DE2518352A1

DE2518352A1 - Spezifische sorbenten und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2518352A1
Application number: DE19752518352
Authority: DE
Inventors: Karel Dr Blaha; Jiri Dipl Ing Coupek; Jaroslava Dipl Ing Turkova; Olag Dr Valentova
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1974-04-25
Filing date: 1975-04-25
Publication date: 1975-11-06
Also published as: DE2518352C2; AU8041075A; CS175047B1; SE400835B; AT343602B; BE828373A; NL7504877A; SE7504655L; NL180982B; JPS584576B2; FR2268824A1; GB1492829A; JPS50144688A; CH629509A5; US4171412A; CA1066847A; FR2268824B1; ATA313575A; NL180982C

Description

23. April 1975 Anw.-Akte: 75.808

PATENTANMELDUNG

Anmelderι Ceskoslovenskö akademie v8d., Praha 1

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Tjtel: Spezifische Sorbenten und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft spezifische Sorbenten, insbesondere fUr die Affinitätschromatographie von Enzymen, welche durch Bindung von Aminosäuren und Peptiden mit der Ausnutzung der D-Analoga von peptidischen Substraten auf makroporösen Gelen hergestellt werden, und ihr Herstellungsverfahren.

Durch derartige Verfahren entstehen synthetische Inhibitoren mit hervorragenden Eigenschaften fUr die Verwendung in der Affinitätschromatographie.

Die Affinitätschromatographie unter Verwendung von insolubilisierten Inhibitoren gehört zu einer der modernsten Isolierungsmethoden der Enzyme. FUr die Isolierung von proteolytischen Enzymen verwendet man bisher am häufigsten natürliche hochmolekulare Inhibitoren, welche aber infolge ihres Eiweisscharakters nach mehrfacher Verwendung einer irreversiblen Inaktivation unterliegen und fUr die technologische Ausnutzung nicht zu geeignet sind.

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Die Erfindung betrifft spezifische Sorbenten, welche durch die Mischpolymerisation von Hydroxyalkylestern und Hydroxyalkylamiden der Acryl- und Methacrylsäure mit vernetzenden Acrylat- und Methacrylat-Comonomeren, an welchen durch kovalente Bindung die D-Aminosäure oder das eine der mehrere Einheiten von D-Aminosäuren enthaltende Peptid gebunden wird, hergestellt werden· Diese spezifischen Sorbenten können vorzugsweise eine makroporöse Struktur aufweisen· Der Grundträger wird durch die Reaktion mit den die carboxyterminale oder aminoterminale Funktionsgruppe enthaltenden Verbindungen, welche aus der Gruppe von Diaminen (z.B. 1,6-Hexamethylendiamin), Aminosäuren ( £, Aminocapronsäure) oder Dicarboxylsäuren (Glutarsäure) ausgewählt werden, modifiziert. Ein auf solche Weise modifiziertes Gel wird dann in Üblicher Weise mit den D-Analoga von Aminosäuren oder Peptiden, welche eine oder mehrere D-Aminosäureeinheiten enthalten, kondensiert. Zur Kondensation kann man ein aktives Ester der Aminosäure oder des Peptide (Triehlorphenyl) oder Kondensationsmittel, z. B. l-Aethoxy-carbonyl-2-öthoxy-l₇2-dihydrochinolin, verwenden. Spezifische Sorbenten kann man auch durch die weitere Kondensation von dem an der Oberfläche des Trägers gebundenen Peptid herstellen· Alle auf diese Art hergestellten spezifischen Sorbenten wurden mit sehr guten Ergebnissen in der Affinitätschromatographie der Enzyma verwendet.

Für die Isolierung von Proteasen ist deshalb die Verwendung von spezifischen, aus niedermolekulaten synthetischen Inhibitoren hergestellten Sorbenten, wie z.B. D-Analoga der peptidischen Substrate, besser geeignet, weil diese Sorbenten in Gegenwart von proteolytischen Enzymen keinen Änderungen unterliegen. Kommt es nach mehrfacher Verwendung zur Kapazitätserniedrigung des Sorbenten, können s4e beispielsweise leicht durch ein Durchwaschen mit 6 M-Lösung ν·η Guanidinhydrochlorid regeneriert werden.

