DE3855191T2

DE3855191T2 - Membranen mit gebundenen Oligonukleotiden oder Peptiden

Info

Publication number: DE3855191T2
Application number: DE3855191T
Authority: DE
Inventors: James M Coull; Hubert Koester
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1987-09-04
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2008-08-27
Also published as: US4923901A; EP0305929A2; DE3855191D1; JPH01151596A; EP0305929A3; EP0305929B1

Description

Hintergrund der Erfindung

In den vergangenen Jahren wurde auf biotechnologischem Gebiet in großem Umfang von der Festphasenbiochemie Gebrauch gemacht (beispielsweise "Solid Phase Biochemistry - analytical and synthetic aspects", Herausgeber W.H. Scouten, Verlag John Wiley & Sons, New York, 1983). Die meiste Beachtung fanden die Affinitätschromatographie (beispielsweise "Affinity Chromatography - a practical approach", Herausgeber P.D.G. Dean, W.S. Johnson & F.A. Middle, Verlag IRL Press Ltd., Oxford, 1986 und "Nucleic Acid Hybridization - a practical approach", Herausgeber B.D. Hames & S.J. Higgins, Verlag IRL Press Ltd., Oxford, 1987), immobilisierte Enzyme und Zellen (beispielsweise "Immobilized Cells and Enzymes - a practical approach", Herausgeber J. Woodward, Verlag IRL Press, Oxford, 1985), Festphasenpeptide (beispielsweise G. Barany & R.B. Merrifield in "The Peptides", Bd. 2, Herausgeber E. Gross und J. Meienhofer, Verlag Acedemic Press, New York, 1979) und die Oligonucleotidsynthese (beispielsweise oligonudeotide Synthesis - a practical approach", Herausgeber M.J. Gait, Verlag IRL Press Ltd., Oxford, 1984). In nahezu sämtlichen in den aufgeführten Literaturstellen beschriebenen Fällen werden die Nudeinsäuren oder Peptide/Pro teine an perlenförmigen Werkstoffen, wie Cellulose, Glasperlen, Sephadex, Sepharose, Agarose, Polyacrylamid, porösem teilchenförmigem Aluminiumoxid, Hydroxyalkylmethacrylatgelen, diolgebundenem Siliciumdioxid oder porösen Keramikwerkstoffen, entweder adsorbiert oder nichtspezifisch gebunden. Flache Werkstoffe, z.B. Rundfilter aus Nylon und Nitrocellulose, dienen sehr häufig zur Immobilisierung von Nudeinsäuren bei Hybridisierungsversuchen durch Adsorption. Bei einigen Anwendungen auf diesem Gebiet wird chemisch modifiziertes Papier eingesetzt. Cellulose wird entweder mit einem Diazobenzyloxymethyl- (vgl. J.C. Alwine und Mitarbeiter in "Methods in Enzymology", Bd. 68, Herausgeber R. Wu, Verlag Academic Press, New York und London, S. 220, 1979) oder einem o-Aminophenylthioether- (vgl. B. Seed, "Nucleic Acids Res., Bd. 10, S. 1799, 1982) Derivat funktionalisiert. In beiden Fällen führt dies zu einer nichtspezifischen kovalenten Bindung von Nucleinsäuren an das Papier. Bei einem weiteren Versuch wurde die Oberfläche von aus Vinylacetat/Ethylen-copolyineren hergestellten röhren- oder schlauchförmigen Gebilden chemisch aktiviert, um für ein nichtspezifisches kovalentes Haftenbleiben von Proteinen an der Röhren- oder Schlauchoberfläche zu sorgen (vgl. G. Manecke und H.G. Vogt in "J. Solid-phase Biochem.", Bd. 4, S. 233, 1979). Es sei darauf hingewiesen, daß in letzterem Falle keine poröse Struktur verfügbar ist, um eine signifikante Menge von an dein Träger zu bindenden Molekülen zu liefern.
In jüngster Zeit wurde der Entwicklung von Verfahren zur ortspezifischen kovalenten Bindung biologischer Moleküle an festen Trägern zunehmend Beachtung geschenkt. Zur Affinitätsreinigung komplementärer Nudeinsäuren und zur sequenzspezifischen Bindung von Proteinen sowie als Reaktanten bei enzymatischen Ligationsreaktionen wurden bereits kovalent an perlenförmige Matrizen wie Cellulose, kovalent gebundene synthetische DNA-Moleküle (vgl. P.T. Gilham in "Methods in Enzymology", Herausgeber L. Grossman & K. Moldave, Bd. 21, Teil D, S. 191, Verlag Academic Press, New York und London, 1971 und J.T. Kodanaga & R. Tjian in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Bd. 83 S. 5889, 1986), Glasperlen mit gesteuerter Porosität (vgl. T. Mizutani & Y. Tachibana in "J. chromatogr.", Bd. 356, S. 202, 1986) sowie Latexmikrokügelchen (vgl. J.N. Kremsky und Mitarbeiter in "Nucleic Acids Res.",Bd. 15, S. 2891, 1987) verwendet. In gleicher Weise wurden auch bereits an die (den) verschiedensten perlenförmigen Trägern einschließlich Sepharose und Agarose gebundene bzw. haftende synthetische Peptide in großem Umfang zur Affinitätsisolie rung von Enzymen (vgl. P. Cuatrecasas, M. Wilchek und C.B. Anfinsen in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Bd. 61, S. 636, 1968), Antikörpern (vgl. E. Hurwitz und Mitarbeiter in "Eur. J. Biochem.", Bd. 17, S. 273, 1970) und sonstigen Proteinen (vgl. B. Penke und Mitarbeiter in "J. Chromatogr.", Bd. 376, S. 307, 1986) verwendet.
Die Synthese von Affinitätsmatrizen umfaßt üblicherweise die Reaktion einer trägergebundenen elektrophilen funktionellen Gruppe mit einer nudeophuen Gruppe in dem Oligonucleotid oder in dem Peptid. Andererseits kann die elektrophile funktionelle Gruppe auch auf dem biologischen Molekül vorliegen und eine Reaktion mit einer nudeophilen Gruppe auf dem polymeren Träger eingehen.
Noch öfter werden Peptide an feste Träger über die verschiedensten reaktionsfähigen funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten sowie über die Amino- und Carboxylenden des biologischen Polymers gekuppelt. Oligonucleotide können nur vergleichsweise schwieriger zur Bindung an feste Träger gebracht werden, da sie keine starken nudeophilen oder elektrophilen Zentren enthalten. Folglich wurden eine Reihe von Verfahren und Reagenzien beschrieben, die die chemische Synthese von Oligomeren mit reaktionsfähigen funktionellen Gruppen an festgelegten Stellen im Molekül, vorzugsweise an einem der Enden des biologischen Polymers, gestatten (vgl. beispielsweise J.M. Coull und Mitarbeiter in "Tetrahedron Lett.", Bd. 27, S. 3991, 1986; S. Agrawal und Mitarbeiter in "Nucleic Acids Res.", Bd. 14, S. 6227, 1986; B.A. Conolly in "Nucleic Acids Res.", Bd. 15, S. 3131, 1987 und B.A. Conolly und P. Rider in "Nucleic Acids Res.", Bd. 12, S. 4485, 1985).
Da beide Versuche die Synthese und Isolierung eines Oligonucleotids oder Peptids vor der Befestigung an der festen Matrix erfordern, würde die direkte Festphasensynthese des biologischen Moleküls auf dem Träger eine signifikante Verbesserung darstellen. Auf diese Weise läßt sich der Affinitätsträger auf direktem Wege bereitstellen. Zwei bekannte Beispiele für diesen Versuch sind die chemische Synthese von Oligo-dT auf Celluloseperlen (P.T. Gilham, vgl. oben) für die Affinitätsisolierung einer einen Poly-A-Schwanz enthaltenden MRNA und die Synthese von kurzen Peptiden auf Polyethylenzapfen zur Antikörperepitopkartierung unter Benutzung der spezifischen Affinitäten bestimmter Aminosäuresequenzen auf dem Antikörper für eine starke und spezifische Reaktion mit dem Antigen (vgl. H.M. Geysen und Mitarbeiter in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Bd. 82, S. 3998 (1984)). Polyethylenzapfen eignen sich lediglich für sehr spezielle Zwecke und kranken wegen ihrer nichtporösen Struktur an einer extrem geringen Beladung mit immobilisierten biologischen Molekülen. Bei einer Beschreibung eines Verfahrens zur gleichzeitigen chemischen Synthese verschiedener Oligonucleotide wurden Papierscheiben benutzt (DE 3301833 und EP 114599). Dieses Material ist als Affinitätsträger nicht empfehlenswert, da das Material offensichtlich den Einsatz der bekannten Phosphoramiditchemie zur Konstruktion langer Oligondeotide mit mehr als 100 Nudeotideinheiten in der Sequenz nicht zuläßt (vgl. N.D. Sinha und Mitarbeiter in "Nucleic Acids Res.", 12:4539 (1984)). Mit der Phosphattriestermethode (vgl. beispielsweise M. Gait oben) lassen sich mit der Papierscheibenmethode lediglich relativ kurze Oligonucleotide (im Bereich von 20 Nudeotideinheiten enthaltenden Sequenzen) herstellen. Darüber hinaus wird nach einigen wenigen Synthesezyklen unter Einsatz der erforderlichen Behandlung mit unterschiedlichen Reagenzien und Waschstufen das Papier sehr reißanfällig (zerbrechlich) und verliert seine mechanische Stabilität. Bislang konnten auf Papier keine Peptide synthetisiert werden. Höchst wahrscheinlich reißt infolge der zur Peptidsynthese erforderlichen drastischen Bedingungen die Cellulosematrix. Somit können durch chemische Synthese von Oligonucleotiden oder Peptiden auf Papier als festem Träger keine Affinitätsträger hergestellt werden.
