DE2344060A1

DE2344060A1 - Verfahren zur herstellung eines optisch aktiven enantiomorphen einer aminosaeure

Info

Publication number: DE2344060A1
Application number: DE19732344060
Authority: DE
Inventors: Soichiro Asai; Shoichi Ishii; Kanagawa Kawasaki; Tsutomu Tabira; Hideo Tazuke; Eigo Tsuchiya
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-08-31
Filing date: 1973-08-31
Publication date: 1974-03-07
Also published as: JPS4942887A; JPS5037277B2; GB1429976A; FR2197836A1; CA1018920A; US3841966A; FR2197836B1; CH577438A5

Description

Priorität: 31. August 1972, Nr. 87419/1972, Japan

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Spaltung von Aminosäuren und deren Derivaten in optische Isomeren und spezieller ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Enantiomorphen einer Aminosäure aus einem Salz eines N-Acylderivats dieser Aminosäure in razemischer Form.

Es ist bekannt, daß Acylase selektiv N-Acylderivate eines Enatiomorphen einer Aminosäure in dem N-Acylderivat der razemischen Säure hydrolysiert, wodurch die N-Acyl-DL-aminosäure in ein Gemisch aus der ursprünglich die Acylgruppe bildenden Säure, einem Enantiomorphen der Aminosäure und dem N-Acylderivat des anderen Enantiomorphen umgewandelt wird. Die drei Reaktionsprodukte lassen sich aufgrund» ihrer unterschiedlichen löslichkeit oder anderer physikalischer Eigenschaften leicht voneinander trennen.

Acylase wurde zur Herstellung eines optisch aktiven Enantiomorphen einer Aminosäure mit Hilfe eines anteilweise durchgeführten Verfahrens auf Basis der selektiven Hydrolysewirkung des Enzyms

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angewendet. Die Methode, wie sie bisher durchgeführt wurde, ist jedoch unwirtschaftlich. Es ist während der Aufarbeitung de,s in üblicher Weise erhaltenen Entacylierungsgemisches erforderlich, die Acyläse vor der Gewinnung des gewünschten Produkts zu koagulieren oder in anderer Weise zu inaktivieren und es geht daher ein großer Anteil der Acylase verloren. Wenn bei dem diskontinuierlichen Verfahren nur ein geringer Anteil der N-Acyl-DL-aminosäure in das gewünschte Enantiomorphe übergeführt wird, so könnte das verbleibende Material erneut verwendet werden; die Rückgewinnung des Produkts und die Aufbereitung des als Rückstand verbleibenden Materials zur erneuten Verwendung sind jedoch schwierig. Das zurückgewonnene N-Acylderivat des anderen Enantiomorphen hat gewöhnlich geringe optische Reinheit und kann normalerweise nur als Ausgangsmaterial für die Razemisierung verwendet werden.

Es wurde nun gefunden, daß die Nebenprodukte dieser Methode, d.h., die Carbonsäure der ursprünglich vorliegenden Acylgruppe und das K-Acylderivat des unerwünschten Aminosäure-Enantiomorphen die Acylaseaktivität hemmen und daß.auf diese Tatsache zahlreiche der Schwierigkeiten zurückzuführen sind, die bisher bei der Herstellung einer optisch aktiven Aminosäure aus einem Acylderivat der razemischen Form aufgetreten sind. Ein hohes Spaltungsverhältnis, d.h., ein hohes Molverhältnis des gebildeten gewünschten Enantiomorphen der Aminosäure zu dem ursprünglich eingesetzten Acylderivat der razemiseben Aminosäure kann nur dann erhalten werden, wenn entweder eine sehr große Menge der teuren und schwierig zugänglichen Acylase verwendet wird oder das Verfahren in einem sehr verdünnten wässrigen Medium durchgeführt wird, was die Handhabung und schließliche Entfernung einer großen Wassermenge erfordert.

Im Hinblick auf diese Schwierigkeiten wurde vorgeschlagen, die Acylase in ein unlösliches Material überzuführen und das N-Acylderivat der razemischen Aminosäure durch, ein mit dem unlöslich gemachten Enzym beschicktes Filter zu leiten. Dieses Verfahren war wegen der Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Akti-

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vität des Enzyms und beim Aufrechterhalten der Durchlässigkeit des Filters im industriellen Maßstab nicht erfolgreich.

