DE2640451A1

DE2640451A1 - Verfahren und vorrichtung zur zuechtung, haltung und befoerderung lebender organismen

Info

Publication number: DE2640451A1
Application number: DE19762640451
Authority: DE
Inventors: Jaroslav Kalal; Artur Stoy; Vladimir Dipl Ing Stoy; Jiri Dipl Ing Sulc
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1975-09-19
Filing date: 1976-09-08
Publication date: 1977-03-31
Also published as: CS183856B1; IT1068313B; JPS5238397A; FR2324365B3; GB1530705A; FR2324365A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Züchtung, Haltung und Beförderung von lebendigen Organismen beliebiger Art wie Mikroben, Pflanzen, Tieren und Menschen in einem Medium, das die hauptsächlichen Lebensvorgänge ermöglicht, jedoch von anderen, in der äußeren Umgebung anwesenden Organismen getrennt ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Züchtung, Haltung und Beförderung lebender Organismen anzugeben, nach denen die lebenden Organismen durch eine Trennwand von der äußeren Umgebung getrennt

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sind, die zwar für alle zur Aufrechterhaltung der Lebensvorgänge zu- und abzuführenden Stoffe durchlässig, für Mikroorganismen, Viren, Sporen und andere auszuschließenden Organismen jedoch undurchlässig ist.

Der Ausdruck "Vorrichtung" bedeutet hier sehr verschiedene Einrichtungen, von einfachen Säcken oder Behältern beispielsweise zur Züchtung von Fischen und anderen Wasserlebewesen bis hin zu Senkkästen und unterseeischen Laboratorien, Taucheranzügen oder Taucherglocken, bei denen Sauerstoff von außen her zugeführt und Kohlendioxid und andere Nebenprodukte der Lebensprozesse nach außen abgeführt werden. Unter dieser Bezeichnung sind ferner auch biologische Reaktoren zur Haltung und Züchtung von Mikroorganismen wie Schimmelpilzen, Bakterien, Streptomyceten, Saccharomyceten, von Pilzen, Algen und anderen Pflanzen, ferner Inkubatoren, Brutkammern, Vorrichtungen zur Züchtung von Zellen und Gewebekulturen, zur Züchtung und Haltung von Versuchstieren und Versuchspflanzen unter sterilen Bedingungen oder auch Vorrichtungen verstanden, die zur Haltung oder Züchtung von mit Infektionskrankheiten befallenen Organismen und ihrem Transport in Laboratorien oder Krankenhäuser, ferner zur dauernden Haltung von reinen Mikroorganismenstämmen wie Reinkulturen zu industriellen oder wissenschaftlichen Zwecken oder etwa zur Befruchtung von Fischrogen und weiteren Züchtung der Brut dienen, ferner Blutoxygenatoren, Respiratoren o. dgl.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß lebende Organismen durch eine Membran oder Trennwand von der äußeren Umgebung getrennt gehalten werden, die aus einem in Wasser gequollenen MuItiblock-Copolymer.von Acrylnitril mit Acrylamid und/oder Acrylsäure besteht, das nachweisbare, nicht abtrennbare Polyacrylnitrilbereiche enthält und im in Wasser gequollenen Zustand für Gase, Ionen und niedermolekulare ge-

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löste Stoffe durchlässig, jedoch für Viren, Mikroorganismen und Sporen undurchlässig ist, wobei gasförmige oder flüssige Stoffe wie insbesondere Sauerstoff durch die Membran oder Trennwand eintreten und zugleich die Stoffwechselprodukte durch sie hindurch abgeleitet werden.

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen besitzen das gemeinsame Merkmal, daß das Innere, in dem die Organismen leben, von der äußeren Umgebung durch eine Membran bzw. eine Trennwand getrennt ist, die aus einem in Wasser gequollenen Multiblock-Copolymer von Acrylnitril mit Acrylamid und/oder Acrylsäure besteht, das deutliche, jedoch nicht abtrennbare PoIyacrylnitrilbereiche enthält und im in Wasser gequollenen Zustand für Gase, Ionen und niedermolekulare gelöste Stoffe durchlässig, jedoch für Viren, Mikroben und deren Sporen undurchlässig ist. Von außen treten durch die Trennwand bzw. Membran gasförmige oder flüssige Stoffe, insbesondere Sauerstoff in die Vorrichtung ein, wobei unerwünschte wie auch erwünschte Metabolite gleichzeitig durch dieselbe Membran abgeleitet und verworfen oder isoliert und ausgenutzt werden können,

Auf diese Weise werden die zum Leben und gegebenenfalls zur Weiterzüchtung der Organismen nötigen Bedingungen gesichert, wobei jede Kontamination bzw. z. B. jeder Befall durch schädliche Mikroorganismen von außen ausgeschlossen wird.

Der Ausdruck 'in Wasser gequollene Membran' bzw. 'in Wasser gequollenes Copolymer' bedeutet, daß die Membran oder Trennwand mindestens von einer Seite mit einem genügend feuchten Medium wie z. B. mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung oder einer mit Wasserdampf derart gesättigten Gasphase in Berührung steht, daß eine Verdampfung von Wasser aus der Mem-

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bran unmöglich ist.

Es wurde versucht, die erfindungsgemäße Aufgabe mit anderen Mitteln, insbesondere mit Folien aus Silikongummi, zu lösen. Die Ergebnisse waren jedoch nicht ganz befriedigend, obgleich Silikongummi für Gase wie z. B. Sauerstoff und Kohlendioxid gut durchlässig ist. Das Material ist jedoch hydrophob und wasserabweisend, so daß es für Ionen und in Wasser gelöste Stoffe undurchlässig ist. Aus diesem Grund kann das Leben beispielsweise in derartigen Vorrichtungen gehaltener Versuchstiere nur dann aufrechterhalten bzw. verlängert werden, wenn eine ziemlich komplizierte Dialysevorrichtung vorgesehen wird, die unerwünschte, schädliche Metabolite entfernt.

