DE2547721A1 - Biologisch aktive amide - Google Patents

Description

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!MÜNCHEN SO · WiAUEBKlRCHERSTR. 45 2547721

Anwaltsakte: 26507 _n , _n,„

2 4. OKT. 1975

The Wellcome Foundation Limited London/Großbritannien

Biologisch aktive Amide

Diese Erfindung betrifft Peptide, ihre Säureadditions salze und Komplexe der Peptide mit pharmazeutisch annehmbaren Metallen; die Herstellung derartiger Peptide, Salze und Komplexe; Formulierungen, die derartige Peptide, Salze oder Komplexe enthalten, und die Herstellung derartiger Formulierungen sowie die Verwendung der Peptide, Salze und Komplexe in der Human- und Veterinärmedizin.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Analoge des luteinisierenden Hormon -Releasinghorraons (LH-RH), ein Decapeptid mit folgender Struktur:

iGlu-His-Trp-Ser-Tyr-GIy-LeU-ATg-PrO-GIy-NH₂

A 456 V/bu

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Die Abkürzung, die hier für Aminosäuren und deren Reste verwendet werden, sind in der Fachwelt üblich und lassen sich beispielsweise in der Zeitschrift "Biochemistry" 11 (1972), Seite 1726 finden.

Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die obigen und die folgenden Ausführungen sich auf L-Aminosäuren und ihre Reste beziehen, wenn nichts anderes gesagt wird, ausgenommen im Fälle von Glycin.

LH-RH wird vom Säugetier-Hypothalamus in die Venen des Hypothalamus-hypophysären Portalsystems freigegeben und wirkt auf den Hypophysenvorderlappen, um die Freigabe von zwei Gonadotrophinen, des luteinisierenden Hormons (LH) und des Follikelstimulierenden Hormons (FSH)zu bewirken. LH stimuliert die Synthese von Steroidhormonen in den Gonaden beider Geschlechter und induziert bei der Frau die Ovulation von geeignet gereiften Ovarialfollikel. FSH stimuliert bei der Frau das Wachstum und die Reifung von Ovarialfollikel und beim Mann das Wachstum der Samen-führenden Tubulen sowie die frühen Stufen der Spermatogenese. Die Reifung der Spermatozoen wird beim Mann durch Androgene kontrolliert, deren Bildung wiederum durch LH kontrolliert wird.

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Es wurde nun gefunden, daß - falls die Sequenz von LH-RH in folgender Form geschrieben wird:

- His - Trp - Ser 2 3 4

5 Tyr

9 8 7 6-Pro - Arg - Leu - GIy H₂N-GIy 10

- erkennbar ist, daß die Aminosäuren um den Tyrosinrest symmetrisch verteilt sind. Die Aminosäuren können zu folgenden Paaren gruppiert werden: (Tyrosin und Glycinamid haben keine formalen Partner)

Paar Allgemeine Eigenschaften

Ser, GIy kleine Seitenketten, hydrophil, aber

neutral

Trp, Leu hydrophob und neutral His, Arg hydrophil und basisch , Pro mittlere Seitenkette mit fünfgliedri-

gem Ring, Zwischenproduktcharakter, aber

neutral

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Hinsichtlich der angegebenen Struktursymmetrie ist es nicht undenkbar, daß eine Struktursymmetrie bei der aktiven Konformation vorliegt und daß der Rezeptor die gleiche Symmetrie besitzt.

In Übereinstimmung mit dieser Symmetriekonzeption des LH-RH und de,s Rezeptors dafür, ist jetzt gefunden worden, daß die asymmetrischen LH-RH-Analogen der Formel (I)

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-Pro-W (I)

und deren Additionssalze LH-RH-antagonistische Aktivität bei in vitro-Versuchen zeigen. Der Begriff LH-RH-Antagonist wird hier in dem Sinne verwendet, daß darunter eine Verbindung zu verstehen ist, die die biologische Antwort bzw. biologische Reaktion auf das natürliche Hormon herabsetzt, wenn die beiden zusammen in einem biologischen System anwesend sind. Daher bewirken die Verbindungen der Formel (I) und ihre Säureadditionssalze eine Herabsetzung der LH- und FSH-Freigabe, wenn sie mit isolierten Ratten-Hypophysenvorderlappen in Anwesenheit von LH-RH inkubiert werden im Vergleich zu Kontrollergebnissen, die mit LH-RH allein erhalten werden.

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_ Cl »

In Formel (I) bedeutet:

1

X einen Pyroglutamyl-, einen V -Pro-Rest, wobei

V ein Acyl-, Alkyloxycarbonyl- oder Aralkyloxy-

carbonyl-Rest ist, sowie einen V -CO-Rest, wobei

V ein Cycloalkylrest ist;

X einen HistidyIrest und eine direkte Bindung;

X einen gegebenenfalls im Benzolring substituierten Phenylalanyl- und Tryptophyl-Rest;

X einen Glycyl-, Seryl-, Alanyl- (D- oder L)-D-Leucyl- und D-Valylrest;

X einen gegebenenfalls im Benzolring substituierten PhenylalanyIre st;

X einen Glycyl-, Alanyl- (D- oder L-)-D-Leucyl- und D-VaIyIrest;

7
X einen gegebenenfalls im Benzolring substituierten Phenylalanyl- und Leucyl-Rest;

X⁸ direkte Bindung, wenn X² ein Histidylrest ist und ein anderer als ein Arginyl-. oder Homoarginylrest ist;

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W Glycinaraid und einen R²R¹N-ReSt, wobei R¹, R² und das Stickstoffatom zusammen ein Amino-N-alkylamino-, Ν,Ν-Dialkylamino-, Pyrrolidino-, Morpholino- und i-Methyl-5-aminomethyltetrazolyl-Rest ist, wobei der Alkylrest 1 bis 4 C-Atome aufweist und gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, vorausgesetzt, daß - wenn X¹, X³, X⁴, X⁵, X⁷ und X⁸ ein Pyroglutamyl-, Tryptophyl-, Seryl-, Tyrosyl-, Leucyl-oder Arginyl-Rest ist - W anders als Glycinamid oder ein N-Äthylaminorest ist, wenn X ein Gifcylrest ist und anders als Glycinamid ist, wenn X ein D-Alanylrest ist.

Wenn X - wie oben definiert - ein V -Pro-Rest ist, so weist der Acylrest vorzugsweise 2 bis 4 C-Atome, beispielsweise einen Acetylrest, auf, der Alkylanteil im Alkyloxycarbonylrest weist vorzugsweise 1 bis 4 C-Atome (beispielsweise einen Isopropyl- oder tert.-Butyl-Rest) auf und der Aralkyl-Anteil im Aralkyloxycarbonylrest ist vorzugsweise ein Benzyl-

1 2

rest. Wenn X - wie oben definiert - ein V -CO-Rest

ist, so weist der V -Rest vorzugsweise 3 bis 7 C-Atome im Ring auf und ist beispielsweise ein Cyclopentyl-Rest.

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3 5 Der Benzolring des Phenylalanylrestes (X -, X - und X -Reste) kann mit einem oder mehreren Resten substituiert sein, und zwar mit einem Alkoxy- (beispielsweise Methoxy-) Halogen- (beispielsweise Chlor-), Alkyl- (beispielsweise Methyl-), Hydroxyl-, Nitro- und Aminorest substituiert sein. Wenn lediglich ein Substituent anwesend ist, dann befindet er sich vorzugsweise in 4-Stellung zum Restmolekül.

Eine Untergruppe innerhalb der Formel (I) sind die Verbindungen und deren Salze, in denen

1 1 1

X ein Pyroglutamyl-, V -Pro-Rest, wobei V ein Alkyloxycarbonylrest ist, in dem der Alkylrest 1

ο bis 4 C-Atome aufweist, oder ein V -CO-Rest ist,

wobei V ein Cycloalkylrest mit 3 bis 7-C-Atomen im Ring ist.