Es wurde nun gefunden, daß Acyläse praktisch bis zur Erschöpfung ihrer Enzymaktivität zur Herstellung eines Enantiomorphen einer Aminosäure aus einem F-Acylderivat der razemischen Form der Säure, spezieller, einem Salz dieses Derivats, verwendet werden kann, indem das Salz in einem wässrigen Medium behandelt wird,- das eine wirksame Menge an Acyläse enthält, bis das gewünschte Enantiomorphe durch die Acylase gebildet ist und gleichzeitig eine entsprechende Menge des Acylderivats dee anderen Enantiomorphen des Aminosäuresalzes gebildet wird. Das wässrige Medium wird danach mit Kristallen des Acylderivats des razemischen Aminosäuresalzes in Berührung gebracht, während es das vorstehend angegebene Acylderivat des anderen Enantiomorphen enthält. Wenn die Löslichkeit des razemischen Acylderivats größer als die des entsprechenden Derivats der Enantiomorphen ist, löst das Medium vorzugsweise aus den Kristallen das Salz des Acylderivats des einen Enantiomorphen, so daß die als Rückstand verbleibenden Kristalle an dem Acylderivat des Salzes des anderen Enantiomorphen angereichert sind. Es ist relativ einfach, das eine Enantiomorphe der Aminosäure gesondert in hoher optischer Reinheit aus dem Medium zu gewinnen und das Acylderivat des anderen Aminosäuresalz-Enantiomorphen wird ohne Schwierigkeiten aus dem Medium abgetrennt und ist nicht stark verunreinigt mit dem Salz des Acylderivats der ersteren enantiomorphen Form. Nach Entfernung dieser beiden Produkte ist die Mutterlauge erneut verwendbar zur weiteren selektiven Entacylierung mit Hilfe der noch vorliegenden Acylase.

Erfindungsgemäß wird ein Salz des Acylderivats einer razemischen AminoDäure selektiv diirch Acylase zu einem Enantiomorphen des Salzes der nicht acylierten Aminosäure hydrolysiert und die Mutterlauge ist dann befähigt, selektiv das Salz des Acylderivats des einen Enantiomorphen aus den Kristallen des razemischen Salzes herauszulösen, wobei als Rückstand Kristalle verbleiben, die an .

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dem Salz des Äcylderivats des anderen Enantiomorphen der Aminosäure angereichert sind. Das eine Enantiomorphe und die angereicherten Kristalle können in verschiedenen Stufen des Verfahrens von der Mutterlauge abgetrennt werden und die Mutterlauge kann dann in das Kreislaufverfahren zur Herstellung von weiterem optisch aktiven Material mit Hilfe des gleichen Anteils an Acylase zurückgeführt werden. Das Verfahren hat allgemeine Anwendbarkeit auf Acylderivat-Salze von razemischen Aminosäuren, die der Hydrolyse durch Acylase unterliegen und die stärker in Wasser löslich sind als die entsprechenden Salze der acylierten optisch aktiven Formen der Aminosäure.

In der beiliegenden Zeichnung sind bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch dargestellt.

Figur 1 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, in der die gewünschte optisch aktive Aminosäure in einer frühen Stufe des Verfahrens gewonnen, wird und

Figur 2 zeigt eine andere Ausführungsform, in der das Enantiomorphe der Aminosäure von der Mutterlauge in Form eines Gemisches mit dem Salz des 2T-Acylderivats entfernt wird, um später davon abgetrennt zu werden.

Aus Gründen der Einfachheit wird die Bezeichnung "Acyl" in dieser Beschreibung für "N-Acyl" verwendet und das 1-Enantiomorphe wird als gewünschte Form angesehen, wie es häufig, jedoch nicht notwendigerweise der Fall ist.

Wie in Figur 1 gezeigt wird, wird als Ausgangsmaterial eine wässrige Lösung eines IT-Acyl-Dl-aminosäuresalzes, die Acylase enthält, verwendet. Während der anschließenden selektiven Hydrolyse der L-Form des Salzes iwird !-Aminosäure gebildet und kristallisiert .unter geeignet gewählten Verfahrensbedingungen, während die Mutterlauge, die leicht von den Kristallen abgetrennt werden kann, an dem Salz der N-Acyl-D-aminosäure angereichert wird. Die ange-

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reicherte Mutterlauge wird dann mit Kristallen von zusätzlichem N-Acyl-DL-aminosäuresalz in Berührung gebracht, aus denen die Ir-Form selektiv herausgelöst wirdi während die zurückbleibenden Kristalle aus dem N-Acyl-D-aminosäufesalz bestehen oder zumindest an diesem angereichert sind, welches somit gesondert gewonnen werden kann.

Die Zusammensetzung der Mutterlauge in dieser Stufe ist die glei-% ehe wie die des Ausgangsmaterials oder läßt sich leicht auf die Zusammensetzung des Ausgangsmaterials einstellen, mit Ausnahme der vorliegenden Carbonsäure aus den Acylgruppen, und wird dem gleichen Zyklus von Verfahrensschritten unterworfen, die wiederholt werden können, solange die Acyläse eine geeignete Aktivität beibehält.

