DE2600589C2

DE2600589C2 - Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von Calcium-cis-epoxysuccinat

Info

Publication number: DE2600589C2
Application number: DE2600589A
Authority: DE
Inventors: Noriaki Fujita; Ko Imai; Yoshio Osaka Kamatani; Katsuhiko Osaka Ogino; Hisayoshi Kyoto Okazaki; Yoshio Yamazaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-01-31
Filing date: 1976-01-09
Publication date: 1987-04-23
Also published as: FR2299305A1; FR2299305B1; DE2600589A1; ES444576A1; NL183831B; IT1057067B; NL183831C; NL7600997A; GB1532041A; US4013509A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L(+)- Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von Calcium-cis- epoxysuccinat in einem flüssigen Medium, wobei man Calcium-cis- epoxysuccinat als Ausgangsmaterial dem Kulturmedium zusetzt, den Mikroorganismus bebrütet und hierdurch Calcium-L(+)-tartrat bildet.
Bekannt ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von meso- Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von trans-Epoxybernsteinsäure (Journal of Bacteriology 70 (1955) 405). Von der Anmelderin wurde ferner ein Verfahren zur Herstellung von L(+)- Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von cis-Epoxybernsteinsäure entwickelt (Patentanmeldung 26 00 682 entsprechend der japanischen Patentanmeldung 8149/1975 vom 17.1.1975).
Bei eingehenden Untersuchungen mit dem Ziel, das vorstehend genannte Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von L(+)-Weinsäure aus cis-Epoxybernsteinsäure zu verbessern, wurde gefunden, daß eine als Ausgangsmaterial verwendete Lösung von cis-Epoxysuccinat das Wachstum von Mikroorganismen hemmt und, wenn ihre Konzentration höher ist als 3 bis 5%, das Wachstum beachtlich verzögert oder gelegentlich vollständig zum Stillstand bringt. Es ist daher schwierig, dem Kulturmedium eine große Menge der leicht wasserlöslichen Salze, z. B. der Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze oder ähnlicher Salze, auf einmal zuzusetzen.
Im Gegensatz hierzu hat Calcium-cis-epoxysuccinat eine sehr geringe Wasserlöslichkeit von nur etwa 1% bei Raumtemperatur, so daß auch dann, wenn eine große Menge Calcium-cis-epoxysuccinat auf einmal zugesetzt wird, keine Verzögerung oder Hemmung im Wachstum der Mikrobien in der Kultur noch eine Verzögerung oder Hemmung der Hydrolyse festzustellen ist.
Wenn ferner Calcium-cis-epoxysuccinat als Ausgangsmaterial zur Herstellung von L(+)-Tartrat verwendet wird, ist die Löslichkeit von Calcium-L(+)-tartrat in Wasser so gering, daß das Reaktionsprodukt leicht ausgefällt wird und sehr leicht aus dem Reaktionssystem entfernt werden kann. Eine Hemmung der Hydrolyse durch das Reaktionsprodukt findet nicht mehr statt, noch wird die L(+)-Weinsäure durch den Mikroorganismus weiter abgebaut, so daß die Hydrolysenreaktion in kürzerer Zeit abläuft und daher bessere Ausbeuten erzielt werden.
Was andererseits das Materialproblem anbelangt, so ist festzustellen, daß cis-Epoxybernsteinsäure, das Ausgangsmaterial, im allgemeinen nach einem üblichen Verfahren hergestellt wird, bei dem Maleinsäure in wäßriger Lösung mit Wasserstoffperoxyd in Gegenwart von Katalysatoren wie Wolframsäure, Molybdänsäure, Molydän- oder Wolfram-heteropolysäure oder Salzen dieser Säuren oxydiert wird. Bei einem anderen möglichen Verfahren wird Maleinsäure der Epoxydation in Form von Natrium-, Kalium- oder Calciumsalzen oder ähnlichen Salzen mit anschließendem Ionenaustausch oder Zusatz anderer Metallsalze unterworfen, wodurch die Maleinsäure wirksam in die gewünschte cis- Epoxybernsteinsäure oder das cis-Epoxysuccinat umgewandelt wird. Wie bereits erwähnt, sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von cis-Epoxybernsteinsäure verfügbar. Für das Verfahren zur Umwandlung von cis-Epoxybernsteinsäure in L(+)-Weinsäure unter Verwendung von Mikroorganismen ist es jedoch zweckmäßig, daß das Ausgangsmaterial keine aus der Epoxydation stammenden Verunreinigungen, z. B. Maleinsäure, DL-Weinsäure, Epoxydationskatalysator u.dgl., enthält, weil die Anwesenheit dieser Verunreinigungen das Wachstum von Mikroorganismen oder die Enzymaktivität hemmt. Schließlich wird hierdurch die Reinigung der erhaltenen L(+)-Weinsäure übermäßig kompliziert. cis-Epoxybernsteinsäure und ihre Natrium- und Kaliumsalze und ähnlichen Salze haben eine so hohe Wasserlöslichkeit, daß die Isolierung dieser Verbindungen aus wäßriger Lösung schwierig wird, während Calcium-cis-epoxysuccinat sowohl als normales Salz als auch als saures Salz eine genügend geringe Löslichkeit hat, um leicht von der wäßrigen Lösung isoliert werden zu können. Das nach diesem Verfahren hergestellte Calcium-cis-epoxysuccinat hat daher den Vorteil, daß es in hoher Reinheit und guter Ausbeute erhalten wird und demzufolge keine Verunreinigungen, die das Wachstum des Mikroorganismus oder die Enzymaktivität hemmen würden, und keine Verunreinigungen enthält, die die Reinigung komplizieren.
Dieses Calcium-cis-epoxysuccinat kann nach einem der beiden folgenden Verfahren hergestellt werden: Bei einem dieser Verfahren kann Calciummaleat als Ausgangsmaterial verwendet werden, wie oben beschrieben, und beim zweiten Verfahren werden Maleinsäure oder ihre Natrium- oder Kaliumsalze oder ähnlichen Salze der Epoxydationsreaktion unterworfen, worauf das gebildete Produkt isoliert oder ohne Isolierung durch Zusatz von Calciumsalz, Calciumhydroxyd oder Calciumoxyd in Calcium-cis-epoxysuccinat umgewandelt wird. Bei Verwendung von Calciummaleat als Ausgangsmaterial ist es zweckmäßig, zuerst die Epoxydationsreaktion unter Verwendung einer wäßrigen Lösung oder Aufschlämmung, die 0,2 bis 1 g-Atom Calcium pro Mol Maleinsäure enthält, durchzuführen und nach der Reaktion die Calciumverbindung zuzusetzen. Anstatt die Calciumverbindung zuzusetzen, ist es auch möglich, das gebildete Produkt in Form von Verbindungen wie Calciumhydrogen-cis- epoxysuccinat oder Calcium-cis-epoxysuccinat oder auch als Gemisch dieser Verbindungen zu isolieren. Insbesondere bei Durchführung der Epoxydationsreaktion unter Verwendung einer wäßrigen Lösung oder Suspension, die 0,4 bis 0,8 g-Atom Calcium/pro Mol Maleinsäure enthält, kann Calcium-cis- epoxysuccinat von hoher Reinheit in guter Ausbeute erhalten werden, ohne daß eine besondere Reinigung erforderlich ist. Wie die vorstehenden Ausführungen zeigen, ermöglicht das unter Verwendung von Calcium-cis-epoxysuccinat als Ausgangsmaterial durchgeführte Verfahren die Umwandlung des kristallinen Rohmaterials in kristallines Calcium- L(+)-tartrat, das gewünschte Produkt, in hoher Konzentration und mit verbesserter Ausbeute sowie bei schnellem Verfahrensablauf. Ferner läßt sich das gebildete Produkt leicht isolieren. Alle diese Vorteile lassen erkennen, daß das Verfahren sich zur Großherstellung von L(+)-Weinsäure eignet.
Als zweite Verbesserung des Verfahrens zur Herstellung von L(+)-Weinsäure wurde gefunden, daß bei Verwendung von Calcium-cis-epoxysuccinat als Ausgangsmaterial durch Anwesenheit eines nichtionogenen Tensids im Kulturmedium die Fermentationsdauer erheblich verkürzt und Calcium-cis-epoxysuccinat von hoher Konzentration in Calcium-L(+)-tartrat mit hohem Wirkungsgrad umgewandelt werden kann.
Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zugrunde.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-(+)-Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von Calcium-cis-epoxysuccinat in einem flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Acinetobacter tartarogenes IFO 13644, Acinetobacter tartarogenes IFO 13650, Acinetobacter tartarogenes IFO 13656, Acinetobacter tartarogenes IFO 13657, Agrobacterium aureum IFO 13647, Agrobacterium viscosum IFO 13652, Rhizobium validum IFO 13648, Rhizobium validum IFO 13653 oder Pseudomonoas species IFO 13645 einsetzt.
Gemäß einer verbesserten Ausführungsform des Verfahrens gibt man eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung in Kombination mit Calcium-cis-epoxysuccinat zum Nährmedium, bebrütet den Mikroorganismus und wandelt hierdurch das Calcium-cis-epoxysuccinat in Calcium-L(+)-tartrat um.
Für die Zwecke der Erfindung können alle Arten von Mikroorganismen verwendet werden, die cis-Epoxybernsteinsäure zu hydrolysieren und L(+)-Weinsäure zu bilden vermögen. Geeignet sind beispielsweise Acinetobacter tartarogenes KB-82 (IFO 13644; FERM 2854; ATCC 31105; die gleiche Spezies KB-99 (IFO 13650; FERM 2860; ATCC 31111); die gleiche Spezies KB-111 (IFO 13656; FERM 2866; ATCC 31117; die gleiche Spezies KB-112 (IFO 13657; FERM 2867; ATCC 31118); Agrobacterium aureum KB-91 (IFO 13647; FERM 2857; ATCC 31108); Agrobacterium viscosum KB-105 (IFO 13652; FERM 2862; ATCC 31113); Rhizobium validum KB-97 (IFO 13648; FERM 2858; ATCC 31109); die gleiche Spezies KB-106 (IFO 13653; FERM 2863; ATCC 31114); and Pseudomonas species KB-86 (IFO 13645; FERM 2855; ATCC 31106).
IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan;
FERM = Fermentation Research Institute, Japan;
ATCC = The American Type Culture Collection (USA).
Nachstehend werden die einzelnen bakteriologischen Charakteristika dieser Mikroorganismen genannt:

Taxonomische Eigenschaften der Stämme KB-82, KB-99, KB-111 und KB-112.

a) Zellmorphologie

1) Kugelförmig bis stäbchenförmig, 0,8-1,0 × 1,0-1,3 µm
2) In jungen Kulturen sind kurze stäbchenförmige Zellen und große unregelmäßige Zellen zu finden. In älteren Kulturen sind die Zellen nahezu kugelförmig.
3) Unbeweglich
4) Keine Sporenbildung
5) Gramnegativ
6) Nicht säurefest b) Kulturmerkmale 1) Nähragarplatte: kreisrund, ausgefüllt (entire), konvex, glatt, gräulich weiß, undurchsichtig, glänzend.
2) Schrägagar: Wachstum mäßig, fadenförmig, glatt, gräulich weiß, glänzend.
3) Brühe: leicht trübe; kein Oberflächenwachstum; Sediment.
4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: alkalisch; keine Peptonisierung. c) Physiologische Eigenschaften 1) Nitratreduktion: Im Nitratmedium sind KB-111 und KB-112 positiv, jedoch KB-82 und KB-99 negativ.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrottest: negativ.
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
5) Indol wird nicht gebildet.
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolisiert.
8) Citrat wird verwertet.
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen verwertet.
10) Keine Farbstoffbildung.
11) Urease wird gebildet.
12) Oxidase: positiv.
13) Katalase: positiv.
14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 8,6. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 8°C und 40°C. Optimale Temperatur etwa 30°C.
15) Aerob.
16) Hugh-Leifson-Test: oxydativ.
17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Xylose und D-Fructose. Geringe Säurebildung, aber kein Gas aus D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Maltose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit und Stärke. Andere taxonomische Eigenschaften 1) Resistent gegen 5 Penicillineinheiten.
2) Vom Boden isoliert.

Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-86

a) Zellmorphologie

1) Stäbchen 0,6-0,8 × 1,5 × 3,0 µm
2) Nicht pleomorph
3) Beweglich mit polarer monotricher Geißel
4) Keine Sporenbildung
5) Gramnegativ
6) Nicht säurefest b) Kulturmerkmale 1) Nähragarplatte: kreisrund, ausgefüllt (entire), konvex, glatt, durchscheinend, cremeweiß, glänzend.
2) Schrägagar: Mäßiges Wachstum, fadenförmig, glatt, cremeweiß, glänzend.
3) Brühe: leicht trübe, kein Oberflächenwachstum; Sediment.
4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: unverändert. c) Physiologische Eigenschaften 1) Nitrate werden in Nitratmedium nicht reduziert.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrot-Test ist negativ.
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
5) Indol wird nicht gebildet
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolisiert.
8) Citrat wird verwertet.
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen verwertet.
10) Wasserlösliche Pigmente werden nicht gebildet.
11) Urease wird gebildet.
12) Oxidase: positiv
13) Katalase: positiv
14) Bei pH 6,0 und 10,5 kein Wachstum. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 10°C. Optimale Temperatur zwischen 25 und 30°C
15) Aerob
16) Hugh-und-Leifson-Test: oxydativ
17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Lactose, Inosit und Stärke. d) Andere taxonomische Eigenschaften 1) Stickstoffbindung findet nicht statt.
2) Aminosäuren und Vitamine werden zum Wachstum nicht benötigt.
3) Vom Boden isoliert.

3. Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-91

a) Zellmorphologie

1) Stäbchen 0,5-0,7 × 1,0-3,0 µm
2) nicht pleomorph
3) beweglich mit 1 bis 3 peritrichen Geißeln
4) keine Sporenbildung
5) gramnegativ
6) nicht säurefest b) Kulturmerkmale 1) Nähragarplatte: kreisrund, sich ausbreitend, konvex, transparent, gelb, glänzend.
2) Schrägagar: Wachstum mäßig, sich ausbreitend (spreading), glatt, gelb, glänzend.
3) Brühe: trübe, kein Oberflächenwachstum, Sediment.
4) Gelatine-Stichkultur: schichtweise Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: neutral bis leicht alkalisch ohne Serumzone. Keine Peptonisierung. Gräulichbraune Farbe nach 2 Wochen. c) Physiologische Eigenschaften 1) Nitrate werden in Nitratmedium nicht reduziert.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrot-Test negativ
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
5) Indol wird nicht gebildet.
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolisiert.
8) Citrat wird verwertet.
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen verwertet.
10) Chromogen
11) Urease wird gebildet.
12) Oxidase: positiv
13) Katalase: positiv
14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 10,5. Optimaler ph-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 10°C. Optimale Temperatur etwa 30°C.
15) aerob
16) Hugh-Leifson-Test: oxydativ
17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit. Keine Säure und kein Gas aus D-Xylose, Maltose, Saccarose, Glycerin und Stärke. d) Andere taxonomische Eigenschaften 1) 3-Ketolactosebildungstest: positiv.
2) Aminosäuren und Vitamine werden zum Wachstum nicht benötigt.
3) Wachstum auf Anilinblau-Glucoseagar. Farbstoff wird nicht absorbiert.
4) Cellulose wird nicht abgebaut.
5) Vom Boden isoliert.
6) Nicht parasitisch für die untersuchten Pflanzen.

4. Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-105

a) Zellmorphologie

1) Stäbchen, 0,5-0,7 × 1,0-3,0 µm
2) nicht pleomorph
3) beweglich mit 1 bis 3 peritrichen Geißeln
4) keine Sporenbildung
5) gramnegativ
6) nicht säurefest b) Kulturmerkmale 1) Nähragarplatte: kreisrund, geschlossen (enitre), konvex, glatt, undurchsichtig, gelblich weiß, glänzend.
2) Schrägagar: Wachstum mäßig, fadenförmig, gelblich weiß, glänzend.
3) Brühe: Sediment, Pellcula.
4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: alkalisch mit Serumzone. c) Physiologische Eigenschaften 1) Nitrate werden in Nitratnährmedium nicht reduziert.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrottest: negativ
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
5) Indol wird nicht gebildet.
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolisiert.
8) Citrat wird in Christensen-Medium, aber nicht in Koser-Medium verwertet.
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen verwertet.
10) Kein Farbstoffbildner
11) Urease wird gebildet.
12) Oxidase: positiv
13) Katalase: positiv
14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 10,5. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 10°C. Optimale Temperatur etwa 30°C.
15) aerob
16) Hugh-Leifson-Test: oxydativ
17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Lactose, Inosit und Stärke. d) Andere taxonomische Eigenschaften 1) 3-Ketolactosebildungstest: positiv
2) Vitamin zum Wachstum benötigt.
3) Wachstum auf Anilinblau-Glucoseagar. Farbstoff wird nicht absorbiert.
4) Auf Zuckermedien werden viskose Kolonien gebildet.
5) Cellulose wird nicht abgebaut.
6) Vom Boden isoliert.
7) Nicht parasitisch für die untersuchten Pflanzen.