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— O —

Zur Herstellung von spezifischen Sorbenten kann man als Träger vorzugsweise Hydroxyalkylacrylat- und Hydroxyalkylmethacrylat-GeIe (SPHERON), welche den tschechoslowakischen Patent Nr.148,828, Urheberschein Nr. 150 819 entsprechend hergestellt wurden, oder Hydroxylalkylacrylamid- und Hydroxylalkylmethacrylamid-Gele nach dem tschechoslow. Patenten Nr. 147 113, 147 152, 149 376, Urheberschein Nr. 154 386 und Urheberschein Nr (PV 2879-74),

die man zum Unterschied von dem am häufigsten verwendeten Träger "Agarose" durch Reaktionen in gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln modifizieren kann, verwenden. Ein weiterer Vorteil von der auf diese Weise hergestellten Sorbenten liegt darin,daß man sie einfach ohne Zugabe von Schutzmitteln austrocknen und weiter in trockenem Zustand aufbewahren kann. Eine beträchtliche mechanische und hydrolytische Beständigkeit gemeinsam mit der Anwesenheit von unspezifischen Sorptionserscheinungen prädestiniert sie zur Ausnutzung in technologischem Ausmaß.

Im Hinblick auf den niedermolekularen Charakter der an eine polymere Matrix gebundenen Peptiden ist es erwünscht, zwischen den Inhibitor und die Geloberfläche eine die FunktionsmolekUle von der Oberfläche entfernende Kette - "SPACER" einzulegen.

Spezifische Sorbenten kann man deshalb mit Vorteil aus den Hydro-

xyelkylmethacrylat-Gelen mit angebundener Kette, wie z.B.

1,6-Hexamethylendiamin oder £, -Aminocapronsäure u.a., herstellen.

Die Herstellung von Aminoacyl-, bzw. Peptidylderivaten, welche an Hydroxyalkylmethacrylat-Gel gebunden werden, kann man nach dem Prinzip der Synthese von peptiden durchfuhren. Als Milieu wählt man mit Vorteil ein Organisches Lösungsmittel (am besteht Tetrahydrofuran, im Falle der niedrigeren Löslichkeit von Pep-

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tiderivaten Dimethylformamid oder N,N', N" -Hexamethylphosphortriamid) in Kombination mit gebräuchlichen Kondensationsmitteln (am besten 1-Aethoxycarbonyl-2~äthoxy-l,2-dihydrochinolin oder aktives Ester). Die Reaktion kann man auch in wässrigen Milieu mit Hilfe von löslichem Carbodiimid durchfuhren.

Zu den geeigneten Schutzgruppen fUr die Aminogruppe gehören tert.-Butyloxycarbonyl (Welches durch Trifluoressigsäure abgespaltet werden kann) oder Benzyloxycarbonyl (die Abspaltung wird mit 33% Bromwasserstoff in Essigsäure durchgeführt). Die 2-Nitrobenzolsulfenylgruppe ist ungeeignet, weil das farbige Nebenprodukt, welches bei der Abspaltung (z.B. bei Abspaltung mit Chlorwasserstoff im Methanol entstehendes Methyl-2-nitrobenzolsulfonat) entsteht, schlecht ausgewaschen und teils irreversibel an das Polymerisat gebunden wird« Die Carboxylgruppe kann man durch tert.-Butyl- oder Benzhydrylgruppe, welche man durch Trifluoressigsäure abspalten kann, schützen. Zum Träger mit gebundenen primären Aminogruppen kann man direkt ein geeignet geschütztes Derivat der Aminosäure oder des Oligopeptids anschließen. Nach der Durchfuhrung der Reaktion, Auswaschen mit Lösungsmittel, in welchem die Kondensationsreaktion durchgeführt wurde, und mit wässriger Lösung von 6 M Guanidinhydrochlorid und nach Austrocknen kann man entweder alle Schutzgruppen oder selektiv die NoC -Gruppe abspalten. Die Menge der eingebauten Aminosäure hängt von ihrer Struktur ab. Allgemein bindet sich am meisten Glycin, welches man für die' Bestimmung des Gehaltes an acylierten im Gel anwesenden W^-Gruppen verwenden kann.