Inkubatoren, Taucheranzüge usw. beruhen auf anderen Prinzipien und sind trotz zahlreicher Vervollkommnungen für viele Zwecke noch immer ungeeignet: Die Aufrechterhaltung von sterilen Bedingungen ist schwierig, die notwendigen Pumpen und Filter erfordern verhältnismäßig viel Energie, und die Automatisierung ist problematisch. Die ungenügende Entfernung von Metaboliten verkürzt nicht nur die Lebensdauer der Organismen, sondern vermindert auch die Ausbeute an erwünschten Stoffwechselprodukten.

Die Erfindung vermeidet diese Nachteile und ermöglicht darüber hinaus zahlreiche weitere Anwendungen, die mit den bisher angegebenen Mitteln nicht zugänglich sind.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht im wesentlichen aus einer in Wasser gequollenen Membran aus einem hydrophilen Multiblock-Copolymer von Acrylnitril mit Acrylamid und/oder Acrylsäure, das ggfs. bis zu 15 mol-# andere Monomereinheiten

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enthalten kann. Multiblock-Copolymere dieser Art zeigen bei der Röntgenanalyse typische Reflexe des Polyacrylnitrile mit einer interplanaren Periodizität von 5,1 R und sind in wassergequollenem Zustand für Gase, insbesondere wasserlösliche Gase wie z. B. Sauerstoff und Kohlendioxid, leicht permeabel. Sie sind ferner auch für Ionen sowie zahlreiche wasserlösliche Stoffe durchlässig, nicht jedoch für Organismen wie Viren, Bakterien und Sporen oder andere Materialien vergleichbarer Größe.

Die in Wasser gequollene Membran trennt den Innenraum, in dem sich die lebenden Organismen befinden, von der äußeren Umgebung (Luft oder Wasser). Die Membran kann dabei auf beliebige Weise verstärkt werden, z. B. mit Pasern, Geweben, Netzen, Gewirken, Geflechten, Draht, Polymerfäden oder Saiten oder etwa mit Versteifungen aus gepreßtem oder gestanztem Metall oder Kunststoffen u. dgl.. Wegen der Elastizität der Membran ist es vorteilhaft, eine ebenfalls elastische Versteifung zu verwenden.

Die mechanischen Eigenschaften sowie die Quellungskapazität und Durchlässigkeit hängen vom Verhältnis zwischen der nichtquellenden Polyacrylnitrxlphase und der quellenden PoIyacrylamidphase ab. Erfindungsgemäß können Produkte mit Quellüngskapazitäten zwischen 15 und 98 % Wasser verwendet werden, im Hinblick auf die wünschenswerte Festigkeit und Elastizität sind Copolymere mit einem Quellungsvermögen zwischen etwa 40 und 85 Gew.-SS Wasser bevorzugt. Derartige Hydrogele besitzen ferner die sehr wichtige Eigenschaft, daß sie sich durch Strecken biaxial orientieren lassen. Diese Orientierung ist teilweise permanent und teilweise reversibel (elastisch): In beiden Fällen wird die Festigkeit erhöht und die Dicke vermindert.

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Zumindest ein Teil der Nährstoffe, insbesondere feste oder hochmolekulare Stoffe wie z. B. Stärke oder Amylose können separat durch eine gut abgedichtete Rohrleitung in den Innenraum eingeführt werden, die daneben auch zum Reinigen oder Spülen des Innenraums benutzt werden kann. Die Vorrichtung kann ferner auch mit einer gut abgedichteten Klappe versehen werden, um feste Abfälle oder tote Organismen beseitigen zu können.

Der Hauptvorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung liegt darin, daß die Membran alle oder nahezu alle Aufgaben erfüllt, die zum Leben der darin gezüchteten oder gehaltenen Organismen notwendig sind. Eine separate Dialysevorrichtung kann daher eingespart werden. Die gleiche Wirkung kann mit anderen, bekannten hydrophilen Polymeren nicht erzielt werden, da diese entweder genügend fest, aber nicht genügend durchlässig sind, oder umgekehrt ausreichende Permeabilität, jedoch keine ausreichende Festigkeit besitzen. Die Durchlässigkeit von festen Polymeren wie z. B. regenerierter Cellulose ist für derartige Zwecke zu niedrig.

Die hydrophilen Multiblock-Copolymeren besitzen eine besonders hohe Berst- und Einreißfestigkeit bei einer günstigen Quellbarkeit und Durchlässigkeit für Gase und niedermolekulare gelöste Stoffe, so daß sie zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe besonders geeignet sind. Je höher das Quellungsvermögen in Wasser,desto größere Moleküle diffundieren durch die Membran mit genügender Geschwindigkeit hindurch.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist in Bezug auf die darin gehaltenen Organismen ein geschlossenes System, hinsichtlich des Metabolismus und Stoffwechsels jedoch ein offenes System. Erfindungsgemäß wird so ein rascher Konzentrations-

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ausgleich von Gasen und gelösten Stoffen auf beiden Seiten der Membran ermöglicht. Dadurch kann jede für die darin befindlichen Organismen schädliche Anhäufung von Metaboliten vermieden werden.

