DE2834308C2 - Verfahren zur Wasserabspaltung aus einer kolloidalen Liposomen-Dispersion - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Wasserabspaltung (Konservierung) aus einer kolloidalen Liposomen-Dispersion in einem wäßrigen Flüssigmilieu.

Wie bekannt, wird der Ausdruck »Liposome« üblicherweise verwendet, um die mikroskopischen Bläschen zu bezeicnen, die eine Flüssigkeit umgeben und aus Lipiden mit der allgemeinen Formel X-Y gebildet werden, in der X eine polare hydrophile Gruppe und Y eine nicht polare hydrophile Gruppe ist.

Man kann beispielsweise einerseits aus den polaren Gruppen X als besonders in Frage kommend die Radikale Phosphat, Carboxyl, Sulfat, Amino, Hydroxyl, oder Cholin nennen. Andererseits kann die nicht polare Gruppe Y ein gesättigtes oder nicht gesättigtes Kohlenwasserstoff-Radikal sein, wie beispielsweise ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alinyl-Radikal, das erforderlichenfalls durch ein zykloaliphatisches Radikal ersetzt werden kann.

Wie außerdem bekannt, weisen die Liposome wesentliche Vorteile für die Einkapselung biologisch aktiver Substanzen auf. In diesem Fall können sie vorteilhaft aus Phospholipiden wie Lecithin, aus Phosphatidyl-Äthanolamin, aus Phosphatidyl-Serin oder phosphatidischer Säure gebildet werden.

Angesichts der unvorhersehbaren und recht begrenzten Stabilität liposomenhaltiger Dispersionen ist es allgemein erforderlich, sie in den ersten Monaten nach ihrer Herstellung zu verwerten, um jede unerwünschte Veränderung der Liposome im Verlauf der Zeit zu vermeiden.

Trotz zahlreicher interessanter Anwendungen, die für die Liposome in Betracht kommen, ist ihr Anwendungsgebiet bisher wegen ihrer relativ beschränkten Lagerungsdauer begrenzt gewesen.

Es wäre daher offensichtlich wünschenswert, die Dauer der Konservierung der Liposome wesentlich zu erhöhen, um ihr Anwendungsgebiet als Mittel zur Einkapselung erweitern zu können.

Dies stellt jedoch vor erhebliche Probleme angesichts der relativ instabilen Struktur der Liposome.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Konservierungsdauer der Liposome erheblich zu verlängern und sie in einem stabilen Zustand zu erhalten, der ihre Weiterverwendung auf wirkungsvolle Weise ermöglicht.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Wasserabspaltung aus einer kolloidalen Liposomen-Dispersion in einem wäßrigen Flüssigmilieu erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß man eine hydrophile Zusammensetzung mit der Liposomen-Dispersion vermischt und die derart erhaltene Mischung einer Wasserabspaltungsbehandlung unterwirft, durch die die Liposome in Form eines stabilen Pulvers erhalten werden, das ihre verlängerte Lagerung und die spätere Rückbildung der Liposomen-Dispersion ausgehend von diesem Pulver und einem wäßrigen Milieu ermöglicht.

Vorzugsweise wird die Wasserabspaltung entsprechend diesem Verfahren durch eine Lyophilisierung durchgeführt, die darin besteht, die Mischung einem Gefrieren zu unterwerfen, auf das eine Sublimation unter Vakuum folgt. Dies ermöglicht, auf diese Weise das wäßrige Milieu durch einen unmittelbaren Durchlauf vom festen Zustand in den gasförmigen Zustand zu trennen und zwar, ohne die Liposome einer Schockbehandlung irgendwelcher Art zu unterwerfen, die sie erheblich beschädigen könnte.

Das derart erhaltene Liposomenpulver ist sehr stabil bei einer Lagerung unter Feuchtigkeitsabschluß und bei Umgebungstemperatur in einem dichten Behälter, beispielsweise in einer Vakuumverpackung. Dieses Pulver kann so für eine längere Dauer gelagert und dann wiederverwendet werden, indem es erneut in einem geeigneten wäßrigen Milieu dispergiert wird, um die Liposomen-Dispersion wiederherzustellen.

Die vorherige Zumischung einer hydrophilen Zusammensetzung stellt einen unverzichtbaren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, weil der Vorgang der Wasserabspaltung für sich allein nicht ausreicht.
Die Erfahrung hat gezeigt, daß eine einfache Wasserabspaltung der liposomenhaltigen Dispersion durch Lyophilisierung Liposomen in Form einer fetten haftenden Ablagerung erzeugt, die praktisch im Wasser unlöslich und damit zur Wiederherstellung der liposomenhaltigen Dispersion, um eine Anwendung der Liposomen zu ermöglichen, nicht verwendbar ist.