Ein fortschreitender Aufbau von Peptiden auf dem Träger, welcher Aminogruppen enthält, mit dem carboxyterminalem Rest von Aminosäuren beginnend, ist auch möglich. Die Abspaltung von der vorübergehend N eC schützenden Gruppe erreicht man auf bekannte Weise und ein Anbinden von weiterem Aminosäurederivat oder Peptid-

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fragment kann man wieder durch ein aktiviertes Ester oder 1-Aethoxycarbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinolin durchfuhren. Nach fortschreitender Synthese, bzw. Kupplung von Fragmenten auf dem polymeren Hydroxyalkylmethacrylat-Gel wird allerdings an die Oberfläche des Polymerisats ein Gemisch von Peptiden, von denen einige unvollständige Ketten im Hinblick auf die unterschiedliche Reaktivität von Einzelnen Resten der Aminosäuren bei der Kondensationsreaktion besitzen, angeschlossen. Die makroporöse Struktur von Hydroxyalkylmethacrylaten ist fUr das Erreichen von höheren Ausbeuten bei der Kondensation geeigneter als ein homogenes quellbares dreidimensionales Netz von Polystyrol-Gelen, welche man fUr den geregelten Aufbau der Peptide im allgemeinen verwendet. Wenn man zur Kondensation schon ein fertiges Oligopeptid verwendet, wiad die Gesamtsubstitution niedriger, man gewinnt aber ein homogenes Produkt. Bei fortschreitendem Aufbau von analogem Hexapeptid wurde ein» niedriger· Ausbeute sogar bei der Kondensation von zwei tripeptidischen Fragmenten registriert.

Dieselben Methoden verwendet man auch bei der Kondensation von Peptiden oder Aminosäuren mit Carboxyderivat der Hydroxyalkylmethacrylat-Gele. Die Carboxylgruppe der reagierenden peptidischen Komponente wird durch die sauer abspaltbare Estergruppe geschüttt. Die Ergebnisse der Bindung von Aminosäuren und Peptiden mit Hydroxyalkylmethacrylat-Gelen auf der Basis von SPHERON werden in der Tabelle, welche die Art der Reaktion und den Gehalt an den Kovalent im entsprechenden Derivat gebundenen Aminosäuren beschreibt, Übersichtlich zusammengefaßt.

Tabelle

Ergebnisse der Kondensation von Aminosäuren und Peptiden mit substituierten Spherons in Tetrahydrofuran mit Hilfe von 1-Aethoxycarbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinolin (Sph - Hydroxyalkylmethacrylat-Gel auf Basis von SPHERON).

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Reaktion Gehalt an Aminosäure⁰ umol g~

Z-Gly-D-Leu-OH + NH₂ - Sph Z-Gly-D-Phe-OH + NH₂ - Sph Ac-DL-Lys(Z)-OH + NH₂ - Sph Ac-L-Ly₈(Z)-OH + NH₂ - Sph Boc-L-Lys(Z)-L-Ala-Gly-0H+NH₂-Sph

Boc-L-Ly»{Z?-L-Ala-Gly-Tcp^C+NH₂-Sph Boc-L-Leu/OH + NH₂ - Sph Z-D-Leu^d + NH₂ - Sph Nps-D-Leu-OH + NH_£ - Sph Z-Gly-D-Phe-L-Leu-OH + NH₂ - Sph Z-Gly-L-Phe-L-Leu-Gly-L-Phe-D-Leu-OH + + NH₂ - Sph

H-D-Phe-0CH(C₆H₅)₂ + HOOC - Sph H-L-AIa-OCH(C₆Hg)₂ + HOOC - Sph H-L-AIa-OCH(C₆Hg)₂ ^a + HOX - Sph

GIy	SS,	Leu 70	Lys 73
GIy	115,	Phe 100	, Lys 5Γ
Lys	36		Lys 61
Lys	45
GIy	75,	AIa 79,
GIy	66^b	\ AIa 64°,
GIy	63,	AIa 66,	Leu 33, Phe 29
Leu	47		Leu 25, Phe 24
Leu	13
Leu	3
GIy	33,
GIy	24,
Phe	40
AIa	18
AIa	2

Uj. !_ A · ·_♦ _-~_ΐ I L. 1 X. _

durch Aminosäureanalyse bestimmt; nach Abspaltung der Schutzgruppen;

^c Trichlorphenylester; ^d in wässriger Lösung mit Hilfe des 1-Aethy1-3(3'- -dimethylaminiprop|rl)carbodiimid8 von Methojodid; ^β in Dimethylformamid.