X ein Phe^lalanyl- oder Tryptophyl-Rest ist,

4
X ein Alanyl (D- oder L-) oder Serylrest ist,

X ein Pheylalanyl- oder Tyrosylrest ist,

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X ein Glycyl- oder Alanyl- (D- oder L-) Rest ist,

7
X ein Leucylrest ist, und

W Glycinamid, ein N-Alkylaminorest ist, in dem der Älkylrest 1 bis 2 C-Atome aufweist, oder ein 1-Methyl-5-aminomethyltetrazolylrest ist.

Es ist dem Peptid-Fachmann bekannt, daß die Verbindungen und deren Salze der Formel (I), die Seryl- und/ oder Tryptophyl-Reste aufweisen, erhebliche Vorteile hinsichtlich der Leichtigkeit der Synthese haben, verglichen mit LH-RH selbst und mit dessen Analogen, die diese Reste aufweisen. Eine erhebliche Schwierigkeit bei der Einführung des Serylrestes besteht darin, daß die Hydroxylgruppe darin geschützt sein muß, falls eine O-Acylierung vermieden werden soll. Es sind daher zwei besondere Stufen zur Einführung des Serylrestes erforderlich, und zwar das Schützen der Hydroxylgruppe und die anschließende Entfernung der Schutzgruppe, wovon die erstere Stufe im allgemeinen eine zum Teil schwierige Prozedur darstellt. Der Tryptophylrest oxydiert bereits, besonders unter sauren Bedingungen, die gewöhnlich bei der Peptidsynthese zur Entfernung der Schutzgruppe verwendet werden, und führt zu gefärbten Nebenprodukten, die

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— Q —

schwierig zu entfernen sind. Als Folge davon sind Peptide, wie LH-RH, die den Tryptophylrest enthalfen charakteristisch instabil, ein Nachteil, der nicht bei den Verbindungen und Salzen der Formel (I) auftritt, die diesen Rest nicht enthalten.

Die Wirksamkeit der Verbindungen der Formel (I) liegt im Peptid und die Säure in den Säureadditionssalzen ist von geringerer Bedeutung, obgleich sie für therapeutische Zwecke vorzugsweise pharmakologisch und pharmazeutisch annehmbar gegenüber dem Empfänger ist.
Beispiele geeigneter Säuren sind:

(a) Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasser stoff säure, Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Salpetersäure und Schwefelsäuren;

(b) organische Säuren, wie Wein-, Essig-, Zitronen-, Malein-, Milch-, Fumar-, Benzoe-, Glycol-, Glucon-, Gulon-, Bernstein- und Arylsulfonsäure, beispielsweise p-Toluolsulfonsäuren.

Die pharmazeutisch und pharmakologisch annehmbaren Säureadditionssalze sind zusammen mit den Salzen, die nicht so annehmbar sind, (beispielsweise Salze der

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Fluorwasserstoffsäure und der Perchlorsäure), nützlich bei der Isolierung und Reinigung der Peptide und die nicht annehmbaren Salze sind natürlich auch von Wert bei der Herstellung der annehmbaren Salze durch an sich bekannte Verfahren. Die Peptide, die eine Vielzahl von freien Aminogruppen enthalten, können in Form von Mono- oder Polysäureadditionssalzen erhalten werden oder als gemischte Salze einer Vielzahl von Säuren.

Die Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden nach an sich für die Herstellung von Verbindungen analoger Struktur bekannten Verfahren.. So können sie gebildet werden durch sequentielle Kupplung von geeigneten Aminosäuren unter Verwendung von klassischen Verfahren der Peptidsynthese oder einfachen Verfahren, oder durch Herstellung und anschließende Kupplung der Peptid-untereinheiten.

Derartige Umsetzungen können durchgeführt werden, indem beispielsweise der Carbonsäurerest der eingehenden Aminosäure aktiviert wird und die nicht reagierenden Amino- und Carboxylsäuregruppen geschützt werden. Derartige Methoden gehören zum Standard des Peptidfachmannes. Einzelheiten über geeigneter Aktivierungs- und Schutz (Maskierungs-) Gruppen und über ge-

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eignete Reaktionsbedingungen (sowohl für die Kupplungsreaktionen als auch für die Entfernung der Schutzgruppen), die ein Minimum an Razemisierung ergeben, können in der folgenden Literatur gefunden werden:

(a) britische OffenlegungsSchriften 1 042 487, 1 048 086 und 1 281 383.

(b) "The Peptides", Verlag Academic Press (1965)

(c) J.Am.Chem.Soc, 90 (1968), Seite 165,

(d) Tetrahedron Letters (1970), Seite 849,

(e) Helv.Chim.Acta. 56 (1973), Seite 1729,

(f) "Solid Phase Peptide Synthesis" von Stewart und Young, Verlag W.H. Freeman und Co. (1969)

Die Pyroglutamyl-, Arginyl- und Homoarginyl (Har)-Reste können nicht nur in die Verbindungen der Formel (I) in der oben beschriebenen Art einverleibt werden, sondern können auch in situ in der versammelten Polypeptidkette gebildet werden oder in einer Peptiduntereinheit davon durch Umwandlung einer geeigneten Vorstufe. So können die Aginyl- und Homoaginylreste

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bereits durch Guanidierung eines Ornithyl- oder Lysylrestes unter Verwendung eines Reagenzes, wie 1-Guanyl-3,5-dimethylpyrazol gebildet werden. Der Pyroglutamylrest kann durch Cyclisierung eines Glutamyl- oder Glumaminyl-Restes gebildet werden, der selbst in einer geeignet geschützten Form in das Polypeptid- oder eine Untereinheit davon eingeführt werden kann und die Schutzgruppe von der Cyclisierungsstufe entfernt werden, wie beispielsweise in J.Med.Chem., 14 (1971) Seite 469, Helv.Chim.Acta, 53 (1970), Seite 63, Biochem.Biophys.Res.Comm. 45, (1971) Seiten 767, 822 und Chem. Berichte 105 (1972), Seite 2872 beschrieben wird.

ι Die Verbindungen der Formel (I), in denen X der

ι
hier definierte V -Pro-Rest ist, können über ein zunächst gebildetes Peptidzwischenprodukt hergestellt werden, das dem gewünschten Peptid-Endprodukt mit dem geeigneten W-Rest in der C-terminalen Stellung entspricht

und an dem N-terminalen Ende befindet sich ein V -

3
Pro-Rest, in dem V eine Schutz (Maskierungs)-Gruppe

ist, die nicht mehr unter V- wie in Formel (I) definiert - fällt. Die Umwandlung dieses Zwischenproduktes zu dem gewünschten Endprodukt kann durchgeführt werden, indem selektiv die V -Gruppe entfernt wird und indem der N-terminale Prolylrest mit dem gewünschten V -Rest

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selektiv wiedergeschützt wird unter Verwendung von an sich bekannten Verfahren. Es ist darauf hinzuweisen, daß auf analoge Weise eine Verbindung der Formel

1 -j
(I) , in der X ein V -Pro-Rest - wie er hier definiert ist - in ein Analogon davon umgewandelt werden kann, und zwar auch in ein solches der Formel (I)/ in der V ein verschiedener Rest ist.

Abhängig von den Reaktionsbedingungen werden die Verbindungen der Formel (I) in Form der freien Basen (Peptide) oder in Form der Säureadditionssalze davon erhalten. Die Säureadditionssalze können in die freien Basen umgewandelt werden oder in Salze anderer Säuren und die Basen können in die Säureadditionssalze davon nach bekannten Verfahren umgewandelt werden.

