DE3523082A1

DE3523082A1 - Verfahren zur herstellung von 2-(substituylphenyl)-propionsaeure durch mikroorganismen

Info

Publication number: DE3523082A1
Application number: DE19853523082
Authority: DE
Inventors: Takayuki Tanonaka; Takashi Iwaki Fukushima Yamauchi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1984-06-26
Filing date: 1985-06-25
Publication date: 1986-02-13
Also published as: GB2160866B; GB2160866A; FR2566425B1; JPS6112294A; CH664767A5; JPS6328591B2; FR2566425A1; DE3523082C2; GB8515270D0

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-propionsäure und insbesondere ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2-(Substituylphenyl) -propionsäure aus 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan.

2-(Substituylphenyl)-propionsäure bzw. 2~(substituierte? Phenyl)-propionsäure weist eine antiphlogistische Aktivität und eine analgetische Aktivität bei Menschen und Tieren auf, und insbesondere die 2-(4-Isobutylphenyl)-propionsäure wird allgemein als ein ausgezeichnetes entzündungshemmendes Mittel verwendet. Zu ihrer Herstellung sind nur chemische Syntheseverfahren bekannt. Diese Syntheseverfahren sind zum Beispiel in den JP-PSen 40-7491 (1965) und 47-18105 (1972), der JP-OS 50-4040 (1975) usw. beschrieben·, die bekannten Verfahren umfassen jedoch im allgemeinen viele Stufen und die zugehörigen Maßnahmen sind kompliziert und problematisch; d.h., daß die konventionellen Verfahren nicht unbedingt befriedigend sind.

Zum Beispiel umfaßt das in der JP-OS 50-4040 (1975) beschriebene Verfahren die folgenden Stufen:

25 Isobutylenzol +

AlCl.

CH₃ . 130⁰C 3 Std.

isoBu-/OV^CH~^CH7^CH2^COOH

CH.

Cu (OCOCH₃ )₂ in Pb(OCOCH₃)₄

t-BuOH

KMnO „

isoBu

(2-(4-1sobutylpheny1)propionsäure)

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-propionsäure zu schaffen, das nicht auf einem chemischen Syntheseverfahren basiert, um die oben genannte Komplexität und die Schwierigkeiten der konventionellen chemischen Syntheseverfahren zu überwinden.

Die Aufgabe wird gelost durch ein Verfahren zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-propionsäure, gekennzeichnet durch die Stufen der

Inokulierung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und eine Aktivität zur Umwandlung von 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan zu 2-(Substituylphenyl)-propionsäure aufweist, in ein 1-(Substituyl)-1-phenylethan enthaltendes Kulturmedium,

Kultivierung des Mikroorganismus darin, wobei der Mikroorganismus zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-propionsäure veranlaßt wird, und Isolierung der so hergestellten 2-(Substituylphenyl)-propionsäure aus dem so kultivierten Material.

Bei der Untersuchung eines Verfahrens zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-propionsäure unter Verwendung einer besonderen Bakterienspezies wurde gefunden, daß eine erstmalig aus einem Boden in der Stadt IWAKA in der Prefäktur FUKUSHIMA in Japan isolierte bakterielle Spezies 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan zu 2-(Substituylphenyl)-propionsäure oxydiert; basierend auf dieser mikrobiologischen Umwandlung wurde das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-propionsäure geschaffen, das verglichen mit den konventionellen chemischen Syntheseverfahren weniger Stufen umfaßt. 35

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-propionsäure, gekennzeichnet durch die Stufen der Inokulierung von Bakterien, die zur Gattung Pseudomonas gehören und eine Aktivität zur Umwandlung von 1-(Substituylphenyl)~1-phenylethan zu 2-(Substituylphenyl)-propionsäure aufweisen, wobei der Substituent der letzteren derselbe wie der Substituent des 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethans ist, in einem 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan enthaltenden Kulturmedium, Kultivierung der so inokulierten Bakterien darin, wobei das 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan zu 2-(Substituylphenyl)-propionsäure oxydiert wird, und Isolierung der darin gebildeten 2-(Substituylphenyl)-propionsäure.