509845/0800 ORäG.'NAL !NSPEpTED

Bei der Verwendung der spezifischen Sorbenten in der Affinitätschromatographie ist das Erreichen großer Ausbeute und Reinheit von isolierten Proteasen von Bedeutung· So kann man z. B. bei Isolierung der Aminopeptidase aus dem Proteolytischen, aus den Schimmelpilz Aspergillus flavus gewonnenen Präparat die erreichte spezifische Aktivität des Produktes nach einstufiger Affinitätschromatographie (2, 19 E./mg Eiweisstoff) mit der Aktivität der Aminopeptidase, welche von den japanischen Autoren (Nakadei et al. Agr. Biol. Chem. 37/1973 757) aus roher enzymetischer Lösung aus Aspergillus oryzae isoliert wurde, und 2,12 E./mg Eiweisstoff betrug, vergleichen. Für die Isolierung wurde aber die außerordentlich mühevolle Sorptionsmethode auf Amberlit IRC 50 (vernetzte Methacrylsäure), Fraktionierung mit Natriumsulfat, Fällung mit Rivanol, Chromatographie auf DEAE Zellulose und Gelchromatographie auf Sephadex G-200 und G-I00 verwendet. Die Ausbeute betrug nur 0,438 % der ursprüngslichen Aktivität des verarbeiteten Materials. Die Ausbeute der Aktivität von Aminopeptidase auf spezifischen Sorbenten, welche diese Erfindung betrifft, beträgt beinahe 100 %.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erklärt, ohne sie darauf zu beschränken.

Beispiel 1
Z-Gly-D-Leu-NH-Spheron

1 g Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Aethylondimethacrylat (SPHERON 300) wurde dem tschechoslowakischen Urheberschein Nr (PV-2106-72) entsprechend durch die Reaktion

mit 1,6-Hexamethylendiamin unter Aktivierung durch Bromcyan chemisch modifiziert. Zur Suspension dieses Geles in 5 nl Tetrahydrofuran wurden 0,5 ml Triäthylamin zugegeben und die Suspension wurde bei

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Raumtemperatur und unter periodischem Durchführen 10 Minuten stehen gelassen. Danach wurde das Gel abfiltriert und auf der Fritte mit dreimal je 5 ml Tetrahydrofüren durchgewaschen· Nach dem Übertragen des Material in den Kolben wurden 5 ml Tetrahydrofuren, 89 mg Benzoyloxycarbonyl-glycyl-D-leucin und X 125 mg 1-Aethoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihysrochinolin zugefügt. Nach fünfstündigem Schütteln wurden weitere 50 mg chinolinisches Reagens zugegeben· Die Suspension wurde innerhalb von weiteren 10 Stunden geschüttelt, anschließend mit 50 ml Tetrahydrofuran durchgewaschen und das Gel abfiltriert und ausgetrocknet. Das Produkt wurde auf Gehalt an Aminosäuren analysiert (Tabelle) und in weiterem zur Affinitätschromatographie verwendet (siehe Tabelle)·

Die Isolierung von hochaktivem Chymotrypsin erfolgte durch die Affinitätschromatographie auf Z-Gly-D-Leu-NH-Spheron.

100 mg Chymotrypsin (Aktivität der Esterase auf ATEE 135 yumol/ min.mg) wurden in 10 nl 0,05 M TRIS-HCI Puffer pH 8,0 aufgelöst und in die Säule des Geles von Z-Gly-D-Leu-NH-Spheron (mit Gehalt an 100 Ajmol Phe/g Gel) des Volumens cca 40 ml (Säulenmasse: 22 χ 100 mm) eingsickert. Nach dem Einsickern wartete man 10 Minuten, damit sich die bindenden Stellen der Molekeln von Enzymen und Inhibitoren orientieren konnten, und danach fing man mit der Elution durch 0,05 M TRIS-HCI Puffer an. In der ersten Fraktion kann Material «hne chymotryptische Aktivität. Aktives Chjrmotrypsin wurde aus dem Gel durch cca 0,1 M Essigsäure, welche mit Zugabe von Ammoniak auf pH 3,1 eingestellt wurde, verdrängt. Nach dem Entsalzen auf Sephadex G 25 in 0,02 M Aminoiumacatat wurden 54 g Chymotrypsin mit der Esteraseaktivität von 248 Arnol/min.mg gewonnen· Die Aktivität wurde auf ATEE nach Axeη und Ernback (Europ. J. Biochen. 18 (1971) 351) bestimmt.