Die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens hängt von wenigen kritischen Voraussetzungen ab. Die Acylase muß befähigt sein, das spezifische Salz der Acy1-I-aminosäure zu entacylieren? das Salz der K-Acyl-DIi-aminosäure muß ein Razemat se.in, das stärker löslich ist als die entsprechenden Derivate der optisch aktiven Formen der Aminosäure; und der Basenrest des Salzes muß frei von störenden Enflüssen auf die Wirkung der Acylase sein. Alle anderen Variablen des Verfahrens sind von relativ geringer Bedeutung und sind für den Fachmann offensichtlich.

Die Ausgangslösung kann daher und sollte auch praktisch eine möglichst hohe Konzentration des Acyl-DL-aminosäuresalzes aufweisen. Der pH-Wert der Ausgangslösung wird so eingestellt, daß gute Acylaseaktivität und geringe löslichkeit der L-Aminosäure gewährleistet werden. Wenn die pH-Bereiche für optimale Acylaseaktivität und geringe löslichkeit der Aminosäure sich nicht überschneiden, kann die Aminosäure durch Entfernen eines Teils des als lösungsmittel vorliegenden Wassers oder durch Kühlen des Reaktionsgemisches ausgefällt werden. Die optische Reinheit der ge- _{: r} wonnenen Aminosäure beträgt 100 ^, wenn die elementaren Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um eine Verunreinigung zu vermeiden.

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Die Menge der Acyl-DIr-aminosäuresalz-Kristalle, die nach Entfernung der !-Aminosäure mit der Mutterlauge in Berührung gebracht werden, sollte so gewählt werden, daß ein Anteil an Acyl-D-aminosäuresalz eingeführt wird, der äquivalent dem Anteil der entfernten !-Aminosäure ist, so daß die verbleibenden Kristalle hohe optische Reinheit haben. Es wird ohne Schwierigkeiten eine Reinheit von 90 36 oder mehr erzielt. Das gewonnene Salz der Acyl-D-aminosäure kann dann razemisiert werden, bevor es in das Verfahren zurückgeführt wird, falls keine Verwendungsmöglichkeit für die D-Form besteht, und dabei geht nur äußerst wenig, der Ir-Porm verloren.

Die nach der Entfernung des Acyl-D-Aminosäuresalzes verbleibende Mutterlauge enthält noch einen kleinen Anteil der gelösten Ir-Aminosäure, die in nachfolgenden Verfahrenskreisläufen gewonnen wird, und die von den durch Hydrolyse abgespaltenen Acylresten stammende Carbonsäure. Die Menge der Carbonsäure, welche die Acylaseaktivität hemmt, erhöht sich allmählich. Die Konzenzentration des anderen Nebenprodukts, des Salzes der Acyl-D-aminosäure, ist jedoch nahezu konstant, so daß die Mutterlauge mehrere Male zurückgeführt werden kann, bis die Acylaseaktivität so abgefallen ist, daß der teilweise oder völlige Ersatz des flüssigen Mediums oder die Ergänzung mit frischer Acylase erforderlich sind.

Wenn die erfindungsgemäß behandelte Aminosäure sehr stark wasserlöslich ist, kann die Gewinnung der Säure verzögert werden, so daß in dem ersten Durchgang des Verfahrens keine Säure gewonnen wird und die Gewinnung des ersten Anteils in dem zweiten oder nachfolgenden Verfahrensdurchgängen stattfindet. Die gleiche Wirkung kann durch Zugabe einer ausreichenden Menge der !-Aminosäure zu der AusgaigaLösung erreicht werden, wodurch die teilweise Gewinnung der Aminosäure in dem ersten Durchgang ermöglicht wird. Die Reinheit der Produkte bleibt ungeachtet der sich vermindern-

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den Acylaseaktivität während einer langen Folge von Erfahrenskreisläufen konstant.

Die Anzahl der Verfahrenszyklen, die durchführbar sind, ohne daß die Acylase ergänzt oder das flüssige Medium in anderer Weise erneuert werden muß, hängt weitgehend von der Art und der Menge der anfänglich dem Hydrolysegemisch zugesetzten Acylase, der Zusammensetzung des Acylaminosäuresalzes und dergleichen a"b. Im allgemeinen können mindestens 3 und häufig sogar 10 Zyklen mit einer einzigen Acylase-Beschickung durchgeführt werden.

