Verfahren wurde schließlich eine einzelne transformierte Spezies identifiziert. Aus dieser transformierten Spezies wurde Plasmid-DNA hergestellt und durch Verdauung mit Restriktionsendonuclease charakterisiert. Das IL-1-Gen wurde sequenziert, um seine Nucleinsäure- und Aminosäure-Zusammensetzungen zu bestimmen. Auch wurde das IL-1-Gen in einem E. coli/Hefezellen-System kloniert, um reifes IL-1 zu exprimieren, und daraufhin wurden biologische Assays durchgeführt, um zu bestätigen, daß das exprimierte Proteinprodukt IL-1 war.
Die Details von typischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen
die Fig. 1 eine partielle Strukturformel für den blauen Farbstoff-Liganden veranschaulicht;
die Fig. 2 eine partielle Strukturformel für den roten Farbstoff-Liganden veranschaulicht;
die Fig. 3 eine partielle Restriktionskarte des IL-1-Gens veranschaulicht;
die Fig. 4, die zwei Blätter enthält, die Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz des IL-1-Gens, wie es in dem Nucleotidfragment in Fig. 3 enthalten ist, zeigt, wobei die Nucleotide vom Anfang der in Fig. 4 gezeigten Sequenz aus numeriert sind und die Aminosäuren vom reifen NH&sub2;-Ende des Proteins, d. h. dem Ala-Rest, wie mit einem Pfeil angezeigt, zum Terminationscodon ATT am Rest Nummer 153 hin numeriert sind; und
die Fig. 5 die eingesetzte Strategie, um die Kodierungsregion des IL-1-Gens in einem Schaukelvektor der zur Transformierung von Hefe-Wirten zwecks Expression von funktionalem IL-1 eingesetzt wurde, zu klonieren.

Herstellung von IL-1

Rohe Präparate von IL-1 wurden aus peripheren Blutleukozyten hergestellt. Die Leukozyten wurden aus Vollblut durch wohlbekannte Techniken, wie z. B. Zentrifugierung über einem Volumen von Ficoll/Hypaque-Lösung, abgetrennt. Die aus dem Blut entfernten Leukozyten wurde in vitro in einem Kulturmedium kultiviert, das ein geeignetes Stimulierungsmittel zur Induktion der IL-1-Sekretion enthielt. Nach einer optimalen Kultivierungszeitspanne wird der Überstand durch Zentrifugieren gewonnen und bis zur Verwendung gelagert.
Anstatt aus aus Vollblut entfernten Leukozyten erhalten zu werden, kann IL-1 alternativ aus Monozyten, die aus irgendeiner an Monozyten reichen Quelle stammen, hergestellt werden. Derartige Monozyten-Quellen, schließen monozytische leukämische Milzzellen, Lymphzellen und Lungenbläschen-Makrophagen ein.
Das zur Kultivierung der peripheren Blutleukozyten verwendete Medium kann aus im Handel erhältlichen Medien bestehen, wie z. B. Eagle's Minimum Essential Medium ("MEM") oder Roswell Park Memorial Institute ("RPMI")-Medium. Additive, die einzeln oder in Kombination dem Kulturmedium zugegeben werden können, schließen Glutamin, HEPES-Puffer und verschiedene Antibiotika, wie z. B. Gentamycin, Penicillin und Streptomycin, ein. In der Vergangenheit ist auch häufig Serum als ein Additiv eingesetzt worden. Die Anmelder haben jedoch entdeckt, daß in den Verfahren der vorliegenden Erfindung die Reinigung von IL-1 aus dem Kultur-Überstand leichter wird, wenn in der Kultur kein Serum verwendet wird. Obwohl gefunden wurde, daß die Nicht-Verwendung von Serum in einer dreibis fünffachen Verminderung der in der Kultur erzeugten Menge an IL-1 resultiert, führt die Abwesenheit von Serum auch zu einer hundertfachen Verminderung des gesamten erzeugten Proteins, was die Komplikationen, die bei der Reinigung von IL-1 auftreten, vermindert.
Vorzuziehende Stimulierungsmittel, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, schließen Staphylococcus aureus oder Lipopolysaccharide ("LPS"), die aus Escherichia coli ("E. coli") extrahiert wurden, ein. Zusätzlich können Phorbolester, wie z. B. Phorbalmyristat-13-acetat, als Stimulierungsmittel eingesetzt werden.
Das Verfahren der Kultivierung der Leukozyten zwecks Induktion der Sekretion von IL-1 kann unter verschiedenen Umgebungsbedingungen durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen jedoch im Temperaturbereich von etwa 35 bis 38ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von etwa 5 bis 10% CO&sub2; in Luft gehalten. Die Menge an durch Stimulation von peripheren Blutleukozyten mit einem Aktivierungsmittel freigesetztem IL-1 variiert mit der Zeit. Die Anmelder haben gefunden, daß optimale Werte der IL-1-Expression etwa 24 bis 72 Stunden nach der Stimulierung erreicht werden.

Assays/Analyse

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden ein Thymozyten- Proliferationsassay, ein IL-1-Umwandlungsassay und ein Proteinassay durchgeführt, um das Niveau der IL-1-Aktivität und den Proteingehalt der Proben während der Reinigungs-, Klonierungs- und IL-1-Expressionsverfahren der vorliegenden Erfindung zu überwachen. Auch werden Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel- Elektrophorese (/SDS-PAGE") und zweidimensionale Gelelektrophorese eingesetzt, um die IL-1-Aktivität während des Reinigungsverfahrens zu analysieren.

Thymozyten-Proliferations-Assay

Dieser Assay beinhaltet die Bestimmung der Kapazität einer Probe von IL-1, die Proliferation von von CD-1-Mäusen stammenden Thymozyten zu induzieren. In diesem Assay werden etwa 1·10&sup6; Thymozyten, die aus 10 bis 12 Wochen alten CD-1-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) erhalten wurden, in Mikroplatten-Aushöhlungen mit rundem Boden (Corning Plastics, Corning, New York) in Anwesenheit von dreifachen Serien-Verdünnungen von IL-1-haltigen Proben eingestreut. Die Thymozyten werden in 150 Mikrolitern ("ul") MEM, die 50 Einheiten/ml ("U/ml") Penicillin, 50 Mikrogramm/ml ("ug/ml") Streptomycin, 2 millimolares ("mM") Glutamin, 0,2 mM Gentamycin, 10 mM HEPES-Puffer enthalten (gemeinsam als "ergänztes MEM" bezeichnet), pH 7,4, zusammen mit 3% Vol/Vol Humanserum und 10&supmin;&sup5; molarem ("M") 2-Mercaptoethanol kultiviert. Die Proben
werden 72 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Luft kultiviert. Daraufhin werden die Kulturen über 4 runden mit 0,5 Mikrocurie ("uCi") tritiiertem Thymodin ("³H-Tdr") (New England Nuclear, Boston, Massachusetts, spezifische Aktivität 2 Ci/mM) bepulst, worauf die Kulturen auf Glasfaserfilterstreifen gegeben werden, z. B. mit Hilfe eines mehrfach automatisierten Proben- Erntegerätes. Die Einverleibung von ³H-Tdr wird dann durch Flüssigkeits- Scintillationszählung gemessen. Details dieses Verfahrens sind in Gillis et al., 120 J. Immunol. 2027 (1978) beschrieben.
Durch dieses Thymozyten-Proliferations-Assayverfahren nehmen nur CD-1-Thymozyten, die in Anwesenheit von IL-1 kultiviert worden sind, ³H-Tdr in einer Dosisabhängigen Weise auf. In Abwesenheit von IL-1 kultivierte CD-1-Zellen nehmen nur Hintergrundkonzentrationen von ³H-Tdr auf. Die IL-1-Aktiviät wird zwecks Bestimmung der Interleukin-2-Aktivität aus dem linearen Teil der ³H-Tdr- Inkorporierungsdaten auf ähnliche Weise wie beim von Gillis et al., oben,
beschriebenen Verfahren berechnet. Einheiten der IL-1-Aktivität werden als die reziproke Verdünnung einer Probe, die 50% der maximalen Thymozyten-³H-Tdr- Inkorporation im Vergleich zu einem Labor-Standard erzeugt, bestimmt. Zum Beispiel wird dann, wenn eine Probe 50% der maximalen Thymozyten-³H-Tdr- Inkorporierung bei einer Verdünnung von 1:15 erzeugt, eine Einheit ("U") IL-1 in einem 1/15 des 150 ul- Assayvolumens gefunden oder man sagt, daß 10 ul eine U Aktivität enthalten. Die gesamte Probe würde deshalb 100 U [1000 (ul/ml) 10 ul (pro U)] IL-1-Aktivität/ml enthalten. Siehe Gillis et al., oben.

IL-1-Umwandlungsassay

Es kann ein zweiter alternativer Assay für die IL-1-Aktivität eingesetzt werden, der sich der Tatsache bedient, daß von den Anmeldern gefunden wurde, daß IL-1 eine Mäusetumorzellinie, LBRM-33-145, die kein Interleukin 2 ("IL-2") produziert, in eine solche, die IL-2 produziert, umwandeln kann. In diesem Assay
werden LBRM-33-1A5-Zellen, ATCC Nr. CRL-8079, durch Zugabe von 50 ug/ml Mitomycin C desaktiviert und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. 100 ul der desaktivierten LBRM-33-1A5-Zellen (5·10- Zellen/ml) werden in Platten mit 96 flachen Aushöhlungen in Anwesenheit eines gleichen Volumens des Mitogens, Phytohämagglutinin ("PHA") (Endkonzentration 1%) zusammen mit Serien-Verdünnungen von IL-1-enthaltenden flüssigen Proben kultiviert. Nach 6 bis 24 Stunden wird die von durch IL-1 angeschaltete durch Mitomycin C inhibierte LBRM-33-1A5-Zellen erzeugte IL-2-Aktivität (und somit IL-1-Aktivität) durch Zugabe von 50 ul von von IL-2 abhängigen CTLL-2-Zellen (8·10&sup4; Zellen/ml) direkt bestimmt. Die Kulturen in den Mikro-Aushöhlungen werden dann 20 weitere Stunden inkubiert, gefolgt von einem vierstündigen Pulsen mit 0,5 uCi von ³H-Tdr (New England Nuclear, Boston, MA, spezifische Aktivität 2 Ci/mM). Daraufhin werden die mit Thymidin-bepulsten Kulturen mit Hilfe eines automatisierten Mehrfach-Proben-Erntegeräts (MASH II; Microbiological Associates, Bethesda, MD) auf Glasfaser-Filterstreifen überführt.
Die ³H-Tdr-Inkorporierung wird durch Flüssigkeits-Scintillationszählung gemessen. Details dieses Verfahrens finden sich in Gillis et al., oben, und in US-Patent- 4 411 992. In diesem Assay nehmen nur CTLL-2-Zellen, die in Anwesenheit von IL-2 kultiviert wurden, ³H-Tdr in einer Dosis-abhängigen Weise auf. In Abwesenheit von IL-2 (und somit IL-1) kultivierte CTLL-2-Zellen nehmen nur Hintergrundspiegel von ³H-Tdr auf. Dieser "Umwandlungs"-Assay hat den Vorteil, daß er schneller (innerhalb von 24 Stunden fertig) und etwa 1000 bis 10000mal empfindlicher als der oben diskutierte Thymozyten-Proliferationsassay ist. Trotzdem können sowohl der "Umwandlungs"- als auch der /Proliferations"-Assay im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.

Protein-Assay

Der Proteingehalt der Reinigungsproben wird durch einen Biorad-Proteinassay, der im Handel von Biorad, Richmond, California, erhältlich ist, bestimmt. Dieser Assay setzt Rinder-Serumalbumin als Standard ein. Die Prinzipien und Details dieses Assays werden in Bradford, 72 Anal. Biochem. 248 (1976) diskutiert.

Gel-Elektrophorese

Der Überstand der Kultur und Chromatographiesäulenfraktionen werden durch SDS-PAGE analysiert, um die Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung zu überwachen. Dieser Assay wird gemäß dem Gelstapelverfahren von Laemmli, 227 Nature (London) 680 (1970), durchgeführt. Der Assay verwendet 0,75 mm SDS- Plattengele unter Einsatz eines 10 bis 20%-Gradienten von Polyacrylamidgel. Die Gele werden bei einem konstanten Strom von 30 mA laufengelassen. Die resultierenden Gelproben werden mit Silber angefärbt, wie z. B. durch das von Oakley et al., 105 Anal. Biochem. 361 (1980), beschriebene Verfahren.
Die speziellen Assayproben, die eine hohe Salzkonzentration enthalten, werden zunächst gegen 0,001% SDS in 0,1 mM NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert und dann unter Vakuum getrocknet. Der getrocknete Rückstand wird vor dem SDS-PAGE-Verfahren in einem reduzierenden Puffer (2% SDS), 1% 2-Mercaptoethanol aufgelöst.

Zweidimensionale Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Nach Beendigung der Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird das IL-1 durch zweidimensionale Polyacrylamidgel-Elektrophorese durch das in Sammons et al., 2 Electrophoresis 135 (1981), beschriebene Verfahren analysiert. In diesem Verfahren werden lyophilisierte IL-1-Proben erneut in 20 ul SDS-Solubilisierungspuffer, der aus 11% (Gew/Vol) Cyclohexylaminoethan, 2% (Gew/Vol) SDS, 2% 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin in Wasser zusammengesetzt ist, suspendiert. Die Proben werden 10 Minuten auf 100ºC erhitzt. Nach zweistündiger Präfokusierung werden Proben (10 Minuten bei 100ºC in SDS solubilisiert) auf das Gel der ersten Dimension aufgetragen und bei einer konstanten Spannung von 600 V 20 Stunden lang fokusiert. Die Fokusierungsgele der ersten Dimension werden direkt mit einem pH-Gradienten-Gel-Abtaster abgetastet. Darauf hin werden die Gele in Äquilibrierungspuffer [9,3% (Vol/Vol) Glycerin; 50% (Vol/Vol) Tris- SDS-Puffer (30 g Tris, 2 g DSD pro Liter, mit konzentrierter HCl auf pH 6,8 eingestellt); 1% (Gew/Vol) SDS; 0,8% (Vol/Vol) 2-Mercaptoethanol in Wasser] 2 Minuten lang gespült, auf das obere Ende des Gels der zweiten Dimension gegeben und dann mit bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose bedeckt. Die Elektrophorese der zweiten Dimension (10 bis 20%iger linearer Acrylamidgradient) wird bei einem konstanten Strom von 40 mA/Gel durchgeführt, bis die Farbstoffront das untere Ende des Gels erreicht. Nach der Fixierung in 50% (Vol/Vol) Ethanol und 10% (Vol/Vol) Eisessig werden die Gele durch das Silbernitrat-Farbverfahren von Sammons et al., oben, angefärbt.