Nudeinsäuren und Peptide oder Proteine wurden bereits auf perlenförmigen und flachen polymeren Trägern entweder durch Adsorption oder durch nichtspezifische kovalente Bindung immobilisiert. Zur Vermittlung einer wirksamen und spezifischen Wechselwirkung durch Hybridisierungs- oder Affinitätstechniken zwischen den löslichen und immobilisier ten biologischen Molekülen wäre eine spezifische kovalente Bindung des biologischen Moleküls unter Beteiligung lediglich einer endständigen funktionellen Gruppe optimal. Dies würde die gesamte Sequenz des immobilisierten biologischen Moleküls für eine Wechselwirkung mit dem komplementären Molekül in (der) Lösung verfügbar machen. Bei einer Adsorption oder nichtspezifischen kovalenten Bindung sind jedoch mehrere funktionelle Gruppen in dem biologischen Molekül beteiligt, die dann für die gewünschte intermolekulare Wechselwirkung nicht mehr verfügbar sind. Nachteilig an der Adsorption ist ferner, daß einige der immobilisierten biologischen Moleküle während des Hybridisierungs- oder Affinitätsverfahren ausgewaschen (desorbiert) werden können. Dies ist insbesondere zu beachten, wenn der Affinitätsträger mehrmals wiederverwendet werden soll.
Während die endspezifische kovalente Befestigung von Oligonucleotiden oder Peptiden an festen Trägern unter Benutzung einer stufenweisen Synthese mit Hilfe von perlenförmigen Trägern oder Papierscheiben (im Falle von Oligonucleotiden) oder perlenförmigen Trägern und Polyethylenzapfen (im Falle von Oligopeptiden) durchgeführt wurde, wurde bislang noch nicht über eine Synthese dieser biologischen Polymere mit Hilfe meinbranartiger Träger berichtet.
Eine Membran, d.h. ein flacher und hoch poröser, mechanisch stabiler Werkstoff, wäre als Affinitätsträger in hohem Maße von Vorteil, da sie leicht handhabbar ist, auf verschiedene Größen zugeschnitten, zur Produktion in größerem Maßstab aufeinander gestapelt und mehrmals wiederverwendet werden kann. Weiterhin sollte der Träger unter den Bedingungen einer Oligonucleotid- und Peptidsynthese chemisch stabil sein und kein nichtspezifisches Binden von entweder Nudeinsäuren oder Proteinen zeigen, da dies eine empfindlichkeitsvermindernde Hintergrundwechselwirkung bedingen könnte. Die Entwicklung eines diesen unterschiedlichen Anforderungen genügenden Affinitätsträgers stellt keine triviale Aufgabe dar. Darüber hinaus läßt sich auch nicht vorhersagen, ob auf einem solchen unlöslichen Träger eine direkte chemische Synthese von Oligonudeotiden oder Peptiden möglich ist. Wie bereits ausgeführt, konnte Papier lediglich bei Durchführung des Phosphotriestervervahrens als Träger für eine Festphasenoligonucleotidsynthese dienen. Aus noch nicht geklärten Gründen funktionierte die sehr erfolgreich auf porösen Glasperlen durchgeführte, weit wirksamere und bekannte Phosphoamiditchemie auf Papier nicht.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden (DNA und/oder RNA-Fragmenten) oder Peptiden, die kovalent und spezifisch an Membranen gebunden sind. Die Erfindung betrifft ferner Membranen zur Synthese von Oligonudeotiden und Peptiden und Membranen mit daran durch endspezifische Bindung (das biologische Polymer ist an einem seiner Enden kovalent gebunden) gebundenen Oligonucleotiden oder Peptiden.
Gegenstand einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Membran, umfassend ein mikroporöses Polymer einer Porengröße im Bereich von 0,1 bis 5,0 µm, an welche - austauschbar - ein(e) geschützte(s) Nucleosid oder Aminosäure gebunden ist.
Nach dem Verfahren gemäß dieser Erfindung wird eine durch die Formel
P--S--Y-N-Z--SW
darstellbare modifizierte Membran verwendet.
In der Formel bedeutet P einen polymeren Membranträger, an den ein(e) geschützte(s) Nucleosid oder Aminosäure SW mit W gleich Schutzgruppen über ein Verbindungsglied bzw. einen Linker Y-N-Z gebunden ist. N steht für eine Abstandsgruppe. Y und Z bedeuten dieselben oder verschiedene funktionelle Grup pen. Das Verbindungsglied bzw. der Linker ist an die Membran über eine funktionelle Gruppe X auf der Membran gebunden.
Die Membran ist chemisch derart funktionalisiert, daß (darauf) der erste Nucleotid- oder Peptidbaublock verankert wird. Zur Minimierung einer sterischen Hinderung durch das Membranrückgrat wird zwischen dem Polymerrückgrat und dem ersten verankerten Baublock eine geeignete Abstandsfunktion eingeführt. Die Synthese der spezifischen Biopolymersequenz erfolgt entweder manuell oder als automatisierte Synthese. Man kann Standardchemieprotokolle für die stufenweise Konstruktion von entweder Oligonucleotiden oder Peptiden verwenden. Nach dem Zusammenbau der gewünschten speziellen Sequenz können die Schutzgruppen zur Erzeugung biologisch funktioneller Moleküle entfernt werden.
Je nach Bindung an die Membran kann das synthetisierte biologische Polymer entweder für die folgende Charakterisierung und/oder Identifizierung abgespalten oder in ungeschützter Form auf der Membran belassen werden. Im letzteren Fall kann es zur Wechselwirkung mit sonstigen Molekülen über eine Hybridisierung oder sonstige Reaktionen spezifischer Affinität benutzt werden. Dies ist für die Reinigung und den Nachweis von beispielsweise Nudeinsäuren, wie mRNA, genomischen DNA-Sequenzen und rRNA sowie zum Nachweis von Organismen und Viren sowie Enzymen und Antikbrpern von Bedeutung.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt einen speziell gestalteten Halter für eine Membran zur Synthese eines Oligonucleotids oder Oligopeptids;
Fig. 2 zeigt ein HPLC-Chromatogramm des hexadecameren Oligonucleotids;
Fig. 3A zeigt eine PAGE-Analyse eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten hexadecameren Oligonucleotids;
Fig. 3B zeigt das Sequenzgel für das hexadecamere Oligonucleotid;
Fig. 4 zeigt ein HPLC-Chromatogramm eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten Nonapeptids und
Fig. 5 zeigt ein HPLC-Chromatogramm des hydrolysierten Nonapeptids in Form von PTC-derivatisierten Aminosäuren.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der als Ausgangsmaterial für die Synthese von entweder Oligonucleotid- oder Peptidsequenzen dienende feste Träger besitzt die allgemeine Formel (1)
P--X--Y-N-Z--SW (1).
In dieser Formel bedeuten P das die poröse Membranstruktur umfassende polymere Grundmaterial und X eine funktionelle Gruppe auf dem polymeren Material, die eine Verankerung des ersten synthetischen Baublocks S (eines (einer) in geeigneter Weise geschützten Nucleosids oder Aminosäure) an der Membran über das Abstandsglied N, das zwei gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen Y und Z aufweist, gestattet. W steht für Schutzgruppen für die Nucleosid- oder Aminosäureeinheit. Obwohl S als einzelner anfänglicher Baublock dargestellt ist, kann S selbstverständlich auch für ein dimeres, trimeres oder oligomeres Ausgangsmaterial stehen. So kann beispielsweise S ein geschütztes Nucleosid-Nucleotid-Dimer bedeuten. Diese anfängliche Kette kann dann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verlängert werden. Bei einigen Ausführungsformen kann an S ein zweiter Linker mit einer funktionellen Gruppe, von der aus das biologische Polymer synthetisiert werden kann, befestigt werden.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbare Membranen sind flache, permeable, polymere Werkstoffe poröser Struktur mit einer funktionellen Gruppe X (die für den Polymergrundstoff nativ oder - wie unten beschrieben - in das membranartige Polymer eingeführt ist) zur Befestigung des ersten Nucleotid- oder Peptidbaublocks. Die folgenden vier Arten von Polymeren eignen sich zur Herstellung der für den Erfindungszweck geeigneten Affinitätsmembranen:
A: Copolymere, die aufgrund des Vorhandenseins funktioneller Gruppen in den jeweiligen Monomeren, z.B. Acryl (oder Methacryl)säureester mit einer freien Funktionalität im Alkoholteil der Esterfunktion, wie (CH&sub2;)nCH&sub2;-OH,
- (CH&sub2;)n-CH(CH&sub3;)-OH (n=2-10) oder einer aktiven Esterfunktion, wie -COOR mit R beispielsweise gleich Pentafluorphenyl, p-Nitrophenyl, Methoxymethylen oder einer Lactonfunktion, die direkt mit einem Nudeophil reagieren kann, funktionelle Gruppen enthalten. Ähnliche Arten von Polymeren lassen sich durch Vernetzen von Dialkylsilandiolen oder Polydialkylsiloxanen, Polyvinylalkohol, Polyoxymethylen oder Polyoxyethylen mit geeigneten Vernetzungsmitteln, wie Terephthaldehyd, Carbonsäuredichloriden oder Bisisothiocyanaten, gewinnen.
B: Polymere, in die durch chemisches Modifizieren funktionelle Gruppen eingeführt werden können, z.B. vernetztes Polystyrol, Polysulfon mit aromatischen Resten, Polyester, Polyamide, Polycarbonate und Polyvinylacetat. Polymere mit aromatischen Resten können beispielsweise durch Friedel- Crafts-Acylierung und anschließende Reduktion oder Grignard- Reaktion modifiziert werden. Sonstige Arten von Polymeren können durch Teilhydrolysereaktionen freie funktionelle Gruppen liefern. Polyvinylidendifluorid (PVDF) kann durch Dehydrohalogenieren funktionelle Gruppen (Doppelbindungen) liefern.
C: Chemisch inerte Polymere, wie Polysulfone, Polytetrafluorethylen (Teflon ), Polyethylen, Polypropylen und Polyvinylidendifluorid (PVDF), können durch Bestrahlen beispielsweise mit hochenergetischer UV-Strahlung oder Cobalt-60 aktiviert werden. Die hierbei erzeugten Ionen oder Radikale können zum Aufpfropfen von Ketten, die Monomere mit funktionellen Gruppen entsprechend A und/oder B enthalten, auf die Oberfläche des Polymers benutzt werden.
D: Chemisch inerte Polymere, wie Polysulfone, Polytetrafluorethylen (Teflon ), Polyethylen, Polypropylen und Polyvinylidendifluorid (PVDF) können mit Copolymeren, die bereits freie funktionelle Gruppen enthalten (A) oder ohne Schwierigkeiten nach üblichen chemischen oder physikalisch chemischen Verfahren zur Erzeugung funktioneller Gruppen transformiert werden können (B, C), beschichtet werden. Einen anderen Untertyp erhält man durch Vernetzen von beispielsweise Polyvinylalkohol auf der Oberfläche der genannten Polymere, Erzeugung von Diradikalen durch Umsetzen der cis-Diol struktur mit Cer(IV)nitrat und Benutzung der Radikale zur Einleitung eines Pfropfverfahrens mit Monomeren gemäß A und/oder B.
Y-N-Z ist eine bifunktionelle Gruppe, in der Y mit der funktionellen Gruppe X auf dem Polymer reagiert und über Z eine Bindung an den ersten Synthesebaublock in Form entweder eines geeignet geschützten Nucleosid- oder Aminosäurederivats vermittelt. N steht für ein Abstandsglied. Sämtliche geeigneten Abstandsglieder, z.B. substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Aryl- oder Arylalkylgruppen können eingesetzt werden. So kann beispielsweise N für ein variables Abstandsglied aus n CH&sub2;-Gruppen mit n gleich 1 - 20 stehen. Den Abstand erreicht man auch durch Ketten, wie Oligoglycin oder -NH- (CH&sub2;)m-NHCO-(CH&sub2;)m-CO mit m beispielsweise gleich 1 - 6. Y und Z können gleich oder verschieden sein und aus den verschiedensten funktionellen Standardgruppen, wie
ausgewählt sein. In den Gruppen bedeutet R Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Cycloalkyl.
S steht für einen auf dem Membranträger P verankerten, in geeigneter Weise geschützten ersten Baublock, z.B. ein Nucleosid oder eine Aminosäure. Das Nucleosid entspricht der Formel:
worin W" für H oder eine geeignete Hydroxyschutzgruppe, z.B. Trityl-, Acyl- oder Silylgruppen, steht. B steht für eine Nucleosidbase, wie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil oder Anologe dieser Basen. W' kann beispielsweise für eine allgemein zum Schutz von exocyclischen Aminogruppen auf den heterocyclischen Nucleosidbasen verwendete, baselabile Acylgruppe stehen. Das Nucleosid ist an die Membran im allgemeinen über die 3'-Stellung gebunden, es kann jedoch auch in 5'-Stellung gebunden sein. Wenn die Befestigungsstelle an die Membran die 3'-Stellung ist, kann das 5'-Kohlenstoff eine geschützte Hydroxygruppe enthalten. Bevorzugte Schutzgruppen für die 5'-Hydroxygruppe sind 4,4'-Dimethoxytrityl- oder 4,4',4"-Trimethoxytritylgruppen.
Der Aminosäurebaublock entspricht der Formel:
Dieser ist über seine Carboxy- oder Aminofunktion an die funktionelle Linkergruppe Z gebunden. U steht für eine Aminosäureseitenkette, beispielsweise natürlich vorkommende Aminosäureseitenketten oder modifizierte Versionen hiervon. Als Aminosäurebaublocks können an die Membran entweder die L- oder die seltenen D- oder modifizierte Aminosäuren, wie β- oder N-Methylaminosäuren gebunden werden. W' steht für (eine) Seitenkettenschutzgruppe(n). Wenn die Aminosäure an das Abstandglied über seine Carboxyfunktion gebunden ist, steht W" für eine Schutzgruppe für die primäre Aminofunktion, z.B. für Fluorenylmethoxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl. W"' steht für eine Schutzgruppe für die Carboxygruppe, z.B. eine Pentafluorphenylgruppe.
Die Affinitätsineinbran der Formel (1) dient als fester Träger für die Synthese spezifischer und biologisch relevan ter Oligonucleotid- oder Peptidsequenzen. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert Membranen mit daran durch endspezifische Befestigung (Befestigung über eines der Enden des biologischen Polymers) gebundenen biologischen Polymeren. Im allgemeinen werden die Membranen mit dem gebundenen biologischen Polymer durch folgende Formel wiedergegeben:
P--X--Y-N-Z-(SW)n
Hierin bedeutet n die Anzahl der Nucleotid- oder Aminosäureeinheiten in dem Polymer (diese Zahl ist lediglich durch die Fähigkeit der benutzten Synthesechemie beschränkt). Wie später noch eingehender diskutiert werden wird, können die biologischen Polymere auf der Membran in geschützter oder teilgeschützter Form verbleiben oder vollständig entschützt werden, um die natürliche Form des Polymers zu liefern. Membranen mit entschützten biologischen Polymeren lassen sich durch folgende Formel wiedergeben:
P--X--Y-N-Z-(S)n
In der Formel besitzen P, X, Y, N, Z und n die angegebene Bedeutung. S steht für eine entschützte Nucleotid- oder Aminosäureeinheit des Polymers.
Die Synthesen des biologischen Polymers auf der modifizierten Membran gemäß Formel (1) können entweder manuell oder in einer automatischen Synthesevorrichtung durchgeführt werden. Als Meinbranhalter für entweder die manuelle oder automatisierte Synthese kann die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung benutzt werden. Sie gestattet einen raschen Durchfluß von Lösungsmitteln und Reagenzien und führt infolge hoher Diffusionsraten zu raschen und quantitativen Reaktionen. Diese Vorrichtung belegt ferner die Leichtigkeit der Handhabung des membranartigen Materials, d.h. den Vorteil dieses Syntheser verfahrens zur Herstellung von (auch bezüglich ihres späteren Einsatzes) Affinitätsträgern.
Zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde eine Immobilon-Affinitätsmembran (IAM, 2; Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA) mit reaktionsfähigen elektrophilen funktionellen Gruppen mit 1,2-Diaminoethan (3, n=2) oder 1,6-Diaminohexan (3, n=6) behandelt, wobei entsprechend Schema I eine Aminoalkyl-IAM 4 (n--2 oder 6) erhalten wurde.