Die effektive Permeabilität der Membran für molekularen Sauerstoff ist überraschend hoch und erheblich höher, als aufgrund der Tatsache erwartet werden konnte, daß Sauerstoff in solchen Membranen durch Wasser transportiert wird und der entsprechende Diffusionskoeffizient von Silikongummi für Sauerstoff etwa 20mal höher ist als der von reinem Wasser. Eine wahrscheinliche Erklärung hierfür ist, daß der Transport von Sauerstoff durch die Membran nicht direkt durch Diffusion, sondern vielmehr durch den übergang aus einer Phase in die andere bestimmt wird. Im Fall einer Membran aus Silikongummi bestehen zwei solche übergänge und Transferkoeffizienten - Gas/Polymer und Polymer/Wasser -, wogegen bei einer in Wasser gequollenen Membran nur ein einziger übergang Gas/Wasser vorliegt. Das Polymer vermindert nur die Diffusionsund Konvektionsgeschwindigkeit in der Nähe der Grenzflächen, die Diffusion und Konvektion stellen jedoch nicht immer die bestimmenden Schritte des Stoffübergangs dar. Eine analoge Erklärung gilt offensichtlich auch für den Fall, wenn die hohe Sauerstoffdiffusion bei Silikongummi viel mehr durch die Porosität als durch hohe Löslichkeit des Gases im Gummi verursacht wird. Der Diffusionskoeffizient von Sauerstoff in der hydrophilen Membran nähert sich dem für reines Wasser, sobald der Wassergehalt in der Membran etwa 60 Gew.-% übersteigt.

Die Hauptnachteile von Silikongummimembranen, die sonst in Blutoxygenatoren und ähnlichen Einrichtungen verwendet werden, sind der Mangel an Hydrophilie sowie die verhältnismäßig geringe Festigkeit. Diese Eigenschaften erfordern einen ge-

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trennten Dialysator.

Zum Stande der Technik gehören Beutel aus Celluloseacetat, die zur Züchtung von Mikrobenkulturen im Handel sind und in einen Überschuß von Nährlösungen getaucht werden, die gegebenenfalls im Kreislauf geführt werden können. Infolge der niedrigen Festigkeit und verhältnismäßig geringen Durchlässigkeit solcher Membranen kann dieses Verfahren jedoch nur zu einer speziellen Kultivierung von Mikroben im Labor benutzt werden.

Die erfindungsgemäß geeigneten Membranen können aus Lösungen der betreffenden Multiblock-Copolymeren nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, z. E. durch Gießen auf eine feste oder bewegliche Unterlage unter gleichzeitiger Koagulierung in Wasser oder durch Auspressen durch einen geraden oder kreisförmigen Schlitz in ein Koagulationsbad, wobei durch die kreisförmige Düse ein Gas oder eine koagulierende Flüssigkeit eingeleitet wird. Die dazu geeigneten Multiblock-Copolymeren enthalten etwa 2 bis etwa 85 % nichthydrolysierte Acrylnitrileinheiten, vorzugsweise 20 bis 60 %₃ wobei der Rest aus Acrylamid-und/oder Acrylsäure-Einheiten besteht; dabei können die Säuregruppen entweder frei vorliegen oder neutralisiert sein. Das Verhältnis zwischen den Acrylamid- und den Acrylsäure-Einheiten kann je nach dem angewandten Verfahren zur partiellen Hydrolyse variieren und ist erfindungsgemäß nicht entscheidend. Andere Arten von Einheiten können in einer Menge bis zu 15 mol-# vorkommen und werden entweder aus vor der Copolymerisation zugesetzten Comonomeren oder durch Nebenreaktionen gebildet.

Die im Verlauf der partiellen Hydrolyse auftretenden Nebenreaktionen führen z. B. zu Diacrylimid- oder Tetrahydronaphthyridineinheiten. Die partielle Hydrolyse kann entweder in saurem oder

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alkalischem homogenen Medium verlaufen.

Als Comonomere kommen verschiedene mit Acrylnitril copolymerisierbare Monomere in Betracht wie z. B. Styrol, Vinylchlorid, Vinylacetat, Maleinsäureanhydrid, Acryl- oder Methacrylsäure sowie deren Ester und Amide, wasserlösliche Salze der Äthylen- oder Styrolsulfonsäure, Vinylpyridine, Vinylpyrrolidon, Hydroxyalkylacrylate und -methacrylate, Vinylcarbazol u.a. Der Anteil dieser Comonomeren darf etwa 15 mol-% nicht übersteigen, um den Multiblockcharakter der Produkte aufrechtzuerhalten. Die Comonomeren werden in erster Linie zur Beeinflussung der Verarbeitbarkeit der Hydrogele bzw. der partiellen Hydrolyse zugesetzt. Ihr Einfluß auf die maßgebenden Eigenschaften der Membran ist weniger bedeutend und oft sogar ungünstig, da die erwünschten Eigenschaften durch die Multiblock-Struktur und die Anwesenheit von physikalisch vernetzenden Polyacrylnitrilbereichen bedingt sind.

Die Polyacrylnitrilphase läßt sich durch die übliche Röntgenanalyse oder durch Röntgenkleinwinkelstreuung vermessen. Weitere wichtige Merkmale sind insbesondere ein günstiges Verhältnis zwischen Quellungsvermögen und Festigkeit, wobei das Quellungsvermögen im Gleichgewicht mit Wasser vorteilhaft etwa 40 bis 85 Gew.-% Wasser im Gel beträgt. Die gequollenen Hydrogele dieser Art besitzen eine hohe Summe von permanenter und elastischer Deformation, nämlich I50 bis 2000 % der Ruhelänge beim Strecken. Die permanente Deformation überwiegt bei niedrigeren Hydrolysegraden, d. h. bei einem Gehalt an nichthydrolysierten Acrylnitrileinheiten zwischen etwa 65 und 85 mol-%. Bei höheren Hydrolysegraden und besonders unter 25 % Acrylnitrileinheiten tritt die elastische Dehnbarkeit in den Vordergrund - solche Hydrogele sind gummiartig. Zwischen etwa 25 und 65 mol-# Acrylnitrileinheiten können die Hydrogele stets wenigstens teilweise

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permanent orientiert werden, wobei die biaxial orientierte Membran immer noch eine bedeutende Elastizität beibehält.