Reinigung von IL-1

Der aus der Blut-Leukozytenkultur resultierende Überstand, wie durch das obige Verfahren hergestellt, wird durch Kationenaustauschchromatographie, Anionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie unter Verwendung eines an eine Säulenmatrix gekuppelten Farbstoff-Liganden gereinigt. Alle Chromatographiefraktionen werden auf IL-1-Aktivität und Proteinkonzentration untersucht. Falls angemessen, werden der pH und die Leitfähigkeit gemessen. Nach jedem Chromatographieschritt werden Proben durch SDS-PAGE analysiert. Zusätzlich werden nach der Beendigung des Affinitätschromatographieverfahrens aktive Fraktionen durch zweidimensionale Polyacrylamidgel-Elektrophorese, wie oben diskutiert, analysiert.
Eine geeignete Säule für das Kationenaustauschchromatographie-Verfahren ist zusammengesetzt aus Sulfopropyl-Sephadex C-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey). Vorzugsweise wird die Säule vor dem Aufgeben der IL-1-Probe mit Puffer äquilibriert und dann mit dem gleichen oder einem anderen Puffer gewaschen, nachdem die IL-1-Probe auf die Säule aufgegeben worden ist, um nicht-gebundenes Protein ohne Elution von IL-1-Aktivität zu entfernen. Die Elution des IL-1 von der Säule wird mit einem gepufferten Elutionsmittel mit ausreichendem pH, um die Bindung des IL-1 an die Säule rückgängig zu machen, durchgeführt.
Die zusammengegebenen aktiven Fraktionen aus dem Kationenaustauschchromatographie-Verfahren werden weiter durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt. Die Anmelder haben gefunden, daß ein geeignetes Säulenmaterial für diesen Zweck DEAE-Sephacel ist. Die DEAE-Sephacel-Säule wird mit einem Puffer äquilibriert und das Proben-Konzentrat wird auf die Säule aufgegeben. Die Elution wird zunächst mit dem Ausgangs-Puffer und anschließend mit einem linearen Salzgradienten im selben Puffer durchgeführt. Fraktionen werden wie oben diskutiert gesammelt und analysiert.
Das IL-1 in den zusammengegebenen aktiven Fraktionen aus der DEAE-Sephacel- Säule wird weiter durch Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung eines synthetischen Triazinyl-Textilfarbstoff-Liganden, der an eine Trägermatrix gekoppelt ist, gereinigt. Verschiedene Farbstoff-Farben, einschließlich Blau oder Rot, können verwendet werden. Der Farbstoff wird über eine Etherbindung zum Triazinring hin oder alternativ über eine primäre Amin- oder eine Anthrachinon- Gruppe des Farbstoffs an eine geeignete Säulenmatrix, die z. B. aus Agarose, Polyacrylamid, Cellulose oder anorganischen Materialien auf Siliciumdioxid-Basis zusammengesetzt ist, gekuppelt. Statt direkt an eine Trägermatrix gebunden zu werden, kann der Farbstoff an hochmolekulares Dextran gebunden werden, wobei das Dextran dann an einer Säulenmatrix immobilisiert wird. Partielle chemische Strukturen von blauen und roten Farbstoff-Liganden, die an eine Matrix gekuppelt sind, sind in den Fig. 1 bzw. 2 gezeigt. Es versteht sich, daß diese Farbstoff-Strukturen modifiziert werden können, um Analoge zu bilden, z. B. durch Austausch der Positionen der sulfonierten Anthrachinongruppe relativ zum Triazinring oder durch Substitution eines Sulfonatsalzes für die Sulfonsäure- Substituenten. Siehe Fulton, Dye-Ligand Chromatography, Lexington, MA:Studio 6, Inc. (1980).
Vor dem Aufgeben der IL-1-haltigen Fraktionen, die über SP-Sephadex und DEAE-Sephacel gereinigt worden sind, auf die Farbstoff-Ligand-Säule kann es erforderlich sein, die Ionenstärke der zusammengegebenen aktiven Fraktionen zu erniedrigen. Auch kann die Anwesenheit eines zweiwertigen Kations, wie z. B. Mg&spplus;&spplus; oder Ca&spplus;&spplus;' die Bindung von IL-1 an den Farbstoff-Liganden verbessern. Die Säule wird mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. Tris-HCl, äquilibriert und daraufhin werden die IL-1-Aktivität enthaltenden zusammengegebenen DEAE-Fraktionen auf die Säule gegeben. Daraufhin wird die Säule mit demselben Ausgangs-Puffer gewaschen und dann wird die Elution mit einem linearen Salzgradienten im selben Puffer oder einem speziellen löslichen Liganden durchgeführt. Fraktionen werden gesammelt und wie oben diskutiert analysiert.
Die Anmelder haben entdeckt, daß roter Triazinyl-Textilfarbstoff, wenn er unter den angegebenen Säulenbedingungen eingesetzt wird, besonders hochspezifisch für die Bindung von IL-1 ist. Ein handelsüblicher Typ dieses roten Farbstoffs, der Fig. 2 entspricht, ist "Procion"-Rot (Reaktivrot 120) (Imperial Chemical Industries). Die Anmelder haben auch entdeckt, daß blauer Triazinyl-Textilfarbstoff, wenn er unter den angegebenen Säulenbedingungen verwendet wird, ebenfalls hochspezifisch für die Bindung von IL-1 ist, d. h. etwa 80% der Spezifizität des roten Triazinyl-Farbstoffs aufweist. Ein handelsüblicher Typ von blauem Farbstoffist Cibacron® Blue 36A (Ciba AG).
Durch das oben erwähnte Reinigungsverfahren haben die Anmelder Human-IL-1- Protein auf mehr als 99% Reinheit gereinigt, während eine hohe Ausbeute von etwa 53% aus dem Ausgangs-Oberstand aufrechterhalten wurde. Durch die oben beschriebenen Assay-Verfahren haben die Anmelder festgestellt, daß IL-1 aus einer Spezies mit singulärem Molekulargewicht mit etwa 17500 Dalton Molekulargewicht zusammengesetzt ist. Dieses Molekulargewicht ist merklich schwerer als das bisher für sowohl Human- als auch Mäuse-IL-1 berichtete. Darüber hinaus wurden von den Anmeldern im Gegensatz zu den Berichten von anderen Beobachtern keine Spezies von IL-1 mit anderem Molekulargewicht gefunden. Siehe Lachman, oben; Togawa et al., oben; Mizel et al., oben; und Blyden et al., oben. Trotzdem ist es aufgrund der hohen Ausbeuten an IL-1, die von den Anmeldern unter Verwendung der vorliegenden Erfindung festgestellt wurden, unwahrscheinlich, daß während des oben erwähnten Reinigungsverfahrens merkliche Mengen von anderen IL-1-Spezies mit niedrigerem Molekulargewicht verlorengegangen sind. Das wahre Molekulargewicht für homogenes Human-IL-1 beträgt deshalb 17500 Dalton.

Aminosäurezusammensetzungs-Analyse

Zusätzlich dazu, daß sie die biologische Untersuchung von IL-1, das frei von Kontaminierung durch andere Proteine ist, möglich macht, hat die Fähigkeit, homogenes IL-1 herzustellen, die Anmelder in die Lage versetzt, die Aminosäurezusammensetzung des IL-1-Moleküls zu bestimmen. Diese Information kann verwendet werden, um bei der Klonierung des IL-1-Gens und der Herstellung von großen Mengen an reinem IL-1 für klinische Untersuchungen und schließlich für die klinische Verwendung zu helfen.
Proben von gereinigtem IL-1 aus dem Affinitätschromatographie-Verfahren wurden mit einem automatisiertem Analysiergerät unter Einsatz des Ninhydrin- Nachweises auf ihre Aminosäurezusammensetzung analysiert. Beobachtete Maxima wurden mit einem im Handel erhältlichen Aufzeichnungs-Integrator integriert. Durch dieses Verfahren haben die Anmelder die Aminosäurezusammensetzung des IL-1-Moleküls, wie sie in Tabelle I in Beispiel 4 unten zusammengefaßt ist, bestimmt.
Da der Aminosäurerest Cystein (Cys) gegen Hydrolyse instabil ist, wird dieser Rest durch die automatisierte Ninhydrin-Analyse nicht nachgewiesen. Die Anwesenheit des Cys-Restes wurde durch die unten diskutierte Aminosäure- Sequenzierungsanalyse nachgewiesen. Die automatisierte Ninhydrin-Analyse unterscheidet auch nicht Asparaginsäure- Reste von Asparagin-Resten, noch unterscheidet sie Glutaminsäure-Reste von Glutamin-Resten. Unter Berücksichtigung der unten diskutierten Aminosäure-Sequenzierungsanalyse wurden jedoch in einem N-terminalen Teil des IL-1-Moleküls (das aus 42 Aminosäureresten besteht) ein Asparagin-Rest und 6 Glutamin-Reste nachgewiesen. Somit sind in Tabelle I die Asparaginsäure- und Asparagin-Reste zusammen aufgeführt, ebenso wie die Glutaminsäure- und Glutamin-Reste.

Aminosäure-Sequenzierungsanalyse des N-terminalen Teils des IL-1-Moleküls

Die Anmelder haben auch die Aminosäuresequenz des IL-1-Moleküls untersucht. Die Anmelder haben gefunden, daß in dem durch die oben aufgeführten Verfahren hergestellten gereinigten IL-1 der N-Terminus dieses Moleküls teilweise blockiert ist. Als solches eignet sich dieses Molekül nicht ohne weiteres für die chemische Analyse-Technik, die in automatisierten Aminosäure-Sequenzierungsapparaten eingesetzt wird, und somit konnte die Aminosäuresequenz des gesamten Moleküls nicht durch Standard-Analyseverfahren bestimmt werden. Als Ergebnis davon haben die Anmelder eine Kombination von zwei Techniken eingesetzt, um die Sequenz des N-terminalen Teils des Proteinmoleküls zu analysieren.
Als erste Technik haben die Anmelder eine relativ große Probe von über 11 ug IL-1 wie durch die oben diskutierten Verfahren auf Homogenität gereinigt, einer Amino-terminalen Edman-Abbau-Sequenzanalyse mit einem automatisierten Sequenzierungsgerät unterzogen. Durch diese Technik wurde gefunden, daß die ersten 20 Reste des N-terminalen Teils des IL-1-Moleküls aus der folgenden Sequenz zusammengesetzt sind: NH&sub2;-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg- Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met.
Es wurde abgeleitet, daß der achte Rest Cys ist. Im achten Zyklus des automatisierten Sequenzierungsverfahrens wurde kein anderer Rest in hoher Ausbeute erhalten, was auf den Schluß hindeutet, daß der achte Rest aus Cys (welches durch Edman-Abbau nicht eindeutig nachgewiesen werden kann), einem glycosylierten Threonin-Rest oder einem glycosylierten Serin (Ser)-Rest zusammengesetzt ist. Die beiden letzteren Möglichkeiten wurden ausgeschlossen, da, wie unten diskutiert, durch die Aminosäurezusammensetzungs-Analyse kein Glucosamin oder Galactosamin beobachtet wurde. Dies führt zu dem Schluß, daß der achte Rest aus Cys zusammengesetzt ist.
Als zweite Aminosäuresequenzanalyse-Technik fraktionierten die Anmelder das Molekül an den Argenin-Resten mit dem Enzym Trypsin. Um das Trypsin daran zu hindern, das IL-1-Molekül auch an den Lysin-Stellen zu spalten, wurden die Seitenketten des Lysinmoleküls mit einem speziellen Blockierungsmittel geschützt. Vorzugsweise wird das Trypsin mit L-1-Tosylamino-S-phenylethylchlormethylketon ("TPCK") behandelt, um andere kontaminierende Enzyme zu desaktivieren, wie z. B. Chymotrypsin, das auch anwesend sein kann, wodurch die Möglichkeit, daß das IL-1-Protein an anderen Resten gespaltet wird, minimiert wird. Es versteht sich, daß statt Trypsin andere Enzyme eingesetzt werden können. Um die IL-1-Moleküle an anderen Rest-Stellen zu spalten.
Nach der Spaltung des IL-1-Moleküls wurden die resultierenden Peptide auf der Basis der Hydrophobizität durch HPLC-Verfahren aufgetrennt. Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzte HPLC-Technik bedient sich vorzugsweise einer Umkehrphasen-Kieselsäuresäule mit gebundenem Octadecyl mit einer ausreichend großen Porengröße, um mit den Protein-artigen IL-1-Peptiden optimal eingesetzt werden zu können, d. h. einer Porengröße von wenigstens 300 A.
Geeignete Umkehrphasen-HPLC-Säulen zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung sind handelsübliche Materialien. Eine bevorzugte Säule für diesen Zweck ist die Vydac 218 TP-Umkehrphasen-Säule, die im Handel von Separations Group, Hesperia, California, erhältlich ist. Diese Säule besteht aus Octadecylsilangruppen, die kovalent mit Hilfe einer Siloxan (Silicium-Sauerstoff- Silicium)-Bindung an die Oberfläche des Kieselgels mit einem Porendurchmesser von 300 A, das auf eine durchschnittliche Teilchengröße von 5 Mikron klassifiziert worden ist, gebunden sind. Es versteht sich, daß die Verwendung anderer Umkehrphasen-Säulen im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt.
Die IL-1-Peptide, die an die Octadecyl-Säule gebunden werden, werden unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril eluiert. Ein bevorzugter Gradient für diesen Zweck ist ein 0 bis 95%iger (Vol/Vol) Acetonitrilgradient in Trifluoressigsäure (TFA), pH 2,0.
Die eluierten Peptide können mit im Handel erhältlichen Nachweissystemen bequem nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann die relative Proteinkonzentration in den von den HPLC-Säulen eluierten Fraktionen durch Messen der Absorption des eluierten Materials mit einem automatisierten UV-Licht-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 230 nm bestimmt werden. Ein geeigneter automatisierter UV-Licht-Absorptionsnachweisapparat ist von Waters Associates, Millford, Maine, erhältlich. Alternativ kann die Proteinelution mit einem automatisierten Fluoreszenznachweissystem überwacht werden, die von Stein und Moschera, 78 Meth. Enzymol, 435 (1981), beschrieben.
Die eluierten HPLC-Fraktionen werden der Reihe nach durch Gelelektrophorese, oben diskutiert, analysiert, um die Zahl der in jeder der HPLC-Fraktionen enthaltenen Peptide zu bestimmen. Darauf werden die Peptide im Vakuum konzentriert und dann auf ihre Aminosäuresequenz analysiert. Dies wird vorzugsweise mit einem automatisierten Sequenzierungsgerät, das im Handel erhältlich ist, gemacht. Durch diese Technik haben die Anmelder entdeckt, daß ein Großteil des IL-1-Moleküls nahe dem N-terminalen Teil des Human-IL-1-Moleküls aus der folgenden Sequenz von Aminosäureresten zusammengesetzt ist: -Ser-Leu-Val-Met- Ser-Gly-Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-Ala-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu--Gln-Gln Val-Val-Phe.
Die ersten vier Reste des Amino-terminalen Teils dieses Aminosäurefragments entsprechen den letzten vier Resten des C-terminalen Teils der oben durch die automatisierte Edman-Abbau-Technik bestimmten Sequenz, was zu dem Schluß führt, daß die ersten 42 Reste des N-terminalen Teils des IL-1-Moleküls aus der folgenden Sequenz zusammengesetzt sind: NH&sub2;-Ala-pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys- Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys -Ser-Leu-Val-Me t-Ser-Gly- Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys- Ala-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gln-Gln-Val-Val-Phe.