Synthese von Oligonucleotiden:

Der erste Nucleosidbaublock ist an die Membran üblicherweise über die 3'-OH-Funktion gebunden, obwohl auch eine Bindung über die 5'-OH-Funktion möglich ist. Das Schema II zeigt die Bindung eines Desoxynucleosidbaublocks 5 an die Aminoalkyl-IAM 4 über die 3'-OH-Funktion nach einem bekannten Verfahren unter Bildung einer Membran, an die ein Nucleosidbaublock spezifisch und kovalent gebunden ist (6). Ein in geeigneter Weise geschützter Ribonucleosidbaublock kann in im wesentlichen gleicher Weise an die Membran gebunden werden. Zur Herbeiführung der kovalenten Verankerung von Nudeosiden an einem festen Träger und zur Konstruktion von Oligonucleotiden kann man sich auch anderer bekannter Verfahren bedienen.
Im folgenden wird das Phosphoramiditverfahren zur Synthese eines Oligonucleotids auf dem Membranträger beschrieben. Es umfaßt folgende Stufen:
a) Benutzung eines Protons oder von Lewis-Säuren zur Entfernung der 4,4-Dimethoxytrityl (DMT)-Schutzgruppe;
b) Kuppeln eines 5'-DMT- und N-geschützten 3'- Phosphoramidits nach Aktivierung mit einem geeigneten Aktivator, z.B. Tetrazol oder 4-Nitrophenyltetrazol, an die freie 5'-OH-Gruppe des meinbrangebundenen Desoxynucleosids;
c) Überkappen nicht-umgesetzter 5'-OH-Gruppen des immobilisierten Desoxynucleosids (oder Oligonucleotids) mit Reagenzien wie Essigsäureanhydrid/N,N-Dimethylaminopyridin zur Verminderung des Auftretens fehlerhafter Sequenzen und
d) Oxidieren der dreiwertigen Phosphittriesterbindung mit Reagenzien, wie Jod/2,6-Lutidin/Wasser zu der fünfwertigen Phosphattriesterbindung.
Zwischen den verschiedenen Reaktionsstufen des Verlängerungscyclus bedient man sich geeigneter Waschstufen. Die Stufen a) bis d) werden unter Benutzung des richtigen Baublocks in Stufe b) bis zur Erzeugung der gewünschten Oligonucleotidsequenz wiederholt.
Vorzugsweise bedient man sich der Beta-Cyanoethylphosphoramiditchemie (vgl. Sinha und Mitarbeiter in "Nucleic Acids Res.", 12: 4539 (1984) sowie ferner US-Patentanmeldung Nr. 752 178, angemeldet am 18. Juni 1985, auf deren Lehren hierin Bezug genommen wird). Diese Techniken umfassen die Kupplung eines nucleosid-beta-cyanoethylgeschützten Phosphoramidits an das membrangebundene Nucleosid zur Herstellung eines meinbrangebundenen Nucleosid-Nucleotids mit einem Phosphittriester, oxidieren des Phosphittriesters zur Bildung einer Phosphattriesterbindung und sequenzielles Kuppeln weiterer nucleosid-beta-cyanoethylgeschützter Phosphoramidite an das membrangebundene Nucleosid-Nucleotid und - nach jedem Kopplungsschritt - Oxidieren der erhaltenen Phosphittriesterbindung zur Herstellung eines meinbrangebundenen Polynucleotids.
Zur Verwendung der Oligonucleotidmembran als Affinitätsträger für Hybridisierungsversuche müssen die N-Schutzgruppen der Nucleosidbasen entfernt werden, um eine Watson-Crick- Basenpaarung zu ermöglichen. Üblicherweise wird auch die Phosphatschutzgruppe (beispielsweise Beta-Cyanoethyl) zur Erzeugung der natürlich vorkommenden Internucleotidbindung (Phosphodiesterbindung) entfernt. Es kann jedoch von Vorteil sein, die Phosphatschutzgruppen zu erhalten. In einigen Fällen (beispielsweise bei der Synthese nicht natürlicher Oligomethylphosphonatdiester) bleibt die Internucleotidbindung "geschützt". Das synthetisierte Oligonucleotid kann auch von der Membran abgespalten werden. Es hängt von der Wahl der X--Y-N-Z-Funktionen (Formel 1) und der Wahl der Phosphat- und N-Schutzgruppen (und 2'-OH-Schutzgruppen im Falle einer Oligoribonucleotidsynthese) ab, ob das Oligonucleotid an die Membran gebunden bleibt (wie dies erforderlich ist, wenn die Membran als Affinitätsträger dienen soll) oder vom Träger während oder nach der Entschützung abgespalten wird. Es stellt ein vorteilhaftes Merkmal dieser Erfindung dar, daß aus den großen Auswahlmöglichkeiten an aus dem Stand der Technik bekannten Schutzgruppen eine Auswahl getroffen werden kann, die es gestattet (durch Einhaltung unterschiedlicher Bedingungskombinationen), das Oligonucleotid entweder von der Membran abzuspalten oder auf der Membran nach geeigneter Entschützung zur Ermöglichung einer Hybridisierung auf der Mem bran zu belassen. In einigen Fällen sollte ein sequenzspezifisches Optimierungsverfahren ausgearbeitet werden, um für hohe Ausbeuten und ein homogenes Produkt zu sorgen. Für ein solches Optimierungsverfahren ist es erforderlich, das oligomere Produkt zu identifizieren und zu charakterisieren. Nachdem die optimalen Bedingungen einmal herausgearbeitet sind, wird der Affinitätsträger durch Entfernen lediglich derjenigen Schutzgruppen, die erforderlich sind, um das Affinitätsverfahren stattfinden zu lassen, hergestellt.