Die durch biaxiale oder multiaxiale Streckung hervorgerufene molekulare Orientierung ist von Vorteil, da sie die mechanischen Eigenschaften erheblich verbessert. Die Orientierung ist besonders bei Temperaturen über 50 ⁰C leicht durchführbar, vorteilhaft zwischen 70 und 100 ⁰C. Die Hydrogele aus Multiblock-Copolymeren des Acrylnitrils mit Acrylamid, die gleichzeitig elastische und permanente Orientierung aufweisen, sind erfindungsgemäß besonders geeignet. Die Orientierung erhöht die Festigkeit und vermindert die Dicke, wodurch die Permeabilität erhöht wird. Die permanente Orientierung ist für die Festigkeit und Dicke der Membran grundsätzlich maßgebend, die zusätzliche elastische Orientierung verbessert diese Parameter weiterhin und kann gegebenenfalls zu einer bestimmten Autoregulation der Permeabilität dienen: Wird z. B. die Konzentrationsdifferenz von Gasen oder Ionen auf beiden Seiten der Membrane erhöht, wobei der Gasdruck und/oder der osmotische Druck geändert wird, wird die Membrane entsprechend elastisch deformiert.

Beim Ansteigrn des inneren Drucks wird die Membran dünner, so daß sie mehr Moleküle bzw. Ionen durchläßt, bis Druckausgleich zwischen beiden Seiten eingetreten ist, umgekehrt wird die Membrandicke bei relativer Erhöhung des äußeren Drucks erhöht und die Permeabilität herabgesetzt, bis Druckausgleich eintritt. Diese Prozesse können immer stattfinden, da sich die Membran üblicherweise im Zustand einer teilweisen elastischen Deformation befindet.

Die Dicke der Membran kann innerhalb weiter Grenzen geändert werden. Je höher das Quellungsvermögen ist, desto weniger wird die Permeabilität von der Membrandicke beeinflußt,

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was wahrscheinlich darauf beruht, daß sich das System dann Verhältnissen nähert, die beim Transfer über freie Phasengrenze vorliegen. Dieser Umstand ermöglicht es, die Abnahme der Festigkeit bei höheren Quellungskapazitäten durch größere Dicke der Membran zu kompensieren. Die Membrandicke kann üblicherweise von ungefähr 0,001 mm bei weniger quellfähigen Membranen bis zu 1 mm bei quellfähigeren Membranen, vorteilhaft zwischen 0,03 und 0,1 mm, variieren.

Die oben erwähnte Versteifung kann entweder innerhalb oder außerhalb der Membran vorgesehen werden. Im ersten Fall wird die wirksame Fläche der Membran vermindert, und diese kann nicht leicht durch elastische Deformation auf Druckunterschiede reagieren. Es ist daher vorteilhafter, die Membran von außen oder auch beiderseits mit einer geeigneten Versteifung zu versehen, z. B. durch ein frei angelegtes Netz aus einem geeigneten Material, z. B. aus synthetischen Fäden, aus Kunststoffen oder aus Metall.

Die Form und Größe der Vorrichtung sowie ihr Aufbau
kann je nach dem Verwendungszweck gewählt werden. Am einfachsten ist eine Form, bei der der ganze innere Raum von
der Umgebung durch eine Membran abgetrennt wird, die einen Sack bildet, in dem die Organismen gezüchtet bzw. gehalten oder transportiert werden. Der Sack kann auf jede geeignete Weise verschlossen werden, z. B. durch Schweißen, Zusammenkleben, Einbinden oder Zusammenpressen der Ränder mit einer geeigneten Klemme usw.. Der verschlossene Sack kann in ein Netz, einen Korb oder ein Gefäß mit perforierten oder gewellten Wänden eingelegt werden. Eine solche einfache Vorrichtung kann z. B. zum Transport von Fischen oder anderen Wasserlebewesen verwendet werden, die durch die Membran hin-

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durch Sauerstoff in genügender Menge erhalten und durch ihre Elastizität gegen etwaige Stöße geschützt sind. Unerwünschte Stoffwechselprodukte wie z. B. Harn können zeitweise durch Eintauchen in überschüssiges reines Wasser entfernt werden. Fallserwünscht kann die Membran von außen her mit Wasser bespritzt oder die Vorrichtung in belüftetem Wasser gehalten werden. Durch Verdampfen von Wasser auf der Membranoberfläche wird die ganze Vorrichtung wirksam gekühlt.

Die hydrophile Membran kann gegebenenfalls nur einen Teil der Oberfläche der Vorrichtung bilden, jedoch nicht weniger als etwa 25 % derselben. Ein Beispiel hierfür ist ein zylindrisches Gefäß, dessen Boden und/oder Deckel durch die Membran gebildet wird.

Die hydrophile Membran kann auch räumlich vom Innenraum, in dem die Organismen leben, getrennt und damit durch Rohre oder Kanäle verbunden werden. Dabei kann entweder eine große Membran mit mehreren Räumen für die Organismen verbunden werden oder ein Züchtungsraum über mehrere Membranen verfugen. Die Rohrleitungen- können gegebenenfalls mit Rückschlagklappen oder -ventilen versehen werden, um bei einer Beschädigung einer Membran das Eindringen der umgebenden Phase, z. B. Wasser, zu vermeiden. Eine derartige räumliche Trennung der Organismen von der Membran ist z. B. beim Züchten von Säugetieren ratsam, die die Membran durchstoßen oder durchbeißen können, oder in einer ungewohnten Umgebung Streßerscheinungen zeigen.