Die Verbindungen der Formel (I), in denen X ein Histidyl-Rest ist, bilden mit pharmazeutisch annehmbaren Metallen, wie Zink, Komplexe und solche Komplexe zeigen eine Verlängerte Wirkungsdauer in vivo bei parenteraler Verabreichung verglichen mit den nicht-komplexierten Peptiden und deren Säureadditionssalze. Derartige Komplexe können nach Verfahren hergestellt werden, die bekannten Verfahren

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entsprechen und beispielsweise in der südafrikanischen Patentanmeldung 73/2419 beschrieben werden.
So können die Zinkkomplexe hergestellt werden, indem beispielsweise das Peptid in einer wässrigen Lösung gelöst wird, die überschüssige Zinkionen und gegebenenfalls auch Phosphationen enthält, und indem der pH mit verdünnter Alkalilauge eingestellt wird. Der Komplex wird anschließend ausgefällt. Die Zinkionen können von einer ionisierbaren Zinkverbindung, wie Chlorid oder Sulfat, herrühren und die Phosphationen können- wenn sie anwesend sind - von einem Alkalimetallphosphat, wie Dinatriumhydrogenphosphat, herrühren.

Die Peptide der Formel (I), ihre Säureadditionssalze und ihre Komplexe mit pharmazeutisch akzeptablen Metallen können hergestellt werden, indem ein Reagenz (ID

Y¹ - OH (II)

worin Y¹

(i) ein X -Rest - wie oben definiert - ist,

(ii) ein zu einem Pyroglutamyl-Rest cyclisierbarer Rest ist,

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- 15 (iii) der Prolyl-Rest ist und

(iv) eine partielle Restsequenz mit einem der Reste (i) , (ii) und (iii) - wie hier angegeben - an ihrem N-terminalen Ende und von da an entsprechend dem oben definierten Peptid-Produkt mit einem Reagenz (III)

H-Y² (III) (5)

ο
worin Y dem Rest des oben definierten Peptidproduktes

entspricht, kondensiert wird»

1 2

wobei die Reagentien Y-OH und H-Y gegebenenfalls geschützt und/oder aktiviert werden, wo und wenn es

1 2 zweckmäßig ist, und wobei in den Resten Y und Y davon - wenn zweckmäßig - der Arginyl - oder Honoarginylrest, der in dem oben definierten Peptidprodukt vorliegt, gegebenenfalls durch einen Ornithyl- oder LysyIrest ersetzt wird,

gefolgt - falls notwendig und zweckmäßig - durch eine oder mehrere Stufen der Entfernung der Schutzgruppen aus dem Produkt, Cyclisierung des N-terminalen Restes davon zu dem Pyroglutamyl-Rest oder Schützen des N-terminalen Restes mit einem V -Rest - wie oben definiert-,

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Guanidierung des Ornithyl- oder Lysyl-Restes darin zum Arginyl- oder Homoarginyl-Rest, Umwandlung des Produktes in das Peptid oder in das Säureadditionssalz davon und Komplexierung des Peptides mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall.

Bei der Auswahl der Peptiduntereinheiten zur Synthese von der Kondensations-Endstufe ist es praktisch üblich, die folgenden Faktoren zu beachten:

(i) Um die Racemisierung zu vermindern, sind Fragmente mit C-terminalem Glycyl-Rest vorteilhaft.

(ii) Fragmente mit sehr langsamer Löslichkeit in den normalerweise bei der Peptidsynthese verwendeten Lösungsmitteln sind nachteilig.

(iii) Von Vorteil ist, wenn die Fragmente kristallin sind.

(iv) Fragmente mit N-terminalem Tryptophylrest sind von Vorteil, da bei der Einverleibung des Tryptophylrestes als schließlicher N-terminaler Rest des Fragmentes eine verlängerte Arbeitsdauer mit diesem labilen Rest vermieden wird.

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In Bezug auf die Verbindungen der Formel (I) entspricht das Reagenz Y-OH - das oben identifiziert wurde - vorzugsweise

(a) dem Fragment X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶;

1 2
(b) dem Fragment X -X ; oder

(c) dem Fragment X des Peptidproduktes. Das

Reagenz H-Y wird zweckmäßigerweise gewählt.

Wegen ihrer LH-RH-Antagonistwirksamkeit - wie oben definiert und beschrieben - können die Peptide der Formel (I), ihre pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze und ihre Komplexe mit pharmazeutisch annehmbaren Metallen bei der Behandlung von Säugetieren im Bereich der Human- und Veterinärmedizin unter Bedingungen verwendet werden, wo es wünschenswert ist, die Wirkung auf den Hypophysenvorderlappen von endogenem LH-RH zu begrenzen und so die Freigabe der Gonadotrophine LH und FSH zu begrenzen. Speziell derartige Peptide, Salze und Komplexe sind in der Human- und Veterinärmedizin brauchbar, und zwar bei

(i) Therapiebedingungen, bei denen eine Hypersekretion von LH-RH und/oder von LH oder FSH auftritt und

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(ii) der Regulierung der Fruchtbarkeit (Contrazeption) bei der Frau durch Regulierung der Ovulation und beim Mann bei der Regulierung der Reifung von Spermatozoen.

Es ist zu bemerken, daß ganz unabhängig von dem Wert in der Humanmedizin diese Peptide, Salze und Komplexe von besonderem Wert sind, da sie die Contrazeption von Haussäugetieren, wie Katzen und Hunde, ermöglichen.

Für jeden der oben erwähnten Verwendungszwecke schwankt natürlich die erforderliche Menge an Peptid, dessen Salz oder dessen Komplex (hier als aktiver Bestandteil bezeichnet) mit dem speziellen aktiven Bestandteil und mit der Verabreichungsart. Im allgemeinen liegt aber bei allen diesen Anwendungen die Dosis für die nasale oder parenterale Verabreichung im Bereich von 0,005 bis 200 yg per kg Körpergewicht Säugetier, vorzugsweise bei 0,01 bis 1OO yg/kg und gegebenenfalls bei 0,02 bis 10 ug/kg. Bei der oralen oder vaginalen Verabreichung liegt die Dosis im allgemeinen im Bereich von 0,005 bis 1000 ug/kg, vorzugsweise 0,05 bis 200 yg/kg und gegebenenfalls bei 0,2 bis 50 ug/kg (alle Dosierungen sind auf der Basis des Peptids berechnet).

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Wenn es auch möglich ist, daß die aktiven Bestandteile als Reinchemikalien verabreicht werden, so ist es doch im Hinblick auf ihre Potenz vorteilhaft, daß sie als pharmazeutische Formulierung vorliegen.

Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung enthalten für humane und Veterinäre Zwecke einen aktiven Bestandteil - wie oben definiert - zusammen mit einem oder mehrere annehmbare Träger dafür und gegebenenfalls andere therapeutische Bestandteile. Der Träger bzw. die Träger müssen annehmbar sein in dem Sinne, daß sie mit anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich sind und nicht beim Empfänger störend wirken. Wünschensweterweise sollten die Formulierungen keine Oxidationsmittel enthalten und andere Substanzen, mit denen Peptide bekannterweise unverträglich sind.

Die Formulierungen sind für die orale, rektale, nasale, topikale (bukkale), vaginale oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichung geeignet, obwohl die geeignete Art in einem bestimmten Fall von dem aktiven Bestandteil abhängt. Als andere Möglichkeit kann ein aktiver Bestandteil als Depot-Formulierung mit einer langsamen Freigabecharakteristik vorliegen, die für die Inplantation

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im Körper des Empfängers geeignet ist, beispielsweise für die subkutane, intraperitoneale oder intravaginale Inplantation. Die Formulierungen können zweckmäßig in Einheitsdosisform vorliegen und können nach in der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren enthalten die Stufe des Inverbxndungsbrxngens des aktiven Bestandteils mit dem Träger, der eine oder mehrere zusätzliche Bestandteile enthält. Im allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem der aktive Bestandteil gleichmäßig und innig mit den flüssigen Trägern oder fein-verteilten festen Trägern in Verbindung gebracht wird und indem - falls notwendig - das Produkt zu der gewünschten Formulierung verformt wird.

Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können als Einzeleinheiten, wie Kapseln, Pastillen oder Tabletten vorliegen, die alle eine vorgegebene Menge des aktiven Bestandteils enthalten, als Pulver oder Körner oder als Lösung oder als Suspension in einer wässerigen Flüssigkeit oder nicht-wässerigen Flüssigkeit oder als öl-in-Wasser-Flüssigkeitsemulsion oder als Wasser-in-öl-Flüssigkeitsemulsion. Der aktive

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Bestandteil kann auch als Pillen, Latwerge oder Paste vorliegen.

Eine Tablette kann hergestellt werden, indem sie gegebenenfalls mit einem oder mehreren weiteren Bestandteilen gepreßt oder verformt wird. Gepreßte Tabletten können hergestellt werden, indem in einer geeigneten Maschine der aktive Bestandteil in frei fließender Form, wie als Pulver oder Granulat, gegebenenfalls mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inertem Verdünnungsmittel, Schmiermittel, oberflächenaktivem Mittel oder Dispergierungsmittel gemischt wird. Verformte Tabletten können hergestellt werden, indem in einer geeigneten Maschine ein Gemisch der gepulverten Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Verbindungsmittel befeuchtet ist, verformt wird.

Die Formulierungen für die rektale Verabreichung können als Suppositorien mit den üblichen Trägern, wie Kokosnußbutter, vorliegen, während eine geeignete Formulierung für die nasale Verabreichung Nasaltropfen sind, die den aktiven Bestandteil in wässeriger oder öliger Lösung enthalten.

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Für die topikale Verabreichlang geeignete Formulierungen im Mund sind Pastillen, die den aktiven Bestandteil in einem Geschmacksbasisstoff enthalten, gewöhnlich Sucrose und Akazie oder Traganth und Pastillen, die den aktiven Bestandteil in einer inerten Basis, wie Gelantine und Glycerin oder Sucrose und Akazie enthalten.

Für die vaginale Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Cremes, Pasten und Sprayformulierungen vorliegen, die neben dem aktiven Bestandteil für diese Zwecke geeignete und bekannte Träger enthalten.

Für die parenterale Verabreichung geeignete Formulierungen enthalten sterile, wässerige Lösungen des aktiven Bestandteils. Diese Lösungen sind vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch·. Derartige Formulierungen können zweckmäßig hergestellt werden, indem der feste aktive Bestandteil in Wasser gelöst wird, um eine wässerige Lösung zu erhalten, und indem die Lösung steril und mit dem Blut des Empfängers isotonisch gemacht wird.

Ein geeignetes Langsam-Abgabe-Medium für eine Depot-Formulierung ist Polyäthylenglycol.

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Es versteht sich von selbst, daß neben den oben erwähnten Bestandteilen die erfindungsgemäßen Formulierungen eine oder mehrere weitere Bestandteile, wie Verdünnungsmittel, Puffer, Geschmacksmittel, Bindemittel, oberflächenaktive Mittel, Verdicker, Gleitmittel, Schutzstoffe (einschließlich Antioxidationsmittel) und dergleichen enthalten.

Wo die Formulierung für die humane und Veterinäre Verwendung in Einheitsdosisform vorliegt, beispielsweise in solchen Einheitsdosisformen, die oben speziell erwähnt werden, so enthält jede Einheit davon zweckmäßig den aktiven Bestandteil (wie oben definiert) in den folgenden Mengen. Alle Angaben beziehen sich auf die Peptidbasis.

Für die nasale oder parenterale Verabreichung: 0,25 yg bis 10 mg, vorzugsweise 0,5 yg bis 5 mg, und optimal 1,0 yg bis 500.0 yg.

Für die orale oder vaginale Verabreichung: 0,25 yg bis 50 mg, vorzugsweise 2,5 yg bis 10 mg, und optimal 10 yg bis 2,5 mg.

Es ergibt sich aus den obigen Ausführungen, daß das, was beansprucht wird, folgendermaßen zusammengefaßt werden kann.

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(a) Peptide der Formel (I) - wie oben definiert ihre Säureadditionssalze und ihre Komplexe mit pharmatzeutisch annehmbaren Metallen;

(b) Verfahren zur Herstellung der Peptide, der Salze und der Komplexe, wie sie oben beschrieben werden;

(c) Pharmazeutische Formulierungen, die ein Peptid der Formel (I), ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall zusammen mit einem annehmbaren Träger dafür, enthalten;

(d) Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Formulierungen, wie sie unter (c) oben definiert werden;

(e) Verfahren zur Contrazeption bei einem Säugetier, das in der Verabreichung eines Peptids der Formel (I) einem pharmazeutisch annehmbaren Additionssalz davon oder einem Komplex davon mit einer pharmazeutisch annehmbaren Metall einem Säugetier besteht;

(f) Verfahren zur Regulierung der Ovulation (bei einem weiblichen Säugetier) oder zur Regulierung der Reife

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von Spermatpzoen (bei einem männlichen Säugetier) , das in der Verabreichung eines Peptides der Formel (I), eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes davon oder eines Komplexes davon mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall einem Säugetier besteht.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Herstellung der Verbindung A
Cblu-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH·C₃H₅

Diese Verbindung wurde nach dem in der beigefügten Tabelle I angegeben Schema hergestellt, worin Z = ein Benzyloxycarbonylrest BOC = ein tert.-Butyloxycarbonylrest Bu = ein tert.-Butylrest

Ät = ein Äthylrest ist.

Das geschützte Dipeptid (1) wurde erhalten, indem äquimolare Mengen von Benzyloxycarbonylglycin und Leucin-tert.-butylester in Methylendichlorid in

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Anwesenheit einer äquivalenten Menge von Dicyclohexylcarbodiimid gekuppelt wurden. Nach einer Anfangsperiode von 30 Minuten bei -10°C, wurde das Reaktionsgemisch 24 Stunden bei 4 C gerührt. Nach anschließender Entfernung von Dicyclohexylharnstoff wurde das Reaktionsgemisch aufgearbeitet und das Dipeptid in einer Ausbeute von 94% erhalten. Das geschützte Dipeptid wurde in Methanol gelöst und nach Spülen mit Stickstoff wurden 10% Palladium auf einem Holzkohlenkatalysator eingeleitet. Wasserstoff wurde 20 Stunden bei Zimmertemperatur durch das gerührte Gemisch geleitet. Nach der Entfernung des Katalysators wurde die Lösung aufgearbeitet und das partiell ungeschützte Dipeptid (1a) erhalten.

Die Umwandlung des Produktes (1a) in das geschützte Hexapeptid (II) ging bei der portionsweisen Zugabe der geeigneten Z-geschützten Aminosäuren und der anschließenden Entfernung der geschützten Gruppe durch Hydrolyse vor sich. Einzelheiten der Kupplung und der Entfernung der Schutzgruppe sind im wesentlichen die gleichen, wie si oben für das Dipeptid beschrieben wurden. Das Peptid (III) wurde erhalten durch Behandlung des Produktes (II) mit Trifluoressigsäure in Anwesenheit eines großen Überschusses von Anisol 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Die Verdampfung des

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Reaktionsgemisches und die Ausfällung mit Äther ergab das gewünschte Produkt.