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Beispiel 2 L-Lys-L-Ala-Glv-NH-Spheron (Reaktion mit Trichlorphenylester)

1 g Mischpolymerisat von Z-Hydroxyäthylmethacrylat und Aethylendimethacrylct (Spheron 300) wurde nach der chemischen Modifizierung mit 1,6-Hexamethylendiamin in derselben Weise wie im Beispiel 1 mit Triäthylamin versetzt. Nach dem übertragen des Materials in den Kolben wurden 180 mg (0,25 mmpl) tert.Butyloxycarbonyl-(benzyloxy-carbonyl)-L-Lysyl-L^slanyl-glycintrichlorphenylester, 40 yul Triäthylamin und 10 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden geschüttelt, danach wurde das Gel abfiltriett, dreimal mit je 10 ml Tetrahydrofuran und mit 50 ml Aether durchgewaschen und ausgetrocknet. Die Probe (70 mg) wurde auf ihren Gehalt an Aminosäuren analysiert (siehe Tabelle). Auf dem Rest des Polymerisats wurden die Schutzgruppen von den Peptidmolekeln durch Reaktion mit 15 ml 33 % HBr in Eisessigsäure abgespalten. Nach Einwirkung von 15 Minuten wurde das Gemisch mit 30 ml Essigsäure verdünnt, das Gel wurde abfiltriert, auf dem Filter mit 3 χ 5 ml Essigsäure gewaschen, dann mit Wasser bis zum Verlieren der sauren Reaktion, mit Aethanol und Aether durchgewaschen und ausgetrocknet. Das gewonnene Material wurde auf seinen Gehalt an Aminosäuren analysiert und zu der Affinitätschromatographie ähnlich wie im Beispiel 1 verwendet.

Beispiel 3 Das durch Carboxy-Spheron ocvlierte D-Phenylalanin (D-Pha-COO-Spheron)

Zu 0,90 g HOOC-Spheron, welches durch die Reaktion des Mischpolymerisatz aus 2-Hydro«yäthylmethacrylat und Aethylendimethacrylat (Spheron 700) mit £, -Aminocapronsäure hergestellt wurde, wurden 5 ml Tetrahydrofuran, 2,23 g Benzhydrylester des D-Phenylalanins und 0,172 g 1-Aethexycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin zugegeben.

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Das Gemisch wurde innerhalb von 6 Stunden geschüttelt, danach wurden weitere 50 mg des Chinollinderivats zugefügt, das Gemisch noch weitere 4 Stunden geschüttelt, abfiltriert und das feste Produkt auf dem Filter mit Tetrahydrofuran, Wasser, Aethanol, Aether durchgewaschen und ausgetrocknet. Die Probe (50 mg) wurde auf ihren Gehalt an Aminosäuren analysiert.

FUr die Abspaltung der Schutzgruppe wurde das polymere Material in Trifluoressigsäure (3 ml) suspendiert, das Gemisch wurde 30 Minuten stehen gelassen, danach mit Wasser verdünnt, der feste Stoff abfiltriert, auf de* Filter bis zur neutralen Reaktion mit Wasser, anschließend mit Aethanol und Aether durchgewaschen und ausgetrocknet. Das auf solche Weise gewonnene Material wurde auf seinen Gehalt an freien Carboxylgruppen analysiert und zur Affinität se hromatographie verwendet.

10 mg Carboxypeptidase A wurden in 2 ml 0,05 M TRIS-HCI Puffer pH 8,0, welcher 0,3 N NaCl enthielt, aufgelöst. Die Lösung wurde auf die Säule von D-Phe-CCO-Spheron (mit Gehalt 40 yumol Phe/g Gel) mit einem Rauninhalt von 8 ml (10 χ 100 mm) aufgesetzt. Nach der Verweilzeit von 10 Minuten wurde die Säule mit dem Puffer eliert. Es kam zur vollständigen Retention von allen Enzym, welches erst durch die Aenderung des pH-Puffer« durch 0,1 M Essigsäure freigemacht wurde.

Beispiel 4

Fortschreitender Aufbau des Tripeptide von Z-Gly-B-Phe-L-Leuauf NHg-Spheron.