5. Taxonomische Eigenschaften der Stämme KB-97 und KB-106

a) Zellmorphologie

1) Kurze Stäbchen 0,8-1,0 × 1,0-1,5 µm
2) In jungen Kulturen werden große unregelmäßige Zellen gefunden. In älteren Kulturen werden die Zellen zu kokkenförmigen Stäbchen.
3) Unbeweglich
4) Keine Sporenbildung
5) Gramnegativ
6) Nicht säurefest b) Kulturmerkmale 1) Nähragarplatte: kreisrund, geschlossen (enitre), konvex, glatt, gräulich weiß, undurchsichtig, glänzend.
2) Schrägagar: mäßiges Wachstum, fadenförmig, glatt, gräulich weiß, glänzend.
3) Brühe: leicht trübe, kein Oberflächenwachstum; Sediment.
4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: leicht alkalisch, nicht peptonisiert; keine Serumzone. c) Physiologische Eigenschaften 1) Reduktion von Nitrat: KB-106 positiv, jedoch KB-97 negativ in Nitratbrühe.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrot-Test: negativ
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
5) Indol wird nicht gebildet.
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolisiert.
8) Citrat wird nicht verwertet.
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen
verwertet.
10) Achromogen
11) Urease wird gebildet.
12) Oxidase: positiv
13) Katalase: positiv
14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 8,6. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 10°C. Optimale Temperatur etwa 30°C.
15) Aerob
16) Hugh-Leifson-Test: oxydativ
17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose und D-Fructose.
Etwas Säure, aber kein Gas aus D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit und Stärke. d) Andere taxonomische Eigenschaften 1) 3-Ketolactose wird nicht gebildet.
2) Wachstum auf Hefeextrakt-Medien innerhalb von 3 Tagen.
3) Von Wurzelknoten von Klee isoliert.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt, indem Calcium-cis-epoxysuccinat dem Kulturmedium im Verlauf der Bebrütung des Mikroorganismus zugesetzt wird, wodurch es möglich ist, die Vorgänge der Bebrütung der Mikrobien und der chemischen Reaktion gleichzeitig durchzuführen.
Für die Kultivierung der Mikroorganismen wird ein flüssiges Nährmedium verwendet. Gebräuchlich und zweckmäßig ist die Schüttelkultur oder das unter Belüften und Rühren durchgeführte Kulturverfahren. Bei beiden Verfahren wird ein flüssiges Nährmedium verwendet.
Die Wahl der Art oder des Zustandes des Nährmediums bzw. Kulturmediums unterliegt keiner besonderen Begrenzung oder Bedingung, d. h. beliebige Arten von Nährmedien können verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie an die Mikrobien so angepaßt sind, daß sie normal und zuverlässig zu wachsen vermögen, und daß das Enzymsystem, das das Calcium-cis-epoxysuccinat in Calcium- L(+)-tartrat umzuwandeln vermag, in ausreichendem Maße darin gebildet werden kann.
Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Calcium- cis-epoxysuccinat, Clucose, Lactose, Glycerin, Saacharose, Melasse, organische Säuren und Kohlenwasserstoffe. Als Stockstoffquellen eignen sich beispielsweise Proteinhydrolysate durch enzymatische Hydrolyse des Proteins (Pepton) (z. B. N-Z · Amin; hergestellt von Schefield) oder durch saure Hydrolyse des Proteins (z. B. Casaminosäure; hergestellt von Difco) sowie Stoffe wie Hefeextrakt, Sojabohnenkuchen, Maisquellwasser, Aminosäuren, verschiedene Ammoniumsalze, verschiedene Arten von Nitraten und andere organische oder anorganische Stickstoffverbindungen. Ferner können als anorganische Salze verschiedene Arten von Phosphaten, Magnesiumsulfat und Natriumchlorid als geeignete Zusätze zugegeben werden. Zur Begünstigung des Wachstums von Bakterien können ferner verschiedene Vitamine, Verbindungen, die an die Nucleinsäure gebunden sind, zugesetzt werden. Unabhängig davon, welches Kulturverfahren in der Praxis angewandt wird, ist es zweckmäßig, zu Beginn der Bebrütung oder Kultivierung cis-Epoxysuccinat wennn auch nur in geringer Menge dem Nährmedium zuzusetzen, da hierdurch bessere Ergebnisse erzielt werden.
Zur Einleitung der Kultivierung wird außerdem das Nährmedium vorzugsweise mit einer geeigneten Menge eines Kulturmediums geimpft, das durch eine vorher im kleineren Maßstab durchgeführte Vorkultur erhalten worden ist.
Die Kultivierungsbedingungen einschließlich Kultivierungstemperatur und -dauer und Acidität-Alkalinität der Flüssigkeit im Kulturmedium und andere Faktoren sind verschieden in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Mikroorganismen oder von der Zusammensetzung oder den Elementen des Nährmediums. Es genügt jedoch, die Wahl und Einstellung so vorzunehmen, daß das Ziel, d. h. maximale Bildung des Enzymsystems, erreicht wird. In vielen Fällen der Praxis werden gute Ergebnisse erzielt, wenn die Kultivierung 1 bis 7 Tage unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis 40°C durchgeführt wird, während der pH-Wert des Kulturmediums bei etwa 5 bis 9 gehalten wird.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Calcium-cis-epoxysuccinat kann in beliebiger Form als normales Salz, saures Salz oder Gemisch dieser Salze verwendet werden. Bei Verwendung eines Ausgangsmaterials, das ein saures Salz enthält, ist es jedoch im allgemeinen vorteilhaft, das Medium vorher mit Calciumchlorid, Calciumcarbonat zu neutralisieren. Es ist jedoch auch möglich, das Umwandlungsverfahren so durchzuführen, daß Natrium-cis- epoxysuccinat oder Kalium-cis-epoxysuccinat dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, das Calciumchlorid oder andere Calciumsalze in äquimolaren Mengen gegenüber den Succinaten enthält, wodurch die Succinate in die entsprechenden Calciumsalze umgewandelt werden.
Wenn das als Ausgangsmaterial dienende Calcium-cis-epoxysuccinat dem Kulturmedium im Verlauf des Kultivierungsprozesses zugesetzt wird, erfolgt die Zugabe entweder vor Beginn der Bebrütung oder zu einem geeigneten Zeitpunkt während der Bebrütung. In diesem Fall wird das Ausgangsmaterial beispielsweise in Form von kristallinem Calciumsalz oder auch in Form einer Suspension in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Wasser, verwendet. Die Kristalle oder die Suspension werden entweder auf einmal oder kontinuierlich über einen bestimmten Zeitraum oder intermittierend in regelmäßigen Abständen während der Kultivierungszeit des Mikroorganismus zugesetzt.
Die Gesamtmenge des Calcium-cis-epoxysuccinats, die während der Kultivierung des Mikroorganismus verwendet wird, liegt bei nicht weniger als 5% (Gew./Vol.) und kann bis zu 50% (als freie Säure) betragen.
Als bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel in das Kulturmedium gegeben, um die Inkubationszeit zu verkürzen und das Calcium-cis-epoxysuccinat besonders wirkungsvoll in das Calcium-L(+)-tartrat umzuwandeln.
Die verschiedensten nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindungen können für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise Sorbitanfettsäureester (z. B. Sorbitanmonooleat und Sorbitantrioleat), Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester (z. B. Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat und Polyoxyäthylensorbitanmonooleat), Polyoxyäthylensorbitfettsäureester (z. B. Polyoxyäthylensorbitmonolaurat), Polyoxyäthylenfettsäureester (z. B. Polyoxyäthylenstearat und Polyoxyäthylenlaurat), Polyoxyäthylenalkoholäther (mit höheren Alkoholen) (z. B. Polyoxyäthylenlaurylalkoholäther und Polyoxyäthylenoleylalkoholäther), Polyoxyäthylenalkylaryläther (z. B. Polyoxyäthylen-nonylphenoläther und Polyoxyäthylenoctylphenoläther), Glycerylfettsäureester (z. B. Glycerylmonostearat), Alkylenglykolfettsäureester (z. B. Propylenglykolmonostearat), Polyoxypropylen-poly- oxyäthylenalkyläther (z. B. Polyoxypropylenpolyoxyäthylencetylalkoholäther), Kondensationsprodukte von Polyoxyäthylenalkylphenol und Formaldehyd (z. B. Polyäthylennonylphenol-Formaldehyd-Harze und Polyoxyäthylenoctylphenol- Formaldehyd-Harze), Polyoxyäthylenalkylamin oder -amid (z. B. Polyoxyäthylenoleylamin und Polyoxyäthylenoleylamid), Polyoxyäthylen-Lanolin-Derivate, Polyoxyäthylen- Lanolinalkoholderivate, Polyoxyäthylensorbit- Bienenwachs-Derivate, Polyoxyäthylen-Rizinusöl-Derivate, Polyoxyäthylenpolyole, Polyoxypropylenpolyole, Polyoxyäthylenoxypropylenpolyole (z. B. Athylendiamin-oxypropylenoxyäthylentetraol), Polyoxyäthylentetrahydrofurfurylalkohol und Polyoxypropylenfettsäureester.
Im allgemeinen werden die oberflächenaktiven Verbindungen in einer Menge von 0,05 bis 5,0% (Gew./Vol), vorzugsweise 0,05 bis 2,0% verwendet. Die oberflächenaktiven Verbindungen können auf einmal vor Beginn der Kultivierung oder portionsweise im Verlauf der Kultivierung zugesetzt werden.
Wie bereits erwähnt, kann das im Kulturmedium oder im Reaktionsgemisch gebildete Cacium-L(+)-tartrat leicht durch Filtration oder Zentrifugieren isoliert werden.
Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Stämme von Spezies wie Acinetobacter tartarogenes KB-82, Pseudomonas species KB-86, Agrobacterium aureum KB-91 und Rhizobium validum KB-106 werden in 30 ml Nährmedium geimpft, das in 200 ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist und 0,05% Casaminosäure, 0,5% Natriumnitrat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisen- (II)-sulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird kristallines Calcium-, Dinatrium- bzw. Dikalium-cis-epoxysuccinat so zugesetzt, daß die Endkonzentration jeweils 5%, gerechnet als freie Säure, beträgt. Das Gemisch wird dann 2 Tage bei 30°C in rotierender Schüttelkultur bebrütet. Bei Herstellung des Nährmediums unter Zusatz von Calcium-cis-epoxysuccinat wird das Endprodukt durch Zentrifugieren abgetrennt, nachdem das Calciumsalz vorher mit Schwefelsäure löslich gemach worden ist. Bei Verwendung des Dikaliumsalzes oder Dinatriumsalzes beim Ansetzen des Nährmediums wird das Kulturmedium ohne jede Vorbehandlung zentrifugiert. Die Menge der L(+)-Weinsäure wurde an Hand des Wertes der optischen Drehung bei 436 µm bestimmt, während die nicht umgesetzte cis-Epoxybernsteinsäure nach der Methode von Payne und Williams bestimmt wurde (G.B. Payne und P.H. Williams, Journal of Organic Chemnistry 24 (1959) 54). Die Ergebnisse werden nachstehend genannt. cis-Epoxybernsteinsäure &udf53;ta1,6:15,6:23,6:31,6:37,6:15,6:19,6:23,6:27,6:31,6:35,6:37,6&udf54;&udf53;tz5,5&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg8&udf54;\Mikroorganismus\ Calciumsalz\ Natriumsalz\ Kaliumsalz\ (A)*)&udf50;(%)\ (B)**)&udf50;(%)\ (A)&udf50;(%)\ (B)&udf50;(%)\ (A)&udf50;(%)\ (B)&udf50;(%)&udf53;tz5,10&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;ta1,6:15,6:19,6:23,6:27,6:31,6:35,6:37,6&udf54;&udf53;sg9&udf54;\Acinetobacter tartarogenes&udf50;¸KB-82\ 90\ Æ0\ 10\ 85\ Æ9\ 87&udf53;tz&udf54; \Pseudomonas species&udf50;¸KB-86\ 55\ 42\ Æ3\ 95\ Æ4\ 92&udf53;tz&udf54; Agrobacterium aureum&udf50;¸KB-91\ 75\ 22\ Æ5\ 92\ Æ3\ 92&udf53;tz&udf54; \Rhizobium validum&udf50;¸KB-106\ 93\ Æ0\ 13\ 83\ 11\ 85&udf53;tz5&udf54; &udf53;te&udf54;&udf53;sg8&udf54;Æ*)Æ(A):@2Mol-Ausbeute an L(+)-Weins¿ure. Hierbei gelten 100%°efÝr den Fall, in dem die gesamte cis-Epoxybernsteins¿ure°e vollst¿ndig in L(+)-Weins¿ure umgewandelt°eworden ist.&udf50;@0**)Æ(B):@2Restliche cis-Epoxybernsteins¿ure, bezogen auf°edie zugesetzte Menge. Hierbei gelten 100% fÝr den°eFall, in dem 1,5¤g cis-Epoxybernsteins¿ure als°efreie S¿ure zurÝckbleibt.&udf50;@0&udf53;sg9&udf54;&udf53;sb37,6&udf54;&udf53;el1,6&udf54;