Das Äthylamid von Z-Pro-Oh wurde durch eine gemischte Anhydridkupplung zwischen Z-Pro-OH und Äthylamin hergestellt. Die Kupplung von BOC(NO₂)-Arg-OH mit H-PrO-NH^C₃H₅ erfolgte in einem Gemisch des gewünschten geschützten Peptides und das Laktam von BOC(NO₂) Arg-OH, das durch erschöpfende Extraktion mit Wasser des schwach hydrophileren Dipeptids aus einer Äthylacetatlösung des Gemisches gewonnen wurde, wieder gelöst. Das Peptid wurde durch Lyophilisierung der wässerigen ':■■ xtrakte erhalten. Es wurde durch Dünnschichtchromatographie rein und hatte die richtige Elementaranalyse. Das Peptid wurde mit N-Wasserstoffchlorid in Essigsäure von der Schutzgruppe befreit und das Produkt (IV) erhalten, das dann mit dem Produkt (III) in Dimethylformamid in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid und einer äquivalenten Menge von 1-Hydroxy-benzotriazol gekuppelt wurde.

Die Nitrogruppe des Produktes (V) wurde durch Hydrolyse in dem Lösungsmittelgemisch Methanol/Essigsäure/ Wasser von 5:1:1 entfernt. 350 mg Palladium/Holzkohle-Katalysator wurden pro mMol Peptid verwendet und Wasserstoff wurde 24 Stunden durch die gerührte Suspension geleitet. Die Reinigung des Produktes -

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zuerst durch Trockenkolonnen-Chromatographie auf Silikagel und anschließend durch Gradienteluierungschromatographie auf Carboxymethylcellulose führte zum Peptid (A) (in Acetatadditionssalzform) in reiner Form.

Das Produkt (A) war positiv gegenüber dem Pauly-Reagenz (für ungeschütztes Tyrosin) und gegenüber dem Sakaguchi-Reagenz (für das ungeschützte Arginin). Es verhält sich wie eine im wesentlichen einfache Komponente bei der Dünnschichtchromatographie mit dem jeweils folgenden Lösungsmittelsystemen :

(a) Chloroform zu Methanol zu Ammoniak (D = 0,880) 60 : 45 : 20

(b) Chloroform zu Methanol zu Essigsäure (32%ig) 60 : 45 : 20

(c) n-Butanol zu Essigsäure zu Wasser zu Äthylacetat 1 : 1 : 1 : 1 .

Die Aminosäureverhältnisse betrugen nach 24-stündiger Hydrolyse bei 110°C in 6N-Salzsäure:

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GIu: 1,08, Phe: 0,99, Ala: 1,00, Tyr: 0,98, GIy: 0,99, Leu: 1,00, Arg: 0,91, Pro: 0,98

Ausbeute 95% (berechnet als Acetat)

Eigenschaftsdaten:

(α)

26

- 65,4° (C = 0,785, 1%ige Essigsäure)

UV-Absorptionsspektrum (in 0,1N Natriumhydroxyd):

: 11260, E

2370

Z.
Z.

H-

--0H

AIa

Z4-0H Z.

H.

Tyr

Z-2-

E.

Tabelle I:

Z-4-0H Z.

II.

Leu

H-

(1)

(1a)

InI

ClII)

(Y)

-OBu

-OBu¹

Arg

.OBu"

OBu*

OBu* -OBu* .0Bu*

OBu*

-0Bu*B0C- _CBu*30C.

-OH. H.

IiO.

NO,

Pro

Z--OH

.0H HO-HS

JH-Ä

-JiHl" Ä

(Pi)

609818/1 131

Tabelle II

Arg

BOCL BOC. H.

KO

KO,

XnI

Ppo
Z-4-0H

2 4-AMT-He ' j E-Ml-IT-Me '

JJZZ-Ke AMT-Ke

Beispiel 2:

Herstellung der Verbindung (B)

KSlu-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-i-methyl-S-aminomethy1-tetrazoI

Das Hexapeptid

Cblu-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-OH

wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Das C-termiiiale Fragment wurde nach dem in der beigefügten Tabelle II angegebene Schema hergestellt, worin

AMT-Me
ist.

ein Benzyloxycarbonylrest ein tert.-Butyloxycarbonylrest ein 1-Methyl-5-aminomethylretrazolrest

609818/1131

1-Methyl-S-aminomethyltetrazol-Hydrochlorid wurde mit dem p-Nitrophenylester von Benzyloxycarbonylprolin in Dimethylformamid in Anwesenheit einer äquivalenten Menge von Triäthylamin hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und anschließend aufgearbeitet und ein kristallines Produkt erhalten, das bei 91-92°C schmolz. Der Benzyloxyeaxbonylrest wurde durch Hydrolyse entfernt und das erhaltene N Prolyl-(1-methyl-5-aminomethyl)-tetrazol wurde mit

NO₂

BOC-Arg-OH

in Dimethylformamid unter Verwendung der Carbodiimid-Methode gekuppelt. Diese Reaktion war von der in Beispiel 1 beschriebenen Lactambildung begleitet und die Abtrennung des erforderlichen Produktes von der Lactam-Verunreinigung wurde durch Extraktion, die der in Beispiel 2 beschriebenen entsprach, erreicht. Die Lyophilisation der wässerigen Extrakte führte zu einem Produkt (I), das bei der Dünnschichtchromatographie rein war und die richtige Elementaranalyse aufwies. Nach Entfernung der Schutzgruppe mit Wasser-freier Salzsäure

6 0 9 8 18/1131

in Essigsäure wurde das Peptid (II) mit dem Hexapeptid nach der Carbodiimid/Hydroxybenzotriazol-Methode gekuppelt. Die Nitroschutzgruppe wurde aus dem Agininrest durch verlängerte Hydrolyse in einem Methanol-Essigsäure- und Wasser-Gemisch entfernt. Das Endprodukt (B) wurde anschließend durch Chromatographie, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt.

Das gereinigte Material (als Acetatadditionssalz) ergab eine positive Reaktion gegenüber dem Pauly-Reagenz und auch gegenüber dem Sakaguchi-Reagenz. Es war im wesentlichen rein, wenn es bei der Dünnschichtchromatographie in den drei in Beispiel 1 vorher beschriebenen Systemen untersucht wurde.

Die Aminosäureverhältnisse betrugen nach der sauren Hydrolyse:

GIu: 1,08, Phe: 1,01, AIa: 1,02, Tyr: 0,97 GIy: 1,00, Leu: 1,00, Arg: 1,01, Pro: 0,97

Ausbeute: 83 % (berechnet als Acetat)

UV-Absorptionsspektrum (in 0,1N-Natronlauge) E₂₄₂ : 9940, E₂₉₃ : 2060

(α)ρ⁶ - 61,4° (C = 1,1% Essigsäure)

609818/1 131

Beispiel 3

Herstellung der Verbindung (C) Cblu-His-Trp-Ser-Tyr-Gry-Leu-Pro-NH'C^H

2 "5

Ausgehend von der Verbindung N-GIy-OCH₃ wurde das geschützte Tetrapeptid Z-Trp-Ser(BzI)-Tyr(BzI)-GIy-OCH₃ durch eine Reihe von Carbodiimid-Zwischenkuppelungen hergestellt und anschließend in wässerigem Dioxan verseift und die entsprechende freie Säure erhalten, die aus Äthanol als freie Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 2O2-2O4°C erhalten wurden. Die Säure wurde mit H-Leu-OBu^t (Carbodiimid/Benzotriazol) gekuppelt und ein Produkt erhalten, das aus wässerigem Methanol mit einem Schmelzpunkt von 158-16O°C kristallisierte.