Peptidsynthese:

Bei der bekannten Peptidsynthese werden vor der Verankerung des ersten Aminosäurebaublocks an dem festen Träger die nicht natürliche Aminosäure Norleucin und ein spezielles Linkermolekül an dem festen Träger gebunden. Der Norleucinrest dient als interner Standard für die nachfolgende Aminosäureanalyse des synthetisierten Oligopeptids. Das Linkermolekül sorgt für eine Benzylalkoholfunktion zur Veresterung des ersten Aminosäurebaublocks an dem festen Träger. Es sind die verschiedensten Linkermoleküle in Gebrauch. Diese unter scheiden sich in der Reaktionsfähigkeit der Esterbindung (vgl. beispielsweise R.L. Sheppard & B.J. Williams in "Int. J. Peptide & Protein Res.", Bd. 20, S. 451, 1982).
Das Schema III beschreibt die Herstellung der Immobilon- Affinitätsmembran IAM 4 (n=2) für die Peptidsynthese. Zunächst wird 4 mit dem aktiven Pentafluorphenyl (Pfp)-Ester von Norleucin 7, der an der primären Aminofunktion mit der Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe geschützt ist, zu 8 umgesetzt. Die restlichen Aminogruppen von 4 werden mit Essigsäureanhydrid (Stufe a von Schema III) überkappt. Anschließend wird die Fmoc-Gruppe durch Behandeln mit 20% Piperidin in N,N-Dimethylformamid (Stufe b von Schema III) entfernt, wobei 9 entsteht. Danach wird die primäre Aminogruppe von 9 mit dem Pentafluorphenylester des Linkermoleküls 10 umgesetzt, wobei das zur Veresterung mit dem ersten Aminosäurebaublock über sein Carboxylende bereite Membranderivat 11 erhalten wird. Die Wahl von p-Hydroxymethylphenoxyessigsäure als Verbindungsmittel sorgt für eine säurelabile Bindung an die synthetisierte Peptidsequenz. Der erste Aminosäurebaublock 12 wird über sein symmetrisches Anhydrid in Gegenwart von N,N-Dimethylaminopyridin als Katalysator an 11 gekuppelt, wobei das nunmehr ein kovalent und spezifisch gebundenes geschütztes Aminosäurederivat tragende Membranderivat 13 entsteht.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden unter Verwendung von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) als Aktivator Fmoc-geschützte Aminosäurepentafluorphenylester verwendet. Ein Verlängerungzyklus besteht aus folgenden Stufen:
a) Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe von 13 durch Behandeln mit 20% Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF);
b) Kuppeln eines Fmoc-geschützten Aminosäure Pfp- Esters an die primäre Aminofunktion auf der Membran unter Verwendung von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) als Aktivator zur Erzeugung der ersten Peptidbindung und
c) Überkappen der nicht umgesetzten primären Aminofunktionen durch Behandeln mit Essigsäureanhydrid.
Die Stufen a) bis c) werden durch Wahl richtiger geschützter Aminosäurederivate bis zur Verknüpfung des letzten Baublocks mit der Kette zur Erzeugung der gewünschten Sequenz wiederholt. Die Stufe c) kann wahlweise durchgeführt werden.
Zur Herstellung der Membran für Affinitätsversuche müssen die Schutzgruppen, insbesondere die Seitenkettenschutzgruppen, entfernt werden. Je nach Wahl der Seitenkettenschutzgruppen und des Verbindungsmittels kann das Peptid auf der Membran verbleiben oder zum Zwecke der Identifizierung und Kennzeichnung von der Membran entfernt werden. Dieses Merkmal des Verfahrens ist für die Herstellung von Peptidsequenzen tragenden Affinitätsmembranen von besonderer Bedeutung. Dem Fachmann ist es bekannt, daß bei der Synthese sequenzspezifische Probleme auftreten können, die ein individuelles Optimierungsverfahren erforderlich machen.
Durch die Wahl sonstiger dem Fachmann bekannter Verbindungsfunktionen zur Befestigung an der Membran können auch andere Peptidsyntheseverfahren durchgeführt werden (vgl. beispielsweise Barany & Merrifield, siehe oben). Bei einem solchen anderweitigen Chemismus bedient man sich unterschiedlicher Schutzgruppen für die primäre Aminofunktion (beispielsweise tert.-Butyloxycarbonyl, tBOC), unterschiedlicher Seitenkettenschutzgruppen und unterschiedlicher Kupp lungsmaßnahmen, z.B. der Verwendung symmetrischer Aminosäureanhydride oder sonstiger aktiver Esterfunktionen oder Aktivatoren.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung näher.

