DE2625843C2 - Nona- und Decapeptidamide, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

^C)

und deren pharmakologisch verträgliche Salze.

2. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-D-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-Ieucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid

und dessen pharmakologisch verträgliche Salze.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I gemäß Anspruch I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise von einer Verbindung der allgemeinen Formel

mit folgender Substituenten-Bedeutung und Zuordnung

a) X¹ = Ser(R*). Y = D-Trp und Z¹ = GIy-R²; oder

b) X¹ = SertR"), Y = D-Phe und Z¹ = GIy-R²; worin R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ Schutzgruppen bedeuten, und

R⁸ ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeutet;

oder von einer Verbindung der allgemeinen Formel R^pyroGIu-HisiN^-

mit folgender Substituenten-Bedeutung und Zuordnung

c) X' = Ser(R⁶), Y = D-Trp und Z² = GIy-A; oder d) X¹ = Ser(R"). Y = D-Phe und Z² = GIy-A;

worin R⁴. R\ R\ R⁷ und R* vorstehend definiert sind, und A tür

^{H H}

C₆H₃

steht,

oder von einer Verbindung der allgemeinen Formel

R'-pyroGlu-His-Trp-D-SertRVTyrlR'j-D-Leu-Lcu-ArgiN^-R'VPro-NHR¹

worin R' eine CV bis Cj-Alkylgruppc bedeutet und R⁴, R\ R" und R⁷ Schutzgruppen bedeuten,

die Schutzgruppen abspaltet.

Ni 4. Arzneimittel mit üblichen Forniulicrungsmilteln und Trägern, enthaltend eine oder mehrere Verbin

dungen der Ansprüche 1 bis 2.

Die Erfindung betrifft Nona- und Decapeptidamide der Formel I

pyroGlu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z (I)

mit folgender Substituentcn-Bedcutung und Zuordnung:

Scr	I) IVp	GIy-NII,
Scr	I)-PhC	CiIy-NlI,
D-Ser	D-Leu	NH(C1- bis CVAIkyl)

und deren pharmakologisch verträgliche Sal/c.
Diese Peptide der Formel I werden auch bezeichnet als:

a) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid,

b) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryplophyl-L-scryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid,

c) L-Pyroglutymal-L-histidyl-L-tryptophyl-D-scryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin^Ci- bis C_ralkyl)-amid

:o und können mit der Abkürzung

a) [D-Trp^fc|-LH-RH,

b) ID-PhC¹¹I-LH-RILbZW.

c) [D-Ser\D-Lcu\desGly-NH}"l-LH-RII-(C, bis C_ralkyl)-amid

bezeichnet werden.

Sowohl das luteinisiercndc Hormon (LH) als auch das Follikel-stimulierende Hormon (FSH) sind gonadotrope Hormone, die von der Hypophyse von Mensch und Säugetieren produziert werden. LH stimuliert zusammen mit FSH die Freisetzung von Östrogenen aus den reifenden Follikeln in den Ovarien und induziert im weibliehen Organismus den Ovulationsprozeß. Im mannlichen Organismus stimuliert LH die interstitiellen Zellen bzw. die Leydig'schen Zwischenfällen und wird daher auch interstitielle Zellen stimulierendes Hormon (ICSH) genannt. FSH induziert die Reifung der Follikel in den Ovarien und spielt zusammen mit LH eine bedeutende Rolle beim Zyklus des weiblichen Organismus. FSH fordert die Entwicklung der Keimzellen der männlichen Hoden. Sowohl LH als auch FSH werden von der I lypophyse durch Einwirkung des LH- und FSH-freisetzenden 3 Hormons freigesetzt, und es bestehen deutliche Hinweise darauf, daß dieses freisetzende Hormon im Hypcthalamus gebildet wird und die Hypophyse aui neurohumoralem Wege erreicht, vergl. z.B. A.V. Schally et al.. Recent Progress in Hormone Research, 24, 497 (1968).

Das natürliche LI I- und FSH-freisetzcnde Hormon wurde aus dem I lypothalamus von Schweinen isoliert, und seine Struktur wurde von A. V. Schally et al., Hiochcm. Res. Commun., 43,393 und 1334 (1971) untersucht, der die Decapeptid-Struktur

pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Lcu-Arg-Pro-Gly-NH,

vorschlug. _4<

Diese Struktur hat sich durch Synthese bestätigt, vergl. beispielsweise H. Matsuo et al.. Biochem Biophys Res. Comm., 45, 822 (1971) und R. Geiger et al., ibid., 45, 767 (1971).

Im folgenden wird das natürliche LH- und FSH-frcisetzcndc Hormon LH-RH genannt.

Auf Grund der Bedeutung von LH-RH sowohl in der diagnostischen als auch in der therapeutischen Medizin besteht ein beträchtliches Interesse an der Herstellung neuer Verbindungen mit im Vergleich mit dem natürlichen Hormon verbesserten Eigenschaften. Eine Annäherung an dieses Ziel war die selektive Modifikation oder der selektive Ersatz von Aminosäureresten des LH-RH durch andere Aminosäuren. Obwohl sich in einigen wenigen Fällen Peptide mit derartigen Änderungen als aktiver erwiesen haben als LH-RH, beispielsweise [D-AIa⁶I-LH-RH, A. Arimura et al.. Endocrinology, 95, 1174 (1974), (D-LeU⁶J-LH-RH und [D-Leu⁶, desGly-NH2"I-LH-RH-äthylamid, J. A. Vilchez-Martine/ et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 59, 1226 (1974). haben sich in den meisten Fällen modifizierte Peptide als weniger aktiv erwiesen.

Es wurde nunmehr gefunden, daß

a) der Ersatz des Glyeylrcsls in der 6-Stellung von LH-RH durch D-Tryptophan; oder

h) der Krsal/. des Glycylrcsts in 6-Stcllung von LII-RH durch D-Phenylalanin; oder _M>

c) der Ersatz des L-Scrylrcsts in 4-Stellung von LH-RH durch einen D-Scrylrest, Ersatz des Glycylrests in

6-Stellung durch einen D-Leucylrcst und Ersatz des Glycinamidrcst in 10-Stcllung durch eine C,- bis C,-

Alkylamidgruppc,

/u einem Peptid der Formel I führt, das wesentlich aktiver und länger wirksam ist als LH-RH.

Gemäß einer Ausführiingsform der Erfindung wurde gefunden, daß die Änderung der Asymmetrie des Scrylrests in 4-Stcllung zusammen mit der Einführung eines D-Lcucylrcsts in der 6-Stcllung zu einer erhöhten Wirksamkeit und verlängerten Wirksamkcitsdauer des Pcptidsdcr Formel I führt, worin X = D-Scr. Y = D-Lcu und

Ser	D-Trp	GIy-NH2
Ser	D-Phe	GIy-NH2
D-Ser	D-Le u	NH(Cj- bis C3-ASkVi)

Z = NHR¹, was überraschend ist, insbesondere, da im allgemeinen eine Änderung der Asymmetrie der Aminosäurereste von LH-RH und/oder ein Ersatz davon zu eiDem Derivat führt, das wesentlich weniger wirksam ist als LH-RH selbst; vergl. beispielsweise Y. Hirotsu, Biochem. Biophys. Res. Comm., 59,277 (1975). In diesem Zusammenhang hat es sich auch gezeigt, daß [D-Ser⁴J-LH-RH weniger als 5 % der LH-RH-Aktiviläl desnatüriichen s Hormons aufweist.

Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide der Formel I sind von praktischer Bedeutung. Die geringe minimal wirksame Dosis verringert Nebenwirkungen sowie die Kosten zur Herstellung der Verbindung, und die längere Wirkungsdauer verringert die Notwendigkeit mehrfacher Verabreichung.

Gegenstand der Erfindung sind Nona- und Decapeptidamide der allgemeinen Formel I:
lu

pyroGlu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z (I)

mit Folgender Substituenten-Bedeutung und Zuordnung:

und deren pharmakologisch verträgliche Salze.