Die Entfernung der Schutzgruppe in Trifluoressigsäure/Anisol ergab Z-Trp-Ser(BzI)-Tyr(BzI)-GIy-Leu-OH mit einem Schmelzpunkt von 144-145°C aus Methanol/Äther, das mit H-Pro-NH.C₂H₅ (Carbodiimid/ Benzotriazol) gekuppelt wurde. Die Hydrierung des Produktes in Anwesenheit von Palladium auf Holzkohlekatalysator ergab das vollständig von der Schutzgruppe befreite Hexapeptid, das anschließend mit

Eblu-His-OH (11) in wässerigem Dimethylformamid (Carbodiimid/Benzo-

6 0 9 8 18/1131

triazol) gekuppelt wurde und zu dem rohen Produkt (C) führte. Das rohe Produkt wurde zuerst auf Silikagel (Chloroform : Methanol : Essigsäure) chromatographiert und anschließend auf Carboxymethylcellulose und das reine Octapeptid (als Acetatadditionssalz) erhalten, das bei der Dünnschichtchromatographie eine einzige Komponente bei den drei Lösungsmittelsystemen, die in Beispiel 1 aufgeführt sind, ergab. Es war positiv gegenüber dem Pauly-Reagenz für das ungeschützte Tyrosin und gegenüber dem Ehrlich-Reagenz (für Tryptophan).

Z und Bu haben oben die in Beispiel 1 angegebenen Bedeutungen, BzI ist der Benzylrest.

Die Aminosäureverhältnisse waren nach der Hydrolyse wie in Beispiel 1:

GIu: 1,09, His: 1,01, Ser: 0,85, Tyr: 0,96 GIy: 1,02, Leu: 1,00, Pro: 0,96

Ausbeute: 91% (berechnet als Acetat)

Optische Rotation: (a)^³ - 44,65° (C = 1, 1% Essigsäure)

609818/1 131

Beispiel 4

Herstellung der Verbindung (D)
ßlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Por-Gly-NH₂

das geschützte Pentapeptid Z-Trp-Ser(BzI)-Tyr(BzI)-Gly-Leu-OH hergestellt wie in Beispiel 3) wurde mit H-Pro-GlyNH» (Carbodiimid/Benzotriazol in Dimethylformamid) gekuppelt und das erhaltende geschützte Heptapeptid anschließend hydriert und

H-Trp-Ser-Typ-Gly-Leu-Pro-Gly-NH₂ erhalten. Dieses wurde mit

ÜGlu-His-OH

(Carbodiimid/Benzotriazol in wässerigem Dimethylformamid) gekuppelt und das Rohprodukt (D) erhalten, das anschließend durch Trockenkolonnen-Chromatographie auf Silikagel unter Verwendung eines Lösungsmittelsgemisches von Chloroform : Methanol : Essigsäure (32%) von 60:5 und 40:20 erhalten wurde. Die weitere Reinigung wurde durch Chromatographie auf Carboxymethylcellulose durchgeführt.

Das reine Nonapeptid war als Acetatadditionssalz

609818/1 131

Pauly und Ehrlich positiv und ergab bei der Dünnschichtchromatographie eine einzige Komponente mit den drei in Beispiel 1 angegebenen Lösungsmittelsystemen .

Die Aminosäureverhältnisse waren nach der Hydrolyse wie in Beispiel 1:

GIu: 1,07, His: 1,01, Ser: 0,84, Tyr: 0,95 GIy: 2,00, Leu: 1,00, Pro: 0,94

Ausbeute: 86% (berechnet als Acetat)

Optische Rotation: (a)^³ - 43,54° (C = 1, 1% Essigsäure)

Beispiel 5

Herstellung der Verbindungen

Tert.-Butyloxycarbonyl-Pro-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (E)

Cyclopentylcarbonyl-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH.C₂H₅ (F)

Nachfolgend bedeutet der BOC-Rest den tert.-Butyloxy-

609818/1131

carbonylrest und der Bzl-Rest den Benzyl-Rest.

Die Synthese der Verbindungen (E) und (F) erfolgte aus der üblichen Vorstufe BOC-Arg(NO)„-Pro-NH-C₂H₂ (Beispiel 1). In jedem Fall wurden die übrigen Kupplungsstufen unter Verwendung der Repetitive Excess Mixed Anhydrid- (R.E.M.A)-Methode durchgeführt, wie sie in Tetrahedron Letters (1970) Seite 849 und in der Zeitschrift HeIv.Chim. Acta., 56 (1973), S. 1729 beschrieben wurde. Jede Zwischenstufe wurde auf Reinheit durch Dünnschichtchromatographie geprüft. Der Tyrosin-Rest wurde in jede Verbindung als BOC-Tyr(BzI) OH einverleibt und sorgfältiges Waschen war erforderlich, um den Überschuß dieser Verbindung aus dem isolierten Peptid zu entfernen.

In der Anfangsstufe wurden bei der Synthese der Verbindung (E) 6,76 mMol von

BOC-Arg-Pro-NH«C₂H₅

durch Behandlung mit 40 mMol N-Wasserstoffchlorid in Essigsäure bei Zimmertemperatur innerhalb von 45 Minuten entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 30°C konzentriert, der Rest mit Äther trituriert,

609818/1131

filtriert und anschließend völlig über Phosphorpentoxid und Natriumhydroxy-Plätzchen getrocknet. Das von der Schutzgruppe befreite Dipeptid-Hydrochlorid wurde auf diese Weise erhalten, in 18 ml Dimethylformamid gelöst und mit 6,76 rnMol N-Methylmorpholin, gelöst in 4 ml Dimethylformamid, behandelt und die Lösung wurde anschließend auf -15°C gekühlt. 10,15 mMol tert.-Butyloxycarbonyl-Leusinmonohydrat wurden in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und anschließend mit 10,15 mMol N-Methyl-morpholin in 3 ml Tetrahydrofuran behandelt. Diese Lösung wurde auf -15°C gekühlt und die Lösung von 9,46mMol Isobutylchloroformat in 3 ml Tetrahydrofuran wurde unter kräftigem Rühren zugesetzt. Nach 2 Minuten auf -15°C wurde die gekühlte Lösung der oben beschriebenen Amino-Komponente zu dem gemischten Anhydrid gegeben und die Komponenten wurden stehen gelassen, um bei -15 C 2 1/2 Stunden zu reagieren. Die Temperatur wurde anschließend auf O⁰C erhöht und 10 ml einer 2M-Kaliumbicarbonatlösung wurden einlaufen gelassen, um das überschüssige gemischte Anhydrid zu zersetzen. Das erhaltene Gemisch wurde auf 300 ml eiskalte 75%ige gesättigte Natriumchloridlösung gegossen und das ausgefallene öl in Äthylacetat aufgenommen. Die organische Schicht wurde mit Natriumchloridlösung gewaschen, getrocknet und zur Trockene im Vakuum eingedampft. Nach

609818/1131

Trituration mit Äther wurde das geschützte Peptid BOC-Leu-Arg(NO)2~Pro-NH«C₂H₅ in 88%iger Ausbeute erhalten.

Durch eine Reihe von verschiedenen Entfernungen der Schutzgruppe und überschüssigen gemischten Anhydridkupplungen mit der geeigneten geschützten Aminosäure unter Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen wurden das geschützte Octapeptid BOC-Pro-Phe-Ala-Tyr(BzI)-Gly-Leu-Arg(NO₂)-Pro-

hergestellt.

Dieses wurde in einem Methanol/Essigsäure/Wasser-Gemisch (Palladium/Holzkohlekatalysator) hydriert und das Rohprodukt (E) erhalten, das chromatorgraphisch gereinigt wurde. Das reine Produkt (als Acetatadditionssalz) ergab bei der Dünnschichtchromatographie eine einzelne Komponente mit jedem der drei in Beispiel 1 angegebenen Systemen.

Die Aminosäureverhältnisse waren nach der Hydrolyse wie in Beispiel 1:

Pro: 1,73_f Phe: 0,97, AIa: 0,96, Tyr: 0,97, GIy: 0,99, Leu: 1,00, Arg: 0,94

609818/1131

Optische Rotation: (α)^³ - 72.2° (C = 1, 1% Essigsäure)

Die Verbindung (F) wurde auf die gleiche Weise wie oben für Verbindung (E) beschrieben hergestellt mit der Ausnahme, daß Cyclopentancarbonsäure für die Endkupplung verwendet wurde. Das Rohprodukt wurde auf Carboxymethylcellulose chromatographisch gereinigt. Das reine Material (als Acetatadditionssalz) ergab eine einzige Komponente bei den drei in Beispiel 1 angegebenen Systemen.