Zur Suspension von 3 g Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthylmethacrylats und Aethylendimethacrylats (Spharon 500), welches durch

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die Reaktion mit 1,6-Hexamethylendiamin modifiziert wurde, wurden 1,5 ml Triethylamin zugegeben und die Suspension wurde unter periodischem Durchrühren 10 Minuten stehen gelassen. Danach wurde das Gel abfiltriert, dreimal mit je 10 ml Tetrahydrofuren durchgewaschen und in den Kolben, in welchm 15 ml Tetrahydrofuran, 0,21 g (0,90 mmol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucin und 0,23 g 1-Aethoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin vergelegt wurden, Übergeführt· Das Gemisch wurde innerhalb von δ Stunden geschüttelt, danach wurden weitere 50 mg Chinolinderivat zugefügt und nach 5 Stunden geschüttelt· Das feste Material wurde abfiltriert, mit Tetrahydrofuren und Aether durchgewaschen und ausgetrocknet· Die Probe (70 mg) wurde auf ihren Gehalt an Aminosäuren analysiert·

Zu 2,5 g Reaktionsprodukt aus der vorherigen Stufe wurden 5 ml Trifluoressigsüure zugegeben, die Suspension wurde 15 Minuten stehen gelassen, dann mit Wasser verdünnt, der feste Stoff wurde abfiltriert, mit Wasser bis zur neutralen Reaktion durchgewaschen und nach weiterem Durchwaschen mit Aethanol, Aether und nach Austrocknen, in 15 ml Tetrahydrofuran suspendiert, Zur Suspension wurden 0,335 g tert.-Butyloxycarbenyl-D-phenylalanindicyklohexylammoniumsalz und 0,192 g 1-Aethoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin zugegeben. Das Gemisch wurde 6 Stunden geschüttelt, anschließend wurden noch 50 mg Chinolinderivat zugefügt und das Gemisch wurde weitere 6 Stunden geschüttelt. Festes Material wurdqäanach abfiltriert, stufenweise mit Tetrahydrofuran, Wasser, Aethanol, Aether durchgewaschen und ausgetrocknet. Die Probe wurde auf ihren Gehalt an Aminosäuren analysiert.

Zu 2 g auf solche Weise gewonnenem Material wurden 4 ml Trifluoressigsäure zugegeben, die Suspension wurde 15 Minuten stehen gelassen, mit Wasser verdünnt, der feste Stoff wurde abfiltriert,

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mit Wasser bis zur neutralen Reaktion durchgewaschen, denach mit Aethanol und Aether durchgewaschen, ausgetrocknet und in 10 ml Tetrahydrofuran suspendiert· Zur Suspension wurden 0,115 ml Oicyέlohexylamin, 0,113 Benzyloxycarbonylglycin und 0,138 g 1-äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin zugegeben, das Gemisch wurde 6 Stunden geschüttelt, weitere 50 mg Chinolinreagens wurden zugegeben und wiederum 6 Stunden geschüttelt. Der feste Stoff wurde abfiltriert, mit Tetrahydrofuran, Wasser, 1 M HCl, Wasser, Aethanol und Aether durchgewaschen und ausgetrocknet. Das auf solche Weise gewonnene Produkt wurde auf seinen Gehalt an Aminosäuren analysiert und zur Affinitätschromatographie verwendet«

Beispiel 5 D - Leu-NH-Spheren

100 mg N-Benzyloxycarbonjrl-D-leucin wurden in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst und nach Zugabe von 10 ml aufgequollenem Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthylmethacrylats mit Aethylendimethacrylat (Spheren 300), welches durch Reaktion mit 1,6-Hexamethylendiamin modifiziert wurde, wurde der pH-Wert der Suspension durch 1 M HCl Lösung auf den Wert 4,7 adjustiert. Zur Suspension wurde dann innerhalb von 5 Minuten 1 ml 15?S-ige Lösung von 1-Aethyl-3(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimid des Methojodis zugetropft· Das Reaktionsgemisch wurde danach 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührto Nach dem Reaktionsende wurde das Gel mit 5OjS-iger Lösung von Dimethylformamid und Wasser durchgewaschen. Im Hydrolysat nach saurer Hydrolyse von dem« auf solche Weise hergestellten Gel wurde D-Leu«in bestimmt. Es wurde festgestellt, daß auf 1 ml aufgequollenes NH₂-Sphereη 300 3,6 yumol Z-D-Leucin (entspricht 13 /Jmοl/g Gel) angebunden wurden. Aus den in solcher Weise hergestellten Derivat des Z-D-Leucins wurde dann die Benzylcarbonylschutzgruppe durch

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die Reaktion von 2,5 g trockenem Gel mit 15 ml HBr-Lösung in Essigsäure (Raumtemperatur, 30 Minuten) abgespalten. Das Gel wurde mit Wasser, Aethanol und Aether durchgewaschen und zur Affinitätschromatographie der Aminopeptidase aus dem rohen proteolytischen Präparat vom Schimmelpilz Aspergillus Flavus verwendet.