Die Membran selbst kann verschiedene Formen besitzen, z. B. die eines einfachen Sacks oder eines gefalteten Sacks, einer hohlen Lamelle, eines Rohrs oder eines Systems von Röhren. Die wirksame Oberfläche kann durch Faltengebung oder Runzelung vergrößert werden, was z. B. durch Heißorientierung in einem Gitter oder einer schraubenförmigen Formlehre oder

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sonstigen Schablonen erfolgen kann, wobei die Membranen durch die hohlen Teile der Schablone herausragen und dabei orientiert werden.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, auf eine röhrenförmige Membran feste Ringe aus Metall oder Kunststoff aufzuziehen und größere Ringe wechselweise in das Innere der Membrane einzustecken. Die letzteren verursachen eine teilweise Orientierung der Membran zwischen den kleineren Ringen. Es ist auch möglich, nur kleinere Ringe äußerlich aufzuziehen und dann die Membran durch Überfüllen mit einem heißen Medium (z. B. Wasser oder Luft) zu orientieren, wobei sie zwischen den Ringen nach außen ausgedehnt wird.

Um die Manipulation innerhalb des Raumes für die Tiere oder sonstige Organismen zu erleichtern, kann ein Teil der Membran als Handschuhe geformt werden, die in das Innere hineinragen.

Falls die Vorrichtung als biologischer Reaktor verwendet wird, wobei die lebenden Organismen üblicherweise Mikroben, Hefen, Schimmelpilze, Algen, Streptomyceten usw. darstellen, kann die Membran mit einer Einrichtung zum Rücklauf der Nährlösung versehen werden, die die Isolierung von erwünschten und Entfernung von unerwünschten Metaboliten ermöglicht. Hierdurch kann die Konzentration von Nährstoffen und Metaboliten auf einer optimalen Höhe gehalten werden, so daß die Lebensprozesse nicht gestört sind. Unter sonstigen sterilen Bedingungen, die jede Kontamination mit anderen Mikroorganismen ausschließen, ermöglicht eine solche Anordnung eine kontinuierliche Reaktionsführung mit einer wesentlichen Steigerung der Ausbeute und Erhöhung der Reinheit im Vergleich mit diskontinuierlichen Verfahrensweisen, bei denen die allmähliche Konzentrationserhöhung der Metabolite die Ausbeute herabsetzt und unerwünschte Nebenreaktionen verursacht.

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Auf diese Weise können z. B. Antibiotika, alifatische Alkohole und Ketone, Hefen, Algen und andere Produkte der Gärungsindustrie durch aerobe oder anaerobe Verfahren erzeugt werden. Im ersten Falle ist die Konzentration von Sauerstoff kritisch, im zweiten die des Kohlendioxids. Algen und höhere Pflanzen können beide Gase verbrauchen. Es ist in einigen Fällen vorteilhaft, einen Teil der gasförmigen Nährstoffe direkt in den Innenraum des Reaktors einzuleiten und dadurch den Druck auf einer geeigneten Höhe zu halten, bei der die Membran elastisch gespannt ist. Die Gase werden in diesem Falle selbstverständlich filtriert. Die flüssigen bzw. gelösten Nährstoffe dringen aus der umgebenden Flüssigkeit in den Reaktor ein, wobei die Metabolite in entgegengesetzter Richtung durch die Membran hindurch in die äußere Flüssigkeit abgeführt werden.

Der erforderliche schwache überdruck innerhalb der Membran kann gegebenenfalls osmotisch derart erhalten werden, daß in der inneren flüssigen Phase eine geeignete Konzentration eines gelösten Polymeren aufrechterhalten wird. Das Molekulargewicht des Polymeren wird dabei so gewählt, daß es im wesentlichen nicht durch die Membran hindurchdiffundieren kann. Das Polymer kann ferner gleichzeitig als Nährstoff dienen (z. B. Amylose, Polypeptide od. dgl.). Der Druckgradient und die dadurch verursachte Verminderung der Wanddicke erleichtern die Diffusion der Metabolite durch die Membrane.

Bei bestimmten technischen Verfahren wie z. B. der Vergärung von Sulfitablaugen enthält die Nährlösung flüchtige schädliche Gase, in diesem Falle Schwefeldioxid. Wird eine solche Nährlösung in feiner Verteilung außen auf die Membran aufgespritzt, können die leichtflüchtigen Gase in die Atmosphäre entweichen, wobei nur ein geringer Teil in den Reaktor ge-

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langt. Die Konzentration von solchen leichtflüchtigen Beimengungen im Inneren des Reaktors ist dann nur von ihrer Konzentration in der umgebenden Atmosphäre, jedoch nicht von der in der Nährlösung abhängig.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen und der Zeichnung näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1: die einfachste erfindungsgemäße Vorrichtung

in Form eines Sacks aus der erfindungsgemäßen Hydrogelmembran mit einem lebenden Fisch, wobei nicht wie sonst üblich Luft eingeleitet werden muß;

Fig. 2: schematisch die Vergrößerung der Membranoberfläche durch fingerähnliche Ausstülpungen, die mit einer heißen Patrize erzeugt werden können;

Fig. 3'· eine schematische Querschnittsarisicht eines biologischen Reaktors;

Fig. 4a, 4b: einen Querschnitt durch eine geöffnete (4a) und reißverschlußartig geschlossene (4b) Vorrichtung in Form eines endlosen Bandes, durch das in geschlossenem Zustand eine Nährlösung geleitet wird. Das öffnen ermöglicht die Reinigung, Beseitigung des verbrauchten Mycels usw..

Die Zeichnung wird in den folgenden Beispielen näher erklärt .

Beispiel 1

Eine Folie aus einem Multiblock-Copolymer von Acrylnitril

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mit Acrylamid, 0,25 mm dick, viurde zu einem Rohr mit 100 mm Durchmesser zusammengeschweißt. Die Folie wurde aus einer 12 $igen Lösung des Copolymeren in 65 $ige Salpetersäure gegossen und in Wasser koaguliert. Das Copolymer enthielt 41 % Acrylnitrileinheiten, 54 % Acrylamideinheiten, 4 % Acrylsäure und 2 % nicht identifizierter Komponenten, wahrscheinlich Diacrylimid.