Die Aminosäureverhältnisse waren nach Hydrolyse wie in Beispiel 1:

Phe: 0,96, AIa: 0,97, Tyr: 0,97, GIy: 0,97 Leu: 1,00, Arg: 1,00, Pro: 0,97

Optische Rotation: (a)p - 54,52° (C = 1, 1% Essigsäure)

Beispiele pharmazeutischer Formulierungen

(i) Tabletten (Zusammensetzung pro Tablette) Verbindung der Formel (I) : 1,0 mg 5,0 mg 25,0 mg Stärke : 20,0 mg 20,0 mg 20,0 mg

609818/1131

Lactose : 50,0 mg 50,0 mg 50,0 mg

Polyvinylpyrrolidon : 8,0 mg 8,0 mg 8,0 mg Magnesiumstearat : 2,0 mg 2,0 mg 2,0 mg

Die Verbindung der Formel (I) wurde mit der Stärke und der Lactose innig gemischt und das Gemisch unter Verwendung einer Lösung des Polyvinylpyrrolidons in Wasser granuliert. Die Körner wurden anschließend getrocknet, das Magnesiumstearat zugesetzt und die Tabletten durch Pressen hergestellt.

(ii) Pessare (Zusammensetzung pro Pessar) Verbindung der Formel (I): 0,5 mg 2,5 mg 12,5 mg

Theobrominöl : 1,0g 1,0 g 1,0 g

Die Verbindung der Formel (I) wurde zu einer glatten Paste mit einer geringen Menge des geschmolzenen Theobrominöls bei einer Temperatur, die 45 C nicht überschritt, gemischt. Die Paste wurde anschließend in das restliche geschmolzene öl einverleibt und das Gemisch in eine geeignete geschmierte Form gegossen und absitzen gelassen.

609816/1

(iii) Vaginaltabletten (Zusammensetzung pro Tablette)

Verbindung der Formel (I): 0,5 mg 2,5 mg 12,5 mg

Lactose : 500,0 mg 500,0 mg 500,0 mg

Stärke : 450,0 mg 450,0 mg 450,0 mg

Polyäthylenglycol 6000 : 100,0 mg 100,0 mg 100,0 mg

Magnesiumstearat : 10,0 mg 10,0 mg 10,0 mg

Die Verbindung der Formel (I) wurde mit der Stärke und der Lactose innig gemischt und das Gemisch unter Verwendung einer Lösung von Polyäthylenglykol 6000 in Wasser granuliert. Die Körner wurden getrocknet, das Magnesiumstearat zugesetzt und die durch Verpressen in einer geeignet geformten Tablettendüse geformt.

(iv) Injektionslösung

Verbindung der Formel (I): 0,04 g 0,2 g 1,0 g verdünnte Essigsäure : ausreichend um einen pH 3,0-

4,0 zu erreichen

Chlorcresol : 0,1 g 0,1g 0,1g

Wasser für Injektion : auf 100,0 ml aufgefüllt

Die Verbindung der Formel (I) wurde in 9/10 des schließlichen Volumens Wasser, das mit verdünnter Essigsäure auf pH 3,0-4,0 eingestellt war, gelöst. Chlorcresol wurde anschließend zugegeben und gelöst und das Gemisch mit dem restlichen Wasser 60981 8/1131

auf das Volumen verdünnt.

Die Lösung wurde sterilisiert, indem sie durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 ym hindurchgeleitet wurde und anschließend aseptisch in 10 ml Vials geteilt wurde. Die Vials wurden jeweils mit einem sterilen Gummistopfen verschlossen, der mit einem Aluminiumverschluß gesichert war.

Die drei Lösungen, die oben angeführt wurden, enthielten 0,4 mg, 2 mg und 10 mg pro Milliliter der Verbindung der Formel (I).

Oben liegt die Verbindung der Formel (I) das Endprodukt des Beispiels 1 ind Form des Acetatadditions salzes vor, obgleich alle Mengen davon auf Peptidbasis berechnet wurden.

609818/1 131

Claims (35)

1. Patentansprüche :

   . / Peptid der Formel

   X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-Pro-W eines Säureadditxonssalzes davon oder eines Komplexes davon mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall, worin

   1

   X ein Pyroglutamylrest, ein V -Pro-Rest ist,

   wobei V ein Acyl-, Alkyloxycarbonyl- oder

   Aralkyloxycarbonyl-Rest ist, oder ein V -Co-

   Rest ist, wobei V ein Cycloalkylrest ist,

   X ein Histidyl-Rest und eine direkte Bindung ist,

   X ein Phefylalanylrest ist, der gegebenenfalls in Benzolring substituiert wird, oder ein Tryptophyl-Rest ist,

   4
   X ein Glycyl-, Seryl-, Alanyl (D- oder L-), D-Leucyl oder D-Valyl-Rest ist,

   6 0 9 8 18/1131

   X ein Phenylalanyl-Rest ist, der gegebenenfalls im Benzolring substituiert ist;

   X ein Glycyl-, Alanyl (D- oder L-), D-Leucyl- oder D-Valyl-Rest ist;

   X ein Phejylalanylrest ist, der gegebenenfalls im Benzolring substituiert ist, oder ein Leucyl-Rest ist,

   O O

   X eine direkte Bindung ist, wenn X ein Histidylrest oder ein anderer Rest als ein Arginyl- oder Homoarginyl-Rest ist und

   2 1 1

   W Glycinamid oder ein R R N-Rest ist, wobei R ,

   R und das Stickstoffatom zusammen ein Ämino-, N-Alkylamino-, N,N-Dialkylamino-, Pyrrolidino-, Morpholino- und i-Methyl-5-aminomethyl-tetrazolyl-Rest ist, der Alkylrest 1 bis 4 C-Atome aufweist und gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert

   13 4 5 ist, vorausgesetzt, daß - wenn X , X , X , X , X

   und X ein Pyroglutamyl-, Tryptophyl-, Seryl-, Tyrosyl-, Leucyl-oder Arginyl-Rest ist- W anders

   /ist
   als Glycinamid oder ein N-Äthylaminorest ist, wenn

   X ein Glycyl-Rest und anders ist als Glycinamid, wenn X ein D-Alanyl-Rest ist,' wobei sich alle Verbindungen auf L-Aminosäuren beziehen und deren Reste 609818/1 131

   mit Ausnahme im Falle des Glycins.
2. 2. Peptid, ein Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn-

   11 1

   zeichnet, daß X ein V -Pro-Rest ist, wobei V

   ist ein AcyIrest mit 2 bis 4 C-Atomen, ein Alkyloxycarbonyl-Rest ist, wobei der Alkylrest 1 bis 4 C-Atome aufweist, und ein Benzyloxycarbonyl-Rest

   2 2

   oder ein V -CO-Rest ist, wobei V 3 bis 7 C-Atome im Ring aufweist.
3. 3. Peptid, ein Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch

   3 5 7

   gekennzeichnet, daß der als X , X oder X vorliegende Phenylalanyl-Rest gegebenenfalls im Benzolring durch eine oder mehrere Reste und zwar durch einen Methoxy-, Chlor-, Methyl-, Hydroxyl-, Nitro- und Amino-Rest substituiert ist.
4. 4. Peptid, ein Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X ein Pyroglutamyl-, ein V Pro-Rest ist, worin V ein Alkyloxycarbonylrest ist, wobei der Alkylrest 1 bis 4 C-Atome aufweist,