Die im Rahmen der Erfindung erstmalig isolierten und erfindungsgemäß zur Umwandlung von 1-(Substituylphenyl·) -1-phenylethan zu 2-(Substituylphenyl)-propionsäure verwendeten Bakterien gehören zur Gattung Pseudomonas, was aus einer Untersuchung ihrer bakteriologischen Eigenschaften hervorgeht, wobei auf Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage und The Prokaryotes Bezug genommen wird; da die erfindungsgemäßen Bakterien von den bekannten Pseudomonas-Arten im Hinblick auf die Verwendung von 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan verschieden sind, ist diese erstmalig isolierte Bakterienart als neu anzusehen; dieser neuen Art ist der Name Pseudomonas Cepacia gegeben worden. Ein Stamm von Pseudomonas Cepacia ist bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-BP 534 mit dem Hinteriegungsdatum 25. Mai 1984 hinterlegt worden.

Pseudomonas Cepacia weist die folgenden bakteriologischen Eigenschaften auf:

(1) Morphologische Eigenschaften: Gestalt einer Zelle: stäbchenförmig

Größe einer Zelle: 1,0 bis 1,5.um Breite und

1,5 bis 2,5.um Länge Pleomorphismus einer Zelle: keiner Bewegungsfähigkeit: positiv Anzahl Flagella: mehr als eines

Sporenbildung: keine Gramfärbung: negativ Säurebestandigkeit: negativ

(2) Wachstumszustand (Farbe, Glanz, Aussehen usw.)

5 Testgegenstand (Kulturbedingungen) Testergebnisse

Bouillon-Agar -Plattenkultur

Bouillon-Agar-Kippkultur

(1) Produktion von Pigment: (+) schwach gelbes Pigment

(2) Glanz: (+) die Oberfläche der Kolonien war glatt.

(1) Produktion von Pigment: (+) schwach gelbes Pigment

(2) Glanz: (+) die Oberflächen der Kolonien waren glatt.

Flüssige Bouillon

(1) kein Wachstum

Bouillon-Gelatine-Stichkultur

(1) Wachstum nur auf der Oberfläche des Mediums

(2) Verflüssigung der Gelatine: (-)

Lack mus-Milch-Kul tür

(1) Das Aussehen des Mediums veränderte sich nicht,

Koagulation: (-)
Verflüssigung: (-)

(3) Wirkung der Temperatur auf das Wachstum

Temperatur (°C) Wachstum

(4) Wirkung des pH-Werts auf das Wachstum

pH Wachstum

4,0 5,0 6,0 8,0

9,0

10,0

(5) Herstellung von Säure und/oder Gas aus Kohlehydrat

Kohlehydrat Herstellung von Säure Herstellung von Gas
5

L-Arabinose ( + ) ( - )

D-Xylose ( + ) (- )

D-Glucose ( + ) ( - )

D-Mannose (+ ) ( - )

D-Fructose (+) ( -)

D-Galactose (+) ( - )

Maltose (+ ) ( - )

Sucrose ( + ) ( - )

Lactose (+ ) ( -)

Trehalose (+ ) ( -)

D-Sorbit (+ ) ( - )

D-Mannit (+ ) ( - )

Inosit (+) ( - )

Glycerin ( - ) ( - )

Stärke ( - ) ( - )

(6) Andere Eigenschaften

Testgegenstand Testergebnis 5

Wachstum unter aeroben Bedingungen ( + )

Wachstum unter anaeroben Bedingungen ( - )

Hydrolyse von Stärke ( - )

Reduktion von Nitrat ( - )

Denitrierung ( - )

MR-Test ( - )

VP-Test ( - )

Bildung von indol ( - )

Bildung von Schwefelwasserstoff ( - )

5 Verwendung von Zitronensäure

im Kulturmedium nach Koser ( - )

im Kulturmedium nach Christensen ( - )

Verwendung von Nitrat ( - )

Verwendung eines Ammoniumsalzes ( + )

Bildung von Pigment ( + ) (+) gelbes Pigment

Bildung von Urease ( - )

Bildung von Oxidase ( + )

Bildung von Katalase ( + )

O/F-Test (Verfahren von Hugh-Leifson) Oxydativ

Zwar kann Pseudomonas Cepacia als Beispiel für eine erfindungsgemäß geeignete Bakterienart genannt werden, aber jede künstliche oder natürliche Mutante derselben und alle anderen Mikroorganismen, die zur Gattung Pseudomonas gehören und 2-(Substituylphenyl)-propionsäure aus 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan herstellen, kann erfindungsgemäß verwendet werden.