Bevorzugt sind L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-D-seryl-L-tyrosyl-D-Ieucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid und dessen pharmakologisch verträgliche Salze.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können erhalten werden, indem man in an sich bekannter Weise von einer Verbindung der allgemeinen Formel

R*-pyroGlu-His(N'ⁿⁱ-R⁷)-Trp-X'-Tyr(R⁵)-Y-Leu-Arg(N^t:-R-')-Pro-Z^l

mit folgender Substituenten-Bedeutung und Zuordnung

a) X' = SeitR"). Y = D-Trp und Z' = GIy-R²; oder

b) X¹ = SeitR"). Y = D-Phe und Z¹ = GIy-R²; worin
R⁴, R\ R" und R⁷ Schulzgruppen bedeuten, und

R* ein Wassersloft'ulom oder eine Schutzgruppe bedeutet;

oder von einer Verbindung der allgemeinen Formel
40

mit folgender Substituenten-Bedeutung und Zuordnung

c) X¹ = Ser(R"), Y = D-Trp und Z² = GIy-A; oder
d) X¹ = Ser(R"), Y = D-Phe um! Z² = GIy-A;

worin R⁴, R⁵, R⁽¹, R⁷ und R⁸ vorstehend definiert sind, und A für
H

C₁₁H₅

steht,

oder von einer Verbindung der allgemeinen Formel

R*-pyroGlu-His-Trp-D-Ser(R")-Tyr(R⁵)-D-Leu-Leu-Arg(N^t:-R⁴)-ProNHR^l

worin R¹ eine C₁- bis Cj-Alkylgruppc bedeutet

und
R\ R⁵, R" und R⁷ Schutzgruppen bedeuten,

die Schutzgruppen abspaltet.

Dabei bedeutet H^A eine Schutzgruppe für N"-. N"- und N'"-Stickstoffatome des Arginine, ausgewählt aus der Gruppe von Tosyl, Ni'ry, Benzyloxycarbonyl und Adamantyloxycurbonyl. R⁵ bedeulel eine Schulzgruppe Pur die Hydroxylgruppe von Tyrosin, ausgewählt aus der Gruppe von 2-Brombcnzyloxycarbonyl. Benzyl. Acetyl, Tosyl, Benzoyl. terl.-Bulyl, Tetrahydropyran-2-yl, Trityl, 2,4-l)ichlorben/yl und Bon/yloxycurbonyl; R^h ist eine

Schutzgruppe für die I lydroxylgruppe des Serins, ausgewiihll aus der vorstehend für R" definierten Gruppe. R⁷ ist eine Schutzgruppe für die Imidazol-Stickstoflatome des Histidins, nämlich eine Tosyl- oder Dinitrophenylgruppe. R* bedeutet ein Wusserstoffatom oder σ-Amino-Schutzgruppe, ausgewählt aus der Gruppe von tert.-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl und d-Isobornyloxycarbonyl.

Bei der Herstellung nach der Festphasenmethode sind die Verbindungen über die Verankerungsbindung A an einen festen Harzträger gebunden.

Der Ausdruck »C|- bis C,-Alkyl« bezeichnet Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und umfaßt Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl.

N° = die Seitenketten-Slickstoffalomc von Arginin. N^lm = die Imidazol-Stickstoflatome von Histidin.

Das Symbol 0 bedeutet »Phenyl«.

Im allgemeinen basieren die hier verwendeten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren und Schutzgruppen auf den Empfehlungen der lUPAC-lUB-Kommission für die biochemiöschc Nomenklatur, vergl. Biochemistry 11, 1726 (1972). Beispielsweise t-Boc - tcrt.-Butyloxycarbonyl, Z - Benzyloxycarbonyl.Tos = Tosyl. 2-Br-Cbz = 2-Brombcnzyloxycarbonyl, BzI = Benzyl und Dnp = 2,4-Dinitophenyl. Die hier für die verschiedenen Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind Arg - Arginin, GIy - Glydir,, His = Hisiidin, Leu = Leucin. Pro = Prolin, (pyro)-Glu = 5-Oxoprolin (Pyrolglutaminsäure), Scr = Serin, Trp = Tryptophan und Tyr = Tyrosin. Alle hier beschriebenen Aminosäuren gehören der L-Reihe an, falls nicht anders angegeben, ti. h. D-Ser = ein D-Seryirest, D-Lcu = ein D-Leucylrest, D-Phe ··= ein D-Phenylalanylrcst und D-Trp = ein Tryptophylrcst.

Die erfindungsgemäßen Peptide der Formel I können in Form von Säureadditionssalzcn erhalten werden. Beispiele für solche Salze sind die Salze mit organischen Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure. Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäurc oderToluolsulfonsäure, sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure bzw. J5 Tannin oder Carboxymethylcellulose, und Salze mit unorganischen Säuren, wie Halogenwasscrstoffsäuren, z. B. !

Chlorwasserstoffsäure, oder Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Gegebenenfalls kann ein spezielles Säureadditionssalz in ein anderes Säurcadditionssaiz, z. B. ein Salz mit einer sicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure, durch Behandlung mit dem entsprechenden Ionenaustauscherharz nach der von R. A. Boissonnas et al., HeIv. Chim. Ac'a,43,1349(1960) beschriebenen Weise umgewandelt werden. Geeignete Ionenaustauscher- jo harze sind Kationenuustauschcr auf Cellulosebasis, beispielsweise Carboxymethylcellulose, oder chemisch modifizierte quervernetzte Dextran-Kationenaustauscher, beispielsweise solche von Sephadex* C-Typ, und stark basische Anionenaustauscherharze, beispielsweise die von J. P. Greenstein und M. Winitz in »Chemistry of the Amino Acids«, John Wiley and Sons, Inc., New York und London, 1961, Band 2, Seite 1456 aufgeführten. '

Die Peptide der Formel I und ihre Salze besitzen wertvolle lang-wirksame LH- und FSH-frcisctzende Hormon- J5 Wirksamkeit.

Die wertvollen LH- und FSH-freisetzende Hormon-Wirksamkeit und die langanhaltendc Wirksamkeit der empfindungsgemäßen Verbindungen sind aus pharmakologischcn Standard-Untersuchungen ersichtlich. Beispielsweise können diese Wirksamkeiten durch von A. Arimura et al.. Endocrinology, 95,1174 (1974) beschriebenen Untersuchungen veranschaulicht werden. Beispielsweise zeigen nach der dort beschriebenen Arbeits- weise LH-Freisetzungs-l-rgcbniss.dican Ratten erzielt wurden, denen eine Dosis von (50 ng, subkutan) der Verbindung verabreicht wurde, daß die Peptide der Formel I Spitzenaktivitäten etwa 2 Stunden nach der Dosierung aufweisen und daß noch nach bis zu 6 Stunden eine beträchtliche Wirksamkeit vorliegt. Dagegen wird bei der gleichen Dosis von LH-RH (50 ng, subkutan) eine Spitzenaktivität nach etwa 15 Minuten erzielt, und nach 1 Stunde können keine Wirkungen der Injektion mehr beobachtet werden. Auch integrierte Mengen von LH während einer Zeitdauer von 6 Stunden zeigen, daß die Verbindungen der Formel I [D-Ser\D-Lcu\des-Gly-NHjⁿ]-LH-RH-äthylamid, [D-Phe"|-LH-RH und [D-Trp^l-LH-RH 21-, 20- bzw. 12mal aktiver bei Freisetzung von LH sind als LH-RH. Die FSI I-Freisetzungs-Datcn nach Injektionen der Verbindungen der Formel I zeigen, daß [D-Ser\D-Leu",desGly-NH.!"|-LH-RH-äthylamid, [D-PhC⁶J-LH-RH und [D-TTp⁶I-LH-RH etwa 11-, 20- bzw. 20mal aktiver sind als LH-RH bei der gleichen Dosierung (50 ng).