Die zylinderförmige Membran wurde an einem Ende durch Schweißen verschlossen und mit 85 ⁰C warmem Wasser so gefüllt, daß der Durchmesser auf I85 mm vergrößert wurde. Dadurch wurde die Wand nach Fig. 1 geformt. Das warme Wasser wurde dann durch kaltes, gut belüftetes Wasser ersetzt und ein 1,4 kg schwerer Karpfen darin eingesetzt. Der Flüssigkeitsdruck wurde dann derart erhöht, daß der Durchmesser der Membran 215 mm erreichte. Der so gebildete Sack mit dem Fisch wurde dann mit einem Gummiring 2 zugebunden. Der Sack wurde anschließend in einen Korb aus PVC-Geflecht gelegt, wie es zum Schutz von Flaschen mit Chemikalien üblicherweise benutzt wird. In dieser Vorrichtung konnte der Fisch in einwandfreiem Zustand mehrere Tage transportiert werden. Nur einmal im Tag wurde der ganze Korb eine Stunde in frisches, belüftetes Wasser getaucht, um den entstandenen Harn zu entfernen. In diesem Fall bestand die Füllung 3 aus Wasser, das umgebende Medium 4 war die übliche Atmosphäre bzw. kurzzeitig Wasser,

Beispiel 2

Ein Multiblock-Copolymer aus 18 mol-% Acrylnitril, 62 -$ Natriumacrylat, 12 mol-# Acrylamid und 8 m.ol-% einer nicht identifizierten basischen Komponente, wahrscheinlich Tetrahydronaphthyridineinheiten, wurde durch homogene alkalische Hydrolyse eines hochmolekularen Polyacrylnitrile in einer wäßrigen Natriumrhodanidlösung hergestellt. Aus der Lösung wurde eine 0,5 mm dicke Folie gegossen, stark unter den Gelpunkt

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abgekühlt und in Wasser koaguliert. Die Folie wurde bis zum Entfernen des Rhodanids in Wasser gewaschen. Aus dieser Folie wurde durch Schweißen ein 150-ml-Sack hergestellt, innen sterilisiert und mit sterilem frischem Wasser gefüllt. Darauf wurden Forellenrogen und -milch hineingegeben und der Sack sofort durch Schweißen verschlossen. Der Sack wurde dann in kaltes, gut belüftetes Wasser getaucht. Befruchtung und Reifung verliefen unter sterilen Bedingungen, wobei der Zutritt von Schimmelpilzen, die sonst einen großen Teil des Rogens vernichten, vermieden wurde. Erst wenn der Fischlaich gegenüber den meisten Infektionskrankheiten widerstandsfähig genug war, wurde der Sack geöffnet und der Forellenlaich in einen Fluß ausgelassen.

Beispiel 3

Eine Folie aus dem Multiblock-Copolymer nach Beispiel 1 wurde zu einem 120 mm breiten Rohr zusammengeschweißt. Das Rohr wurde dann an einem Ende vollständig und am anderen fast vollständig durch Schweißen geschlossen, wobei nur eine 10 mm große Füllöffnung offen blieb. Die 750 mm lange zylindrische Membran wurde dann leicht mit einem sterilen Gas gefüllt, anschließend wurden 10 Ringe aus Polycapronamid darauf aufgefädelt und die Membran mit 95 °C heißem Wasser derart gefüllt, daß sie zwischen den Ringen nach außen hinausragte und dadurch orientiert wurde. Nach dem Abkühlen auf 40 ⁰C wurden die Ringe nach dem Ablassen des Wassers entfernt. Dabei entstand ein Balg, der keine Undichtheiten aufwies. Der Balg wurde mit einer frischen Suspension von Hefen mit üblichen Nährsalzen und 10 % Saccharose gefüllt. Die Einlaßöffnung wurde mit einem Rückschlagventil verschlossen, worauf der Balg in einen größeren Glaszylinder gelegt und mit einer 10 #igen Rübenzucker-

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lösung unter sterilen Bedingungen bespritzt wurde. Die Lösung floß in dünner Schicht über die Membran und wurde vom Boden abgezogen und in eine Abtriebskolonne geleitet, in der der Alkohol herausdestilliert wurde. Die Flüssigkeit aus der Kolonne wurde mit Zucker auf 10 % nachgesättigt und im Kreislauf auf den Membranbalg zurückgeleitet. Die Feder des Kugelventils wurde so eingestellt, daß ein Teil des Kohlendioxids, das nicht schnell genug durch die Membran hindurchdiffundieren konnte, im Balg verblieb und ihn unter einer gewissen Spannung hielt. Durch periodisches öffnen des Kugelventils wurde das überschüssige Kohlendioxid abgelassen, wodurch ein periodisches Spannen und Schrumpfen des Balges und damit eine Rührwirkung auf die Maische erzielt wurde. Der Kreislauf der Nährlösung und das Bespritzen der Membran waren veränderlich, wodurch die Dicke der Flüssigkeitsschicht auf der Membranoberfläche reguliert werden konnte: Im extremen Fall konnte der Glaszylinder ganz mit der Nährlösung gefüllt werden. Die Temperatur wurde zwischen 27 und 30 ⁰C gehalten, wobei die Wärme von der Abtriebskolonne geliefert wurde. Der so gewonnene Äthylalkohol enthielt verhältnismäßig wenig Fuselöl.