Herstellung von RNA aus Human-IL-1- produzierenden Zellen

Gesamt-RNA aus Human-IL-1 produzierenden Zellen wird durch Standardverfahren, wie z. B. von Chirgwin et al., 18 Biochemistry 5294 (1979), und Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) beschrieben, extrahiert.
Wie wohlbekannt ißt, ist es bei der Extraktion von RNA aus Zellen wichtig, die Ribonuclease ("RNase")-Aktivität während der ersten Stufen der Extraktion zu minimieren. Eine Art und Weise, in der dies erreicht werden kann, ist die Denaturierung des zellulären Proteins, einschließlich der RNase, mit einer Geschwindigkeit, die die Geschwindigkeit der RNA-Hydrolyse durch RNase übersteigt. In den Verfahren von Chirgwin et al., oben, und Maniatis et al., oben bei 196, wird dies unter Verwendung von Guanidiniumthiocyanat, zusammen mit einem Reduktionsmittel, wie z. B. 2-Mercaptoethanol (um die Disulfidbindungen des Proteins auf zubrechen), durchgeführt. Die RNA wird aus dem Protein durch Standard-Verfahren isoliert, wie z. B. Phenol/Chloroform-Extraktion, Fällung mit Ethanol oder Sedimentation mit Cäsiumchlorid.
Anschließend wird polyadenylierte mRNA von dem extrahierten Protein getrennt. Obwohl verschiedene Techniken zur Durchführung dieses Abtrennverfahrens entwickelt worden sind, ist ein bevorzugtes Verfahren die Chromatographie der polyadenylierten mRNA an Oligo(dT)-Cellulose, wie von Edmonds et al., 68 Proc. Natl. Acad. Sci. 1336 (1971); Aviv und Leder, 69 Proc. Natl. Acad. Sci. 1408 (1972); und Maniatis et al., oben bei 197, beschrieben. Die Oligo-(dT)- Cellulosesäule wird mit einem Beladungspuffer hergestellt und dann wird die mRNA auf die Säule aufgegeben. Daraufhin wird die Säule zunächst mit einer Pufferlösung gewaschen, um die nicht-polyadenylierte mRNA zu entfernen, und dann wird die polyadenylierte mRNA mit einem gepufferten Elutionsmittel von niedriger Ionenstärke aus der Säule eluiert. Die Integrität der polyadenylierten mRNA wird durch Gelelektrophorese verifiziert.
Die polyadenylierte mRNA wird dann durch Elektrophorese durch Methylquecksilber-Agarosegelfraktionen, die unterschiedlichen Größenklassen der mRNA entsprechen, nach Größe sortiert und dann unter Verwendung einer Standard- Kaninchen-Reticulozytenlysat-Technik, wie sie von Palmiter, 248 J. Biol. Chem. 2095 (1973); Pelham and Jackson, 67 Eur. J. Biochem. 246 (1976); und Lee et al., 253 J. Biol. Chem. 3494 (1978) beschrieben wird, in vitro translatiert. Sätze für den Kaninchen-Retikulozyten-Assay sind aus vielen Quellen im Handel erhältlich, wie z. B. von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland. Alternativ kann die mRNA-Translation durch Mikroinjektion der mRNA in Frosch- Xenopus laevis ("X. laevis")-Oozyten unter Verwendung von Standard-Techniken, wie von Stoma et al., 79 Meth. Enzym. 68 (1981) beschrieben, durchgeführt werden. Flüssigkeiten, die durch entweder die Retikulozytenlysat-Translationen oder durch mRNA-mikroinjizierte Oozyten freigesetzt werden, werden dann unter Verwendung der oben diskutierten Assays auf die Anwesenheit von Il-1-Aktivität getestet. mRNA- Gelfraktionen, die bei der in vitro-Translation eine IL-1-Aktivität ergaben, werden als Quelle von mRNA für einen cDNA-Aufbau ausgewählt.
In dem Translationsverfahren mit X. laevis-Oozyten werden ungefähr 50 Nanoliter (/nl") mRNA (in einer Konzentration von 0,5 bis 1 mg/ml in sterilem Wasser aufgelöst) in jeden Oozyten injiziert. Die Oozyten werden von X. laevis (Nasco, Fort Atkinson, Wisconsin) geerntet und in 150 ml Oozyten-Inkubationsmedium (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO&sub3;m 0,82 mM MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,33 mM Ca(NO&sub3;)&sub2;·4H&sub2;O, 0,41 mM CaCl&sub2;·6H&sub2;O, 7,5 mM Tris-Base, 18 Einheiten/ml (11 ug/ml) Penicillin G-Kalium und 18 ug/ml Streptomycin) inkubiert. Der endgültige pH des Mediums wird mit HCl auf 7,6 eingestellt und durch Filtration sterilisiert. Nach der Injektion werden die Oozyten in 0,1 ml frisches Oozyten-Inkubationsmedium gegeben und 18 Stunden bei 23ºC in einem sterilen 1,5 ul- Polypropylenröhrchen inkubiert. Nach der Inkubation wird die Flüssigkeit, in denen die Oozyten kultiviert wurden, geerntet und unter Verwendung der oben diskutierten Assays auf die Anwesenheit von IL-1-Aktivität getestet.

Herstellung von cDNA aus mRNA

Eine Bibliothek von doppelsträngiger cDNA, die der mRNA, wie oben hergestellt und untersucht, entspricht, wird durch bekannte Techniken unter Verwendung des Enzyms reverse Transkriptase aufgebaut. Ein solches Verfahren, das im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, wird detailliert von Maniatis et al., oben bei 230, beschrieben. Kurz gesagt, wird die polyadenylierte mRNA unter Verwendung von Oligo-dT, das an den polyadenylierten Schwanz der mRNA hybridisiert worden ist, als Primer für einen ersten cDNA-Strang revers transkribiert. Dies führt zu einer "Haarnadel"-Struktur am 3'-Ende des ersten cDNA-Stranges, die als integraler Primer für den zweiten DNA- Strang dient. Danach wird der zweite cDNA-Strang unter Verwendung des Enzyms cDNA-Polymerase I synthetisiert und die Haarnadel-Struktur wird durch S1-Nuklease gespaltet, um doppelsträngige cDNA-Moleküle herzustellen. Die doppelsträngige cDNA wird durch irgendwelche bequeme Mittel fraktioniert, um die kürzeren Stränge zu entfernen, wodurch die nutzlose Klonierung kleiner cDNA-Bruchstücke vermieden wird.
Es versteht sich, daß zur Herstellung von doppelsträngiger cDNA aus mRNA alternative Standardverfahren eingesetzt werden können. Eine derartige alternative Technik wird von Land et al., 9 Nucl. Acids Res. 2251 (1981) beschrieben. In dem Land et al.-Protokoll wird die Haarnadel-Struktur nicht als Primer für den zweiten cDNA-Strang verwendet. Stattdessen wird das 3'-Ende des ersten cDNA-Stranges unter Verwendung terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase ("TdT") mit einem Schwanz von dCMP-Resten versehen. Dies produziert einen 3'-Schwanz von Poly-C-Resten. Dann-wird die Synthese des zweiten Stranges durch Oligo-dG, das an den 3'-Schwanz hybridisiert ist, geprimt. Es wird gesagt, daß diese Technik hilft, den Verlust von Teilen des 5'-Schwanzes des zweiten cDNA- Stranges zu vermeiden, der auf treten könnte, falls die Haarnadel mit S1-Nuclease gespaltet wird, wie in dem Maniatis et al.-Protokoll.

Klonierung von cDNA

Als nächstes wird die doppelsträngige cDNA in einen Klonierungsvektor insertiert, der zur Transformierung kompatibler prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtszellen für die Replikation des Vektors verwendet wird. Daraufhin werden die transformierten Spezies identifiziert und es wird daraus Plasmid-DNA hergestellt.
Verschiedene Klonierungsvektoren können eingesetzt werden. Obwohl dem Plasmid der Vorzug gegeben wird, kann der Vektor ein Bakteriophage oder ein Cosmid sein. Falls die Klonierung in Säuger-Zellen erfolgt, können auch Viren als Vektoren eingesetzt werden.
Wenn ein Plasmid eingesetzt wird, kann es aus einer natürlichen Quelle erhalten werden oder künstlich synthetisiert werden. Das spezielle gewählte Plasmid sollte mit dem ins Auge gefaßten Transformations-Wirt, sei es ein Bakterium wie E. coli, Hefe oder ein anderer einzelliger Mikroorganismus, kompatibel sein. Das Plasmid sollte den geeigneten Replikations-Origin für die spezielle einzusetzende Wirtszelle aufweisen. Auch sollte das Plasmid eine phänotypische Eigenschaft aufweisen, die es ermöglicht, die transformierten Wirtszellen leicht zu identifizieren und von den Zellen zu trennen, die nicht transformiert werden. Solche phänotypische Eigenschaften können Gene einschließen, die Resistenz gegenüber Wachstums-inhibierenden Substanzen, wie z. B. Antibiotika, liefern. Plasmide, die für Gene codieren, die gegenüber verschiedenen Antibiotika- einschließlich Tetracyclin, Streptomycin, Sulfa- Arzneistoffen, Penicillin und Ampicillin, resistent sind, sind im Handel erhältlich.
Falls E. coli als Wirtszelle eingesetzt wird, sind viele mögliche Klonierungsplasmide im Handel erhältlich, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Ein bevorzugtes Plasmid zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ist pBR322. Dieses Plasmid ist voll sequenziert worden, wie in Sutcliffe, 43 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
77 (1979) ausgeführt. Ein signifikanter Vorteil dieses Plasmids ist es, daß es 11 bekannte einzigartige Restriktionsstellen aufweist, einschließlich die Pst I- Stelle im Ampicillin-resistenten Gen. Diese Eigenschaft ist zur Klonierung durch das Verfahren, mit dem ein Homopolymer-Schwanz eingeführt wird, besonders geeignet.
Falls anstelle eines Plasmids ein Bakteriophage eingesetzt wird, sollten derartige Phagen im wesentlichen dieselben Eigenschaften, die oben für die Auswahl von Plasmiden aufgeführt wurden, aufweisen. Dies schließt die Existenz eines phänotypischen Markers und ligatisierbarer Termini für das Anknüpfen fremder Gene ein.
Vorzugsweise wird die doppelsträngige cDNA, mit stumpfen Enden, durch Homopolymer-Tailing in einen Plasmidvektor eingeführt. Wie auf diesem Gebiet wohlbekannt ist, werden bei dieser Technik komplementäre Homopolymer-Schienen den Strängen der cDNA und der Plasmid-DNA hinzugefügt. Der Vektor und die doppelsträngige cDNA werden dann durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Homopolymer-Schwänzen verbunden, um offene, circuläre Hybridmoleküle zu bilden, die Wirtszellen, wie z. B. E. coli, transformieren können.
In einem Homopolymer-Tailing-Verfahren werden etwa 50 bis 150 dA-Nucleotid- Reste den 3'-Enden von linearisierter Plasmid-DNA hinzugefügt. Eine ähnliche Zahl von dT-Nucleotid-Resten wird den 3'-Enden der doppelsträngigen cDNA hinzugefügt und dann werden cDNA und Plasmid miteinander verbunden.
Bei einem alternativen und bevorzugten Verfahren werden dG-Schwänze an die 3'-Enden des Klonierungsvektors, der mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespaltet worden ist, angefügt. Zum Beispiel kann, falls das Plasmid pBR322 eingesetzt wird, das Restriktionsenzym Pst I verwendet werden, um das Plasmid an dem Ampicillin-resistenen Gen zu verdauen. Komplementäre dC-Schwänze werden den 3'-Enden der doppelsträngigen cDNA vor der Insertion des cDNA-Segments in das Plasmid mit einem geeigneten Annealing-Puffer hinzugefügt.
Es versteht sich, daß die doppelsträngige cDNA durch verschiedene andere Standardverfahren in Plasmid-Klonierungsvektoren insertiert werden kann. Eine derartige Alternativ-Technik beinhaltet das Befestigen von synthetisierten Nucleotid-Linkern an den Enden der cDNA-Stränge unter Verwendung von DNA-Ligase. Die Linker werden mit einem Restriktionsenzym abgespaltet, um klebende Enden für die Insertion in ein mit demselben Restriktionsenzym gespaltenes Plasmid zu erzeugen. Scheller et al. 196 Science 177-180 (1977); Maniatis et al., oben bei 219.
Die wie oben hergestellten rekombinanten cDNA-Plasmide , werden zur Transformierung von Wirtszellen verwendet. Obwohl der Wirt irgendeine geeignete prokaryotische oder eurkaryotische Zelle sein kann, ist er vorzugsweise ein gut definiertes Bakterium, wie z. B. E. coli, oder ein Hefestamm. Derartige Wirte werden ohne weiteres transformiert und sind in der Lage, in einer Kultur schnell zu wachsen. E. coli kann durch andere Formen von Bakterien, wie z. B. Salmonella oder Pneumococcus, ersetzt werden. Anstelle von Bakterien können andere einzellige Mikroorganismen verwendet werden, z. B. Pilze und Algen. Unabhängig davon, welcher Wirt gewählt wird, sollte dieser kein Restriktionsenzym enthalten, welches das rekombinante Plasmid spalten würde.
Falls E. coli als Wirt eingesetzt wird, sind vorzuziehende Stämme MM294 und RR1. Protokolle für die Transformierung des MM294-Wirts durch einen Plasmidvektor sind wohlbekannt, wie in Maniatis et al., oben bei 255; und Hanahan, 166 J. Mol. Biol. 557 (1983), dargelegt. Protokolle für die Transformierung des RR1-Wirts durch einen Plasmidvektor sind ebenfalls wohlbekannt, wie in Bolivar et al., 2 Gene 95 (1977) und Peacock et al., 655 Biochem. Biophys. Acta. 243 (1981), dargelegt. Andere Stämme von E. coli, die ebenfalls als geeignete Wirte dienen könnten, schließen DH1 (ATCC Nr. 33849) und C600 ein. Diese Stämme und die MM294- und RR1-Stämme sind verbreitet im Handel erhältlich.
Bei den Transformierungsprotokollen, einschließlich derer, die von Maniatis et al., oben, und Hanahan, oben, beschrieben werden, wird nur ein kleiner Teil der Wirtszellen aufgrund der begrenzten Plasmidaufnahme durch die Zellen tatsächlich transformiert. Die Zellen die transformiert worden sind, können identifiziert werden, indem man die Zellkultur auf Agarplatten, die ein geeignetes Wachstumsmedium und ein phänotypisches Identifizierungsmittel, wie z. B. ein Antibiotikum, enthalten, gibt. Nur jene Zellen, die das geeignete Resistenzgen aufweisen (z. B. gegen das Antibiotikum) überleben. Falls das rekombinante pBR322-Plasmid zur Transformierung des E. coli-Stammes MM294 eingesetzt wird, können die transformierten Zellen unter Verwendung von Tetracyclin als phänotypischem Identifizierungsmittel identifiziert werden.