Darüber hinaiii kann die Wirksamkeit einer Verbindung der Formel I am Menschen demonstriert werden:

Radioimmun-Untersuchungen von Untersuchungen von Serumgehalten von LH nach intranasaler Verabreichung zeigen, daß die minimal wirksame Dosis von LH-RH etwa 2,0 mg beträgt, wohingegen eine äquivalente Wirksamkeit mit einer Dosis von 0,5 mg [D-Trp''J-LH-RH erzielt wird. Hierbei werden die Verbindungen an Menschen in einer normalen Salzlösung verabreicht. Im Hinblick auf die FSH-Freisetzung beim Menschen ergeben vergleichende Untersuchungen von LH-RH und [D-Trp^A]-LH-RH besonders bemerkenswerte Ergebniss. Die intranasale Verabreichung von bis zu 2,0 mg LH-RH hat eine geringere oder gar keine Auswirkung auf die durch Radioimmun-Untersuchung gemessenen FHS-Serum-Gehalte, H. G. Dahlen et al.. Horm. MeUb. Res., 6,510 (1974). Jedoch setzen unter den gleichen Bedingungen 0.5 mg [D-Trp⁶]-LH-RH beträchtliche Mengen an FSH frei, d. h. Mengen im Bereich von 0,3 bis über 1,5 miU/ml. Es ist ersichtlich, daß eine Verbindung, die dazu geeignet ist, FSH wirksam freizusetzen, viele therapeutische Anwendungsmöglichkeiten besitzt, vergl. beispielsweise H. G. Dahlen et al., a.a.O. _:

Die LH- und FSH-Frcisetzungs-Eigenschaften der Peptide der Formel I, die ihrerseits die Ovulation bei Tic- I

ren bewirken, machen die Peptide für die veterinärmedizinische Praxis sowie für die Viehzucht wertvoll. Es ■'

kann oft erwünscht sein, die Brunstperiode in Viehhaltungen, beispielsweise bei Rindern, Schafen oder Schwei- 65 ^i nen, synchron ablaufen zu lassen, entweder, um alle weiblichen Tiere einer Gruppe durch ein männliches Tier mit den erwünschten genetischen Qualitäten /u hcsamen, oder, um eine künstliche Besamung bei einer maxi- Ϊ--

malen Anzahl von weiblichen Tieren durchführen zu können, und zwar beides innerhalb einer relativ kurzen ':,^;

Zeitspanne. Bisher hat man dies durch Verabreichung von ovulalionsinhibierer.den Mitteln an die Tiere, Absetzen der Verabreichung dieser Mittel kurz vor der zur Befruchtung oder künstlichen Besamung vorgesehenen Zeit und Vertrauen auf die natürliche Produktion von LH und FSH zur Einleitung der Ovulation und Brunstperiode, oder durch Verabreichen von Gonadotropinen, bewirkt. Jedoch war dies nicht völlig zufriedenstellend, da die Ovulation zu einer vorherbestimmten Zeit niemals bei allen Tieren gleichzeitig, sondern lediglich bei einem gewissen Anteil davon auftrat, wenn man keine gonadotropen I lormone verwendete. Andererseits machten die hohen Kosten der Gonadotropic und durch ihre Verabreichung bewirkte Nebenwirkungen diese Methode nicht praktizicrbar. Es ist nunmehr möglich, eine im wesentlichen vollständige Synchronisierung der Ovation und der Brunstperiode zu erzielen, dadurch, dal.! man die Tiere einer bestimmten Gruppe zunächst

in mit einem Ovulatinnsinhinitor behandelt, der anschließend abgesetzt wird, und dann ein Peptid der Formel I kurz vorder für die Befruchtung oder künstliche Besamung bestimmten Zeit verabfolgt, um eineüvulalion und Brunst zu diesem Zeilpunkt zu erzielen. Die Zeitspanne bis zum Finsalz der Ovukition und der Brunst nach Verabreichung des Peptids variiert mit der Tierspezies, und dicopiimalcn Zeitintervalle sind für die jeweiligen Spezies zu ermitteln. Bei Nagetieren, wie Rallen oder Hamstern, findet beispielsweise die Ovulation innerhalb

:^; \on 18 Stunden nach Verabreichung eines crfindungsgcmä'ßcn Peplids statt.

Die vorstehende Methode zur Erzielung der Ovulation und Brunst innerhalb eines genau vorherbestimmten Zeitintervalls zur Sicherstellung einer erfolgreichen Befruchtung ist besonders bedeutsam für die Züchter von Rassepferden und Ausstellungstieren, wo die Kosten für die Dienste eines besonders hervorragenden männlichen Tieres häufig sehr beträchtlich sind.

Die Peptide der Formel ϊ kutmcn auch nüiziicn zur Steigerung der Anzahl der Lebendgeburten pro Trachtigkeit in Viehbeständen, beispielsweise von Rindern, Schafen oder Schweinen, verwendet werden. Für diesen Zweck wird das Peptid in einer Reihe von parenteralen Dosierungen, vorzugsweise durch intravenöse oder subkutane Injektionen, im Bereich von 0.1 bis 10 meg pro Tag, % bis 12 Stunden vor der erwarteten Brunst mit anschließender Befruchtung gegeben. Eine einleitende Injektion von 1000 bis 5000 ilJ eines Gonadotropin-

:> Serums von trächtigen Stuten kann ebenfalls I oder 2 Tage vor der vorstehenden Injektion des Peptids gegeben werden. Eine ähnliche Behandlung mit oder ohne vorhergehende Behandlung ist ebenfalls zur Einleitung der Pubertät bzw. Reifungsperiode von Haustieren geeignet.

Wird ein Peptid der Formel I zur Einleitung der Ovulation und der Brunst oder zur Füllleitung der Pubertät bei Warmblütern, insbesondere bei Nagetieren, wie Rallen oder Hamstern, oder in Viehbeständen verwendet, so

Jo wird es systemisch, vorzugsweise parenteral, in Kombination mit einer pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit oder einem festen Träger verabreicht. Der Anteil des Peplids wird durch seine Löslichkeil in dem gegebenen Tri.j.er, durch den gewählten Verabreichungsweg und nach biologischer Standardpraxis bestimmt. Zur parenleralcn Verabreichung an Tiere wird das Peptid in einer sterilen wäßrigen Lösung verwendet, die auch andere gelöste Materialien, wie Puller oder Konservierungsmittel, sowie ausreichend pharmazeutisch verträgliche

'·< Salze oder Glucose enthalten kann, um die Lösung isoionisch zu machen. Die Dosierung variiert mit der Form der Verabreichung und der speziellen Tierart, die behandelt werden soll, und liegt vorzugsweise bei 0,1 meg bis

H) meg pro kg Körpergewicht. Jedoch ist es besonders erwünscht, einen Dosisgchalt im Bereich von etwa I meg

bis etwa 5 meg pro Körpergewicht an/uwend-cn, urn wirfcsitntc Ergebnisse zu erzielen.

Die Peptide der Formel I können auch in einer der langwirksamen, langsam freisetzenden oder Depol-Dosic-

JH rungsformen, die nachstehend beschrieben sind, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion oder durch Implantation, verabreicht werden. Derartige Dosislbrmcn sind derart gestaltet, dall sie etwa 0,1 mcg his etwa 10 meg pro hg Körpergewicht pro Tag freisetzen. Die Peptide der Formel I sind auch in der Humanmedizin nütlieh. Beispielsweise wurde auch das Human-Choriongonadoiropin (UCG). das hauptsächlich LH und etwas FSH enthält, über 30 Jahre zur Behandlung gewisser endokriner F.rkrankungcn, wie Störungen des Zyklus,

•4> Amenorrhoe, mungchafte Entwicklung der sekundären Geschlechtsmerkmale und Unfruchtbarkeil bei der Frau, oder gewisse Fälle von Hypogonadismus, verzögerter Pubertät, Kryptorchismus und nicht-psychogener Impotenz beim Mann, verwendet. In letzter Zeil wurde die Unfruchtbarkeit der Frau auch mit menschlichem Menopause-Gonadotropin (HMG) behandelt, das hauptsächlich FSII cnlhält,gcfolgt von einer Behandlung mit HCG. Einer der Nachteile dieser Behandlung der Unfruchtbarkeit von Frauen mil HC(J oder mit I IMG, gefolgt

>u von HCG, zeigte sich darin, daß bei einer derartigen Behandlung häufig eine Superovulalion und unerwünschte Mehrfachgeburten eintreten, wahrscheinlich, da es nicht möglich ist, lediglich die exakten Mengen an FSH und LH zu verabreichen, die für die Ovulation notwendig sind.

Die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Peptids gleicht diese Nachteile aus, da die Verbindung die Frei- >ii>ung son LH und FSH über die Hypohysc lediglich in genauen Mengen, die für die normale Ovulation erfor-

5> derlich sind, bewirkt. Aus diesen Gründen ist ein erfindungsgeniäßes Peptid nicht nur für die vorstehenden

Zwecke geeignet, sondern ebenfalls zur Anwendung an Frauen bei der Behandlung von Störungen des Zyklus,

der Amenorrhoe, von ilypogonadismus und mangehafter Fnlwicklung der sekundären Geschlechtsmerkmale geeignet.

Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Peptide zur Kontrazeption geeignet. Wird beispielsweise das

M) Peptid an Frauen /u einem frühen Zeitpunkt des Menstruationszyklus verabreicht, so wird LI I zu diesem Zeitpunkt freigesetzt und bewirkt eine vorzeitige Ovulation. Das ungcrcifte Ovum ist entweder nicht geeignet zur Befruchtung oder, falls dennoch eine Befruchtung stattfinden sollte, ist es sehr unwahrscheinlich, daß das befruchtete Ei implantiert wird, da das zur Präparation des Fndometriums erforderliche Östrogen-Progeslin-Gleichgewicht nicht vorliegt und das Fndometrium sich nicht in dem Tür die Implantation notwendigen Zustand

to befindet. Wird andererseits das Peptid gegen das Ende des Zyklus verabreicht, so wird das Endometrium unterbrochen, und die Menstruation erfolgt.

Auch sind die erfindungsgemäßen Peptide nützlich bei der Kontrazeption durch die »Rhythmusu-Melhode, die immer relativ unzuverlässig war, das es nicht möglich ist, die Ovulation der Frau mit dem erforderlichen Ge-

nauigkcilsgrad vorherzubestimmen. Die Verabreichung des Peplids in der ;*iitte des Zyklus, d. h. zu etwa dem normalerweise zu erwartenden Zeilpunkt der Ovulalion, bewirkt kurz danach eine Ovulation und gestaltet so die »RhythmusH-Methode sicher und wirksam.

Die Peptide der Formel I sind auch als diagnostisches Mittel zur Unterscheidung zwischen den Funktionen oder Verletzungen von I lypothalamus oder I !ypophysc der Frau geeignet. Bei der Verabreichung des Peplids an > einen Paptienten, bei dem man derartige Mißfunktionen oder Verletzungen vermutet, und einem anschließend beobachteter Anstieg des Ll l-(iehaltes hat man einen guten Hinweis darauf, daß der I lypothalamus den Grund für die Mißl'uirktion ist und die Hypophyse intakt isl. Wird andererseits anschließend an die Verabreichung des Pcptids kein Anstieg des zirkulierenden LII beobachtet, so kann mit großer Sicherheil eine Diagnos auf Mißfunktion oder Verletzung der Hypophyse gestellt werden. in

Beim Manne schafft die Verabreichung eines l'eptids der Formel I die Mengen an LII (oder ICSH) und an FSH, die für eine normale sexuelle F.ntwicklung in Füllen von Hypogonadismus oder verzögerter Pubertät notwendig sind, und ist auch bei der Behandlung von Kryptorchismus nützlich. Darüber hinaus stimuliert das durch die Verabreichung des Peptids freigesetzte FSH die Entwicklung von Keimzellen in den Hoden, und das Peptid ist geeignet zur Behandlung von psychogener und nicht-psychogener Impotenz. :«

Werden die Peptide der Formel I, vorzugsweise in Form eines Saureadditionssalz.es, in der Humanmedizin verwendet, so werden sie systemisch, entweder intravenös, subkutan oder durch intramuskuläre Injektion oder sublingi.ia), nasal oder vagina! in Zusamniensetzungeü /ussmmef! mit eiiierr. pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Träger verabreicht.

Zur Verabreichung auf nasalem Wege in Form von Tropfen oder Sprays bevorzugt man ein Peptid der Formel I, gelöst in einem sterilen wäßrigen Vehikel, das auch andere gelöste Bestandteile, wie Puffer oder Konservierungsmittel, sowie ausreichende Mengen an pharmazeutisch verträglichen Salzen oder an Glucose zur Erzielung einer isotonischen Lösung enthalten kann. Dosierungen auf intranasalcm Wege liegen im Bereich \onO.l bis 50 meg/kg oder vorzugsweise 0,5 bis IO mcg/kg.

Die Peptide der Formel I können auch als nasale oder vaginale Pulver oder Einblasungen verwendet werden. Für derartige Zwecke wird das Peptid in leinverteilter fester Form zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen festen Träger, beispielsweise einem feinverteilten Polyäthylenglykol (Carbowax* 1540), feinverteilter Lactose oder, vorzugsweise für die vaginale Verabreichung, sehr leinverteiltem Siliciumdioxid (Cab-O-Sil*), verabreicht. Derartige Zusammensetzungen können auch andere F.xcipienten in leinverteilter fester Form, wie Konservierungsmittel, Puffer oder oberflächenaktive Mittel, enthalten.

Zur sublingualen oder vaginalen Verabreichung bevorzugt man die Formulierung der Peptide der Formel I in festen Dosisformen, wie Sublingualtablcttcn oder vaginalen Einlagen oder Suppositoricn, mit ausreichenden Mengen an festen Excipienten. wie Stärke, Lactose, gewissen Typen von Ton, Puffern, Gleitmitteln, desintegrierenden Mitteln oder oberflächenaktiven Mitteln, oder mit halbfesten Excipienten, die bei der Formulierung von Suppositorien üblich sind. Heispiele für derartige Excipienten finden sich in der pharmazeutischen Standard-Literatur, z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Compony. Easlon, Pa., 1970.

Die Dosierung der Peptide der Formel I hängt mit der Verabreichungslbrm und vom speziellen zu behandelnden Patienten ab. In allgemeinen beginnt man die Behandlung mit geringen Dosierungen, die wesentlich unter der optimalen Dosis der Verbindung liegen. Anschließend werden die Dosierungen in kleinen Schlitten erhöht, bis den Umständen entsprechende optimale Wirkungen erzielt werden. Im allgemeinen isl es erwünscht, die Peptide der Formel I in einer Konzentration zu verabreichen, die im allgemeinen wirksam LH und FSH freisetzt, ohne schädliche oder nachteilige Nebenwirkungen zu ergeben, und vorzugsweise wird in einer Dosierung im Bereich von etwa 0,01 meg bis etwa 100 meg pro kg Körpergewicht verabreicht, obwohl die vorstehenden Variationen durchgeführt werden können. Jedoch wird eine Dosierung des Peplids der Formel 1, worin

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NII, oder

b) X = Scr, Y = D-Phe und Z = GIy-NII,,

die im Bereich von etwa 0,5 meg bis etwa 5,0 meg pro kg Körpergewicht liegt, und des Peptids der Formel I, worin

O X = D-Scr, Y = D-Leu und Z = NH-(C,- bis C,-Alkyl)

die im Bereich von etwa 0,1 meg bis etwa 10 meg pro kg Körpergewicht liegt, besonders bevorzugt verwendet, um wirksame Ergebnisse zu erzielen.

Häufig ist es erwünscht, die Peptide der Formel I kontinuierlich über längere Zeiträume in Lang wirksamen, langsam freisetzenden Formen oder in Depot-Dosierungsformen zu verabreichen. Solche Dosierungsformen können entweder ein pharmazeutisch verträgliches Salz der Verbindung mit einem niedrigen Löslichkeitsgrad in Körperflüssigkeiten, beispielsweise Salze mit Pamoasäurc oder Gerbsäure bzw. Tannin oder Carboxymethylcellulose, enthalten, oder sie können die Peptide in Form eines wasserlöslichen Salzes, zusammen mit einem schützenden Träger enthalten, der eine rasche Freisetzung verhindert. Im letzteren Falle können die Peptide beispielsweise mit einer nicht-antigenen, partiell hydrolysierten Gelatine in Form einer viskosen Flüssigkeit verabreicht werden; oder sie können auf einem pharmazeutisch verträglichen festen Träger, wie beispielsweise Zinkhydroxid mit oder ohne Protamin, adsorbiert und suspendiert in einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Vehikel verabreicht werden; oder die Peptid«: können -n Gelen oder Suspensionen mit einem nicht-antigenen Schutz-Hydrokolloid, beispielsweise NairiumcarboxymethylccIIulose, Polyvinylpyrrolidon, Natriumalgi- nat. Gelatine, Pclygalakturonsäuren. beispielsweise Pektin, oder gewisse Mucopolysaccharide, zusammen mit wäßrigen oder nicht-wäßrigen, pharmazeutisch verträglichen flüssigen Vehikeln, Konservierungsmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln, formuliert sein. Beispiele fur solche Formulierungen finden sich in pharmazeuti-

zu zj

scher Standard-Literatur./. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, a.a.O. Langwirksame, langsam freisetzende Präparate der Peptide können auch durch Hinschiuli in Mikrokapseln aus einem pharmazeutisch verträglichen Ü'b?rzugsmalcrial. beispielsweise Gelatine, Polyvinylalkohol und Äthylcellulose, erhallen wcden. Weitere Beispiele für Überzugsmaterialien und die Verfahren /ur Mikroeinkapselung sind von J. A. llerbig in »Encyclopedia of Chemical Technology«. Kand 13, 2. A ullage, Wiley, New York, 1967, Seilen 43*» bis 456 beschrieben. Solche Formulierungen sowie Suspensionen von Salzen der Peptide, die in Körperllüssigkeiten lediglich mäßig löslich sind, werden se eingestellt, daß sie etwa ü, I meg bis etwa 50 meg des Hormons pro kg Körpergewicht pro Tag freisetzen, und sie werden bevorzugt durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Alternativ können einige der festen Dosierungsformen, die vorstehend aufgeführt sind, beispielsweise gewisse schlecht wasserlösliche Salze oder Dispersionen in oder Adsorbate auf festen Trägern von Salzen der Peptide, beispielsweise Dispersionen in einem neutralen Hydrogel eines Polymeren von Äthylenglykolmethaerylal oder ähnlichen Monomeren, die quervernetzt sind, wie in der US-PS 35 51 556 beschrieben, in der Form von Pellets vorliegen, die etwa die gleichen Mengen, wie vorstehend gezeigt, freisetzen und subkutan oder intramuskulär implantiert werden können.