Beispiel 2

Mit einem Stamm von Acinetobacter tartarogenes KB-111 werden 500 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in einem 2 l-Sakaguchikolben enthalten ist und 0,6% Calcium-cis-epoxysuccinat, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 30°C in hin- und hergehender Schüttelkultur bebrütet, wobei 500 ml Kulturmedium erhalten werden. Dieses Kulturmedium wird in einen 50 l-Tank überführt, der 30 l eines flüssigen Nährmediums enthält, das 0,1% Polypeton, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und 0,2% Glucose enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig werden 180 g Calcium-cis-epoxysuccinat zugesetzt. Das erhaltene Produkt wird unter Belüften und Rühren bei 30°C kultiviert, wobei etwa 20 g Schaumverhütungsmittel zugesetzt werden. 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung werden 3 kg (gerechnet als freie Säure) Calcium-cis-epoxysuccinat zugesetzt, worauf weitere 48 Stunden kultiviert wird. Etwa 30 l des erhaltenen Kulturmediums werden mit einer Filterpresse filtriert. Der erhaltene feste Anteil wird mit Wasser gewaschen.
Das Zentrifugieren und Waschen werden wiederholt, worauf die erhaltenen festen Anteile gut verrieben und getrocknet werden. Nach Abschluß aller vorstehend beschriebenen Arbeitsgänge wird kristallines Calcium-L(+)-tartrat in einer Menge von 4,2 kg (gerechnet als Anhydrid; Reinheit 99%) erhalten. (Bei Berechnung nach der in Beispiel 1 (A) beschriebenen Methode beträgt die Ausbeute 93%.)
Als Vergleich zu dem vorstehenden Beispiel wird ein weiterer Versuch durchgeführt, bei dem der Stamm KB-111 verwendet wird. Bei diesem Versuch wird die Kultivierung unter den gleichen Bedingungen wie im vorstehenden Beispiel mit Ausnahme des verwendeten Materials durchgeführt. An Stelle von Calcium-cis-epoxysuccinat wird die gleiche molare Menge Dinatrium-cis-epoxysuccinat verwendet. Etwa 30 l des erhaltenen Kulturmediums werden mit einer Filterpresse filtriert. Unter gutem Rühren werden 3,5 kg kristallines Calciumchlorid (Dihydrat) portionsweise zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird mit der Filterpresse abfiltriert, wobei 5,8 kg feste Substanz erhalten wird. Am Dünnschichtchromatogramm dieser festen Substanz ist die restliche cis-Epoxybernsteinsäure festzustellen. (Dünnschicht: feine kristalline Cellulosefolie, Lösungsmittel: Isopropyläther-Tetrahydrofuran-Ameisensäure-Wasser (10 : 10 : 5 : 4); entwickelt mit Bromkresolgrün.) Auf der Grundlage dieser Bestimmungen wird der Gehalt an L(+)- Weinsäure nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, d. h. nach der Methode der optischen Drehung, bestimmt. Hierbei wird festgestellt, daß die Menge der gebildeten L(+)-Weinsäure 1,3 kg als wasserfreies Calciumsalz beträgt. (Bei Berechnung nach der in Beispiel 1 (A) beschriebenen Methode beträgt die Ausbeute 30%.)