Herstellung einer synthetischen Oligonucleotid-Prüfsonde

Ein radioaktiv markiertes synthetisches Oligonucleotid, das einem Teil des N-terminalen Teils der Aminosäuresequenz des Human-IL-1-Moleküls, wie oben bestimmt, entspricht, wird als Sonde zur Durchmusterung der cDNA-Bibliothek eingesetzt. Die Hybridisierung der synthetischen Oligonucleotid-Sonde mit aus den Bibliotheks-Klonen hergestellter Plasmid-cDNA wird anschließend durch Autoradiographie identifiziert.
Der N-terminale Teil der Aminosäurezusammensetzung des IL-1-Moleküls wurde oben als aus den Resten: NH&sub2;-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp- Ser-Gly-Gln-Lys -Ser-Leu-Val-Me t-Ser-Gly- Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-Ala-Leu-His-Leu- Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gln-Gln-Val zusammengesetzt, bestimmt. Diese Sequenzinformation wird als Basis für die synthetische Oligonucleotid-Sonde verwendet.
Die Anmelder haben ein synthetisches Oligonucleotid aus der obigen Aminosäuresequenz zur Verwendung als Sonde zur Durchmusterung von Plasmid-DNA, von der angenommen wird, daß sie das IL-1-Gen enthält, entwickelt. Die Sonde ist aus der folgenden Sequenz zusammengesetzt, die der gegenläufigen Sequenz entspricht, die durch die obige Aminosäuresequenz stromabwärts vom ersten Met- Rest codiert wird: 5'-AC TTG TTG TTC CAT GTC TTG GCC TTG CAG GTG CAG GGC TTT CAG TTC GTA GGG GCC GGA CAT-3'. Diese Sonde hat den Vorteil, daß sie kurz genug ist, um leicht synthetisiert zu werden, während sie lang genug ist, um ausreichend Information zu enthalten, um als Sonde für das IL-1-Gen brauchbar zu sein. Obwohl die beschriebene Oligonucleotidsequenz eine bevorzugte Zusammensetzung der synthetischen Sonde der vorliegenden Erfindung ist, versteht es sich, daß Sonden mit anderen Zusammensetzungen, die anderen Segmenten der N-terminalen Aminosäuresequenz des IL-1-Moleküls entsprechen, eingesetzt werden können, ohne vom Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Die synthetischen Oligonucleotid-Sonden können durch wohlbekannte Techniken chemisch synthetisiert werden, wie z. B. durch Phosphodiester- oder -triester- Verfahren. Die Details der Triester-Synthese-Technik sind in Sood et al., 4 Nucl. Acid Res. 2557 (1977); und Hirose et al., 28 Tet. Lett. 2449 (1978) dargelegt. Nach der Synthese wird die Oligonucleotid-Sonde mit T4-Polynucleotidkinase und ³²P-ATP markiert. Ein Standard-Protokoll für das Markierungsverfahren ist in Maniatis et al., oben bei 122, dargelegt. Vorteilhafterweise können die Oligonucleotid-Sonden mit OH-5'-Termini synthetisiert werden, wodurch das typischerweise erforderliche Phosphatase-Verfahren vermieden wird.

Durchmusterung der cDNA-Bibliothek

Im Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung werden die transformierten Spezies in Gruppen zusammengegeben, von denen jede aus etwa 2000 transformierten Spezies zusammengesetzt ist. Die replizierten Plasmide werden aus den transformierten Spezies unter Verwendung irgendeiner der vielen wohlbekannten Techniken, wie z. B. durch alkalische Lyse, extrahiert. Plasmid-DNA wird hergestellt durch Spaltung der Plasmide an den Pvu II- und Hind III- Restriktionsstellen, wobei beide einzigartige Stellen auf dem Hybridplasmid sind. Die resultierenden DNA-Segmente werden durch Elektrophorese an Agarosegel fraktioniert und dann direkt durch Southern Blotting analysiert, wie in Southern, 98 J. Mol. Biol. 503 (1975), beschrieben. Die DNA, die sich an den Nitrocellulose-Filter im Southern Blotting-Verfahren bindet, wird mit der markierten Oligonucleotid-Sonde hybridisiert. Die speziellen DNA-Fragmente, die mit der Probe hybridisieren, werden durch Autoradiographie identifiziert.
Die spezielle(n) Gruppe(n) von Klonen, die nach der Autoradiographie ein Signal ergibt (ergeben) wird (werden) ausplattiert und in einer direkten Bakterienkolonie-Hybridisierung auf einem Nitrocellulose-Filter mit denselben oben identifizierten Oligonucleotid-Sonden verwendet. Nach der Beendigung der Hybridisierung wird der Nitrocellulose-Filter durch Autoradiographie überprüft, um die größte Kolonie zu identifizieren. In der vorliegenden Erfindung haben die Anmelder eine solche Kolonie entdeckt. Die als IL-1 X-14 bezeichnete Plasmid-DNA wird aus der identifizierten speziellen positiven Kolonie hergestellt.

Charakterisierung von durchmusterter cDNA

Die oben hergestellte Plasmid-DNA wird durch Herstellen einer Restriktionsenzym-Karte charakterisiert. Verschiedene Strategien zur Erstellung einer Restriktionsenzym-Karte werden von Maniatis et al., oben bei 374, diskutiert. Eine Standardtechnik beinhaltet die partielle Verdauung von an den Enden markierten Fragmenten von linearer DNA. Diese Technik wurde von Smith und Birnstiel, 3 Nucl. Acids Res. 2387 (1976), entwickelt. Eine Teil-Restriktionsenzym-Karte des Plasmids IL-1 X-14 in der Region des IL-1-Gens ist in Fig. 3 gezeigt. Die Entfernung zwischen Restriktionsstellen ist in Basenpaaren ("bp") angegeben. Die Pst I-Restriktionsstellen, die in eckigen Klammern gezeigt sind, sind diejenigen, die durch die Klonierungsverfahren erzeugt wurden.
Die Plasmid-cDNA, von der die in Fig. 3 erläuterte Karte erstellt wurde, wurde unter Verwendung des Ketten-Abbruchverfahrens sequenziert. Dieses Verfahren der Nucleotid-Sequenzierung wurde erstmals von Sanger et al., 70 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 5463 (1977), angewendet. Siehe auch US-Patent Nr.- 4 322 499. Verfahren für die Kettenabbruchs-Sequenzbestimmung sind in dem Amersham Handbook, betitelt M13 Cloning and Sequencing, Blenheim Cresent, London (1983) (im folgenden "Amersham Handbook"); in Messing, 2 Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Publication No. 79-99, 2, 43-48 (1979); Norrander et al., 26.Gene 101 (1983); Cerretti et al., 11 Nucl. Acids Res. 2599 (1983); und Biggin et al., 80 Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 3963 (1983), dargelegt. M13-Filament-Phagen werden als Vektoren zur Klonierung der interessierenden DNA- Sequenzen eingesetzt. Diese Phagen-Vektoren stellen einsträngige DNA-Template (Matrizen) bereit, die durch das Kettenabbruchs-Verfahren ohne weiteres sequenziert werden, welches das Primen eines einsträngigen Templatmoleküls mit einem kurzen Primer-Strang mit einer freien 3'-Hydroxylgruppe und die anschließende Verwendung von DNA-Polymerase, um den Templat-Strang in einer Kettenverlängerungsreaktion unter Verwendung aller vier Desoxyribonucleotidtriphosphate, d. h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP (kollektiv als "dNTPs" bezeichnet), wobei eines davon radioaktiv markiert ist, zu kopieren, beinhaltet. In der Synthesereaktion wird ein Nucleotid-spezifischer Kettenabbrecher, der keinen 3'- Hydroxyl-Terminus aufweist, z. B. ein 2',3'-Didesoxynucleotidtriphosphat ("ddNTP"), verwendet, um eine Reihe von Kettenverlängerungen unterschiedlicher Länge zu erzeugen. Der Abbrecher hat einen normalen 5'-Terminus, so daß er in eine wachsende DNA-Kette einverleibt werden kann, hat aber keinen 3'-Hydroxyl- Terminus. Sobald der Abbrecher in die DNA-Kette integriert worden ist, können keine weiteren Desoxynucleotidtriphosphate hinzugefügt werden, so daß das Wachstum der Kette endet. Vier separate Synthetisierungsreaktionen werden durchgeführt, wobei jede ein ddNTP von einem der vier Nucleotid-dNPTs, d. h. dATP, dCPT, dGTP und dTTP, aufweist. Eines der normalen dNTPs wird radioaktiv markiert, so daß die synthetisierten Stränge nach ihrer Sortierung nach der Größe auf einem Polyacrylamidgel mit Hilfe der Autoradiographie untersucht werden können. Die Kettenverlängerungen aus den vier Reaktionen werden Seite an Seite auf separate Gelbahnen gegeben, so daß das Muster der Fragmente aus der Autoradiographie der DNA-Sequenz der klonierten DNA entspricht.
Die DNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen der Plasmid-cDNA in Fig. 3, wie durch die obigen Techniken bestimmt, sind in Fig. 4 dargestellt. Die Nucleotide sind ausgehend vom Beginn der in Fig. 4 gezeigten Sequenz numeriert. Die Aminosäuren sind ausgehend vom reifen NH&sub2;-Terminus des IL-1- Proteins, d. h. dem Ala-Rest, mit einem Pfeil markiert, hin zum Ser-Rest (Nr. 153), der dem Abbruchs-Kodon TAA benachbart ist, numeriert. Die kodierende Region des IL-1-Gens, die sich vom Ala-Kodon zum TAG-Abbruchs-Kodon erstreckt, ist als umrandeter Teil in Fig. 3 gezeigt. Die Restriktionsenzym-Spaltstellen, die in Fig. 3 identifiziert sind, sind auch in Fig. 4 angegeben.
Bei der Vorbereitung auf die Sequenzierungsverfahren wird der in Fig. 3 gezeigte Plasmid-cDNA-Abschnitt mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen verdaut und dann werden die resultierenden DNA-Fragmente in M13-Phagen-Vektoren kloniert, um einsträngige DNA-Template zu bilden. Ein universeller Primer wird eingesetzt, um stromaufwärts und stromabwärts von Zwischenstellen der hin- und gegenläufigen Stränge zu sequenzieren. Statt sich auf die Sequenzierungsergebnisse, die aus der Sequenzierung der gesamten Länge der Fragmente mit einem einzigen Kettenabbruchs-Verfahren erhalten werden, zu verlassen, werden zusätzliche synthetisch hergestellte Primer verwendet, um das Kettenabbruchsverfahren von anderen Zwischenstellen entlang der Länge. Der Stränge aus zu initiieren. Durch dieses Verfahren werden beide Stränge der in Fig. 3 gezeigten Plasmid-cDNA in überlappender Weise sequenziert, wodurch sie dazu dienen, die Sequenzen in redundanter Weise zu bestätigen.
Es versteht sich, daß statt des Einsatzes der oben skizzierten Kettenabbruchs-Technik andere bekannte Verfahren eingesetzt werden können, um das IL-1-Gen zu sequenzieren. Zum Beispiel kann das chemische Abbauverfahren von Maxam und Gilbert, wie in 74 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 560 (1977) beschrieben, eingesetzt werden.
Aminosäuresequenz-Untersuchungen von wie oben hergestelltem und gereinigtem IL-1 wurden gemäß dem Verfahren von Stern et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 871 (1984) durchgeführt. Die Endopeptidase-Cyanogenbromid wurde eingesetzt, um das IL-1 an den Methionin-Resten zu schneiden und daraufhin wurden die resultierenden Fragmente durch ein Standard-Edman-Abbau-Verfahren analysiert. Durch dieses Verfahren haben die Anmelder bestätigt, daß der C-Terminus des IL-1-Proteins aus der Aminosäuresequenz: Gln-Phe-Val-Ser-Ser zusammengesetzt ist. Dies beweist, daß das "natürliche" IL-1 nach der Translatierung aus mRNA nicht durch Entfernung von Aminosäuren von diesem Ende des Moleküls verarbeitet wird. Dies ist wichtig, da klar ist, daß ein Großteil des kodierten Proteins während der Reifung des IL-1 aus seinem Vorläufer von dem 5'-Ende des offenen Ablesrahmens des IL-1-Gens entfernt wird.