Infolgedessen erlaubt das Verfahren entsprechend der Erfindung nicht nur die verlängerte Lagerung der Liposomen, sondern gewährleistet auch ihre Rückgewinnung in einer geeigneten Form, die ihre Weiterverwendung erlaubt.

Die hydrophile Zusammensetzung, die man zur Durchführung des Verfahrens verwendet, kann vorteilhaft aus verschiedenen Zusammensetzungen mit erhöhtem Molekulargewicht ausgewählt werden.

So hat man zufriedenstellende Ergebnisse durch Verwendung verschiedener hydrophiler Polymere wie beispielsweise Dextran, Rindereiweiß, Polyvinylalkohol (APV) und Gummi Arabicum erzielt.

Man kann im übrigen auch die Verwendung hydrophiler Zusammensetzungen mit weniger hohem Molekulargewicht wie beispielsweise Sucrose in Aussicht nehmen.
Diese hydrophile Zusammensetzung stellt damit auch

ein Stabilisierungsmittel dar, das es ermöglicht, die das entwässerte Erzeugnis darstellenden Liposome in einem Zustand zu konservieren, der ihre Weiterverwendung ermöglicht Das Vorhandensein einer solchen hydrophilen Zusammensetzung in dem entsprechend erhaltenen Liposomenpulver braucht keinen besonderen Nachteil darzustellen, insbesondere wenn man ein natürliches, aus den vorerwähnten Polymeren ausgewähltes Polymer verwendet.

Beispielsweise ermöglicht das Dextran jede Weiterverwendung des Liposomenpulvers. In dem Fall, wo die derart konservierten Liposome ins Blut injiziert werden sollen, verwendet man vorzugsweise Dextran oder Polyvinylpyrrolidon als hydrophile Zusammensetzung. Wenn dagegen diese Liposome zu einer oralen Eingabe bestimmt sind, kann man jede hydrophile Zusammensetzung verwenden, die aus den verschiedenen, beispielsweise vorerwähnten Zusammensetzungen ausgewählt ist.

Was die Qualität der hydrophilen Zusammensetzung angeht, die man mit der liposomenhaltigen Dispersion vor der Wasserabspaltung zumischt, so entspricht diese vorzugsweise der Menge der Substanz, die die in der Dispersion enthaltenen Liposome darstellt. Die Menge der verwendeten hydrophilen Zusammensetzung kann sich aber in einem relativ weiten Bereich bei der Durchführung des Verfahrens ändern.

Das Verfahren soll mit Hilfe der folgenden Beispiele erläutert werden:

Beispiel 1

Zuerst wurde eine kolloidale Liposomen-Dispersion im Wasser hergestellt. Diese Liposome werden aus Lecithin in einer Menge gebildet, die 25 mg pro Milliliter entspricht, und sie schließen eine wäßrige Insulin-Lösung(100 mg Insulin pro Milliliter)ein.

Dann wurden der kolloidalen Dispersion 25 mg/ml Dextran (Pharmacia T70) als Stabilisierungsmittel zugefügt, das man gut mit der Dispersion in einem Behälter vermischt.

Der die derart gewonnene flüssige Mischung enthaltende Behälter wurde dann bei — 30⁰C eine Stunde lang in eine Gefrierkammer gestellt, um diese Mischung zu gefrieren. Dann wurde er in eine Kammer unter Vakuum (absoluter Druck 0,1 mm Hg) verbracht, in dem das gefrorene Wasser der kolloidalen Dispersion sich innerhalb mehrerer Stunden sublimierte.

Auf diese Weise erhielt man ein feines Pulver, das das lyophilisierte Erzeugnis bildete, welches man unter Vakuum konservierte.

Von diesem Erzeugnis wurden einerseits direkt nach der Lyophilisierung und andererseits in gegebenen Abständen, nämlich 15 Tagen, einem Monat, zwei Monaten, sechs Monaten, zwölf Monaten und achtzehn Monaten Lagerung unter Vakuum, Proben von 100 mg entnommen.

Die auf diese Weise entnommenen Proben wurden leicht in Wasser aufgelöst, um die kolloidale Lösung wiederherzustellen, die man danach einer Ultrafiltration unterwarf, die es erlaubte, die Liposome zurückzugewinnen. Dieser Vorgang ermöglichte so, die Menge der unbeschädigten in der dispergierten Phase enthaltenen Liposome zu bestimmen, und zwar mit Hilfe einer Dosierung von in dem Ultrafiltrat enthaltenem freien Insulin.