300 mg dialysiertes rohes proteolytisches Präparat aus dem Schimmelpilz Aspergillus flavus (alkoholische Fällung der ZUchtungsflUssigkeit) wurden in 100 ml Puffer A (0,05 M TRIS-HCI + 0,01 M CaCI₂ -pH 8,0) aufgelöst. In die Lösung wurden 70 ml vom abgesaugten D-Leu-NH-Spheron (13 A)mol Leu/g Gel) zugegeben und 15 Minuten massig geschüttelt. Dann wurde die Lösung mit dem Gel in die Säule mit einem Durchmesser von 3 cm Übergetragen und mit Puffer A durchgewaschen· Fraktionen vom Volumen 18 ml wurden in den viertelstundigen Intervallen abgenommen. In den ersten 6 Fraktionen wurde das Material, welches alle Protessen mit Haemoglobinaktivität gemeinsam mit unaktiven Komponenten, enthielt, eluiert. Die Elution wurde fortgesetzt und es wurden weitere 14 Fraktionen gesammelt, in denen keine proteolytische Aktivität und kein Eiweissgehalt auf Grund der Absorptionsmessung bei 280 mi gefunden wurde. In der Säule wurden allerdings Verbindungen gehalten, die sämtlich Aminopeptidaseaktivität, die durch die Spaltung von L-Leucin-p- -nitranilid bestimmt wurde, aufweisen. Sämtliche Aktivität von Aminopeptidase wurde desorbiert und in einem scharfen "peak" durch Puffer B (Puffer A + 2 N NaCl-Lösung) eluiert. Das eluierte Material wies keine proteolytische Aktivität auf Haemoglobin auf.

Die Aktivität der Aminopeptidase wurde durch eine modifizierte Methode nach Pfleiderer (G. Pfleiderer. Methods in Enzycology 19 (1970) 514) bestimmt. Als Substrat fUr die Aktivitätsbestimmung diente 1,66 mH L-Leucin-p-nitranilid in 0,05 m TRIS-HCl Puffer pH 8,0. Die Menge des freigemachten Nitranilids nach der 10 Minuten Inkubation bei 37° wurde aufgrund der Absorption bei 405 nm gemessen. Als Substrat fUr

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die Messung der proteolytischen Aktivität wurden Lösungen von denaturierten Haemoglobin bei pH 6 und pH 8 benutzt· Die iiweisskonzentration in Lösungen wurde mit Hilfe des Folln's Roagens nach der von Leary ausgearbeiteten Methode (H.0, Leary et al· J· Biol. Chem. 193 (1951) 265) bestimmt. Die Einheit der enzymetischen Aktivität von Aminopeptidase wurde als Menge des Enzyms, welches 1 /umol p-Nitranilid pro Minute unter beschriebenen experimentellen Bedingungen frei macht, definiert. Die spezifische Aktivität wurde aus diesen Einheiten, die auf mg Eiweisstoff bezogen wurden, berechnet.

Die spezifische Aktivität des Ausgangsmaterials betrug 0,336 E./ mg Eiweisstoff (3 mg des dialysierten proteolytischen Präparat enthielten 0,5 mg Eiweisstoff)· Aus der vorgelegten Menge wurden 7,7 mg Aminopeptidase mit einer von spezifischen Aktivität 2,17 E./mg Eiweisstoff gewonnen.