i> Alternativ kann eine langsam freisetzende Wirkung während langer Zeiträume auch durch Verabreichung der crfindunysgemüßen Peptide in Form eines Süureadditionssalzcs in einer intravaginalen Vorrichtung oder in einem temporären Implantat, beispielsweise einem Container, der aus nicht-reizenden Siliconpolymeren, wie Polysiloxan, /. B. »Silastic«, oder einem neutralen Hydrogel eines Polymeren, wie vorstehend beschrieben, hergestellt ist, der eine Permeabilität aufweist, die /ur Freisetzung von etwa 0.1 meg bis ei «ä '0 meg pro kg Körper-

:u gewicht pro Tag erforderlich ist. Derartige intravaginale oder implantierbare Dosisformen zur verlängerten Verabreichung weisen den Vorteil auf, daß sie entfernt werden können, wenn es erwünscht ist, die Behandlung zu unterbrechen oder zu beenden.
Unter Bezugnahme auf R'' umfassen geeignete a-Amino-Schulzgruppcn

1) aliphatisch^ Urethan-Schutzgruppen. beispielsweise lert.Bulyloxycarbonyl, Diisopmpylmethoxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl, lsopropyloxycarbonyl, lert.-Amyloxycarbonyl, Äthoxycurbonyl, AIIyloxycarbonyl;

2) Schutzgruppen von Cycloalkylurethan-Typ, z. B. Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, d-Isobornyloxyearbonyl, Cyc'ohexyloxycarbonyl, Nitrophenylsulfcnyl, Trilylsulfcnyl, <r.<7-Dimcthyl-3,5-dime-

yo thoxybenzyloxycarbonyl und Trityl.

Bevorzugt wählt man die a-Amino-Schutzgruppe für V? aus tert.-Hulyloxycarbonyl. Cyclopentyloxycarbonyl, lert.-Amyloxycarbonyl, d-lsobornyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl und a.a-DimethylO.S-dimethoxybenzyloxycarbonyl.

Die erfindungsgemäßen Peptide der Formel I werden unter Anwendung einer Festphasensynthese hergestellt, die durch folgenden Ausführungsformen veranschaulicht werden soll.

a) und b) Petide der Formel I. worin

a) X = Ser. Y = D-Trp und Z = GIy-NH, oder
b) X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₂

Die Synthese in fester Phase der Peptide der Formel I, die unter a) und b) beschrieben sind, beginnt man mit dem C-terminalen Ende des Peptids unter Anwendung eines «-Amino-gcschützten Harzes. Ein derartiges Ausgangsmaterial wird durch Bindung eines σ-Amino-geschütztcn Glycins an ein Bcnzhydrylaminharz, ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz, wobei das erstgenannte bevorzugt ist, hergestellt. Die Herstellung eines Benzhydrylaminharzes wird beispielsweise von P. Rivaillc et al., HeIv. Chim. Acta, 54,2772 (1971), und die Herstellung des Hydroxymethylharzcs wird von M. Bodans und J.T. Sheehan, Chem. Ind. (London), 38, 1597 (1966) beschrieben. Ein chlormethylierles Harz ist im I landcl von den Bio Rad Laboratories erhältlich. Bei der Anwendung des Benzhydrylaminharzes wird eine amidverankcmde Bindung mit dem ff-Amino-geschüt7-ten Glycon wie folgt gebildet:

R⁹— N — CH,- C-NH-C-CH₄-

C₆H,

Dadurch wird es möglich, die C-terminale Amidfunktion direkt nach beendeter Synthese der Aminosäure-Sequenz zu erhalten durch Abspalten des Harzträgers von dem gebundenen Peptid unter Bildung des Glycinamids am C-endständigen Teil des gewünschten Decapeptids. In diesem Falle werden bei Verwendung von Fluorwasserstoff zur Abspaltung des Harzlrägers auch die Schutzgruppen der Seitenkette abgespalten, wobei man das entsprechende Decapeptid der Formel 1 erhall, worin,

a) X = Ser, X = D-Trp und Z = GIy-NH₂ oder

b) X = Ser. Y = D-Phe und Z = GIy-NH,.

Werden die anderen Harze verwendet, so ist die verankernde Bindung die Benzylestergruppe, wie vorstehend aufgezeigt In diesem Falle besteht eine zweckmäßige Verfahrensweise zur Umwandlung des gebundenen geschützten Peptids in das C-endständigc Amid darin, das geschützte Peptid von dem Harz durch Ammonolyse zu entfernen und anschließend die Schutzgruppen des resultierenden Amids durch Behandeln mit Natrium und flüssigem Ammoniak oder durch Spaltung mit Fluorwasserstoff^ entfernen. Ein alternatives Verfahren besteht in der Spaltung durch Umesterung mit einem nicdrig-Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, in Anwesenheit von Triäthylamin und anschließende Umwandlung des resultierenden Esters in ein Amid und schließlich Entfernung der Schutzgruppen, wie vorstehend beschrieben. Es sei hier auch auf J. M. Steward und J. D. Young, »Solid Phase Peptide Synthesis«, W. II. Freeman & Co., San Francisco, 1969, Seiten 40 bis 49 hingewiesen.

Insbesondere wird gemäß einer Ausl uhrungsform der vorliegenden Erfindung ein a-Amino-geschützten Glycin, vorzugsweise tert.-Butyloxycarbonylglycin, mit Benzhydrylaminhar/ mit Hilfe der Carboxylgruppen aktiverenden Verbindung, vorzugsweise Dicyclohcxylcarbodiimid, gekoppelt. Anschließend an die Koppelung des e-Amino-gcschütztenCilycins an den 11arzlrager wird die or-Amino-Schulzgruppe beispielsweise durch Trifluoressigsaurc in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder Chlorwasserslofsäure in Dioxan entfernt. Die Ent- fernung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwische 0⁰C und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standard-Spaltungsmittel und Bedingungen zur Entfernung von speziellen σ-Amino-Schutzgruppen können verwendet werden, wie beispielsweise von E. Schröder und K. Lübke, »The Peptides«, Band I, Academic Press, New York, 1965, Seiten 72 bis 75 beschrieben.

Nach Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe werden die verbleibenden s-aminogeschützteri Aminosäuren stufenweise in der gewünschten Reihenfolge unter Bildung des Peptids gekoppelt. Jede geschützte Aminosäure wird in den Festphasen-Reaktor in etwa dreifaciieni Überschuß eingeführt, und die Koppelung wird in einem Medium von Methylenchlorid oder Mischungen von Dimethylformamid und Methylenchlorid durchgeführt. In Fällen, wo eine unvollständige Kupplung auftritt, wird der Kupplungsarbeitsgang wiederholt, bevor die a-Amino-Schutzgruppe abgespalten wird und bevor die Kupplung der nächsten Aminosäure an die an das Polymere gebundene Aminosäure oder das Peptid erfolgt. Der Erfolg der Kupplungsrcaktion zu jeder Stufe der Synthese wird durch die Ninhydrinreaklion, wie von E. Kaiser et al., Analyt. Bioehem., 34,595 (1970) beschrieben, durchgeführt.

Nach der Synthese der gewünschten Aminosäuren-Sequenz wird das Peptid von dem Harzträger durch Behandeln mit einem Reagens, wie Fluorwasserstoff, abgespalten, das nicht nur das Peptid von dem Harz abspaltet, sondern alle restlichen Schutzgruppen von Scitcnketten und die a-Amino-Schutzgruppe (falls vorhanden) an dem Pyroglutaminsäurcrcst in dem Falle, wo das Benzhydryliaminharz zur direkten Erzielung des Peptids der Formel I, vorstehend als a) oder b) beschrieben, verwendet wurde, abspaltet.