Beispiel 3

Mit einem Stamm von Acinetobacter tartarogenes KB-112 werden je 500 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in zwei 2 l-Sakaguchikolben enthalten ist und 0,6% Calcium-cis-epoxysuccinat, 0,2% Casaminosäure, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Dieses Gemisch wird 30 Stunden in hin- und hergehender Schüttelkultur bei 30°C bebrütet, wobei 1 l Kulturmedium erhalten wird. Dieses Kulturmedium wird in einen 50 l- Tank überführt, der 30 l eines flüssigen Nährmediums enthält, das 0,1% Casaminosäure, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calcium- cis-epoxysuccinat in einer als freie Säure gerechneten Menge von 9 kg zugesetzt. Nach der Zugabe des Succinats wird die Kultivierung unter Belüftung und Rühren 3 Tage bei 30°C durchgeführt. Während der gesamten Kultivierungsdauer werden etwa 20 g Schaumverhütungsmittel portionsweise zugesetzt. Etwa 38 l des erhaltenen Kulturmediums werden mit der Filterpresse filtriert. Der feste Anteile wird gewaschen, in 40 l Wasser suspendiert und gut gerührt. Das Gemisch wird stehen gelassen, wobei der feste Anteil sich absetzt. Nachdem etwa 25 l Überstand verworfen worden sind, werden erneut 25 l Wasser zugesetzt, worauf geführt wird. Das Gemisch wird mit der Filterpresse filtriert. Die hierbei erhaltene feste Substanz wird zerkleinert, verrieben und getrocknet. Hierbei werden 11,9 kg (=91%) kristallines Calcium-L(+)-tartrat erhalten (gerechnet als Anhydrid; Reinheit 98%).

Beispiel 4

Mit einem Stamm von Rhizobium validum KB 97 werden 500 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in einem 2 l- Sakaguchikolben enthalten ist und 0,5% Hefeextrakt und 0,5% Glucose enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Das Kulturmedium wird in hin- und hergehender Schüttelkultur 24 Stunden bei 30°C bebrütet. Das erhaltene Kulturmedium wird in einen 50 l-Tank überführt, der 30 l eines flüssigen Nährmediums enthält, das 0,2% Maisquellwasser, 0,6% Calcium-cis-epoxysuccinat, 0,6% Ammoniumsulfat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,03% Magnesiumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Der Inhalt des Tanks wird 40 Stunden bei 30°C unter Belüftung und Rühren kultiviert, wobei etwa 30 l Kulturmedium erhalten werden. Eine Menge von 15 l dieses Kulturmediums wird in einen 200 l-Tank überführt, der 100 l eines flüssigen Kulturmediums enthält, das 0,05% Maisquellwasser, 1,0% Ammoniumsulfat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisen(II)-sulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calcium-cis-epoxysuccinat in einer Menge, die 10 kg der freien Säure entspricht, zugesetzt. Nach der Zugabe des Succinats wird der Inhalt des Tanks unter Belüften und Rühren bei 30°C bebrütet, während etwa 50 g Schaumverhütungsmittel zugesetzt werden. Die Kultivierung unter Belüften und Rühren wird 5 Tage durchgeführt. Am 1. Tag und am 3. Tag werden je 20 kg (gerechnet als freie Säure) Calcium-cis-epoxysuccinat zugesetzt. Etwa 150 l des hierbei erhaltenen Kulturmediums werden mit der Filterpresse filtriert. Der feste Anteil wird gewaschen und in 150 l Wasser suspendiert. Nach gutem Rühren läßt man den festen Anteil absitzen. Etwa 70 l des Überstandes über dem Sediment werden verworfen, worauf erneut 70 l Wasser zugesetzt werden, worauf gut gerührt und mit der Filterpresse filtriert wird. Die Endausbeute an kristallinem Calcium-L(+)-tartrat beträgt 64,8 kg (=90%) (gerechnet als Anhydrid; Reinheit 99%).

Beispiel 5

Ein Stamm von Acinetobacter tartarogenes KB-99 wird in 30 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist und 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikalumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 1,8% Calciumchlorid (Dihydrat) enthält und einen pH-Wert von 7,2 hat. In jedem Fall wird eine Impfnadelmenge des Stamms zugesetzt. Gleichzeitig wird das Natriumsalz (A) bzw. das Kaliumsalz (B) von cis-Epoxybernsteinsäure in einer Menge zugesetzt, die jeweils 1,5 g der freien Säure entspricht. Das Gemisch wird 2 Tage der rotierenden Schüttelkultur bei 30°C unterworfen. Mit einem Teil dieses Kulturmediums wird eine andere Kultivierung unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch 1) ein modifiziertes Nährmedium verwendet wird, das die gleiche Zusammensetzung wie das oben genannte Nährmedium hat, jedoch kein Calciumchlorid enthält, und 2) nach dem Impfen mit dem Stamm KB-99 in einer Impfnadelmenge das Calciumsalz (C) von cis-Epoxybernsteinsäure in einer Menge, die 1,5 g der freien Säure entspricht, zugesetzt wird. Das hierbei erhaltene Kulturmedium wird auf dem Glasfilter filtriert und dann mit Wasser gespült. Hierbei wird kristallines L(+)-Tartrat erhalten. Die aus den Kulturmedien A, B und C erhaltene, als Anhydrid gerechnete Menge von Calcium- L(+)-tartrat beträgt 1,7, 1,8, bzw. 1,9 g (=80, 84, 89%). Die Reinheit beträgt in allen Fällen 97-99%. Dieses Ergebnis zeigt eindeutig, daß auch das Natriumsalz oder Kaliumsalz von Epoxybernsteinsäure als Ausgangsmaterial verwendet werden kann, vorausgesetzt, daß im Kulturmedium das Calciumion in einer der cis-Epoxybernsteinsäure äquivalenten Menge vorhanden ist, und daß dieses Ausgangsmaterial leicht mit dem Ion unter Bildung des Calciumsalzes von cis-Epoxybernsteinsäure reagiert. Hierbei wird somit fast das gleiche Ergebnis erzielt, als wenn das Calciumsalz von vornherein zugesetzt wird.