Beispiel k

Ein Copolymer von Acrylnitril mit 3 mol-% Vinylpyrrolidon (mittleres Molekulargewicht etwa 950 000) wurde in einem Gemisch von 55 Gew.-% Salpetersäure, 8 % Schwefelsäure und 37 % Wasser gelöst (HNO, und HpSO|, als wasserfrei berechnet). Die 5 $ige dickflüssige Lösung wurde bei 0 ⁰C so lange stehengelassen, bis 22 % der Nitrilgruppen zu Amidgruppen hydrolysiert waren. Die Lösung wurde dann auf eine langsam umlaufende Trommel gegossen und koaguliert. Die so erhaltene Folie

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wurde gründlich gewaschen und bei 80 ⁰C in Wasser biaxial verstreckt. Die so erhaltene Membran war 0,1 mm dick und enthielt im Quellungsgleichgewicht 19,5 Gew.-% Wasser. Die Reißfestigkeit der orientierten Folie in vollständig gequollenem Zustand lag über 3500 kg/cm . Die Folie wurde dann bei 120 ⁰C vakuumverformt, wie es in Fig. 2 schematisch im Querschnitt veranschaulicht ist. Die Oberfläche der Folie wurde dadurch fünffach vergrößert und die Meir.brandicke in den Ausstülpungen auf 0,0075 mm herabgesetzt. Die durchschnittliche Dicke der ganzen Folie betrug rund 0,025 mm. Die Membran konnte in einem biologischen Reaktor zur Durchführung anaerober Prozesse verwendet werden.

Beispiel 5

Ein biologischer Reaktor besteht aus einer Reihe von Einheiten, von denen eine in Fig. 3 schematisch dargestellt ist. Der Reaktor dient zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen mit im Gegenstrom entfernten Metaboliten, wobei durch die Membran Nährstoffe zugeführt werden.

Die schraubenartig angeordnete Spirale 5 ist durch die Längsträger 6 gegen Dehnung und Verdrillung versteift und an beiden Enden mit Stirnflanschen 7a, 7b verbunden, die in Hohlwellen 10a, 10b übergehen und sich in den Lagern 8a, 8b drehen. Die Achse 10a ist mit einer Riemenscheibe 9 versehen. Innerhalb der Hohlwellen 10a, 10b ist ein stationäres, koaxiales Rohr 11a, 11b angeordnet, das mit einer inneren Membran 12 aus einem Multiblock-Copolymer von Acrylnitril mit Acrylamid verbunden ist und Druckluft liefert. Der Druck wird so eingestellt, daß die Membran gespannt und an die Spirale 5 angepreßt wird. Von außen her ist eine ähnliche Membran über die Spirale 5 gezogen. Die äußere Membran 13 wird mit unbeweglichen

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Dichtungen I4a, lUb fest verbunden. Das Ganze befindet sich in einem Mantel 15, in den die Nährlösung durch die Einlaßöffnung 16 zugeführt wird. Die Lösung der Metabolite wird durch den
Auslaß 17 abgezogen. Die Vorrichtung arbeitet derart, daß
die Spirale 5 zwischen den unbeweglichen Membranen 12 und 13 rotiert und als endlose Transportvorrichtung dient. Durch
die Kreisringfläche zwischen den koaxialen Hohlwellen 10 und Rohren 11 wird eine Kultur von Mikroorganismen zugeführt,
deren Lebenszyklus (Latenzphase, Proliferation, Produktionsphase und Absterben) im Raum zwischen den Membranen 12 und
13 abläuft. Sauerstoff wird von innen durch die Membrane 12
hindurchgeführt j so daß sich eine Sterilisation erübrigt.
Die Mährstoffe werden durch die Membrane 13 aus der Lösung zugeführt, die zur Produktabtrennung allmählich gewechselt wird. Die Konzentration von Metaboliten in der durch den Auslaß 17 abgezogenen Flüssigkeit kann höher sein als die von den Mikroorganismen normal vertragene Konzentration, während die Konzentration an unverbrauchten Nährstoffen sehr niedrig, ist.

Um die Reibung zwischen der Spirale 5 und den Membranen 12 und 13 zu vermindern und ein Ankleben von Mikroorganismen auf ihnen zu verhindern, kann die Oberfläche der Membranen
12 und 13 in an sich bekannter Weise schlüpfrig gemacht werden, z. B. durch eine Behandlung mit einem Gemisch von
Glycerin mit konz. Schwefelsäure (1:6).

Die Luft oder der Sauerstoff können auch im Gegenstrom
durch den zentralen Hohlraum geleitet werden, auch kann
dazu wäßrige, mit Sauerstoff gesättigte Nährlösung verwendet werden. Ein Teil des Sauerstoffs kann in der Lösung gelöst
werden. Ein Vorteil dieser Vorrichtung liegt darin, daß Sauerstoff oder Luft unter Druck zugeführt werden können, wodurch die Diffusionsgeschwindigkeit erhöht wird. Ein anderer Vor-

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teil besteht darin, daß die biologischen Prozesse in einem engen Raum zwischen den beiden Membranen ablaufen, wodurch eine große Oberfläche zur Lieferung der Nährstoffe bei einem kleinen Volumen der Mikrobenkultur gesichert wird. Diese Vorrichtung eignet sich z. B. zur Herstellung von Antibiotika durch Submersverfahren.

Beispiel 6

Das Beispiel bezieht sich auf das Prinzip einer kontinuierlich arbeitenden Vorrichtung mit einer sich bewegenden Membran. Die verwendete Mikrobenkultur wird zusammen mit der Membran im Gegenstrom zur fließenden Nährlösung bewegt, wobei diese gleichzeitig zur Entfernung der Metabolite dient. Eine derartige Vorrichtung ist besonders dann zweckmäßig, wenn die Kultur direkt auf der Membranoberfläche wächst und daran festgehalten wird, so daß keine Spirale wie im Beispiel 5 verwendet werden kann. Hier wird eine Membran in Form eines endlosen Bandes benutzt, die in der Produktionszone mit einem Rohr verbunden ist und sich dann zu einer Zone öffnet, in der die abgestorbenen und unbrauchbaren Mikroben entfernt werden.