Expression von funktionalem IL-1 aus einem cDNA-Klon

Um zu bestimmen, ob die kodierende Region des IL-1 X-14-Klons für funktionales IL-1 kodieren kann, wird der Klon in einem prokaryotischen/eukaryotischen Wirtssystem exprimiert. Ein Hybrid-cDNA-Fragment, das die kodierende Region des IL-1 X-14-Klons enthält, wird in einen Expressions- Schaukelvektor insertiert, der zwei Sätze von Replikationssequenzen aufweist, eine erste Sequenz für die Amplifikation des Vektors in prokaryotischen Wirtszellen und eine zweite Sequenz für die Expression auf hohem Niveau von fremdem Strukturprotein, d. h. IL-1, in eukaryotischen Wirtszellen. Die transformierten eukaryotischen Wirtszellen werden geerntet und auf die Expression von reinem IL-1 unter Verwendung der oben im Detail beschriebenen Thymocyten- Proliferations- und IL-2-Umwandlungs-Assays untersucht.
Verschiedene Arten von Schaukelvektoren sind entwickelt worden. Ein gebräuchlicher Typ beinhaltet einen Replikations-Origin und Promotor-Sequenzen, die ein Signal für die DNA-Replikation in prokaryotischen Zellen typischerweise E. coli liefern, und einen vergleichbaren Replikations-Origin und Promotor- Sequenzen, die ein Signal für die DNA-Replikation in eurkaryotischen Zellen, am häufigsten Hefezellen, liefern. Der Schaukelvektor schließt auch einen phänotypischen Marker, wie z. B. ein Arzneistoff-resistentes Gen, für die Selektion der transformierten prokaryotischen Zellen ein. Der Schaukelvektor weist einen vergleichbaren phänotypischen Markerwechsel für die Selektion von transformierten eukaryotischen Zellen auf. Idealerweise werden für die Expression von IL-1 auf hohem Niveau alle Protein-kodierenden Sequenzen aus der eukaryotischen Promotor-Sequenz entfernt, um die Expression eines nichterwünschten Proteins zu vermeiden. Zu diesem Zweck wird auch eine natürliche oder synthetische Initiator-Kodon-Sequenz, d. h. ATG, an dem 5'-Ende der insertierten Kodierungsregion des IL-1-Gens befestigt.
Ein vorzuziehender Schaukelvektor zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird als pY ADH bezeichnet. Wie schematisch in Fig. 5 veranschaulicht, beinhaltet das pY ADH-Plasmid einen Replikations-Origin (aus Plasmid pBR322) für die DNA-Expression in E. coli in einer hohen Kopienzahl und ein Ampicillin (/Amp®")-resistentes Gen für die Selektion von transformierten E. coli-Zellen. Der Schaukelvektor schließt ach den zirkulären 2u-Replikations- Origin und ein Hefe-Trp I-Gen für die Selektion von transformierten Hefewirten in Hefe (trp minus)-Auxotrophen ein. Der Schaukelvektor schließt ferner die Hefe-Promotor-Sequenz aus dem Alkoholdehydrogenase-Gen ("ADH") für die Fortpflanzung des Plasmids in sowohl Hefe- als auch E. coli-Wirten ein. Diese Promotor-Sequenz ist aufgrund der starken Expression dieses Gens in Hefe und weil die vollständige DNA-Sequenz dieses Gens bekannt ist, von besonderem Vorteil zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Alle Protein- Kodierungs-Sequenzen, einschließlich des Initiator-ADG-Codons, sind aus dem ADH-Promotor-Fragment entfernt worden. Der pY ADH-Schaukelvektor schließt eine Anzahl von einzigartigen Substratstellen für die Spaltung mit Restriktionsenzymen, d. h. Eco RI und Stu I, ein.
Wie in Fig. 5 veranschaulicht, wird das pY ADH IL-1-Plasmid als Expressionsvektor für die Expression von IL-1-Gen durch Insertion der Kodierungsregion des IL-1-Gens in das Plasmid pY ADH hergestellt. Beispiele für diesen Schaukelvektor sind bei der American Type Culture Collection ("ATCC"), 12361 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter der Zugangsnr. 39967 hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde am 21. Dezember 1984 durchgeführt und betrifft das Plasmid pY ADH IL-1. im E. coli-Stamm RR1. Die Kodierungsregion des IL-1-Gens wird aus dem oben hergestellten cDNA-Plasmid entfernt. Aufgrund der Abwesenheit einer einzigartigen Restriktionsenzym-Schnittstelle genau am 5'-Ende der Kodierungsregion des IL-1-Gens wird ein Großteil der Kodierungsregion mit den Restriktionsenzymen Hpa II und Pst I von der Plasmid-cDNA abgespaltet. Die Hpa II-Stelle befindet sich leicht stromabwärts vom 5'-Ende der Genkodierungsregion. Daraufhin wird ein synthetisches Oligonucleotid, das das abgespaltene 5'-Ende des Gens enthält, chemisch mit einem Hpa II-klebenden 3'-Ende für die bequeme Ligierung des "natürlichen" Haupt-IL-1-cDNA-Fragments synthetisiert. Da, wie oben erwähnt, alle Protein-Kodierungssequenzen stromabwärts von der ADH- Promotorsequenz entfernt wurden, wird das synthetische Oligonucleotid mit einem ATG-Initiierungscodon an seinem 5'-Ende synthetisiert.
Das IL-1-cDNA-Fragment wird zusammen mit dem synthetischen Oligonucleotid in den Schaukelvektor pY ADH, der zuvor mit geeigneten Restriktionsenzymen, die den Konfigurationen des 5'-Endes des synthetischen Oligonucleotids und des 3'-Endes des Haupt-IL-1-cDNA-Fragments entsprechen, verdaut wurde, insertiert. Der resultierende rekombinante Schaukelvektor pY ADH IL-1 wird zur Transformierung eines prokaryotischen Wirts, z. B. E. coli, zwecks Amplifikation des Schaukelvektors in einer hohen Kopienzahl eingesetzt. Nach diesem anfänglichen Transformationsverfahren wird der rekombinante Schaukelvektor aus dem E. coli- Wirt isoliert und dann eingesetzt, um einen eukaryotischen Wirt, z. B. Hefezellen, zwecks Expression von IL-1 auf hohem Niveau zu transformieren. Die transformierten Hefezellen werden geerntet und der resultierende Überstand wird unter Verwendung der oben beschriebenen Thymocyten-Proliferations- und/oder IL-1-Umwandlungs-Assays auf biologische Aktivität hin untersucht.
Die Verfahren und Produkte der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

BEISPIEL 1

IL-1-Herstellung

Leukozytenkonzentrate mit einem Volumen von 300 bis 400 ml, aus Human- Vollblut (Mischung vom Roten Kreuz Portland, Oregon) erhalten, wurden mit Ca&spplus;&spplus;-, Mg&spplus;&spplus;-freier Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ("PBS") gemischt und verdünnt, auf Histopaque (Sigma Chemical Company,. St. Louis, MO) aufgeschichtet und dann bei 600·g 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Grenzflächenschicht, die aus den Leukozyten bestand, wurde isoliert, mit PBS gewaschen und bei 400·g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Zellen wurden noch zweimal in Ca&spplus;&spplus;-, Mg&spplus;&spplus;-freier PBS gewaschen und nach jedem Waschvorgang bei 200·g 10 Minuten lang zentrifugiert.
Die resultierenden einkernigen Zellen in einer Konzentration von 2·10&sup6; Zellen/ml wurden in Schleuderkolben in MEM-Medium kultiviert. Das Medium wurde mit 50 U/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin, 0,2 mM Gentamycin, 10 mM HEPES, pH 7,4, ergänzt. Die Zellen wurden durch Zugabe von 0,01 mg/ml Hitze-desaktivierter, an Formal in fixierter Staphylococcus aureus (Igsorb, The Enzyme Center, Inc., Malden, MA) zur Produktion von IL-1 angeregt. Um die Produktion von kontaminierenden Proteinen zu vermindern, wurde dem Kulturmedium kein Serum zugegeben. Nach 24stündiger Inkubation bei 35ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Luft wurde die Kultur bei 7000·g 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und dann wurde der Überstand entfernt und in Polypropylenflaschen bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Z

BEISPIEL 2

Ionenaustausch-Chromatoaraphie

IL-1-haltige Überstände, wie in Beispiel 1 hergestellt, wurden durch Kationenaus tausch-Chromatographie und Anionenaus tausch-Chromatographie gereinigt. Diese Chromatographie-Verfahren wurden bei 4ºC durchgeführt und die dabei verwendeten Gele wurden mit 0,1% Triton-X und 10% Vol/Vol Kälberfeten-Serum vorbehandelt, um die nicht-spezifische Absorption von IL-1-Aktivität an den Harzen zu vermindern. Vor den Chromatographie-Verfahren wurde der Kultur- Überstand wie oben beschrieben untersucht. Man fand, daß die Roh-IL-1-Lösungen eine typische Gesamtaktivität von 1,98·10&sup7; U, eine spezifische Aktivität von 6,37·10&sup4; U/mg Probe und einen Gesamtproteingehalt von 3,11·10&sup5; ug aufwiesen.

A. Kationenaustausch-Chromatographie

Die Ionenstärke des Kultur-Überstands wurde durch Zugabe von 1 M Natriumcitrit-Puffer, pH 4,0, auf eine Endkonzentration von 10 mM Citrit eingestellt und auch mit konzentrierter HCl auf einen pH von 4,0 erniedrigt. Der auf diese Weise eingestellte Überstand wurde auf eine 30·1,6 cm-Säule von Sulfopropyl- Sephadex ("SPS") C-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), die zuvor mit demselben Puffer zusammen mit 150 mM NaCl, pH 4,0, äquilibriert worden war, aufgegeben. Der Kultur-Überstand wurde mit einer Geschwindigkeit von 400 ml/- Stunde auf die Säule gegeben.
Nachdem die Beladung beendet war, wurde die Säule mit 10 Säulenvolumina und 10 mM 2-N-Morpholinoethansulfonsäure ("MES") -Puffer, pH 5,0, gewaschen, um nichtgebundenes Protein zu entfernen. Das gebundene Protein wurde dann mit vier Säulenvolumina von 10 mM Tris-HCl, pH 8,1, mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/Stunde auf die Säule gegeben, von der Säule eluiert. Es wurde gefunden, daß der pH der Säule nach der Aufgabe von etwa 3 Säulenvolumina des Elutionsmittels anstieg, was zu der Elution des IL-1-Peaks führte. Säulenfraktionen wurden wie oben diskutiert gesammelt und untersucht.
Die Anmelder haben gefunden, daß das von der Kationenaustausch-Säule eluierte IL-1 eine Aktivität von etwa 1,1·10&sup7; U und eine spezifische Aktivität von etwa 2,10·10&sup5; U/mg aufwies, wodurch eine etwa dreifache Zunahme der IL-1-Aktivität erreicht wurde, während etwa 56% des ursprünglichen IL-1 zurückbehalten wurden. Auch wurden etwa 80% der kontaminierenden Proteine durch das Kationenaustauschchromatographie-Verfahren entfernt.

B. Anionenaustausch-Chromatographie

Das zusammengegebene Konzentrat aus der Kationenaustauschsäule wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie an einer Säule aus DEAE-Sephacel (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) weiter gereinigt. Die DEAE-Sephacel-Säule wurde mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,1, äquilibriert. Da das IL-1 mit demselben Äquilibrierungspuffer von der SPS-Säule eluiert wurde, wurde der SPS-"Pool" mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/Stunde direkt auf die DEAE-Sephacel-Säule geladen, wodurch jedweder Aktivitätsverlust durch Dialyse vermieden wurde. Nach der Beladung wurde die Säule mit 5 Säulenvolumina desselben Äquilibrierungspuffers gewaschen und dann wurde die Elution mit einem linearen Gradienten von 4 Säulenvolumina von 0 bis 400 mM NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 8,1, durchgeführt.
Die Anmelder haben gefunden, daß die IL-1-Aktivität in einem scharfen Peak bei 0,08 bis 0,12 M NaCl eluiert wurde. Die SDS-PAGE-Analyse der Elutionsfraktionen offenbarte einige hochmolekulare Verunreinigungen und drei Hauptbanden von Molekulargewichten von etwa 17500, 15000 und 12006 Dalton. Die Analyse des Säuleneluats zeigt eine Gesamtaktivität von 7,75·10&sup6; U, eine spezifische Aktivität von 2,58·10&sup6; U/mg, ein Gesamtprotein von 3·10³ ug und eine Ausbeute von etwa 39%.

BEISPIEL 3

Affinitäts-Chromatographie

Die aktiven Fraktionen von Beispiel 2 wurden zwecks weiterer Reinigung durch die Affinitäts-Chromatographie-Technik unter Verwendung einer 10·1,6 cm-Säule des Farbstoff-Liganden ("Procion"-Rot-Farbstoff, der an eine Agarose-Matrix (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD, Cat. No. 5926 SA) gekuppelt war, die in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,1, voräquilibriert worden war, zusammengegeben. Um die Bindung des IL-1 an die Farbstoff-Ligand-Säule zu optimieren, wurde die Ionenstärke des DEAE-Sephacel-"Pools" durch 1:4-Verdünnung des "Pools" in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,1, auf unter 40 mM gesenkt. Die Farbstoff- Ligand-Säule wurde zunächst mit 4 Säulenvolumina desselben Ausgangs-Puffers gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen, und dann wurde die Elution mit einem linearen Gradienten, der aus 15 Säulenvolumina von 0 bis 1,0 M NaCl in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,1, zusammengesetzt war, durchgeführt. Die Anmelder haben gefunden, daß die IL-1-Aktivität typischerweise in einem scharfen Peak bei 0,50 bis 0,55 M NaCl eluiert wurde. Säulenfraktionen wurden wie oben beschrieben gesammelt und untersucht.
Die SDS-PAGE-Analyse der IL-1-aktiven Fraktionen offenbarte eine einzelne Proteinbande mit einem Molekulargewicht von etwa 17500 Dalton. Die oben erwähnten hochmolekularen Banden wurden beim Durchströmen von der Säule eluiert und die niedermolekularen Banden von 15000 und 12000 Dalton wurden bei höherer Salzkonzentration eluiert. An den aktiven IL-1-Fraktionen durchgeführte Assays offenbarten eine Gesamtaktivität des IL-1 von etwa 6,2·10&sub6; U, eine spezifische Aktivität von etwa 9,5·10&sup8; U/mg und einen Gesamtproteingehalt von etwa 6,5 ug. Dies kommt einer Gesamtreinheit des IL-1 von größer 99% und einer Ausbeute von etwa 31%, ausgehend von den Ausgangs-Überständen, gleich. Aufgrund der einzelnen Proteinbande, die sich aus der SDS-PAGE und der Silber-Anfärbung der Fraktionen, die nach der Farbstoff-Ligand-Affinitätschromatographie gesammelt wurden, ergab, und auch aufgrund der spezifischen Aktivitäten der analysierten Fraktionen ist es klar, daß die wesentliche Homogenität des IL-1-Moleküls durch die vorliegende Erfindung erreicht wurde, während eine hohe Ausbeute an IL-1 aufrechterhalten wurde.
Das homogene IL-1, das aus der Farbstoff-Ligand-Affinitäts-Chromatographie erhalten wurde, wurde wie oben bemerkt auch durch zweidimensionale Polyacrylamid- Gelelektrophorese zusammen mit Silber-Anfärbung analysiert. Dieses Verfahren lieferte durchgehend vier Anfärbungs-Flecken bei exakt demselben Molekulargewicht, d. h. 17500 Dalton, und ergab dieselbe Farbe des Silberfleckens. Die Flecken befanden sich stets in derselben Position und hatten dieselben relativen Anteile, unabhängig davon, welche Charge des Ausgangs-Überstands eingesetzt wurde. Der intensivste Fleck hat einen pI-Wert von 6,3 bis 5,9 angezeigt. Die anderen drei Flecken ergeben mit zunehmend saurem pH-Gradienten eine weniger intensive Färbung. Diese Ergebnisse zeigen an, daß Human-IL-1 in vivo in unterschiedlichen geladenen Zuständen vorkommt, möglicherweise bedingt durch unterschiedliche Amidierungszustände. Die Tatsache, daß die Silber-Anfärbung für jeden Fleck exakt dieselbe Farbe liefert, zeigt an, daß in allen Fällen höchstwahrscheinlich dasselbe Stammprotein die Färbung verursacht.

BEISPIEL 4

Affinitäts-Chromatographie - blauer Farbstoff

Als Alternative zu Beispiel 3 werden aktive Fraktionen aus Beispiel 2 zusammengegeben und dann durch im wesentlichen dieselbe Affinitäts-Chromatographie-Technik, die in Beispiel 3 eingesetzt wurde, gereinigt, mit der Ausnahme, daß der Farbstoff-Ligand aus Cibacron® Blue 36A-Farbstoff, der an eine Agarose- Matrix (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD, Cat. No. 5904 SA) anvernetzt war, zusammengesetzt war. An den aktiven Fraktionen durchgeführte Assays zeigten eine Gesamtaktivität des IL-1 von etwa 5,0·10&sup6; U und eine spezifische Aktivität von etwa 7,6·10&sup8; U/mg, was etwa 80% der Aktivität ist, die in dem vom roten Farbstoff abgeleiteten IL-1 anwesend war. Um eine größere Reinheit zu erzielen, können die aktiven Fraktionen aus der Affinitäts-Chromatographie mit blauem Farbstoff-Ligand gesammelt werden und das Verfahren kann wiederholt werden.