Beispiel 6
Z-Glv-O-Pha-NH-Spheron

100 g Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthylacrylats mit Aethylendiacrylat (Spheron A) wurden durch Reaktion mit 1,6-Hexamethylendiamin und mit 10 g Benzyloxycarbonyl-glycyl-D-phenylalanin analogisch wie im Beispiel 1, chemisch modifiziert. 100 mg Chymotrypsin von niedriger Aktivität (Aktivität der Esterese auf N-Acetyl-L-tyrosinäthylester bei pH 7,9 gemessen betrug 135 /imol/min.mg) wurden in 200 nl 0,05 M TRIS-HCl Puffer pH 8,0 aufgelöst und es wurden 40 ml abgesaugte Z-Gly-D-Phe-LNH-Spheron A (Gehalt 70yomol/leu/g Gel) zugegeben und 15 Minuten massig geschüttelt. Nach Übertragen auf die Säule (dieselben Maße wie im Beispiel 1) wurde die Elution mit TRIS-HCl Puffer 0,05%iit dem ähnlichen Resultat wie im Beispiel 1 durchgeführt.

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Beispiel 7

1 g Mischpolymerisat von 2-Hydroxypropylmethacrylamid mit Aethylendimethacrylat mit der Ausschlußgrenze des Molekulargewichtes 300.000, welches dem tschechoslow· Urheberschein Nr* ·.······. (PV 2879-74) entsprechend hergestellt wurde, wurde durch die Reaktion mit BrCN aktiviert und mit 1,6-Hexamethylendiamin dem tschechoslow· Urheberschein Nr. ·.···.. (PV- 2106-72) entsprechend reagieren gelassen. Das entstandenen Produkt wurde auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 mit 90 mg Benzyloxycarbonyl-glycyl-D-l.eucin in 5 ml Tetrahydrofuren kondensiert. Nach dem Durchwaschen und Austrocknen wurde der Sorbent zu der Affinitätschromatographie von Chymotrypsin verwendet.

Beispiel 8

1 g Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthylhexaxymethacrylats mit Trimethyloläthantrimethacrylat, welches nach dem tschechoslow· Urherberschein Nr. 154.386 mit der Ausschlußgrenze 100.000 hergestellt wurde, wurde mit Bromcyan aktiviert und mit Aethylendiamin (nach PV-2106-72) reagieren gelassen· Das entstandene Produkt wurde ähnlich wie im Beispiel 1 mit 80 mg Z-Gly-D-Ph-L-Leucin in 50 ml Tetrahydrofuran kondensiert. Nach dep Durchwaschen und Austrocknen wurde der Sorbent zur Affinitätschromatographie des Chymotrypsins verwendet.

Beispiel 9

1 g Mischpolymerisat des Tetraäthylglykolmono-methacrylats mit 2,2'-dimethylglykolmonomethacrylat und 2,2'-Dimethylpropantrioldimethacrylat mit der Ausschlußgrenze 500.000 wurde mit Bromcyan aktiviert und mit 1,10-Decandiamin reagieren gelassen. Das entstandene Produkt wurde im 5 ml Tetrahydrofuran mit D-Phenylalanin kondensiert und nach dem Durchwaschen und Austrocknen zur Affinitätschromatographie von Chymotrypsin verwendet.

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Claims

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Spezifische Sorbenten, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem hydrophilen polymeren Träger, welchen Mischpolymerisate von Hydroxyalkylestern und Hydroxyalkylamiden der Acryl- und Methacrylsäure mit vernetzenden Acrylat- und Methacrylat-Coaonomeren darstellen, die D-Aminosäure oder das die D-Aminosäureeinheiten enthaltende Peptid durch kovalente Bindung gebunden wird.

2· Spezifische Sorbenten nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der hydrophile Träger einen makroporösen Charakter besitzt·

3· Spezifische Sorbenten nach Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikeln des Suspensionsmischpolymerisats sphärische Form haben·

4· Verfahren zur Herstellung von Sorbenten nach Patentansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Hydroxyalkylacrylat- Hydroxyalkylmethacrylat-, Alkylamid- oder Methacrylamid-Gele mit Verbindungen, welche carboxyterminale oder aminoterminale Funktionsgruppe enthalten, aus der Gruppe von Diaminen mit bis 10 Kohlenstoffatomen, oder von Aminosäuren oder Dicarboxylsäuren mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen versetzt, wonach man diese carboxyterminale oder aminoterminale Gruppen in Üblicher . Weise mit den D-Analoga von Aminosäuren oder von den in der Kette D-Aminosäureeinheiten enthaltenden Peptiden kondensiert.

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5. Verfahren zur Herstellung von spezifischen Sorbenten nach Patentansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß nan das in der Kette D-Aminosäure enthaltende Peptid auf der Oberfläche des Trägers durch kontinuierliche Kondensation synthetisiert.

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