Beispiel 1

Funktionalisierung einer Immobilon-Affinitätsmembran mit Alkyldiaminen
Fünf Lagen (12,5 x 10 cm) einer Immobilon-Affinitätsmembran (IAM, 2 in Schema I) (erhältlich von Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA) wurden in eine Schale gelegt und mit 100 ml 0,2 M 1,2-Diaminoethan oder 1,6-Diaminohexan in N,N-Dimethylformamid (DMF) bedeckt. Die Reaktion ließ man 2, h bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren ablaufen. Nach dem Waschen mit wasserfreiem Methanol wurden die Membranlagen unter Vakuum getrocknet. Pikrinsäurebindungstests zeigten, daß 4 (n=2) und 4 (n=6) 0,109 bzw. 0,040 mmol Aminogruppen pro Gramm trockener Membran enthielten. Die Pikrinsäurebindungstests wurden durch genaues Abwiegen eines Stücks der Membran (5 mg) und Behandeln desselben mit einer 0,2 M Lösung von Pikrinsäure in Dichlormethan durchgeführt. Das Membranfragment wurde mit Dichlormethan gewaschen und in 10,0 ml frisch zubereiteten 4%igen Triethylamins in Dichlormethan aufgenommen. Danach wurde sofort die Extinktion von Triethylammoniumpikrat bei 358 nm (&epsi;358 = 14 500) ermittelt.

Beispiel 2

Bindung eines geschützten Nucleosids an IAM 4
Funktionalisiertes IAM 4 (n=6), 0,98 g (0,039 mMol Aminogruppen) wurde mit dem p-Nitrophenylester von N-4-Benzoyl- 3'-O-succinyl-5'-O-dimethoxytrityl-desoxycytidin (0,2 mMol), Triethylamin (0,2 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,5 mg) in 0,4 ml trockenem DMF behandelt. Nach 16 h bei 20ºC wurde die Membran mit Methanol gewaschen und unter Vakuum getrock net. Überschüssige Aminogruppen wurden durch 2-stündiges Einwirkenlassen von 4,0 ml Pyridin/Essigsäureanhydrid, 3/1 (v/v), auf das Material bei 20ºC acyliert. Nach dem Waschen mit Methanol wurde die Membran getrocknet. Ein geringer Teil (5 mg) des Trägers 6 (Schema II) wurde auf die Anwesenheit der Dimethoxytritylgruppe (&epsi;498 = 74 500 in 70% Perchlorsäure/Ethanol, 1/1 (v/v)) getestet. Der Test zeigte 0,032 mMol gebundenes Nucleosid pro Gramm trockener Membran 6 (80%ige Ausbeute).

Beispiel 3

Synthese von d (T-C-C-C-A-G-T-C-A-C-G-A-C-G-T-C)
Eine 0,8 cm² große Membranscheibe 6 (B=Cytosin, W=Benzoyl) wurde in einen speziell ausgestalteten Halter (Fig. 1) eingesetzt und in einem automatisierten DNA-Synthesegerät Milligen 6500 befestigt. Die obige Sequenz wurde unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoramiditen (N.D. Sinha und Mitarbeiter, vgl. oben) nach einem Standardsyntheseprotokoll automatisch zusammengebaut. Nach dem letzten Additionszyklus wurde die Membranscheibe in einem versiegelten Röhr chen 12 h bei 55ºC mit 0,3 ml konzentrierten wäßrigen Ammoniaks behandelt. Die ammoniakalische Lösung wurde eingeengt und durch Umkehrphasen-HPLC chromatographiert. Das HPLC-Chromatogramm ist in Fig. 2 dargestellt. Der Produktpeak wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese (vgl. N.D. Sinha und Mitarbeiter) analysiert. Das Ergebnis ist in Fig. 3a dargestellt. Das Material in der Hauptbande wurde nach dem Maxam & Gilbert-Verfahren (vgl. N.D. Sinha und Mitarbeiter, aao) einer Sequenzanalyse unterzogen. Das Ergebnis ist in Fig. 3b dargestellt. Diese belegt die Richtigkeit der synthetisierten Hexadecamersequenz.

Beispiel 4

Bindung von Norleucin an IAM 4
Die Immobilon-Affinitätsmembran 4 (n=2, Schema I), 3,20 g (0,349 mMol Aminogruppen) wurde mit N-Fmoc-Nle-O-Pfp (6, mMol) in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol (6,0 mMol) in 20 ml trockenem DMF 2,0 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Träger wurde mit Methanol gewaschen, getrocknet und dann weitere 2,0 h bei Raumtemperatur mit 40 ml Pyridin/Essigsäure anhydrid, 3/1 (v/v) behandelt. Die Acylierungsreaktion wurde durch Waschen der Membranen mit Methanol beendet. Die Menge an eingebautem Norleucin betrug 0,093 mMol/g Membran (bestimmt durch Quantifizieren der Fluorenylmethyloxycarbonyl- Einheit). Der Test erfolgt durch sorgfältiges Einwiegen von 5,0 mg der Membran 8 (Schema III) und 30-minütiges Behandeln bei Raumtemperatur mit 0,4 ml eines Gemischs aus Piperidin und 0,4 ml Dichlormethan. Die Lösung wurde mit Dichlormethan auf 10,0 ml verdünnt, worauf die Extinktion bei 301 nm bestimmt wurde (&epsi;&sub3;&sub0;&sub1; = 7 800 für N-Fluorenylmethylpiperidin in Dichlormethan).