BEISPIEL 5

Aminosäurezusammensetzungs-Analyse

Gereinigtes IL-1 aus Beispiel 3 oder 4 wurde im Vakuum in 5,7 N HCl (aus konzentrierter HCl (Kodak, Rochester, NY) redistilliert) 24 Stunden und 48 Stunden lang gekocht, um eine Hydrolyse der Peptidbindungen und die Freisetzung von freien Aminosäuren zu verursachen. Nach der Hydrolyse wurden Proben unter Vakuum getrocknet und dann in 0,2 N Natriumcitrat, pH 2,2, wieder suspendiert. Die Proben wurden dann in ein Aminosäure-Analysiergerät mit Ninhydrin-Nachweis und einer Säule, LKB Mill 4150-Alpha (Cambridge, England) eingespritzt. Die Flächen der gelieferten "Peaks", die den Mengen von speziellen anwesenden Aminosäuren entsprachen, wurden mit einem LKB Model 2220-Aufzeichnungsintegrator integriert.
Die Aminosäurezusammensetzung von Human-IL-1, wie durch die vorliegende Technik bestimmt, ist in Tabelle I unten angegeben. Wie in Tabelle I angezeigt, wurde durch die obige Aminosäureanalyse kein Glucosamin oder Galactosamin beobachtet, was den früheren Feststellungen der Anmelder entspricht, daß Human-IL-1 auf Polyacrylamidgelen als Spezies mit einem einzigen Molekulargewicht wandert. Eine oder beide dieser Feststellungen würden wahrscheinlich nicht zutreffen, wenn Human-IL-1 daran geknüpfte Kohlenhydrateinheiten einschließen würde. Somit ist es unwahrscheinlich, daß Human-IL-1 ein Glykoprotein ist.

TABELLE I

Aminosäureanalyse von Human-IL-1

Aminosäure Zahl der Reste pro Molekül Asp/Asn 14
Thr 8
Ser 11
Glu/Gln 22
Pro 6
Gly 11
Ala 8
Cys 1*
Val 11
Met 4
Ile 6
Leu 11
Tyr 4
Phe 11
His 3
Lys 13
Arg 3
* Durch Aminosäuresequenz-Analyse bestimmt

BEISPIEL 6

Aminosäuresequenz-Analyse des N-terminalen Teils des Moleküls

Fraktionen, die homogenes IL-1 aus den Farbstoff-Ligand-Affinitätschromatographie-Verfahren der Beispiele 3 oder 4 enthielten, wurden zunächst zehnfach mit entionisiertem destillierten Wasser verdünnt, mit 1 N HCl auf pH 4,0 eingestellt und dann auf eine SPS C-25-Chromatographie-Säule mit einem Bettvolumen von 0,5 ml gegeben. Vor der Aufgabe des IL-1 wurde die Säule mit einem Puffer, der aus 0,1 M Natriumcitrat, 0,05 M NaCl, pH 4,0, zusammengesetzt war, äquilibriert. Nach der Beladung mit dem IL-1 wurde die Säule mit 10 ml desselben Äquilibrierungspuffers gewaschen, gefolgt von einer Wäsche mit 20 ml entionisiertem destillierten Wasser. Daraufhin wurde das Il-1 mit 10 mM Natriumborat, pH 9,0, eluiert.
In einem ersten Sequenzierungsanalyse-Verfahren wurden 11,1 ug wie oben konzentriertes homogenes IL-1 unter Vakuum getrocknet und dann direkt einem automatisierten Amino-terminalen Edman-Abbau unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 470-Protein-Sequenziergeräts unterworfen. Mit Hilfe dieses Verfahrens entdeckten die Anmelder, daß der N-terminale Teil des IL-1-Moleküls aus der folgenden Sequenz von Aminosäureresten zusammengesetzt ist: NH&sub2;-Ala- Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu--Val-Met.
In einem zweiten Sequenzierungsanalyse-Verfahren wurde das homogene IL-1 mit dem Enzym Trypsin fraktioniert und dann einer automatisierten Sequenzierungsanalyse unterzogen. Vor der Fraktionierung der IL-1-Moleküle mit Trypsin wurden die Seitenketten der Lysinreste mit dem speziellen Mittel Citraconsäureanhydrid blockiert. Zu diesem Zweck wurden Fraktionen aus dem SPS C-25-Säuleneluat im Vakuum auf ein Endvolumen von 1 ml konzentriert. Ein ul Citraconsäureanhydrid (Pierce) wurde dem konzentrierten IL-1 zugegeben und dann wurde der pH mit 5 N NaOH auf 8,3 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten lang gerührt und man ließ sie eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine zweite 1 ul-Menge Citraconsäure zugegeben, die Reaktionsmischung wurde weitere 15 Minuten gerührt und dann wurde die Mischung mit 5 N NaOH auf einen End-pH von 8,3 eingestellt. Nach zusätzlichem Stehen bei Raumtemperatur für eine Stunde wurden der Reaktionsmischung 100 ul 1 M Tris-HCl, pH 7,4, und 100 ul 1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,8, zugegeben, um das Blockierungsverfahren zu vervollständigen.
Als nächstes wurden 2 ug mit TPCK-behandeltes Trypsin (Worthington) (in 10 ul 10 mM HCl, pH 2,0) der Reaktionsmischung zugegeben, um das IL-1-Molekül an den Argininresten zu spalten. Nach der Zugabe des Trypsins wurde die Mischung 5 Sekunden lang leicht gerührt und dann 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach dem Ende der Inkubationszeit wurden zusätzliche 2 ug mit TPCK- behandeltes Trypsin zugegeben und die Mischung wurde weitere 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Mischung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 90%iger Ameisensäure (Baker) auf pH 2,5 eingestellt. Nach vierstündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die angesäuerte Mischung durch Zugabe von 0,5 ml 6 M Guanidin-HCl verdünnt und dann auf eine 4,6·250 mm Vydac 218 TP-Säule aufgespritzt, die zuvor mit 0,1% TFA (Vol/Vol) in Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 ml/Minute mit einer Pumpe, Beckman Model 112 (Beckman Instruments, Division of Smith Kline Beckman), äquilibriert worden war. Die beladene Säule wurde zunächst mit 0,1% TFA (Vol/Vol) in Wasser gewaschen, um nicht-gebundene Komponenten zu entfernen und dann wurden die IL-1-Peptide mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100% Acetonitril in 0,1% TFA (Vol/Vol) mit einer Geschwindigkeit von 0,5%/Minute bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute aus der Säule eluiert. Die Elution der Peptide wurde durch UV-Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 230 nm nachgewiesen.
Einzelne Fraktionen oder "Pools", die aus zwei oder mehr Fraktionen, die IL-1-Peptide enthielten, zusammengesetzt waren, wurden durch automatisierten N-terminalen Edman-Abbau sequenziert. Vor der Sequenzierung wurden die IL-1- haltigen HPLC-Fraktionen durch Gelelektrophorese analysiert, um die Anzahl der Peptide in jeder Fraktion zu bestimmen. Daraufhin wurden die Peptide in Vakuum auf endgültige Volumina von etwa 30 ul konzentriert, punktförmig auf einen konditionierten Filter gegeben und dann in einer Heizkammer bei 44ºC getrocknet. Der getrocknete Filter wurde in ein automatisiertes Proteinsequenziergerät, Applied Biosystems Model Nr. 470A, gegeben. Durch dieses Verfahren haben die Anmelder entdeckt, daß ein größeres Fragment des Human-IL-1-Moleküls in der Nähe des N-terminalen Teils davon aus der folgenden Sequenz von Aminosäureresten zusammengesetzt ist: Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly-Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-Ala-Leu-His- Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gln-Gln-Val-Val-Phe. Die ersten vier Reste des N-terminalen Endes dieser Sequenz fallen mit den letzten vier Resten des C-terminalen Endes der Sequenz zusammen, die oben durch direkte automatisierte Proteinsequenzierung bestimmt wurde, was zu dem Schluß führt, daß diese Zwischensequenz eine Fortführung der oben dargelegten N-terminalen Sequenz ist.

BEISPIEL 7

(Kein Beispiel für die beanspruchte Erfindung)

Einkernige Zellen, hergestellt wie oben im ersten Paragraph von Beispiel 1 diskutiert, wurden zusammen mit 10% Rinderfeten-Serum (Vol/Vol) in RPMU-1640- Medium in Kulturkolben aus Kunststoff gegeben. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37ºC wurden nicht-anhaftende Zellen dekantiert und die Kolben wurden dann mit zusätzlichem mit Serum ergänztem RPMI-1640-Medium, das 20 ug/ml E. coli-LPS in einer Konzentration von 20 ug/ml enthielt, wieder aufgefüllt. 16 Stunden später wurden anhaftende LPS-stimulierte Zellen auf RNA abgeerntet.
Gesamt-RNA wurde aus den anhaftenden einkernigen Zellen durch das von Chirgwin et al., oben, beschriebene Verfahren extrahiert. In diesem Verfahren wurde Guanidinium-Thiocyanat eingesetzt, um das Zellprotein, das die RNase einschließt, mit einer Geschwindigkeit zu denaturieren, die die Geschwindigkeit der RNA-Hydrolyse durch RNase übersteigt. Die mRNA wurde durch Ultrazentrifugieren durch ein dichtes Kissen aus Cäsiumchlorid vom Zellprotein entfernt.
Daraufhin wurde polyadenylierte mRNA auf einer Oligo (dT)-Cellulose- Chromatographiesäule unter Verwendung des von Maniatis et al., oben bei 197, beschriebenen Verfahrens von dem extrahierten Protein abgetrennt. Kurz gesagt, wurde die Säule mit Aufgabepuffer, der aus 20 mM Tris-Cl (pH 7,6), 0,5 M NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraacetat ("EDTA") und 0,1% SDS zusammengesetzt war, vorbereitet. Das Protein-Pellet wurde in Wasser und Aufgabepuffer aufgelöst und dann wurde die Säule damit beladen. Das nicht-absorbierte Material wurde durch anfängliche Wäschen mit Aufgabepuffer, gefolgt von zusätzlichen Wäschen mit 0,1 M NaCl enthaltendem Aufgabepuffer, eluiert. Die zurückgehaltene polyadenylierte mRNA wurde mit Puffern mit verminderter Ionenstärke, die aus 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 1 mM EDTA und 0,05% SDS zusammengesetzt waren, eluiert. Die eluierte polyadenylierte mRNA wurde bei -20ºC mit einem 1/10 Volumen Natriumacetat (3 M, pH 5,2) und 2,2 Volumina Ethanol gefällt. Nach der Elution der polyadenylierten mRNA von der Oligo (dT)-Cellulose-Säule wurde die Integrität der polyadenylierten mRNA mittels Elektrophorese durch Agarosegele, wie im Detail in Maniatis et al., oben bei 199, beschrieben, bestätigt.
Die polyadenylierte mRNA wurde mittels Elektrophorese durch Methylquecksilber-Agarose nach Größe sortiert. Gelfraktionen, die unterschiedlichen Größenklassen der mRNA entsprachen, wurden dann in vitro entweder unter Verwendung von Kaninchen-Reticulocytenlysaten oder durch Injektion in Frosch- X. laevis-Oozyten wie oben beschrieben translatiert. Durch entweder Reticulocyten-Translationen oder durch Oozyten, in die mRNA eingespritzt worden war, freigesetzte Flüssigkeiten wurden dann unter Verwendung der oben dargelegten Assays auf die Anwesenheit von IL-1-Aktivität getestet. mRNA-Gelfraktionen, die bei der in vitro-Translation zu IL-1-Aktivität führten, wurden als mRNA-Quelle für den cDNA-Aufbau ausgewählt.

BEISPIEL 8

(Kein Beispiel für die beanspruchte Erfindung)

Aufbau einer cDNA-Bibliothek

Eine Bibliothek von doppelsträngiger cDNA, die der mRNA entsprach, wurde durch Einsatz des im Detail von Maniatis et al., oben bei 229, beschriebenen Standard-Verfahrens aus der gereinigten mRNA in Beispiel 7 hergestellt. Oligo-dT wurde an den polyadenylierten Schwanz der mRNA anhybridisiert, um als Primer für die reverse Transkription des ersten cDNA-Stranges zu dienen. Das Enzym Vogel- Myeloblastosis-Virus ("AMV") -reverse Transkriptase synthetisierte den ersten DNA- Strang unter Verwendung der mRNA als Templat (Matrize). Dieses Verfahren führte zur Bildung einer Haarnadel-Struktur am 3'-Ende des ersten cDNA-Stranges, die als integraler Primer für den zweiten cDNA-Strang diente. Nach dem Abbau des mRNA- Stranges mit NaOH wurde der zweite cDNA-Strang mit DNA-Polymerase I synthetisiert. Die Haarnadel wurde dann mit Nuklease S1 entfernt, um doppelsträngige cDNA-Moleküle zu produzieren.
Die doppelsträngige cDNA wurde durch Sephacryl S-400 (Pharmacia Fine Chemicals)-Säulenchromatographie in Größenklassen fraktioniert und durch Analyse unter Verwendung von alkalischer Agarose-Elektrophorese unter Einsatz am Ende markierter Fragmente von pBR322-DNA als Molekulargewichts-Markern überprüft. DNA-Stränge mit einer Länge von weniger als 500 bp wurden ausgeschieden, um die unnütze Klonierung dieser cDNA-Fraktionen mit zu geringer Größe zu vermeiden.
Die wie oben hergestellten doppelsträngigen cDNA-Fraktionen wurden in die Pst 1-Stelle des pBR322-Plasmids (Pharmacia Fine Chemicals) durch das von Maniatis et al., oben, beginnend bei 239, beschriebene Verfahren insertiert. Bei diesem Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA an ihren 3'-Enden mit einem Poly (dC)-Schwanz versehen. Das Plasmid pBR322 wurde mit Endonuclease Pst I verdaut und dann an seinen 3'-Enden mit einem Poly(dG)-Schwanz versehen. Die mit einem Schwanz versehene Plasmid-DNA und die mit einem Schwanz versehene cDNA wurden mit Annealing-Puffer (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 7,8) und 10 mM EDTA) verschmolzen, um neue rekombinante Plasmide zu bilden. Alle Restriktionsenzyme, die hier beschrieben werden, sind im Handel von New England Biolabs, Beverly, MA, erhältlich.
Die rekombinanten Plasmide wurden unter Verwendung des Verfahrens von Hanahan, oben, bei welchem die E. coli-Zellen durch Wachstum bei erhöhten Spiegeln von Mg&spplus;&spplus; hergestellt wurden, in den E. coli-Stamm MM294 transformiert. Die Transformationswirte wurden plattiert und dann wurden die transformierten Spezies unter Verwendung von Tetracyclin als phänotypischem Identifizierungsmittel identifiziert. Unter Verwendung dieser Technik erhielten die Anmelder etwa 2·10&sup6; unabhängige transformierte Spezies.