Bei der Kultivierung der Bakterien kann erfindungsgemäß jede Kohlenstoffquelle verwendet werden, die gewöhnlich als Nährmittelkomponente verwendet wird; aber um die Bakterien zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-propionsäure in hoher Ausbeute zu veranlassen, wird 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan als einzige Kohlenstoffquelle oder als eine Komponente der Kohlenstoffquelle verwendet. In diesen Fällen wird das 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan entsprechend der erwünschten 2-(Substituylphenyl)-propionsäure ausgewählt. Das heißt, daß der Substituent bzw. die Substituylgruppe in dem verwendeten 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan dieselbe wie der Substituent bzw. die Substituylgruppe in der angestrebten 2-(Substituylphenyl) -propionsäure ist.

Die zuzugebende Konzentration an 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan als Kohlenstoffquelle beträgt 0,01 bis 0,5 Gew.% und die Gesamtmenge der Kohlenstoffquelle kann auf einmal oder in mehreren Malen in anteiligen Portionen zugegeben werden.

Als das 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan kann die durch die Formel I

ORIGINAL INSPECTED

(D

wiedergegebene Verbindung genannt werden, wobei in der Formel R eine Restgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus gradkettigen Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, verzweigten Alkylgruppen mit 3 bis Kohlenstoffatomen, CF-,-CH₀CH₀-und CF₀-CHCH₀- bedeutet und

^{322 3} OH ²

als stärker bevorzugte Ausgangsmaterialien werden beispielhaft die folgenden Verbindungen genannt:

1-(4-Methylphenyl)-1-phenylethan, 1-(4-Ethylpheny1)-1-phenylethan, 1 -(4-Propylphenyl)-1-phenylethan, 1-(4-Isobutylphenyl)-1-phenylethan, 1 -[ 4- (3,3,3-Trifluorpropyl)phenyl]-1 -phenylethan und 1 -[ 4-{ 2-Trif luormethylpropyl) phenyl] -1 -phenylethan.

Erfindungsgemäß können als zur Kultivierung der Bakterien geeignete Stickstoffquelle Kaliumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Polypepton ohne jede Einschränkung verwendet werden.

ORIGINAL INSPECTED

Weiterhin werden als geeignete anorganische Phosphor- und Kaliumquellen in dem Kulturmedium Dinatriumhydrogenphosphat, KaJinmdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat und dergleichen verwendet. Magnesiumsulfat, Calciumchlorid, Eisen(III)-Chlorid und dergleichen werden als Spurennahrmittelmetallelemente für die Bakterien verwendet.

Als weitere Additive für das Kulturmedium werden Hefeextrakt, Maisquellwasser, Fleischextrakt und dergleichen für günstiges Wachstum der Bakterien verwendet.

Als Verfahren zur Kultivierung der Bakterien können geschüttelte Kulturen, gerührte Kulturen und innen belüftete Kulturen genannt werden, und es kann ein die oben genannten Techniken kombinierendes Verfahren, zum Beispiel eine innen belüftete Kultur unter Rühren und dergleichen verwendet werden.

Die Kultivierung wird geeigneterweise bei einer Temperatur von 25 bis 35 C und einem pH-Wert von 6 bis 8 während 3 bis 35 Tagen ausgeführt.

Nach Beendigung der Kultivierung wird der die 2-(Substituylphenyl)-propionsäure enthaltend· Überstand erhalten, indem man das kultivierte Material einer Filtration oder Zentrifugation zur Entfernung der Bakterienkörper unterwirft. Die gereinigte Säure kann erhalten werden, indem man den Überstand einem Verfahren unterwirft, das die Stufen der Lösungsmittelextraktion, Dehydratation, Entfärbung, Fraktionierung, Säulenchromatographie einzeln oder in Kombination umfaßt.