Wird ein chlormethylicrtcs Harz verwendet, so kann das Peptid von dem Har/ durch Umesterung mit einem niedrig-Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, abgetrennt werden, worauf das gewonnene Produkt an Siliciumdioxidgel chromatographiert und die gewonnene Fraktion einer Behandlung mit Ammoniak unterzogen wird, um den niedrig- Alkylester, vorzugsweise den Methyl- oder Äthylester, in das C-cndständige Amid umzuwandeln. Die Seitenketten-Schutzgruppen werden anschließend durch Arbeitsweisen, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise durch Behandlung mit Natrium im flüssigem Ammoniak oder mit Fluorwasserstoff, abgespalten.

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Schutzgruppen (R⁷) Tür die Imidazol-SlickslolTalome von Histidin, kann R⁷ 2,2,2-Trinuor-l-benzoyIoxycarbonyluminoäthyl und 2,2,2-Trifluor-l-tert.-butyloxycarbonylaminoäthyl umfassen.

c) Peptide iler Formel I, worin c) X =-- D-Scr, Y = IM.cu und Z - NII(C,- bis C,-Alkyl)

Die Synthese in fester Phase des Peptids der Formel I, worin X - D-Ser, Y = D-Leu und /. = NH(C,- bis C·.- <o Alkyl), wird von dem C-endständigcn Ende des Peptids unter Anwendung eine <r-aminogeschülzlen Prolinharzcs begonnen. Ein derartiges Ausgangsmatcrial wird durch Binden eines o-aminogcschülzten Prolins an ein chlormcthylicrtes Harz oder ein Hydroxymcthylh;irz, wobei das erstgenannte bevorzugt ist, hergestellt. Die Herstellung eines Hydroxymethylharzcs wird von M. Bodansky und J.T. Shcchan, Chcm. Ind. (London), .18. 1597 (1966) beschrieben. Ein chlormcthylicrtes Hurz ist im Handel von den Bio Rad Laboratories, Richmond. California, erhältlich. Bei Verwendung des chlormethylierten Harzes wird eine Estcr-Ankcrgruppe mit dem σ-aminogcschütztcn Prolin wie folgt gebildet:

R«_p_ro_0-CH

Ein zweckmäßiges Verfahren zur Umwandlung des gebundenen geschützten Peptids in das C-cndständige (niedrig-Alkyl)-amid besteht in der Abspaltung <lcs geschützten Peptids von dem Harz durch Behandeln mit einem niedrig-Alkylamin, vergl. D. H. Coy et al., Uiochem.,Biophys. Res. Commun., 57,335 (1974). wobei man das entsprechende geschützte Peptid-(niedrig-alkyl)-amid erhält. Anschließend werden die Schutzgruppen des resultierenden Pcptid-(niedrig-alkyl)-umids durch Behandeln mit Natrium und flüssigem Ammoniak oder vorzugsweise durch FluorwasserstofTspaltung unter Bildung des entsprechenden erfindungsgemäßen Peptids der

Forme] I, wie vorstehend unter c) beschrieben, entfernt. Bin alternatives Verfahren besteht in der Spaltung durch Umesterung mit einem niedrigen Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, in Anwesenheit von Triäthylamjn und anschließender Umwandlung des resultierendes Esters in das entsprechende (C₁- bis C₃-Alkyl)-amid und anschließende Entfernung der Schutzgruppen, wie vorstehend beschrieben. Vergl. hierzu J. M. Steward und J. D. Young, »Solid Phase Peptide Synthesis«, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1969, Seiten 40 bis 49. <

Insbesondere wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung <r-aminogeschütztes Prolin, vorzugsweise tert.-ButyloxycarbonylproIin. mit einem chlormethylierten Harz mit Hilfe eines Katalysators, vorzugsweise Cäsiumbicarbonat oder Triäihylamin, gekoppelt. Nach der Koppelung des α-aminogeschützten Pro- lins an den Harzträger wird die a-Amino-Schutzgruppe, beispielsweise unter Anwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder ChlorwasserstofTsäure in Dioxan, entfernt. Die Abspaltung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen etwa 0⁰C und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standard-Spaltungsmittel und Bedingungen zur Entfernung spezifischer ff-Amino-Schutzgruppen können angewendet werden, wie von E. Schröder und K. Lübke, »The Peptides«, Band J, Academic Press, New York, 1965, Seiten 72 bis 75 beschrieben. Nach Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe werden die verbleibenden σ-aminogeschützten Aminosäuren stufenweise in der beschriebenen Reihenfolge gekoppelt, um die Verbindung der Formel I zu ergeben, die vorstehend unter c) beschrieben wurde. Jede geschützte Aminosäure wird in den Festphasen-Reaktor in etwa dreifachem Überschuß eingeführt, und die Koppelung wird in einem Medium von Methylenchlorid oder Mischungen von Dimethylformamid und Methylenchlorid durchgeführt. In Fällen, bei denen eine unvollständige Koppelung aufgetreten ist, wird der Konpeluiigsvorgar:g _vor Entfernung der ü-Amino-Schutzgruppe, vor Koppelung der nächsten Aminosäure an den Festphasen-Reaktor, wiederholt. Der

Erfolg der Koppelungsreaktion bei jeder Synthesestufe wird durch die Ninhydrin-Reaktion, wie von E. Kaiser et

al., Analyt. Biochem., 34, 5995 (1970) beschrieben, überwacht.

Nach der Synthese der gewünschten Aminosäuren-Sequenz wird das geschützte Peptid von dem Harzträger

durch Behandlung mit einem (C,- bis C,-Alkyl)-amin entfernt, wobei man das entsprechende geschützte Peptid-(Cr bis Cj-alkyl)-amid erhält, und auch bei der Verwendung von Dinitrophenyl oderTosyl als Schutzgruppe für den Histidylrest wird die Dinitrophenyl- oder Tosyl-Schutzgruppe während der Behandlung mit dem (C_r bis Cy Alkyl)-amin entfernt. Das Peptid kann auch von dem Harz durch Umesterung mit einem »niedrig-Alkanol«, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, abgetrennt werden, worauf das gewonnene Produkt durch Chromatographie an Siliciumdioxidgel gereinigt und die gewonnene Fraktion einer Behandlung mit einem (C₁- bis Cj-Alkyl)-amin zur Umwandlung des niedrig-Alkylcsters, vorzugsweise des Methyl· oder Äthylesters, in das C-endständige (C₁- bis Cj-Alkyl)-amid unterzogen wird. (Es sei bemerkt, daß, falls eine Dinitrophenyl- oderTosylgruppe am Histidylrest vorhanden ist, diese ebenfalls abgespalten wird.) Die verbleibenden Scitenketten-Schutzgruppen des geschützten Äthylamids werden anschließend durch vorstehend beschriebene Verfahrensweisen, bei- spielsweise durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder mit Fluorwasserstoff unter Bildung des Nonapeptids der Formel I, wie vorstehend als c) beschrieben, abgespalten. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel I

A) L-Pyroglutamyl-L-histidyl(tosyl)-L-tryptophyl-L-seryl(bcnzyl)-L-tyrosyl(2-bronibcnzyloxycarbonyl)-

D-tO'ptophyl-L-leucyl-L-arginylOosyO-L-prolylglycylbcnzhydrylamin-Harz

[R'-ipyroj-Glu-llis-iN^-R'j-Trp-SerfR^-TyriR^-D-Trp-Leu-ArgiN^-R-'i-Pro-Gly-A;

R⁴ = Tos. R⁵ = 2-Br-Cbz, R" = BzI, R⁷ = Tos, R* = H und A » Benzhydrylaminharz)

1,25 g (1,0 mMol) Benzhydrylaminharz werden in das Reaktionsgcfäß einer automuiischcn Peptid-Synthese-Vorrichtung (Beckmann-Modell 990) gefugt, das dazu programmiert ist, folgende Waschzyklen durchzuführen:

a) Methylenchlorid; b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 X während jeweils 2,5 und 25 Minuten); c) Methylenchlorid; d) Äthanol; e) Chloroform; 010% Triethylamin in Chloroform (2 Xje 25 Minutcn);g)Chloroform; h) Methylenchlorid.