Beispiel 5

Bindung der Linkereinheit 10 an H-Nle-IAM 9
Die Membran 9, 3,2 g (0,30 mMol Aminogruppen) wurde in eine Schale mit 50 ml 20%igem Piperidin in Dimethylformamid gelegt. Nach 10 min bei 20ºC wurde die Membran 10 x mit geringen Mengen an trockenem Dimethylformamid gewaschen. Das (noch) feuchte Material wurde dann 2 h bei 20ºC mit 6,0 mMol 4-Hydroxymethylphenylessigsäurepentafluorphenylester und 6, mMol 1-Hydroxybenzotriazol behandelt. Die Reaktion wurde durch Waschen des Trägers nacheinander mit Dimethylformamid, Dichlormethan und Methanol beendet. Nach dem Trocknen zeigte der Pikrinsäuretest 0,002 mMol restlicher Aminogruppen pro Gramm Membran (Ausbeute: 98%).

Beispiel 6

Bindung von Fmoc-L-Val an dem IAM-Derivat 11
N-Fluorenylmethoxycarbonylvalin (0,46 mMol) wurde in 15 ml Dichlormethan gelöst und mit Dicyclohexylcarbodiimid (0,23 mMol) versetzt. Nach 15 min bei Raumtemperatur wurde Dicyclohexylhamstoff abfiltriert und die Lösung eingeengt. Der Rückstand wurde in 4,0 ml trockenem DMF, das 4-Dimethylaminopyridin (0,07 mMol) enthielt, gelöst, worauf das Gemisch auf 0,7 g des IAM-Derivats 11 (Schema III), d.h. 0,085 mMol Träger-gebundenen Benzylalkohol, appliziert wurde. Die Reaktion ließ man über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen. Nach dem Waschen mit DMF und Dichlormethan wurde die Membran getrocknet. Wie anhand der Freisetzung von N-Fluorenylmethylpiperidin ermittelt, enthielt der Träger 0,07 mMol Valin pro Gramm trockener Membran (75%ige Ausbeute, bezogen auf IAM 11).

Beispiel 7

Synthese von H-Ala-Asn-Lys-Gly-Phe-Leu-Glu-Glu-Val-OH
Eine 8,0 cm² große Scheibe des valinveresterten Trägers (Beispiel 6) wurde auf den Boden einer Glasfritte gelegt. Die Membran wurde mit DMF gewaschen und zur Entfernung der N- Fmoc-Gruppe 5 min mit 20%igem Piperidin in DMF behandelt. Nach dem Waschen mit DMF ließ man auf die Membran 30 min bei Raumtemperatur 2,0 ml 0,3 Mol seitenkettengeschütztes N-Fmoc- Glu-O-Pfp, 0,3 Mol HOBT in trockenem DMF einwirken. Danach wurde die Membran mit DMF gewaschen. Der Zyklus von Waschen, Entschützen, Waschen und Kuppeln wurde unter Verwendung der verschiedenen N-Fmoc-O-Pfp-veresterten Aminosäuren derart wiederholt, daß die gewünschte Sequenz N-Fmoc-Ala-Asn- Lys(Boc)-Gly-Phe-Leu-Glu(Obut)-Glu(O-But)-Val (Prothrombinvorläufer) erreicht werden konnte. Die letzte N-endständige Fmoc-Gruppe wurde vor der Abspaltung des Materials vom Träger mit Trifluoressigsäure entfernt. Das Material wurde nach dem Einengen der sauren Lösung durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt. Das Material im Hauptpeak eluierte aus der Säule an derselben Stelle wie das auf einem Kieselgur-Polyacrylamid-Träger synthetisierte identische Peptid (vgl. E. Atherton, E. Brown, R.C. Sheppard & A. Rosevear in "J. Chem. Soc. Chem. Comm.", S. 37, 1981).
Fig. 5 zeigt ein HPLC-Chromatogramm der nach Hydrolyse des Peptids und anschließender Derivatisierung mit Phenylthioisocyanat nach Standardverfahren erhaltenen PCT-Aminosäuren. Dieses belegt die richtige Aminosäurezusammensetzung. Die Aminosäuresequenz wurde durch das Festphasen-Edman-Abbauverfahren bestätigt.

Beispiel 8

Synthese von Oligonucleotiden auf Polypropylenmembranen
Eine aufgepfropftes Polyethoxyethylacrylat enthaltende Polypropylenmembran (0,180 g) wurde 19 h bei 80ºC mit 2, mMol O-Dimethoxytritylaminoethanol in 2,0 ml DMF behandelt. Die Membran wurde mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ein geringer Teil des Materials wurde auf die Anwesenheit der Dimethoxytritylgruppe (vgl. Beispiel 2) hin getestet. Der Test zeigte, daß das Polymer 0,0022 mMol einer geschützten funktionellen Alkoholgruppe pro Gramm Polymer enthielt.
Eine 0,8 cm² große Scheibe der Membran wurde in dem spe ziell ausgestalteten Halter von Fig. 1 in ein Milligen 6500 DNA-Synthesegerät eingesetzt. Die Synthese von
d(T-C-C-C-A-G-T-C-G-A-C-G-T)
erfolgte nach einem Standardphosphoramidit- Syntheseprotokoll (vgl. Sinha und Miterarbeiter, aaO). Am Ende der Synthese wurde die Scheibe 12 h bei 55ºC mit 0,3 ml konzentrierten wäßrigen Ammoniaks behandelt. Eine Säurehydrolyse der 5'-endständigen Dimethoxytritylgruppe zeigte 0,0003 mMol Oligonucleotide pro Gramm trockener Membran. Dies belegte eine Gesamtausbeute über die Stufen hinweg von 88%. Reaktionsschema I Reaktionsschema II Reaktionsschema III Reaktionsschema IV

Äquivalente

Für den Fachmann dürfte es auch ohne Durchführung von mehr als Routineversuchen selbstverständlich sein, daß es zu den hierin speziell beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung zahlreiche Äquivalente gibt. Diese Äquivalente sollen durch die folgenden Ansprüche mit umfaßt werden.

Claims

1. Membran, umfassend ein mikroporöses Polymer einer Porengröße im Bereich von 0,1 bis 5,0 µm, an welches austauschbar ein(e) geschützte(s) Nucleosid oder Aminosäure gebunden ist.

2. Membran nach Anspruch 1, dargestellt durch die Formel:

P--X--Y-N-Z--SW

worin bedeuten:

P eine aus einem Polymer hergestellte Membran;

X eine funktionelle Gruppe auf der Membran;

Y-N-Z ein Verbindungsglied, worin N für ein Abstandstückmolekül steht und Y und Z die gleichen oder unterschiedliche funktionelle Gruppen darstellen, wobei das Verbindungsglied an die Membran über ihre funktionelle Gruppe an die funktionelle Gruppe x gebunden ist, und

SW ein(e) geschützte(s) Nucleosid oder Aminosäure, wobei SW an das Verbindungsglied über dessen funktionelle Gruppe Z gebunden ist.