Beispielsweise wird nach Beendigung der Kultivierung das kultivierte Material einer Zentrifugation unterworfen, um die überstehende Fraktion zu erhalten, und nach Ansäuern der Fraktion durch Zugabe von Säure, falls notwendig, wird die Zielsubstanz mit einem organischen Lösungsmittel wie Dichlormethan und dergleichen extrahiert. Nach der Trocknung und Eindampfung des Extraktes wird der Rückstand einer Chromatographie auf Kieselgel unterworfen, wobei der Rückstand unter Verwendung einer 7:1-Mischung aus Benzol und Ethylacetat als Eluiermittel eluiert und fraktioniert wird. Die so erhaltene Fraktion, die die Ziel subs tanz enthält, wird eingedampft, wobei das angestrebte Produkt in rohen Kristallen erhalten wird, die je nach Notwendigkeit durch Umkristallisieren usw. gereinigt werden.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

In einen 300 ml Erlenmeyerkolben wurden 100 ml eines wäßrigen flüssigen Kulturmediums (pH = 7,2) aus einer Zusammensetzung bestehend aus 0,065 g K₂HPO-, 0,026 g KH₂PO₄, 0,134 g Na₂HPO₄.12H₂O, 0,005 g NH₄Cl, 0,068 g MgSO₄.7H₂O, 0,083 g CaCl₃, 0,0008 g FeCl₃-OH₂O, 0,2 g Polypepton, 0,3 g Hefeextrakt und 1 1 destilliertes Wasser und 0,05 g 1 -[ 4- (3,3,3-tr if luorpropyl) phenyl] -1-phenylethan, das gemäß der JP-OS 58-29725 (1983) synthetisiert worden war, eingebracht und nach Sterilisierung des Kolbens während 15 Minuten bei 121°C unter Druck wurde Pseudomonas Cepacia (Stamm-Nr. KTB-03, hinterlegt bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-BP 534) in das so hergestellte Kulturmedium inokuliert und 28 Tage lang bei 30⁰C unter Drehen und Schütteln des Kolbens kultiviert.

Nach Entfernung der Bakterienkörper aus dem so kultivierten Medium durch Zentrifugieren wurde der pH-Wert des Überstandes auf weniger als 2 durch Zugabe von 6N wäßriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt und aus dem so behandelten Überstand wurde die Zielsubstanz mit 100 ml Chloroform extrahiert. Nach Auflösen des Extraktes in einer wäßrigen 1N Hydroxydlösung wurde die wäßrige Lösung durch nochmalige Zugabe von Chlorwasserstoffsäure angesäuert und die Lösung wurde noch einmal einer Extraktion mit Chloroform unterworfen. Durch Eindampfen der Chloroformphase bei erniedrigtem Druck zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels wurde eine schwach viskose Flüssigkeit von rötlich brauner Farbe erhalten.

Die so erhaltene Flüssigkeit wurde einer Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung einer Mischung aus Benzol und Ethylacetat als Eluiermittel unterworfen, wobei die Flüssigkeit gereinigt wurde, und die so erhaltene Fraktion wurde aus η-Hexan umkristallisiert, worauf 27 mg weiße Kristalle in einer Ausbeute von 61% bezogen auf das Ausgangsmterial 1 -[ 4- (3,3,3-Tr if luorpropy 1) pheny I]-1-phenylethan erhalten wurden.

Der Schmelzpunkt der so erhaltenen Kristalle betrug 75 bis 76_f5°C und die erhaltenen Kristalle wurden aufgrund eines Vergleichs ihres NMR-Spektrums, Infrarotabsorptionsspektrums und Massenspektrums mit denjenigen einer authentischen Probe als 2- 1⁴~ (³'³' 3-Tr if luorpropyl) phenyl ] -propionsäure identifiziert (vergl. JP-OS 58-65237 (1983)).

Die Umwandlung des Ausgangsmaterials in die Zielsubstanz ist im folgenden gezeigt:

CF₃CH₂CH₂

Beispiel 2

Durch Kultivierung der Bakterien auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß anstelle von 1-[4-(2-Triflourpropyl)-phenyl]-1-phenylethan aus Beispiel 1 als Ausgangsmaterial 1 -[ 4- (2-Triflourmethylpropyl )-phenyl ]-1-phenylethan_f das gemäß der JP-OS 58-29725 (1983) synthetisiert worden waren, verwendet wurde, erhielt man 12 mg gereinigte weiße Kristalle in einer Ausbeute von 27% bezogen auf das Ausgangsmaterial H 4- (2-Trif lourmethylpropyl) -phenyl] -1 -phenylethan.