Das gewaschene Harz wird anschließend mit 525 mg (3,0 mMol) tert.-Butyloxycarbony!glycin in Methylenchlorid gerührt, und es werden 3,0 mMol Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur (22 bis 25 °C) während 2 Stunden gerührt, und das Aminosäureharz wird anschließend nacheinander mit Methylenchlorid (3 x), Äthanol (3 X) und Mcthylcnchlorid (3 X) gewaschen. Die gebundene Aminosäure wird mit 33% Trilluoressigsäurc in Mcthylcnchlorid (2 x während 2,5 und 25 Minuten) von der Schutzgruppe abgespalten, und anschließend werden die vorstehend beschriebenen Waschzyklcn c) bis h) durchgeführt.

Die folgenden Aminosäuren (3,0 mMol) werden anschließend nacheinander durch den gleichen Reaktionszyklus gekoppelt: t-Boc-L-prolin; t-Boe-L-arginin(Tos); t-Boc-L-lcucin; t-Boc-D-lryplophan; t-Boc-L-tyrosin (2-Br-Cbz); t-Boc-L-scrin(Bzl); l-Boc-L-lryplophan; l-Boc-L-hislidin(Tos); L-Pyroglutuminsäurc.

Das fertige Decapeptidharz wird 3 x mit Mcthylcnchlorid und anschließend 3 x mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 98% der theoretischen Gcwichts/unamc erhall.

Das in diesem Beispiel verwendete Ben/hydrylaminhar/ ist ein handelsübliches liar/. (I % quervernetzt).

B) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-scryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid; 1,X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NII, |(pyro)-Glu-llis-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NII₂]

Die Entfernung der .Schutzgruppen und Abspaltung des Decnpcptids vnn dem Decapcplkl-Ilar/.. bcchrichen

unter A) wird durch Behandeln von l,OgMaterial mit 24 ml Fluorwasserstoff und 6 ml Anisol während 30 Minuten bei 0°C bewirkt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck entfernt und das Anisol durch Waschen mit Äthylacetat entfernt.

Das rohe Peptid wird durch Gelfiltration an einer Säule (2,5 x 100 cm) von Sephadex^β G-25 durch Eluieren mit 2m-Essigsäure gereinigt, und es wurden die Fraktionen gesammelt und im Vakuum zur Trockne verdampft, die einen Haupt-UV-Absorptions-Peak bei 280 nm zeigten.

Das zurückbleibende Öl wurde auf Säule (2,5 Χ 100 cm) von Sephadex* G-25 (fein) aufgebracht, die vorher mit der unteren Phase, gefolgt von der oberen Phase eines n-Butanol: Essigsäure: Wasser-(4:1:5)-Lösungsniittelsystem äquilibriert worden war. Das Eluieren mit der oberen Phase ergab eine Haupt-Peak-Fraktion, und das Material aus dieser Zone wurde auf einer Säule (1,4 X 94 cm) von Carboxymethylcellulose gemäß den von D. H. Coy et al., J. Med. Chem., 16,1140 (1973) beschriebenen Bedingungen eluiert. Entsprechende Fraktionen (1050 bis 1190 ml) ergaben nach Lyophilisieren aul'konstantcs Gewicht D-Trp'-Ll I-RH als weißes, flaumiges Pulver (80 mg); [a\% -58,8° (r = 0,33, In-HOAc).

Das Produkt erwies sich im DQnnschichtchromalograiran in vier verschiedenen Lösungsmittelsystemen als homogen, wenn Mengen von 20 bis 30 meg aufgetragen und die Flecken durch Joddampfund anschließend Ehrlich-Rcagens sichtbar gemacht wurden. Man erhielt folgende R_rWcrte:

1-ButanoI: Essigsäure: Wasser (4:1:5, obere Phase) 0,25;

Äthylacetat: Pyridin: Essigsäure: Wasser (5:5:1:3) 0,63;

2-Propand: I m-Essigsäure (2:1) 0,38;

i-Buianoi: Essigsäure: Wasser: Älhyiacetal (I 1: 1:1) 0,51

Ergebnis der Aminosäuren-Analyse: GIu 1,08; His 0,95; Trp 2,00; Ser 0,94; Tyr 0,97; 0,93; Arg 0,98; Pro !,00; GIy 1,02; NH, 1,03. Beispiel 2

A) L-Pyroglutamyl-L-histidyl(tosyl)-L-tryptophyl-L-seryl(benzyl)-L-tyrosyK2-brombenzyloxycarbonyl)- jo D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyKtosylJ-L-prolylglycylbenzhydryl-Harz

[pyK^p^yi^gi^y R⁴ = Tos, R^s 2-Br-Cb/, R⁶ = BzI, K⁷ - Tps, R* = II und A = Bcnzhydrylaminharz]

1,25 g (1,0 mMol) Bcn/.hydrylaminharz wurden in das Reaktionsgcfaß einer automatischen Peptid-Synthese-Vorrichtung (Beckmann-Modell 990), programmiert zur Durchführung folgender Waschzyklen, eingefüllt:

a) Mcthylcnchlorid; b)33%Trifluorcssigsäure in Methylenchlorid (2 x während jeweils 2,5 und 25 Minuten), c) Methylenchlorid, d) Alhanol, c) Chloroform, 0 10%Triethylamin in Chloroform (2 xjc 25 Minuten),g) Chloroform, h) Mcthylcnchlorid.

Das gewaschene Harz wird anschließend mit 525 mg (3,0 mMol) tcrt.-Butyloxycarbonylgiycin in Methylen- w chlorid gerührt und mit 3,0 mMol Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur (22 bis 25 ⁰C) 2 Stunden gerührt, und das Aminosäureharz wird anschließend nacheinander 3 X mit Mcthylenchlorid, 3 x mit Äthanol und 3 x mit Methylemhlorid gewaschen. Die gebundene Aminosäure wird mit 33% Trifluoressigsäure in Mcthylenchlorid (2X während jeweils 2,5 und 25 Minuten) von der Schutzgruppe befreit, und anschließend werden die vorstehend beschriebenen Waschzyklcn c) bis h) durchgeführt.

3,0 mMol der folgenden Aminosäuren werden anschließend nacheinander im gleichen Reaktionszyklus gekoppelt: t-Boc-L-prolin; t-Boc-L-arginin(Tos); I-Hoc-L-Ieucin; t-Boc-D-phenylalanin; t-Boc-L-tyrosin (2-Br-Cbz); t-Boc-L-serin(Bzl); l-Boc-L-tryptophan; t-Uoc-L-histidin(Tos); L-( Pyroglutaminsäure.

Das fertiggestellte Decapeptidharz wird 3 x mit Methytenchlorid und anschließend 3 x mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 100% der theoretischen Gewichlszuname erhält.

Das in diesem Beispiel verwendete Benzhydrylaminharz ist ein handelsübliches Produkt (I % quervernetzt).

B) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-lyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid: 1,X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₂ [(pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂l

Die Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung des Decapeplids von dem Harz, bechrieben unter A) wird durch Behandlung von 1,5 g Material mit 24 ml Fluorwasserstoff und 6 ml Anisol während 30 Minuten bei 0⁰C durchgefiihrt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck entfernt, und das Anisol wird durch Waschen mit Äthylacetat entfernt.

Das rohe Peptid wird durch Gelfiltration an einer Säule (2,5 x 100 cm) von Sephadcx* G-25 durch Eluieren «> mit 2m-Essigsäurc gereinigt, und es werden Fraktionen, die einen Haupt-UV-Absorptions-Pcak bei 280 nm zeigen, gesammelt und zur Trockne verdampft.

Das zurückbleibende Öl wird auf eine Säule (2,5 χ 100 cm) von Sephadex " G-25 (lein) aufgebracht, die vorher mit der unteren Phase, gefolgt von der oberen Phase eines n-Bulanol: Essigsäure: Wasser(4 : I : 5i-Lösungsmittelsystcms, äquilibriert wurde. Durch Eluieren der oberen Phase erhielt man eine Haupt-Pcak-f-'raktion. und Fraktionen dieses Peaks wurden gesammelt und zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde von O,2n-Essigsiiurc lyophilisiert, wobei man 158 mg [D-Phe^J-LII-RH als flaumiges weißes Pulver erhielt; \a]'„' -57,5° (c = 0,55, 0,In-HOAc).