Die Vorrichtung ist in Fig. 4 schematisch im Querschnitt dargestellt. Das Band kann zu einem koaxialen Doppelschlauch geschlossen werden, wobei die Kultivierung zwischen den beiden Schläuchen verläuft. In Fig. 4a ist das Band geöffnet und in Fig. 4b geschlossen dargestellt. Das endlose Membranband 18 ist fest mit Verschlußteilen 19, 20 und 21 verbunden, die ebenfalls endlos sind, und zusammen einen Reißverschluß bilden, da sie mit länglichen Schlitzen versehen sind, die genau

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ineinanderpassen. Diese Anordnung sichert eine dichte Verbindung, leichtes Schließen und öffnen und ermöglicht eine Kultur, bei der Nährlösung und Luft gleichzeitig zugeführt werden können.

Beispiel 7.

Aus einer 0,25 mm dicken Folie aus dem Copolymer nach Beispiel 1 wurde ein 100-ml-Säckchen hergestellt, sterilisiert und mit einer Suspension von Hühnereir.bryo-Fibroblasten in einer üblichen Nährlösung gefüllt. Das Säckchen wurde dann zugeschweißt und in einem Thermostaten bei 37 ⁰C gehalten, wobei die Konzentration des Kohlendioxids kontrolliert wurde. Während der ersten zwei Stunden wurde das Säckchen langsam mit 10 U/h gedreht. Danach waren die Zellen bereits auf der Membran fixiert und vermehrten sich, bis eine "Monolayer"-Schicht gebildet wurde. Das Wachstum der Zellen verlief dabei unter wesentlich günstigeren Bedingungen als bei Verwendung der üblichen Polystyrolschalen, in denen die Zellen lediglich am Boden wachsen.

Die obigen Beispiele erläutern nur einige der außerordentlich zahlreichen möglichen Anwendungen. So ist es z. B. möglich, in derartigen Vorrichtungen anaerobe Prozesse durchzuführen und verschiedene wertvolle Metabolite wie Hormone, Vitamine (z. B. Vitamin B 12), Antistoffe o. dgl. herzustellen, deren Moleküle die Membran durchdringen können. Mit derartigen biologischen Reaktoren können ferner die verschiedensten Umsetzungen wie etwa biologische Reduktionen und Oxidationen im Labor wie auch im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Durch Anwendung grenzflächenaktiver Stoffe wie z. B. Gallensäuren ist es z. B. auch möglich, lipophile Substanzen durch die Membrane zu transportieren.

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Darüber hinaus ist es möglich, innerhalb der von den erfindungsgemäßen Membranen eingeschlossenen Räume auch Teile von lebenden Organismen wie z. B. Drüsen zu züchten und so bestimmte Hormone und Enzyme herzustellen.

Auf diese Weise kennen beispielsweise Kohlenhydrate oder Aminosäuren durch Spaltung ihrer Polymeren oder etwa neue Mikrobenmutanten hergestellt werden, wobei zugleich kleine Mengen ihrer Metabolite erzeugt werden können. Hierzu können die Mikroben in der Vorrichtung chemischen Einflüssen oder Strahlung ausgesetzt werden.

Eine weitere Möglichkeit der Anwendung besteht darin, Pflanzen oder Pilze in sterilem Medium zu kultivieren, wobei die Organismen gegen äußere schädliche Einflüsse geschützt sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die erfindungsgemäße Vorrichtung sind jedoch nicht auf die angegebenen Anwendungsgebiete beschränkt.

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Leersei te

Claims

Ansprüche

Verfahren zur Züchtung, Haltung und Beförderung lebender Organismen, bei dem sich diese innerhalb eines durch eine Trennwand von der äußeren Umgebung abgetrennten Raumes befinden, die zumindest teilweise aus einer für Gase durchlässigen, für Viren, Mikroorganismen und Sporen jedoch undurchlässigen dünnen Wand besteht,

dadurch gekennzeichnet,

daß die lebenden Organismen in einem Raum gehalten werden, dessen dünne Wand zumindest teilweise aus einem in Wasser gequollenen Multiblock-Copolymer von Acrylnitril mit Acrylamid und/oder Acrylsäure besteht, das nachweisbare, nicht abtrennbare Polyacrylnitrilbereiche enthält und im in Wasser gequollenen Zustand für Gase, Ionen und niedermolekulare gelöste Stoffe durchlässig, jedoch für Viren, Mikroorganismen und Sporen undurchlässig ist,

wobei gasförmige oder flüssige Stoffe wie insbesondere Sauerstoff durch die Membran oder Trennwand eintreten und zugleich die StoffWechselprodukte durch sie hindurch abgeleitet werden.
2. Vorrichtung zur Züchtung, Haltung und Beförderung von lebenden Organismen in einem Raum, der von der äußeren Umgebung durch eine dünne, für Gase und Dämpfe durchlässige, für Viren, Mikroorganismen und Sporen jedoch undurchlässige Wand getrennt ist,

dadurch gekennzeichnet,

daß die Wand aus einer in Wasser gequollenen Membran aus einem Multiblock-Copolymer von Acrylnitril mit Acrylamid und/oder Acrylsäure besteht, wobei das Copolymer höchstens 15 ταοΙ-% andere Einheiten enthält und bei der Röntgenanalyse

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typische Reflexe von Polyacrylnitril entsprechend einer interplanaren Periodizität von 5,1 8 aufweist, wobei die Membran durch wenigstens einseitigen, dauernden oder wechselweisen
Kontakt mit Wasser oder wäßrigen Lösungen, gesättigtem bzw. übersättigtem Wasserdampf oder wasserdampfhaltigen Gasen
dauernd in wassergequollenem Zustand gehalten ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran wenigstens teilweise orientiert ist.
H. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran durch einen Paserstoff wie etwa ein Netz ο. dgl, versteift ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Versteifung von der Membran getrennt ist, aber mit ihr
in Kontakt steht.
6. Vorrichtung nach einem der Anspräche 2-5, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Einlaß für Nährlösung.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2-6, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Auslaß für feste Abfallprodukte.

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