Die Umwandlung des Ausgangsmaterials in die Zielsubstanz ist im folgenden gezeigt.

³ -— CHCH.-iOh CH-(O

CF

CH.

CF.

CHCH

ORlGiNAL INSPECTED

Beispiel 3;

Durch Kultivierung der Bakterien auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß anstelle der 0,05 g H4-(3,3,3-Triflourpropyl)-phenyl]-1-phenylethan aus Beispiel 0,1 g 1-(4-Isobutylphenyl)-1-phenylethan verwendet wurde, erhielt man ein 61 mg gereinigte weiße Kristalle in einer Ausbeute von 70,5% bezogen auf das Ausgangsmaterial 1-(4-Isobutylphenyl)-1-phenylethan.

Der Schmelzpunkt der so erhaltenen Kristalle betrug 75 bis 77°C und ihr NMR-Spektrum, Infrarotabsorptionsspektrum und Massenspektrum stimmte mit denjenigen einer authentischen Probe von 2-(4-Isobutylphenyl)-propionsäure überein.

Die Umwandlung des Ausgangsmaterials in die Zielverbindung ist im folgenden gezeigt.

CH.

■CHCH

Beispiel 4 Beispiel einer Kurzzeitkultur

Nach Einführung von 50 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Kulturmediums und 0,01 g 1-(4-Isobutylphenyl)-1-phenylethan in einen 300 ml Erlenmeyerkolben und Unterwerfung des Mediums unter Hochdrucksterilisierung während 15 Minuten bei 121°C wurde derselbe Stamm von Pseudomonas Cepacia wie in Beispiel 1 in das so sterilisierte Kulturmedium inokuliert und das Inokulum wurde 3 Tage lang bei 3O°C unter Drehen und Schütteln des Kolbens kultiviert.

Nach Zentrifugieren des so kultivierten Materials, wodurch die Bakterienkörper entfernt wurden, wurde der Oberstand auf einen pH-Wert von weniger als 2 durch Zugabe von 6N Chlorwasserstoffsäure angesäuert und danach wurde die Zielsubstanz mit 50 ml Chloroform extrahiert. Nach Eindampfen der Chloroformphase bei erniedrigtem Druck wurden genau abgemessene 10 ml des Rückstandes einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographieanalyse unterworfen, wobei gefunden wurde, daß 4 mg 2-(4-Isobutylphenyl)-propionsäure in einer Ausbeute von 46% bezogen auf das Ausgangsmaterial 1-(4-Isobutylphenyl)-1-phenylethan gebildet worden waren.

Beispiel 5

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurden 0,2 g 1-(4-Isopropylphenyl)-1-phenylethan in der Kultur desselben Stammes von Pseudomonas Cepacia wie in Beispiel 1 verwendet und zu 2-(4-Isopropylphenyl)-propionsäure umgewandelt. Die Menge des Produkts betrug 49 mg entsprechend einer Ausbeute von 28,6% bezogen auf das

Ausgangsmaterial 1-(4-Isopropylphenyl)-1-phenylethan.

Die Umwandlung des Ausgangsmaterials in die Zielverbindung

ist im folgenden gezeigt.

CE

CH

CH.

CH:

CH-COOH CH „

ORIGINAL INSPECTED

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von 2-(Substituylphenyl)-pro- , pionsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen ^J Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudonomas gehört und ^J-eine Aktivität zur Umwandlung von 1-(Substituylphenyl)-1-phe-

. nylethan zu 2-(Substituylphenyl)-propionsäure aufweist, in ein 0,01 bis 0,5 Gew.% 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan enthaltendes Kulturmedium inokuliert und die so inokulierten Mikroorganismen bei einer Temperatur von 25 bis 35°C und einem pH-Wert von 6 bis 8 kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als 1-(Substituylphenyl)-1-phenylethan eine Verbindung der Formel (I)

(D

verwendet, in der R eine Restgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus gradkettigen Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, verzweigten Alkylgruppen mit 3 bis Kohlenstoffatomen, CF₃-CH₂CH₂- und CF₃-CHCH₂- bedeutet.

CH₃