: Das Produkt erwies sich im Dürraschichtchromatogramm in vier verschiedenen Lösungsmittelsystemen als

ν homogen bei Auftrag von 20 bis 30 meg und durch Joddampf und anschließend Ehrlich-Reagens sichtbar

Hj gemachten Recken. Man erhielt folgende Rj-Werte:

■ 5 1-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:5, obere Phase) 0,14;

Äthylacetat: Pyridin: Essigsäure: Wasser (5:5:1:3) 0,68;

; 2-Propanol: 1 m-Essigsäure (2:1) 0,41;

1 -Butanol: Essigsäure: Wasser: Äthylacetat (1:1:1:1) 0,47.

·: ίο Die Amiriosäuren-Anaiyse ergab:

ψ GIu 1,01; His0,97;Trp0,90;Ser0,92;Tyr 1,00; PheO,96; Leu 1,00; Arg 1,02; Pro0,95; GIy 1,00; NH, 1,00.

Μ is Beispiel 3

(:i A) L-Pyroglutamyl-L-histidyl(dinitrophenyl)-L-tryplophyl-L-seryl(benzyl>-

:?< L-tyrosyl(2-brombenzyloxycarbonyl)-D-Ieucyl-L-lcucyl-L-arginyl(tosyl)-L-prolyl-0-CH"2-H<>^r/-

% [R⁸-(pyro)-Glu-His-(N^lm-RVTrp-D-Ser(Ryryr(RYD-Leu-Leu-Arg(N⁽ⁱ-RVPro-A¹;

P 20 R" = Tos, R⁵ = 2-Br-Cbz, R⁶ = B/l. R⁷ = Dnp, R¹¹ = H

l u„_rtA'=O-C_Hj

'".' 25 1.40 g (0,5 mMol Prolin) Boc-Prolinharz der Formel

. BoC-PrO-O-CH₂-

|:-ί werden in das Reaktionsgefiiß einer automatischen Peplid-Synthcsc-Vorrichtung (Beckmann-Modell 990)

: gefüllt, die zur Durchführung der folgenden Waschzytden programmiert ist:

>! a) Methylenchlorid; b) 33 %Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 xjeweils 2,5 und 25 Minuten), c) Melhy-

lenchiorid, d) Äthanol, e) Chloroform, 0 10%Triäthylamin in Chloroform (2 xje 5 Minuten),g) Chloroform und J? h) Methylenchlorid.

Das gewaschene Harz wird anschließend mit 645 mg (1,5 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-tosyl-arginin in Methylenchlorid gerührt, und mit 1,5 mMol Dicyclohexylcarbodiimid werden/ugcscl/.t. Die Mischung wird bei Raumtemperatur (22 bis 25⁰C) 2 Stunden gerührt, und das Aminosäureharz wird anschließend nacheinander 3 x mit Methylenchlorid,3 Xmit Äthanol und3 x mit Methylcnchlorid gewaschen. Diegcbundene Aminosäure 40 wird mit 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 x 2.5 b/.w. 25 Minuten) von der Schutzgruppe befreit, und ansch/ießend werden die vorstehend beschriebenen Waschzyklen c) bis h) durchgeführt.

1,5 mMol der folgenden Aminosäuren werden anschließend nacheinander durch die gleiche Reaklionsfolge gekoppelt: t-Boc-L-leucin; t-Boc-L-leucin; NBoc-L-tyrosinf.MJr-Cbz); t-Boe-D-serin(ßzl); t-Boc-L-tryptophan; t-Boc-L-histidin(Dnp); L-Pyroglutaminsäurc.

45 Das fertiggestellte Nonapeptidharz wird 3 x mit Methylcnchlorid und anschließend 3 X mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei m;in 96% der theoretischen Gewichtszuname erhält. Das in diesem Beispiel verwendete Prolinharz ist ein handelsübliches chlormclhylicrtes Harz (1 % quervernetzt).

50 B) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-D-seryl(bcn/.yl)-L-tyrosyl(2-brombenzyloxycarbonyl)-

D-leucyl-L-leucyl-L-arginyKlosylJ-L-prolinälnylarnid, RNpvrol-Glu-His-Trp-D-ScriR^-TyrfR^-D-Leu-Leu-ArgfN^-R^-Pro-NHR¹; R⁴ = Tos, R⁵ --= 2-Br-Cbz, R" = B/l, R^K - H und R¹ = C,.'K

55 2,16 g des geschützten Nonapeptidharzes von A) werden in 20 ml Älhylamin bei 0°C suspendiert und 6 Stunden gerührt. Überschüssiges Athylamin wird anschließend bei Raumtemperatur verdunsten gelassen, und das gespaltene Peptid wird mit Dimethylformamid von dem Hai/.gewaschen. Dasgeschülztc Peptid wird anschließend durch Zusatz von Äthylacelat ausgcllilll und unter Bildung von 672 mg eines cremefarbenen Pulvers filtriert. R₁ an Siliciumdioxidgel in 1-ßutanol: !essigsaure: Wasser (4:1:5, ober" Phase) ■= 0,45. Dieses Material

mi wird in C) ohne weitere Reinigung verwendet.

C) L-Pyroglulamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-D-seryl-L-tyrosyl-D-leucy-L-lcucyl-L-arginyl-L-prolin-iithylamid, 1.X = Scr, Y = D-Leu und 7. - NHEt [(pyroJ-Gly-llis-Trp-D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Nlint]

65 Die Entfernung der Schutzgruppen von dem geschützten Nonapcptid, hegestw-üt wie in B) beschrieben, wird durch Behandeln von 670 mg des Materials mit 50 ml Fluorwasserstoff und 15 ml Anisol während 30 Minuten bei O⁰C durchgeführt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck entfernt und das Anisol durch Waschen mit Äther entiernt.

Das rohe Peptid wird durch Gelfiltration an einer Säule (2,5 x 100 cm) von Sephadex* G-25 durch Eluieren
mit O,2m-Essigsa'ure gereinigt, und Fraktionen, die einen llaupl-l!V-Absorptions-I'eak bei 280 nm zeigen, werden gesammelt und /ur Trockne verdampft.

Das zurückbleibende Öl wird auf eine Säule (2,5 x 100 cm) von Sephadex" G-25 (fein) aufgetragen, die vorher
mit der untcreji Phase, gefolgt von der oberen Phase von n-Hulunol: Essigsäure : Wasser (4:1:5) als Lösungs- >
mittelsyslem äquilibrierl wurde. Durch Eluicrcn der oberen Phase erhält man eine llauptfruktion mit einer Ί

hohen UV-Absorption bei 280 nm, und dieses Malerial wird der Chromatographie at: einer Säule (1,5 x94 cm) Sj

von Siliciumdioxidgcl unler/.ogcn und mit einem Gemisch von I-Uutunol: Essigsäure : Wasser (4:1:1) cluiert. it

Entsprechende Fraktionen (3(M) bis 390 ml) ergaben nach Verdampfen und Lyophilisieren von Wasser auf kon- f*j

stantcs Gewicht [D-SCr¹J)-LeU^eSGIy-NIlJ¹¹I-LI l-RII-iithylamid als weißes, flaumartigcs Pulver von 103 mg; iu '■ [a\},' = -29,6° (<· = 0,54, OJn-IIOAe). ;

Das Produkt erweist sich in dem Dünnschichtchromatogramm in vier verschiedenen Lösungsmittclsyslemen h

an Siliciumdioxidgel-Platlen beim Auftrag von 20 bis 30 meg und Sichtbarmachen der Ilecken mit Joddampf. j

gefolgt von Ehrlich-Reagens, als homogen. Man erhielt folgende «,-Werte: ^l

I-Kutanol: Essigsäure : Wasser (4:1:5, obere Phase) 0,20; i

Äthylacetat: Pyridin : Essigsäure: Wasser (5 .5:1 :3) 0,72; I

2-Propanol: Im-Essigsiiurc (2:1) 0,43;
! ΚυίίίΓίί',ί: Es:;igsiiurc : Wasser: Aüiyiacewii (I. ί : i: i j ü.Sji.

:ii
Die Aminosäuren-Analyse ergab:

GIu 1,03; His 0,93; Irp 1,01; Ser 0,82; Tyr 0,97; Leu 1,98; Arg 1.00; Pro 0,90: Äthylamin 0,98.

Claims (1)

1. Patentansprüche: 1. Nona- und Decapeptidamide der allgemeinen Formel 1:

   pyroGlu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z (I)

   mit folgender Substituenten-Bedeutung und Zuordnung:

   Ser D-Trp GIy-NII., Ser D-Phe GIy-NH, D-Ser D-Leu NH(C₁- bis C-Alkyl)

   a) b)