Beispiel 6

Ein Stamm von Acinetobacter tartarogenes KB-112 wird in 30 ml eines Nährmediums geimpft, das in einem 200 ml- Erlenmeyerkolben enthalten ist. Diesem Grundnährmedium, das 0,05% Casaminosäure, 0,1% Ammoniumnitrat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisen(II)-sulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat, werden verschiedene nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen in einer Konzentration von 0,1% zugesetzt. Gleichzeitig wird kristallines Calcium-cis-epoxysuccinat so zugesetzt, daß seine als freie Säure gerechnete Endkonzentration 40% beträgt. Das Gemisch wird 2 Tage der rotierenden Schüttelkultur bei 30°C unterworfen und dann der Reaktion überlassen. Nach Beendigung der Reaktion wird die Flüssigkeit filtriert. Die vom Filtrat erhaltenen Kristalle werden in Schwefelsäure gelöst. Die gelösten Kristalle werden dann zur Entfernung der festen Substanzen zentrifugiert. Anschließend wird L(+)-Weinsäure auf der Grundlage der optischen Drehung bei 436 µm und die restliche cis-Epoxybernsteinsäure nach der Methode von Payne und Williams (Journal of Organic Chemistry 24 [1959] 54) quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse der Bestimmungen sind nachstehend in Tabelle 1 genannt. Tabelle 1 &udf53;ta5,6:17,6:25,6:33,6&udf54;&udf53;tz5,5&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg8&udf54;\Oberfl¿chenaktive Verbindung*)\ Ausbeute an&udf50;L(+)-Weins¿ure,&udf50;Mol-%**)\ Restliche cis-&udf50;Epoxybernsteins¿ure,&udf50;%***)&udf53;tz5,10&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg9&udf54;\Sorbitanmonooleat\ 45\ 52&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylensorbitanmonooleat\ 72\ 25&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylensorbithexastearat\ 50\ 48&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylenstearat\ 47\ 50&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylen-cetylalkohol¿ther\ 52\ 43&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylen-nonylphenol¿ther\ 55\ 40&udf53;tz&udf54; \Glycerylmonostearat\ 48\ 47&udf53;tz&udf54; \Propylenglykolmonostearat\ 46\ 50&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylen-Lanolin-Derivat\ 75\ 21&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylen-Lanolin-Alkohol-&udf50;Derivat\ 74\ 21&udf53;tz&udf54; \Derivat von Polyoxy¿thylen und&udf50;geh¿rtetem RizinusÐl\ 73\ 23&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylen-Nonylphenol-&udf50;Formaldehydharz\ 73\ 21&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylen-tetrahydro-&udf50;furfurylalkohol\ 54\ 42&udf53;tz&udf54; \Polyoxy¿thylenoxypropylen-&udf50;stearat\ 70\ 26&udf53;tz&udf54; \»thylendiamin-polyoxypropylen-&udf50;oxy¿thylentetraol\ 52\ 45&udf53;tz&udf54; \Kein Zusatz\ 34\ 64&udf53;tz5&udf54; &udf53;te&udf54;&udf53;sg8&udf54;Æ**)@1Ein Wert von 100% stellt den Fall dar, in dem die°ecis-Epoxybernsteins¿ure vollst¿ndig zu L(+)-Weins¿ure°eumgesetzt worden ist.&udf50;@0***)@1Rest der zugesetzten cis-Epoxybernsteins¿ure in den°eKristallen. Hierbei stellt 100% den Wert in dem Fall°edar, in dem 12¤g als freie S¿ure zurÝckbleiben.&udf50;@0&udf53;sb37,6&udf54;&udf53;el1,6&udf54;&udf53;sg9&udf54;

Beispiel 7

Stämme von Acinetobacter tartarogenes KB-82, Pseudomonas species KB-86, Agrobacterium aureum KB-91, Acinetobacter tartarogenes KB-99, Agrobacterium viscosum KB-105 und Rhizobium validum KB-106 werden jeweils in 50 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in 200 ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist und 0,2% Maisquellwasser, 0,1% Glucose, 0,1% Ammoniumnitrat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 Magnesiumsulfat und 0,001% Eisen(II)-sulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calcium-cis-epoxysuccinat so zugesetzt, daß seine Endkonzentration 30% als freie Säure beträgt. Auf diese Weise wird die Kultivierung eingeleitet. Die in Tabelle 2 genannten oberflächenaktiven Verbindungen werden zu geeigneten Zeitpunkten zugesetzt. Das Gemisch wird 42 Stunden der Schüttelkultur bei 30°C unterworfen. Die Ergebnisse der Kultivierung zeigen, daß bei allen Stämmen die Ausbeuten an L(+)=Weinsäure höher sind als bei den Versuchen, bei denen die Kultivierung ohne Zusatz einer oberflächenaktiven Verbindung durchgeführt wurde. Tabelle 2 &udf53;ta1,6:13,6:29,6:33,6:37,6&udf54;&udf53;tz5,5&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg8&udf54;\Mikroorganismus\ Tensid und Konzentration, %\ Zeitpunkt&udf50;der Zugabe\ Ausbeute&udf50;an L(+)-&udf50;Weins¿ure,&udf50;%**)&udf53;tz5,10&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg9&udf54;\Acinetobacter tartarogenes\ Polyoxy¿thylensorbitanmonolaurat (0,2)\ Æ0\ 83&udf53;tz&udf54; \KB-82\ ohne Zusatz\ ^\ 59&udf53;tz&udf54; \Pseudomonas species\ Polyoxy¿thylenoleyl¿ther (0,05)\ Æ0\ 47&udf53;tz&udf54; \KB-86\ ohne Zusatz\ ^\ 31&udf53;tz&udf54; \Agrobacterium aureum\ Poly¿thylenglykolmonolaurat (0,1)\ 12\ 65&udf53;tz&udf54; \KB-91\ ohne Zusatz\ ^\ 50&udf53;tz&udf54; \Acinetobacter tartarogenes\ Polyoxy¿thylen-Octylphenol-&udf50;formaldehydharz (0,1)\ 18\ 89&udf53;tz&udf54; \KB-99\ ohne Zusatz\ ^\ 77&udf53;tz&udf54; \Agrobacterium viscosum\ Polyoxy¿thylen-RizinusÐl-Derivat (0,05)\ Æ0\ 59&udf53;tz&udf54; \KB-105***)\ ohne Zusatz\ ^\ 48&udf53;tz&udf54; \Rhizobium validum\ Polyoxy¿thylenoxy-propylenpolyol (0,15)\ Æ0\ 92&udf53;tz&udf54; \KB-106\ ohne Zusatz\ ^\ 85&udf53;tz5&udf54; &udf53;te&udf54;&udf53;sg8&udf54;Æ**@1Die Ausbeute an L(+)-Weins¿ure in Mol.-% wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode bestimmt.&udf50;@0***)@1Bei der Kultivierung dieses Stammes wurden 100¤Óg/ml Pyridoxalhydrochlorid dem Kulturmedium zugesetzt.&udf50;@0&udf53;sb37,6&udf54;&udf53;el1,6&udf54;&udf53;sg9&udf54;