   609818/1131

   2 2

   oder ein V -CO-Rest ist, worin V ein Cycloalkylrest mit 3 bis 7 C-Atomen im Ring ist, X ein Phenylalanyl- oder Tryptophyl-Rest ist,

   X⁴ ein Alanyl (D- oder L-) Rest oder Seryl-Rest ist,

   5
   X ein Phenylalanyl- oder Tyrosyl-Rest ist, X ein Glycyl- oder Alanyl- (D- oder L-) Rest ist,

   7
   X ein Leucyl-Rest ist und

   W Glycinamid, ein N-Alkylamino-Rest ist, wobei der Alkylrest 1 oder 2 C-Atome aufweist, oder ein 1-Methyl-5-aminomethyltetrazolyl-Rest ist.
5. 5. Peptid, Säureadditionssalz davon oder Komplex davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das X ein Pyroglutamyl-, tert.-Butyloxycarbonyl-Pro- oder Cyclopentylcarbonyl-Rest ist,

   3 XL·

   X ein Phejylalanyl- oder Tryptophyl-Rest ist, X ein Alanyl- oder Seryl-Rest ist, X ein Tyrosyl-

   fi 7

   Rest ist, X ein Glycyl-Rest ist, X ein Leucyl-

   Rest ist, X eine direkte Bindung oder ein Arginyl-Rest ist und W Glycinamid, ein N-üthylamino-/oder 1-Methyl-5-aminomethyltetrazolyl-Rest ist.

   609818/ 1131
6. 6. L-Glu-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Äthylamid wie in Anspruch 1 definiert oder ein Säureadditionssalz davon.
7. 7. Glu-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-I-Methyl-5-aminomethyltetrazol wie in Anspruch 1 definiert oder ein Säureadditionssalz davon.
8. 8. KSlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Pro-Äthylamid wie in Anspruch 1 definiert oder ein Säureadditionssalz davon.
9. 9. I-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Pro-Glycinainid wie in Anspruch 1 definiert oder ein Säureadditionssalz davon.
10. 10. tert.-Butyloxycarbonyl-Pro-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Äthylamid wie in Anspruch 1 definiert oder ein Säureadditionssalz davon.
11. 11. Cyclopentylcarbonyl-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Äthylamid wie in Anspruch 1 definiert oder ein Säureadditionssalz davon.

    60981 8/1131
12. 12. Ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz eines Peptides gemäß Anspruch 1 bis 11.
13. 13. Ein Essigsäureadditionssalz eines Peptides gemäß Anspruch 1 bis 11.
14. 14. Komplex mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall eines Peptides gemäß Anspruch 1 bis 11,
15. 15. Zinkkomplex eines Peptides gemäß Anspruch 1 bis 11.
16. 16. Verfahren zur Herstellung eines Peptides, eines Säureadditionssalzes davon oder Komplexes davon gemäß Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reagenz (II)

    Y¹-OH (II)

    worin Y

    •j
    (i) ein X -Rest - wie oben definiert-ist,

    (ii) ein zum Pyrroglutamylrest cyclisierbarer Rest ist,

    (iii) der Prolylrest ist und (iV) ein partieller Seguenzrest mit einem der

    hier angegebenen Reste (i) (ii) und (iii) an seinem N-terminalen Ende ist und von da

    609818/1131

    aus entsprechend zu dem oben definierten Peptidprodukt mit einem Reagenz (III)

    H-Y² (III)

    worin Y dem Rest des oben definierten Produktpeptids entspricht,kondensiert wird,wobei die Reagentien Y-OH und H-Y - falls zweckmäßig gegebenenfalls geschützt und/oder aktiviert sind,

    in 12

    und worin den. RestenY und Y davon - falls zweckmäßig - jeder in dem oben definierten Produktpeptid vorliegende Aginyl- oder Homoarginylrest gegebenenfalls durch einen Ornithyl- oder Lysyl-Rest ersetzt ist, gefolgt - falls notwendig und zweckmäßig durch eine oder mehrere Stufen der Entfernung der Schutzgruppe aus dem Produkt, Cyclisierung des N-terminalen Restes davon zu dem Pyroglutamyl-Rest

    oder Schützen des N-terminalen Restes mit einem V Rest, wie oben definiert, Guanidierung des Ornithyl- oder LysyL-Restes darin zum Arginyl- oder Homoarginyl-Rest, Umwandlung des Produktes in das Peptid oder ein Säureadditionssalz davon und Komplexsieren des Peptides mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall.
17. 17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz Y-OH dem N-terminalen Dipeptid

    609818/1 131

    oder N-terminalen Hexapeptid-Pragment des Produktpeptides entspricht.
18. 18. Verfahren gemäß Anspruch 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Kondensationsstufe in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol durchgeführt wird.
19. 19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Kondensationsstufe in Anwesenheit von Dimethylformamid als Lösungsmittel
    durchgeführt wird.
20. 20. Verfahren gemäß Anspruch 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz Y -OH einen Pyroglutamyl-Rest in der N-terminalen Stellung aufweist .
21. 21. Verfahren gemäß Anspruch 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidprodukt als pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz davon erhalten wird.
22. 22. Verfahren gemäß Anspruch 16 bis 20, dadurch ge-

    kennzeichnet, daß - wenn X ein Histidyl-Rest ist,

    609818/1131

    das Peptidprodukt mit Zink komplexiert ist.
23. 23. Peptid*,ein Säureadditionssalz davon oder

    ein Komplex davon gemäß Anspruch 1 bis 15, hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 16 bis 22.
24. 24. Pharmazeutische Formulierung, dadurch.gekennzeichnet, daß sie ein Peptid, ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall gemäß Anspruch 1 bis 15 enthält in Verbindung mit einem annehmbaren Träger dafür.
25. 25. Formulierung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet., daß sie das Peptid oder ein Säuren additionssalz; davon in Verbindung mit dem Träger dafür enthält. .-;·.-
26. 26. Formulierung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid als Zinkkomplex davon vorliegt.
27. 27. Formulierung gemäß Anspruch 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine FLüssigkeit ist.

    6098 18/1131
28. 28. Formulierung gemäß Anspruch 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Feststoff ist.
29. 29. Formulierung gemäß Anspruch 24 bis 28 in Einheitsdosisform.
30. 30. Formulierung gemäß Anspruch 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur nasalen, pärenteralen oralen und vaginalen Verabreichung geeignet ist.
31. 31. Formulierung gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie für die nasale und parenterale Verabreichung geeignet ist und daß sie das Peptid das Säureadditionssalz davon oder einen Komplex davon in einer Menge von 0,25 \xg bis 10 mg, bezogen auf das Peptid, pro Einheitsdosis enthält.
32. 32. Formulierung gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es für die orale und vaginale Verabreichung geeignet ist und daß sie das Peptid, ein Säureadditionssalz davon oder einen Komplex davon in einer Menge von 0,25 yg bis 50 mg, berechnet auf das Peptid, pro Einheitsdosis enthält,
33. 33. Formulierung gemäß Anspruch 29, dadurch gekenn-

    60981 8/1131

    - 54 zeichnet, daß sie eine Tablette ist.
34. 34. Formulierung gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine sterile Lösung oder Suspension ist.
35. 35. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Formulierung gemäß Anspruch 24 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Peptid ein Säureadditionssalz dayon oder ein Komplexes davon mit einem annehmbaren Träger dafür gemischt wird.

    \ -t γ\ QT

    weiblichen Säugetier oder zur Regulation Reifung von Spermatozoen bei einemjaaännlichen Säugetier, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Verabreichnung einßö^Peptides, eines pharmazeutisch annehmbarej-r"i3äureadditionssalzes davon oder eines Jlexes davon mit einem pharmazeutisch annehm-

    T ff

    g>itiäR Angrvr-nrjTi 1 Vii

    609818/1131