BEISPIEL 9

(Kein Beispiel für die beanspruchte Erfindung)

Herstellung von synthetischen Oligonucleotid-Prüfsonden

Ein synthetisches Oligonucleotid wurde als Sonde bei der Durchmusterung der wie oben in Beispiel 8 dargelegt hergestellten cDNA-Bibliothek eingesetzt. Die Sonde war aus der folgenden Zusammensetzung zusammengestellt: 5' AC TTG TTG TTC CAT GTC TTG GCC TTG CAG GTG CAG GGC TTT CAG TTC GTA GGG GCC CGA CAT 3'. Die Oligonucleotid-Sonde wurde chemisch durch das Triesterverfahren, wie im Detail von Sood et al., oben, und Hirose et al., oben, beschrieben, synthetisiert.
Nach Beendigung der chemischen Synthese wurden die 5'-Enden der Oligonucleotid-Sonden mit ³²P markiert. Um die Markierung zu erleichtern, wurden die 5'-Enden des Oligonucleotids mit OH-Termini synthetisiert, wodurch die Phosphatase-Behandlung, die typischerweise eingesetzt werden muß, wenn DNA-Fragmente markiert werden, eliminiert wurde. Das Markierungsprotokoll schloß die Zugabe von 1 ul der synthetischen Oligonucleotide zu 16 ul von ³²P-ATP (3000 ci/mM), 1 ul (10 U) T4-Polynucleotid-Kinase und 2 ul 10 x Kinasepuffer I ein. Der. 10 x Kinasepuffer I war aus 0,5 M Tris-Cl (pH 7,6), 0,1 M MgCl&sub2;, 50 mM Dithiothreitol,. 1 mM Spermidin und 1 mM EDTA zusammengesetzt. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt und daraufhin wurden die synthetisierten Oligonucleotide mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die markierten Sonden wurden von nicht-markierten Oligonucleotiden durch Chromatographie auf oder Zentrifugieren durch Sephadex G-50-Säulen (Pharmacia Fine Chemicals) abgetrennt.

BEISPIEL 10

(Keine Beispiel für die beanspruchte Erfindung)

Durchmusterung der cDNA-Bibliothek

Um die anfängliche Prüfung der cDNA-Bibliothek, die in Beispiel 9 oben hergestellt wurde, zu erleichtern, wurden die transformierten Bakterienkulturen in Gruppen zusammengegeben, von denen jede etwa 2000 unterschiedliche transformierte Klone aufwies. Von Proben des Wirtsbakteriums wurde Plasmid-DNA durch das Standard-alkalische Lyse-Verfahren, das im Detail von Ish-Horowicz und Burke, 9 Nucl. Acids Res. 2989 (1981), beschrieben ist, entfernt. Die isolierten Plasmide wurden in zwei Fragmente aufgetrennt. Dies wurde erreicht, indem man zunächst die Plasmide vollständig mit Pvu II und Hind III verdaute. Zu diesem Zweck wurden die Plasmide in 20 ul 1·Hind III-Puffer (7 mM Tris, (pH 7,4), 7 mM Magnesiumchlorid, 60 mM NaCl) erneut aufgelöst und dann wurden 1 ul Pvu II- und 1 ul Hind III-Restriktionsendonuclease zugegeben. Diese Mischung wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Als nächstes wurden die Plasmid-Verdauungsprodukte mittels Elektrophorese durch 0,8% Agarosegel mit Markern geeigneter Größe fraktioniert. Das Agarosegel wurde unter Verwendung des von Southern, oben, beschriebenen Standardverfahrens auf Nitrocellulosefilter aufgetupft. Nach dem Übertragungsverfahren wurde der Filter luftgetrocknet und 2 Stunden bei etwa 80ºC unter einem Vakuum erhitzt, um die DNA-Fragmente an die Nitrocellulose zu binden.
Die gebundene DNA wurde als nächstes mit den markierten Oligonucleotid- Sonden hybridisiert. Kurz gesagt, wurde die erhitzte Nitrocellulose in 6·Kochsalzlösung-Natriumcitrat ("SSC") (20·SSC ist zusammengesetzt aus 175,3 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat in 800 ml Wasser, wobei der pH mit 10N NaOH auf 7,0 eingestellt ist) vor-eingeweicht und dann 2 bis 4 Stunden in Vor- Hybridisierungs-Puffer, der aus 6·SSC, 0,5% NP40-Tensid, 0,1% Sareosyl, 5·Denhardt's-Lösung (0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% BSA) und 100 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA (Sigma Type III, Natriumsalz) zusammengesetzt war, bei 50ºC inkubiert. Der Filter wurde dann über Nacht bei 50ºC mit der ³²P-markierten Oligonucleotid-Sonde (106 cpm/ug) (aus Beispiel 3) wie oben in Hybridisierungslösung inkubiert. Nach einer Hybridisierung über Nacht wurde der Filter gründlich mit 6·SSC bei Raumtemperatur und dann 5 Minuten bei 50ºC mit 6·SSC gewaschen. Nach der Lufttrocknung wurde der Filter bei -70ºC einer Autoradiographie unterzogen.
Bei der Autoradiographie fanden die Anmelder mehrere hybridisierende Banden. Der "Pool" von Klonen, aus denen die Plasmid-DNA, die die hybridisierenden Banden erzeugte, stammte, wurde ausplattiert und dann in einer direkten Bakterienkolonie-Hybridisierung auf Nitrocellulosepapier mit der markierten Oligonucleotid- Sonde unter denselben Hybridisierungsbedingungen wie oben eingesetzt. Bei diesem Verfahren wurde eine einzige positive Kolonie identifiziert.

BEISPIEL 11

(Kein Beispiel für die beanspruchte Erfindung)

Erstellen einer Restriktionsenzym-Karte der durchmusterten cDNA

Als IL-1 X-14 bezeichnetes Plasmid wurde durch die in Beispiel 10 dargelegten Verfahren aus der identifizierten positiven Kolonie hergestellt. Proben des IL-1 X-14-Plasmids, das in den E. coli-Stamm RR1 transformiert wurde, sind bei ATCC unter der Zugangsnummer 39925 hinterlegt. Daraufhin wurde das IL-1 X-14-Plasmid durch Erstellen einer Restriktionsenzymkarte unter Verwendung der von Smith und Birnstiel, oben, entwickelten Technik, die die partielle Verdauung von an den Enden markierten Fragmenten der linearisierten DNA beinhaltet, analysiert. Die DNA-Fragmente wurden an ihren 5'-Termini unter Verwendung von Polynucleotidkinase und ³²P-ATP mit ³² P-Phosphorylgruppen markiert. Die markierten DNA-Stränge wurde dann mit einem geeigneten Restriktionsenzym asymmetrisch gespaltet, um zwei Fragmente zu schaffen, von denen jedes an nur einem seiner Enden markiert war. Diese markierten Fragmente wurden durch Gelelektrophorese isoliert. Jedes der zwei Fragmente wurde durch geeignete Restriktionsenzyme partiell verdaut. Obwohl ein großes Spektrum von Verdauungsfragmenten erzeugt werden kann, bilden die markierten Fragmente eine einfache überlappende Reihe, von denen jedes einen gemeinsamen markierten Terminus aufweist. Diese Fragmente wurden durch Gelelektrophorese fraktioniert und dann durch Autoradiographie überprüft. Die Stellen der Fragmente auf dem Gel entsprechen direkt der Abfolge der Restriktionsstellen entlang der Plasmid-DNA.
Durch dieses Verfahren haben die Anmelder eine Teil-Karte der Restriktionsstellen, wie in Fig. 3 gezeigt, des IL-1 X-14-Plasmids in der Region des IL-1- Gens erstellt. Die Zahlen, die zwischen den Restriktionsstellen des Gens gezeigt sind, entsprechen den ungefähren Abständen zwischen den Stellen, ausgedrückt als Basenpaare.

BEISPIEL 12

(Kein Beispiel für die beanspruchte Erfindung)

Sequenzierung von durchmusterter cDNA

Das in Fig. 3 gezeigte DNA-Segment wurde im wesentlichen durch das Didesoxy-Kettenabbruchsverfahren, wie es in dem Amersham Handbook, oben, beschrieben ist, mit den unten dargelegten Variationen sequenziert. Das DNA- Segment wurde mit den Restriktionsendonucleasen Hind III und Pst I verdaut und dann wurden die resultierenden DNA-Fragmente in die Stämme mp18 und mp19 des einsträngigen Filament-Phagenvektors M13 (Amersham, Arlington Heights, Illinois) kloniert. Die Phagenvektoren mp18 und mp19 zeigen, wie in Norrander et al., oben, dargelegt, die folgenden einzigartigen Klonierungsstellen: Hind III; Sph I; Pst I; Sal I; Acc I; Hinc II; XBA I; BamHI; Xma I; Sma I; Kpn I; Sst I; und EcoRI. Die Zusammensetzung der Vektoren mp18 und mp19 ist identisch, mit der Ausnahme, daß die Abfolge der oben genannten Restriktionsstellen im Vektor mp19 umgekehrt ist, so daß beide Stränge eines DNA-Segments bequem mit den beiden Vektoren sequenziert werden können. Die Vektoren mp18 und mp19, mit darin insertierten Fragmenten des cDNA-Segments von Fig. 3, wurden zur Transformierung von E. coli JM103 und JM105 des Stammes K12 (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland) eingesetzt, um einsträngige DNA-Replikationstemplate, die einsträngige Einfügungen der Stränge im hin- und gegenläufigen Sinn enthielten, herzustellen.
Der synthetische universelle Primer: 5'-CCCAGTCACGACGTT-3'(P-L Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin) wurde mit den einsträngigen DNA-Templaten verschmolzen und eingesetzt, um die DNA-Synthese stromaufwärts und stromabwärts von einer Stelle zwischen den Nucleotiden 476 und 477 (Fig. 4) wie oben auf Seite 28 beschrieben zu primen. Daraufhin wurden die Verlängerungsfragmente durch Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt und autoradiographiert, woraus die Nucleotidsequenzen der Fragmente abgeleitet wurden. Drei zusätzliche Primer wurden eingesetzt, um die Synthese von dazwischenliegenden Stellen entlang der Stränge im Hin-Sinn des DNA-Segments in Fig. 4 zu primer. Ein Primer mit der Zusammensetzung: 5'-CTGGAGAGTGTAGATCC-3', der den Nucleotiden 671 bis 688 (Fig. 4) entsprach, wurde verwendet, um die Synthese des Stranges im Hin-Sinn in der Richtung stromabwärts von Nucleotid Nr. 688 zu primen. Die Zusammensetzung dieses Primer-Stranges wurde aus der Sequenzierungsinformation, die zuvor unter Verwendung des universellen Primers erhalten worden war, bestimmt. Ein zweiter synthetischer Primer mit der Zusammensetzung: 5'-GATATAACTGACTTCAC-3' (entsprechend den Nucleotiden 851 bis 868 in Fig. 4) wurde bei der Sequenzierung des Stranges im Hin-Sinn in der Richtung stromabwärts von Nucleotid Nr. 868 eingesetzt. Ein dritter Primer mit der Sequenz: 5'-GATTCGTAGCTGGATGC-3' (entsprechend den Nucleotiden Nr. 235 bis 218) wurde eingesetzt, um den Strang in gegenläufiger Richtung in der Richtung stromaufwärts von Nucleotid Nr. 218 zu sequenzieren.
Durch das obige "Walk Down"-Verfahren wurden beide Stränge der PlasmidcDNA in Fig. 3 in überlappender, redundanter Art und Weise sequenziert, wodurch deren Nucleotidsequenz bestätigt wurde. Es versteht sich, daß andere synthetische Primer hätten eingesetzt werden können, um die Kettenverlängerungen von anderen Stellen entlang der Stränge aus zu initiieren, ohne daß vom Rahmen der vorliegenden Erfindung abgewichen worden wäre. Die obigen Primer-Stränge wurden durch das Triesterverfahren, wie detailliert von Sood et al., oben, und Hirose et al., oben, beschrieben, chemisch synthetisiert. Es versteht sich jedoch, daß andere wohlbekannte Techniken, wie z. B. durch das Phosphordiester-Verfahren, eingesetzt werden können, um die Primer-Stränge zu synthetisieren.
Desoxyadenosin 5' (alpha-[³&sup5;S]-thio)-triphosphat (im folgenden "dATP- [alpha-³&sup5;S]") wurde als radioaktiver Marker in den Didesoxy-Sequenzierungsreaktionen eingesetzt. Statt das auf Seite 54 beschriebene Gel des Amersham Handbook zu verwenden, wurde ein 6% Polyacrylamidgel (6% Polyacrylamidgel, 0,4 mm dick, enthaltend 7 M Harnstoff, 100 mM Trisborat (pH 8,1) und 2 mM EDTA) eingesetzt.
Wie oben bemerkt, ist die Nucleotidsequenz der Plasmid-DNA in Fig. 3 in Fig. 4 dargestellt. Es wurde gefunden, daß dieses DNA-Segment die Region des IL-1-Gens, das für reifes IL-1 codiert, einschließt. Die Nucleotide sind ausgehend vom Anfang des DNA-Segments in Fig. 4 numeriert. Die entsprechenden Aminosäuren, wie durch die Nucleotidsequenz- und durch die Proteinsequenz- Analyse bestimmt, sind oberhalb der entsprechenden Codons angegeben. Die Aminosäurezusammensetzung des IL-1-Gens erstreckt sich vom reifen NH&sub2;-Terminus des IL-1-Moleküls, d. h. dem Ala-Rest, wie in Fig. 4 mit einem Pfeil angezeigt (von dem aus die Numerierung der Aminosäurereste beginnt) zu dem Ser-Rest (Nr. 153), der sich unmittelbar vor dem Abbruch-Codon TAA befindet. Verschiedene Restriktionsenzym-Spaltstellen sind in Fig. 4 ebenfalls angegeben. Die Codierungsregion des IL-1-Gens in Fig. 4 ist in Fig. 3 als eingerahmter Abschnitt veranschaulicht.
Aminosäuresequenz-Untersuchungen an IL-1 wurden gemäß dem Verfahren von Stern et al., oben, durchgeführt, bei welchem Cyanogenbromid eingesetzt wurde, um das IL-1 an den Methioninresten zu spalten. Die resultierenden Fragmente wurden durch Standard-Ionenaustauschverfahren nach Größe aufgetrennt. Die isolierten Peptidfragmente wurden dann durch automatisierten Amino-terminalen Edman-Abbau unter Verwendung eines Protein-Sequenziergeräts, Applied Biosystems Model 470, sequenziert. Durch dieses Verfahren haben die Anmelder die durch Nucleotid-Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse bestätigt, denen zufolge der C-Terminus des IL-1-Proteins aus der folgenden Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist: Gln-Phe-Val-Ser-Ser. Dies beweist, daß das "natürliche" IL-1 nach der Translation aus mRNA nicht durch Entfernung von Aminosäuren aus diesem Ende des Moleküls verarbeitet wird. Dies ist wichtig, da aus der Nucleotidsequenz des IL-1-Gens in Fig. 4 klar ist, daß eine merkliche Menge an RNA-Sequenz während der Reifung von IL-1 aus seinen Vorläufern vom N-Terminus des IL-1-Gens entfernt wird.