Die nach diesen Maßnahmen erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß eine anfängliche Zerstörung von ungefähr 30% der Liposome infolge der Lyophilisierungsbehiindlung stattfindet. Dagegen erleben die unbeschädigt bleibenden Liposome in dem lyophüisierten Erzeugnis von etwa 70% keinerlei wesentlichen Zerfall während 18 Monaten, wie dies im übrigen aus der nachstehenden Tabelle 1 ersichtlich ist, die den Prozentsatz der Liposome als Funktion der Zeit angibt.

Tabelle 1	10	Zustand	Pro/.ciii-.ii der
	unbeschädigten Liposome
ursprüngliche Dispersion	100%
15 nach Wasserabspaltung	68.2%
nach 15 Tagen	71,5%
nach 1 Monat	64,8%
nach 2 Monate	66.6%
nach 6 Monaten	67,5%
20 nach 12 Monaten	70,4%
nach 18 Monaten	65.2%

Es handelt sich dort also um eine Veränderung von ±5% im Verlauf der Zeil in bezug auf den Mittelwert, was der Präzision der Messung entspricht.

Beispiel 2

Es wurde in gleicher Weise vorgegangen wie in Beispiel 1, nur wurde das Dextran durch eine gleiche Menge Gummi Arabicum als Stabilisierungsmittel ersetzt. Nach der Wasserabspaltung enthielt das durch Lyophilisierung erhaltene Pulver eine Liposomenmenge entsprechend 71,5% der ursprünglich in der kolloidalen Lösung enthaltenen Menge der Liposome, die der Lyophiliserung unterworfen wurde. Nach zwei Monaten Lagerung dieses Pulvers enthielt es 70,2% der ursprünglichen Menge an Liposome vor der Wasserabspaltung, d. h. man hat keinen wesentlichen Zerfall infolge dieser Lagerung feststellen können.

Die derart erhaltenen Ergebnisse mit Gummi Arabicum als Stabilisierungsmittel entsprechen etwa denjenigen, die im Beispiel 1 gegeben wurden.

Man hat Vergleichstests entsprechend den in den obigen Beispielen 1 und 2 beschriebenen durchgeführt, bei denen man Rinderfett, Gummi Arabicum, Dextran, AVP (Polyvinylalkohol) oder PVP (Polyvinylpyrrolidon) als Stabilisierungsmittel verwandte, und zwar in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1 einerseits und 4 : 1 ar.dererseits in bezug auf das Gewicht des Lecithins, das die Liposome in der kolloidalen Dispersion bildete, die dann der Wasserabspaltung unterworfen wurde.

Aufgrund dieser Versuche kann der Schluß gezogen werden, daß die vorerwähnten Stabilisierungsmittel etwa äquivalent sind und daß eine Erhöhung ihrer Menge es erlaubte, bessere Ergebnisse zu erreichen, beispielsweise eine Rückgewinnung von 76,2% der Liposome nach der Lyophilisierung, wenn man das Gewichtsverhältnis zwischen dem Gummi Arabicum und dem Lecithin auf einen Wert von 4 :1 erhöhte.

Wie sich aus Vorstehendem ergibt, kann das beschriebene Verfahren auf relativ einfache und schnelle Weise durchgeführt werden.

Die Wasserabspaltung durch Lyophilisierung wie beschrieben ist besonders vorteilhaft, da sie eine sorgsame Behandlung darstellt, die einen relativ geringen Verlust an der Wasserabspaltung unterworfenen Liposome hervorruft. Man kann aber auch andere Verfahren zur

Wasserabspaltung vorsehen, beispielsweise eine Trocknung an Luft bei einer relativ schwachen Temperatur,
die es erlaubt, eine thermische Beschädigung der Liposome zu vermeiden.

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Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Wasserabspaltung aus einer kolloidalen Liposomen-Dispersion in einem wäßrigen Flüssigmiüeu, dadurch gekennzeichnet, daß man eine hydrophile Zusammensetzung mit der Liposomen-Dispersion vermischt und die derart erhaltene Mischung einer Wasserabspaltungsbehandlung unterwirft, durch die die Liposomen in Form eines stabilen Pulvers erhalten werden, das ihre verlängerte Lagerung und die spätere Rückbildung der Liposomen-Dispersion ausgehend von diesem Pulver und einem wäßrigen Milieu ermöglicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung der hydrophilen Zusammensetzung mit der Liposomen-Dispersion einer Behandlung unterwirft, die darin besteht, diese Mischung zu gefrieren und anschließend unter Vakuum zu entwässern, um das Liposomenpulver zu erhalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man der kolloidalen Dispersion eine Menge der hydrophilen Zusammensetzung beimengt, die zumindest derjenigen der Substanz entspricht, die die Liposome in dieser Dispersion darstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophile Zusammensetzung aus Dextran besteht.