3. Membran nach Anspruch 2, wobei die Membran P ein flaches, permeables, mikroporöses Polymer mit funktionellen Gruppen innerhalb seiner (es bildenden) monomeren Einheiten zur Befestigung der Abstandsgruppe umfaßt.

4. Membran nach Anspruch 3, wobei die Monomeren aus Acryloder Methacrylsäureestern mit freier Alkohol- oder Esterfunktion zur Befestigung des Abstandstückmoleküls bestehen.

5. Membran nach Anspruch 3, wobei das Polymer aus einem vernetzten Polymer, ausgewählt aus der Gruppe Polydialkylsilandiole, Polydialkylsiloxane, Polyvinylalkohole, Polyoxymethylene und Polyoxyethylene besteht.

6. Membran nach Anspruch 2, wobei die Membran aus einem flachen, permeablen, mikroporösen Polymer, in welches zur Befestigung des Abstandstücks eine funktionelle Gruppe eingeführt wurde, besteht.

7. Membran nach Anspruch 6, wobei das Polymer Polystyrole, Polysulfone mit aromatischen Resten, Polyester, Polyamide, Polycarbonate, Polyvinylidendifluorid und Polyvinylacetat umfaßt.

8. Membran nach Anspruch 2, wobei die Membran aus einem flachen, permeablen, mikroporösen Polymer, auf welches Einheiten mit funktionellen Gruppen aufgepropft sind, besteht.

9. Membran nach Anspruch 8, wobei das Polymer Polysulfone, Polytetrafluorethylen, Polyethylen, Polypropylen oder Polyvinylidendifluorid umfaßt.

10. Membran nach Anspruch 2, wobei die Membran aus einem flachen, permeablen, mikroporösen Polymer, auf welches zur Befestigung des Abstandstücks ein zweites Polymer mit freien funktionellen Gruppen aufgetragen ist, besteht.

11. Membran nach Anspruch 10, wobei das Polymer Polysulfone, Polytetrafluorethylen, Polyethylen, Polypropylen oder Polyvinylidendifluorid umfaßt.

12. Membran nach Anspruch 10, wobei das zweite Polymer Acryl- oder Methacrylsäureester mit freier Alkohol- oder Esterfunktion zur Befestigung der Abstandstückgruppen umfaßt.

13. Membran nach Anspruch 2, wobei N für -(CH&sub2;)n- mit n gleich 1 - 20 steht.

14. Membran nach Anspruch 2, wobei N für -NH-(CH&sub2;)m-NHCO- (CH&sub2;)m-CO- mit m gleich 1 - 6 steht.

15. Membran nach Anspruch 2, wobei N für Oligoglycin steht.

16. Membran nach Anspruch 2, wobei Y und Z einzeln aus der Gruppe

mit R gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Cycloalkyl, ausgewählt sind.

17. Membran nach Anspruch 2, wobei SW für ein Nucleosid der Formel:

worin BW' eine geschützte Nudeobase darstellt und W" H oder eine Hydroxyschutzgruppe bedeutet, steht.

18. Membran nach Anspruch 17, wobei W" für eine Tritylgruppe, Acylgruppe oder Silylgruppe steht.

19. Membran nach Anspruch 2, wobei 5 für eine Aminosäure der Formel:

worin bedeuten:

U eine Aminosäureseitenkette;

W' Seitenkettenschutzgruppen;

W" eine Aminoschutzgruppe und

W"' eine Carboxyschutzgruppe steht.

20. Membran nach Anspruch 19, wobei &sub5;W für an dem Verbindungsglied über seine Carboxylgruppe befestigtes Norleucin steht.

21. Membran nach Anspruch 20, wobei die primäre Aminogruppe des Norleucins mit Fmoc Fluorenylmethyloxycarbonyl geschützt ist.

22. Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotids durch sequentielles Koppeln von Nucleotid an eine Membran nach Anspruch 17.

23. Verfahren zur Synthese eines Peptids durch sequentielles Koppeln von Aminosäuren an eine Membran nach Anspruch 19.

24. Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotids in folgenden Stufen:

10 a) Bereitstellen einer Membran, dargestellt durch die Formel

P--X--Y-N-Z--SW

worin bedeuten:

P eine aus einem Polymer hergestellte Membran;

X eine funktionelle Gruppe auf der Membran; Y-N-Z ein Verbindungsglied, worin N für ein Abstandstückmolekül steht und Y und Z die gleichen oder unterschiedliche funktionelle Gruppen darstellen, wobei das Verbindungsglied an die Membran über die funktionelle Gruppe X gebunden ist und SW ein geschütztes Nucleosid, wobei SW an das Verbindungsglied über dessen funktionelle Gruppe Z gebunden ist;

b) Koppeln eines geschützten Nucleosidphosphoramidits an das Nucleosid SW zur Bildung eines membrangebundenden Nucleosid-Nucleotids mit einer Phosphittriesterbindung;

c) Oxidieren des Phosphittriesters zur Ausbildung einer Phosphattriesterbindung und

d) sequentielles Koppeln weiteren geschützten Nucleosidphosphoramidits an das membrangebundene Nucleosid-Nucleotid und, nach jedem Kopplungsschritt, Oxidieren der gebildeten Phosphittriesterbindung zu einem Phosphattriester zur Bildung eines membrangebundenen Polynucleotids.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Nucleosidphosphoramidit ein beta-cyanoethylgeschütztes Phosphat enthält.

26. Verfahren nach Anspruch 24, bei welchem weiterhin die Schutzgruppen von dem membrangebundenen Polynucleotid entfernt werden.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das synthetisierte Polynucleotid von der Membran abgespalten wird.

28. Verfahren nach Anspruch 24, zur Synthese eines Peptids in folgenden Stufen:

a) Bereitstellen einer Membran der Formel

P--X--Y-N-Z--SW

worin P, X und Y-N-Z die in Anspruch 24 angegebene Bedeutung besitzen und SW für eine geschützte Aminogruppe steht und an das Verbindungsglied über dessen funktionelle Gruppe Z gebunden ist, und

d) sequentielles Koppeln geschützter Aminosäuren an SW zur Bildung eines membrangebundenen Peptids.

29. Verfahren nach Anspruch 28, bei welchem weiter die Schutzgruppen von dem membrangebundenen Peptid entfernt werden.

30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das synthetisierte Peptid von der Membran abgespalten wird.

31. Verfahren nach Anspruch 28, wobei SW für ein seitenkettengeschütztes Norleucin steht.

32. Verfahren nach Anspruch 28, wobei an SW eine zweite Verbindungsgruppe befestigt ist, welche einen funktionellen Rest zur Kopplung weiterer geschützter Aminosäuren liefert.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Verbindungsglied aus p-Hydroxymethylphenoxyessigsäure besteht.