BEISPIEL 13

Expression von reifem IL-1

Die Codierungsregion des IL-1-Gens wurde aus dem cDNA-Klon von Fig. 3 entfernt und dann in den pY ADH-Schaukelvektor insertiert, um das rekombinante Expressions-Plasmid pY ADH IL-1 zu bilden. Das Restrukturierungsschema für die Herstellung des pY ADH IL-1-Expressions-Schaukelvektors ist in Fig. 5 gezeigt. Das Plasmid wurde in E. coli-Wirtszellen amplifiziert und dann eingesetzt, um Hefe-Wirtszellen für die Expression von reifem IL-1 auf hohem Niveau zu transformieren. Die Funktionalität des exprimierten IL-1 wurde unter Verwendung der oben im Detail beschriebenen Thymocyten-Proliferations- und IL-2-Umwandlungs- Assays bestätigt.
Ein Großteil der Codierungsregion des IL-1-Gens von der Hpa II-Stelle (Base Nr. 457 in Fig. 4) bis zur 3'-flankierenden Region des Gens wurde aus dem in den Fig. 3 und 4 erläuterten cDNA-Plasmidsegment unter Verwendung der Restriktionsenzyme Hpa II und Pst I in dem Standardprotokoll, das von Maniatis et. al., oben bei 104, dargelegt wird, entfernt. Das IL-1-Gensegment wurde von dem cDNA- Klon an der Hpa II-Stelle, die sich 29 Nucleotide stromabwärts vom 5'-Ende des Gens befindet, abgespaltet, da keine bequeme Restriktionsstelle gefunden wurde, die genau dem 5'-Terminus des Gens entsprochen hätte. Die 3'-Pst I-Stelle des herausgeschnittenen IL-1-Gensegments wurde mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt um ein stumpfes Ende zu erzeugen, das mit der Stu I-Stelle des unten diskutierten Schaukelvektors kompatibel war.
Es wurde ein synthetisches Oligonucleotid chemisch synthetisiert, um der Codierungsregion des IL-1-Gens den 5'-terminalen Teil wieder anzufügen und auch um ein Translations-Initiierungscodon am 5'-Ende der Codierungsregion zu erzeugen. Die Zusammensetzung des Oligonucleotids, wie in Tabelle II unten gezeigt, schließt ein Eco RI-klebendes 5'-Ende, gefolgt von einem ATG-Initiierungscodon und darauf dem 5'-Ende der Codierungsregion des IL-1-Gens (zur Hpa II-Stelle hin) ein. Obwohl das in Tabelle II gezeigte Oligonucleotid chemisch durch das detailliert von Sood et al., oben, und Hirose et al., oben, beschriebene Triesterverfahren synthetisiert wurde, versteht es sich, daß das Oligonucleotid durch andere Verfahren hergestellt werden kann, wie z. B. durch das Phosphodiester-Verfahren. TABELLE II
Statt die Codierungsregion des IL-1-Gens an der Hpa II-Stelle zu spalten, könnte die Plasmid-cDNA in Fig. 4 an einer Restriktionsenzymstelle in der 5'-flankierenden Region des Gens gespaltet werden. Darauf können die Nucleotide der flankierenden Region nacheinander durch Standardtechniken entfernt werden.
Der pY ADH-Schaukelvektor wurde für die Ligierung an das synthetische Oligonucleotid und den herausgeschnittenen größeren Teil der Codierungsregion des IL-1-Gens durch vollständige Verdauung des Vektors mit den Restriktionsendonucleasen Eco RI und Stu I durch Standard-Verfahren, wie in Maniatis et al., oben bei 104, beschrieben, vorbereitet. Das gewünschte größere Fragment aus der Verdauung des pY ADH-Plasmids wurde durch Elektrophorese an 0,7% Agarosegel bei 100 Volt bei 22ºC für 2 Stunden isoliert.
Wie in Fig. 5 gezeigt, wurden das synthetische DNA-Oligomer, der herausgeschnittene größere Teil der Codierungsregion des IL-1-Gens und das gewünschte linearisierte pY ADH-Fragment in einer Reaktionsmischung, die zusammengesetzt war aus 100 ug des pY ADH-Vektorfragments (Eco RI - Stu I), 40 ug des Haupt-IL-1-cDNA-Fragments (Hpa II, Pst I [stumpf]), 5 ug synthetischem Oligonucleotid (Eco RI-Hpa II), 1 ul T4-DNA-Ligase und ausreichend T4-Ligasepuffer (0,4 M Tris [pH 7,4], 0,1 M MgCl&sub2;, 0,1 M Dithiothreitol, 10 mM Spermidin, 10 mM ATP und 1 mg/ml BSA) um ein Reaktionsvolumen von 20 ul zu bilden, zusammenligiert. Die Reaktion wurde mittels 15-stündiger Inkubation bei 15ºC durchgeführt.
Das resultierende rekombinante Plasmid, als pY ADH IL-1 bezeichnet, wurde dann unter Verwendung von Standard-Transformierungstechniken, wie in Boiivar et al., oben, und Peacocketal., oben, beschrieben, in den E. coli- Stamm RR1 transformiert. Die Wirtszellen wurden kultiviert, um das pY ADH IL-1-Plasmid zu amplifizieren, und dann wurden die Plasmide aus den Wirtsbakterien durch das Standard-alkalische Verfahren, wie im Detail von Maniatis et al., oben bei 368 und von Ish-Horowicz und Burke, oben, beschrieben, entfernt. Die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugieren bis zum Gleichgewicht in Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradienten gereinigt, wie in Maniatis et al., oben bei 93, beschrieben. Es versteht sich, daß andere Techniken zur Extraktion/Konzentrierung der amplifizierten Plasmid- DNA aus E. coli eingesetzt werden können, ohne vom Rahmen und Geist der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Das wie oben hergestellte amplifizierte pY ADH IL-1-Plasmid wurde dann eingesetzt, um den Hefestamm 20B-12 (alpha, pep 4.3, Trp 1) von S. Cerevisiae, dem Protase fehlte, durch Standard-Verfahren zu transformieren. Vor der Transformierung wurde der Stamm 20B-12 in Kultur in YP-Glucosemedium (200 ml) bis zu Kulturen von 2·107 Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren bei 1000·g für 5 Minuten bei 22ºC geerntet und dann wurde das resultierende Pellet mit sterilem destillierten Wasser gewaschen.
Die Hefezellen wurden dann durch erneute Suspendierung in 20 ml SED (1 M Sorbit, 25 mM EDTA [pH 8,0] und 50 mM Dithiothreitol) konzentriert und 10 Minuten bei 30ºC inkubiert. Die Zellen-Puffer-Mischung wurde dann 5 Minuten bei 300·g zentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit 200 ml 1 M Sorbit gewaschen und die Zellen wurden in 20 ml SCE (1 M Sorbit, 0,1 M Natriumcitrat [pH 5,8], 0,1 M ETDA) erneut suspendiert. Glusulase, um die Zellwände zu zerstören, in einer Menge von 0,2 ml, wurde der Lösung zugegeben und dann wurde die Lösung 30 Minuten bei 30ºC unter gelegentlichem leichten Schütteln inkubiert.
Die Anwesenheit von Sphäroplasten wurde durch Verdünnung von 10 ul der Hefezellen in einen Tropfen 5% Natriumdodecylsulfat (SDS) (Gew/Vol) auf einem Mikroskopträger bestimmt, um bei 400fachem Phasenkontrast nach "Ghosts" zu suchen.
Die Zellmischung wurde dann bei 300·g 3 Minuten zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde zweimal mit 20 ml 1 M Sorbit gewaschen. Das Pellet wurde dann einmal mit STC (1 M Sorbit, 10 mM CaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 7,5]) gewaschen.
Die Hefe-Sphäroplasten wurden dann mit dem zuvor hergestellten Plasmidvektor in einem dem von Beggs, 275 Nature (London) 104 (1978), übernommenen Verfahren transformiert. Die pelletisierten Protoplasten werden in 1,0 ul STC suspendiert und daraufhin in 100 ml-Aliquota in 10 ul- Einmal-Reagenzgläsern (Falcon Nr. 2059) aufgeteilt. Dann wurden 1 bis 10 ul der DNA-Plasmide jedem Aliquot (0,5 bis 5 ug) zugegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann wurde zu jedem Aliquot 1 ml PEG (20% PEG 4000, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl [pH 7,4]) gegeben, um die DNA-Aufnahme zu fördern. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung 5 Minuten bei 350·g zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde erneut in 150 ul SOS (10 ml 2 M Sorbit, 6,7 ul YEP [0,13 ml 1 M CaCl, 27 ul 1% Leucin und 3,7 ml H&sub2;O]) suspendiert. Diese Mischung wurde 20 Minuten bei 30ºC inkubiert.
Darauf wurde die Protoplast/DNA-Mischung in Anwesenheit von Hefe- Minimalmedium, das 1,2 M Sorbit und 3% Agar enthielt, bei 45ºC und ohne Tryptophan plattiert. Das Minimalmedium war aus 0,67 Difco-Hefe, Stickstoffbase, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose zusammengesetzt. Durch Halten der Protoplast/DNA-Mischung in diesem Medium überlebten nur transformierte Spezies, d. h. jene, die das Trp 1-Gen enthielten.
Vor dem biologischen Assay wurden die transformierten Spezies vom Minimalmedium in reichhaltiges Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose) inocculiert und bei 30ºC 15 bis 20 Stunden bis zur späten Exponentialphase gezüchtet. Zum Zeitpunkt der Ernte wurde der Proteaseinhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) auf 1 mM zugegeben. Die Kultur wurde dann bei 400·g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletisieren. Daraufhin wurden die Zellen einmal in 0,1 Volumen kaltem H&sub2;O gewaschen. Zwecks Aufbrechen wurden die Zellen in 0,01 Volumen kaltem Wasser, das 1 mM PMSF enthielt, erneut suspendiert und mit Glaskügelchen (1/3 Vol.) 2 Minuten lang verwirbelt. Die Zelltrümmer und Glaskügelchen wurden durch Zentrifugieren pelletisiert. Es wurde gefunden, daß der resultierende überstand IL-1-Aktivität aufwies. Dies wurde bestätigt, indem man den überstand sowohl im Thymocyten-Proliferations- als auch im IL-1-Umwandlungs- Assay, wie oben diskutiert, einsetzte.
Es kann leicht erkannt werden, das alternativ- Bereiche des IL-1- Gens, das in Fig. 4 gezeigt ist, die die Codierungsregion des Gens enthalten, ebenfalls exprimiert werden können. Zu diesem Zweck kann das pY ADH IL-1-Plasmid mit den Restriktionsendonucleasen Stu I und Eco R1 verdaut werden, um den speziellen oben angegebenen Teil des IL-1-Gens zu entfernen, was zu dem ursprünglichen pY ADH-Plasmid führt. Daraufhin kann ein anderer Abschnitt des IL-1-Gens durch Standard-Verfahren, wie in Maniatis et al., oben bei 104, dargelegt, an das pY ADH-Plasmid ligiert werden.

Claims

1. Proteinzusammensetzung, im wesentlichen bestehend aus Human-lnterleukin-1 mit

a. einem Molekulargewicht von etwa 17500 Dalton, wie durch SDS-PAGE bestimmt;

b. einem pI von etwa 5,9 bis 6,3, wenn vor der Elektrophorese in einem 2% (Gew/V) SDS und 2% (V/V) 2- Mercaptoethanol umfassenden Puffer löslich gemacht; und

c. einer Aminosäuresequenz, die in der Nähe des N- terminalen Teils des Proteins die Reihe Ser-Leu-Val-Metser-Gly-Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-Ala-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln- Asp-Met-Glu-Gln-Gln-Val-Val-Phe umfaßt, worin die Pro teinzusammensetzung durch SDS-PAGE und Silber-Anfärbung als eine einzelne Bande nachgewiesen wird und ausreichend homogen ist, um die oben angegebene Aminosäuresequenz, bestimmt durch Edman-Abbau, aufzuweisen.

2. Verfahren zur Herstellung einer gereinigten Human-Interleukin-1-Zusammensetzung wie in Anspruch 1 definiert aus einer Rohlösung von Human-Interleukin-1, umfassend die folgenden Stufen:

a. In-Berührung-Bringen der Rohlösung von Human- Interleukin-1 mit einem an eine Trägermatrix gebundenen roten Triazinylfarbstoff-Ligand;

b. Abwaschen von ungebundenen Komponenten der Rohlösung von der Trägermatrix; und

c. Eluieren eines gereinigten Human-Interleukin-1 von dem Farbstoff-Ligand mit einem Salzgradienten.

3. Verfahren wie in Anspruch 2 beansprucht, worin der rote Triazinylfarbstoff-Ligand erste und zweite s-Triazinringe umfaßt, die durch eine Aminobenzolringbrücke miteinander verknüpft sind, wobei jeder der ersten und zweiten s- Triazinringe einen sulfonierten Naphthalinsubstituenten trägt und jede sulfonierte Naphthalineinheit einen Substituenten, der einen sulfonierten Benzolring umfaßt, mit einer Azobrücke daran geknüpft aufweist.

4. Verfahren wie in Anspruch 2 beansprucht, worin der Triazinylfarbstoff-Ligand die in Fig. 2 gezeigte Struktur aufweist.

5. Verfahren wie in den Ansprüchen 2 oder 3 beansprucht, worin die Rohlösung von Human-Interleukin-1 aus Zellen hergestellt ist, die periphere Blutleukozyten oder -monozyten sind.

6. Interleukin-1, wie in Anspruch 1 definiert und/oder wie durch ein Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5 beansprucht herstellbar, zur Verwendung als Medikament.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein wie in Anspruch 1 definiertes und/oder wie durch ein in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5 beanspruchtes Verfahren herstellbares Protein als einen aktiven Bestandteil.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht für die therapeutische Vermittlung eines immunologischen Ansprechens.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht für die therapeutische Vermittlung eines nichtimmunologischen Ansprechens.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht für die Behandlung von Autoimmun-Störungen wie z. B. Arthritis oder Lupus erythematosis.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht für die Wund- oder Verbrennungsheilung.

12. Verwendung von Interleukin-1, wie in Anspruch 1 definiert und/oder wie durch ein in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5 beanspruchtes Verfahren herstellbar, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei

(i) der therapeutischen Vermittlung eines immunologischen Ansprechens;

(ii) der therapeutischen Vermittlung eines nichtimmunologischen vermittelten Ansprechens;

(iii) der Behandlung von Autoimmun-Störungen wie z. B. Arthritis oder Lupus erythematosis; oder

(iv) der Wund- oder Verbrennungsheilung.