Beispiel 8

Ein Stamm von Rhizobium validum KB-97 wird zusammen mit einem Stamm von Acinetobacter tartarogenes KB-111 in jeweils 500 ml eines Nährmediums geimpft, das in 2 l-Sakaguchikolben enthalten war, das aus dem in Beispiel 1 genannten Grundnährmedium und einem zugesetzten Tensid besteht. Gleichzeitig wird Calcium-cis- epoxysuccinat dem Kulturmedium so zugesetzt, daß seine als freie Säure gerechnete Endkonzentration 50% beträgt. Anschließend wird das Gemisch in hin- und hergehender Schüttelkultur bei 28°C bebrütet. Die als Rückstand im Kulturmedium verbleibende Menge der cis-Epoxybernsteinsäure wird durch Dünnschichtchromatographie verfolgt (Dünnschicht: feinkristalline Cellulosefolie Lösungsmittel: Isopropyläther-Tetrahydrofuran-Ameisensäure- Wasser (10 : 10 : 5 : 4); Farbentwicklung: Bromkresolgrün). Anschließend wird die Kultivierung fortgesetzt, bis die cis-Epoxybernsteinsäure verschwunden ist. Die während der Umwandlungsreaktion bis zum Endpunkt der verstrichene Zeit sowie die Ausbeute an L(+)-Weinsäure (in Mol.-%, ermittelt nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode) sind in Tabelle 3 genannt, aus der die Verkürzung der Reaktionsdauer und die Steigerung der Ausbeute ersichtlich sind. Tabelle 3 &udf53;ta1,6:9:16,6:24:31,6:37,6:9:12,6:16,6:20:24:27,6:31,6:34,6:37,6&udf54;&udf53;tz5,5&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg8&udf54;\Mikroorganismus\ Polyoxy¿thylen-&udf50;sobitanmonooleat&udf50;(0,15%)&udf50;¸\ Polyoxy¿thylen-&udf50;alkylphenol¿ther&udf50;(0,1%)&udf50;¸\ Derivat von&udf50;Polyoxy¿thylen und&udf50;geh¿rtetem RizinusÐl&udf50;(0,2%)\ Kein Zusatz&udf50;¸&udf50;¸&udf50;¸\ Zeit&udf50;(Std.)\ Ausbeute&udf50;(%)\ Zeit&udf50;(Std.)\ Ausbeute&udf50;(%)\ Zeit&udf50;(Std.)\ Ausbeute&udf50;(%)\ Zeit&udf50;(Std.)\ Ausbeute&udf50;(%)&udf53;tz5,10&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg9&udf54;&udf53;ta1,6:9:12,6:16,6:20:24:27,6:31,6:34,6:37,6&udf54;\Rhizobium&udf50;validum&udf50;KB-97\ 84\ 89\ 96\ 89\ 78\ 92\ 108\ 85&udf53;tz&udf54; \Acinetobacter&udf50;tartarogenes&udf50;KB-111\ 84\ 90\ 108\ 85\ 90\ 87\ 120\ 83&udf53;tz&udf54; &udf53;te&udf54;&udf53;sb37,6&udf54;&udf53;el1,6&udf54;

Beispiel 9

Ein Stamm von Rhizobium validum KB-97 wird in 500 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in zwei 2 l- Sakaguchikolben enthalten ist und 0,5% Glucose und 1,0% Maisquellwasser enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Der Inhalt der beiden Kolben wird 24 Stunden bei 28°C in hin- und hergehender Schüttelkultur bebrütet, wobei etwa 1 l Kulturmedium erhalten wird. Dieses Kulturmedium wird in einen 50 l-Tank überführt, der 30 l eines flüssigen Nährmediums enthält, das 0,2% Maisquellwasser, 0,1% Ammoniumnitrat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und 0,1% Polyoxyäthylen-Lanolin-Derivat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calcium- cis-epoxysuccinat in einer als freie Säure gerechneten Menge von 6 kg zugesetzt. Das Gemisch wird bei 30°C bebrütet. Nach 19 Stunden vom Beginn der Kultivierung werden weitere 6 kg Calcium-cis-epoxysuccinat (gerechnet als freie Säure) zugesetzt und weiter bebrütet, bis insgesamt 48 Stunden vom Beginn der Kultivierung vergangen sind. Das erhaltene Kulturmedium wird wie folgt aufgearbeitet: 40 l Kulturmedium werden mit der Filterpresse filtriert. Der feste Anteil wird mit Wasser gespült und in 30 l Wasser suspendiert. Die Suspension wird gut gerührt und dann zum Absitzen der festen Bestandteile stehen gelassen. 20 l Überstand werden verworfen. Nach Zusatz von 20 l Wasser wird die Suspension gut gerührt und dann mit der Filterpresse filtriert, wobei 15,9 kg (=91%) kristallines Calcium-L(+)-tartrat (gerechnet als Anhydrid) mit einer Reinheit von 98% erhalten werden.
In einem Vergleichsversuch wird der gleiche Stamm KB-97 verwendet. Die Kultivierung und Reaktion werden unter den gleichen, vorstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt mit dem einzigen Unterschied, daß kein oberflächenaktives Mittel dem Nährmedium zugesetzt wird. Etwa 40 l des erhaltenen Kulturmediums werden in der oben beschriebenen Weise gereinigt. Die Prüfung durch Dünnschichtchromatographie (durchgeführt auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise) bestätigt, daß restliches Calcium- cis-epoxysuccinat im Kulturmedium vorhanden ist. Die quantitative Bestimmung der L(+)-Weinsäure auf die in Beispiel 6 beschriebene Weise ergibt, daß die Ausbeute an Calcium-L(+)-tartrat 12,3 kg (=71%) (als Anhydrid) beträgt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-(+)-Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von Calcium-cis-epoxysuccinat in einem flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Acinetobacter tartarogenes IFO 13644, Acinetobacter tartarogenes IFO 13650, Acinetobacter tartarogenes IFO 13656, Acinetobacter tartarogenes IFO 13657, Agrobacterium aureum IFO 13647, Agrobacterium viscosum IFO 13652, Rhizobium validum IFO 13648, Rhizobium validum IFO 13653 oder Pseudomonas species IFO 13645 einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kulturmedium eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung zusetzt.