Weil das flüssige Medium zurückgeführt wird, ist es nicht erforderlich, daß in jedem Durchgang ein sehr hohes Spaltungsverhältnis erzielt wird und die Menge der ursprünglich.zugesetzten Acylase kann ziemlich gering sein, was weiter zu den hohen Ausbeuten an L-Aminosäure pro Gewichtseinheit der Acylase beiträgt, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielt wird.

Λ -,

Die Folge der Einzelstufen, die in Figur 1 dargestellt ist, kann abgeändert werden, ohne daß die grundlegenden Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens verlorengehen.

So ist es nicht erforderlieh, daß die L-Aminosäure gewonnen wird, bevor die Mutterlauge mit Kristallen des Acyl-DL-aminosäuresalzes in Berührung gebracht wird und es kann die Bildung eines·festen Gemisches aus L-Aminosäure und Acyl-D-äminosäuresalz ermöglicht · werden. Das Gemisch wird von dem flüssigen Medium abgetrennt und seine Bestandteile werden aufgrund der unterschiedlichen Löslichkeiten oder nach einer anderen Methode, die offensichtlich und für die Erfindung nicht von Bedeutung ist, voneinander getrennt. Ein bekanntes Trennverfahren, das sich für das modifizierte erfindungsgemäße Verfahren besonders gut eignet, beruht auf der Anwendung von sehr grobkörnigen Acy1-DL-aminosäure-Kristallen, die selbst nach dem Lösen des Acyl-L-aminosäuresalzes mechanisch von den normalerweise viel kleineren Kristallen der L-Aminosäure

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abgetrennt werden können.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform ist in Figur 2 schematisch dargestellt. Die Acyläse enthaltende Ausgangslösung wird bei der gewählten Temperatur mit dem Acyl-DL-aminosäuresalz gesättigt und steht in Berührung mit zusätzlichem Acyl-DL-aminosäuresalz in festem, kristallinem Zustand, während sie der selektiven Hydrolyse durch die Acylase unterliegt. In der ersten Verfahrensstufe wird daher ein festes Gemisch aus L-Aminosäure und N-Acyl-B-aminosäuresalz gebildet, von dem flüssigen Medium abgetrennt und in vorstehend beschriebener Weise in seine Komponenten getrennt. Die Mutterlauge kann als Ausgangsmaterial in das Verfahren zurückgeführt werden und wird vorzugsweise durch Kontakt mit Kristallen von Acyl-DL-aminosäuresalz ergänzt, bevor sie der ersten Stufe des Verfahrenszyklus unterworfen wird, in welchem die Menge der mit dem flüssigen Medium in Berührung gebrachten Kristalle vorzugsweise so eingestellt wird, daß die Menge des zugeführten Acyl-L-aminosäuresalzes/der zu erwartenden ausgefällten Menge 'der L-Aminosäure, jeweils ausgedrückt in Mol, entspricht,

Die Rolle der spezifischen Verfahrensvariablen bei dem Verfahren gemäß Figur 2 ist aus der ausführlicheren vorstehenden Diskussion der Figur 1 ersichtlich. Die Tatsache, daß die Acylase das Acyl-DL-aminosäuresalz in einer gesättigten Lösung, d.h., in einer Lösung mit konstanter und höchstmöglicher Konzentration angreift, hat einen günstigen Effekt auf die Wirksamkeit des Enzyms.

Es hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren auf alle N-Acyl-DL-aminosäuresalze anwendbar ist, die der selektiven Hydrolyse durch eine freie Acylase unterliegen und eine razemische Form aufweisen, die stärker in Wasser löslich ist als die von den optisch aktiven Aminosäuren abgeleiteten Formen. Es wurden keine U-Acyl-DL-aminosäuresalze gefunden, welche dieses Erfordernis erfüllen und sich nicht in ein gewünschtes Enantiomorphes der entacylierten Aminosäure überführen lassen, und die folgen-

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den N-Acyl-Dl-aminosäuresalze wurden in bedeutendem Maß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrene erfolgreich gespalten:

Ammoniumsalz von N-Acety!phenylalanin; Ammoniumsalz von N-Acetyltryptophan; Ammoniumsalz von N-Acetylmethionin; Ammoniumsalz von N-Acetylvalin;

Ammoniumsalz von N-Acetylphenylglycinj ; Ammoniumsalz von N-Acety1-3»4-methylendioxyphenylalanin; Cyclohexylaminsalz von N-Acety!phenylalanin; Monoäthylaminsalz von N-Acety!phenylalanin; Monoäthylaminsalz von N-Acetylphenylglycin; Monoäthylaminsalz von N-Acety!tryptophan; und Monoäthylaminsalz von N-Acetylvalin.

Die vorstehenden Salze wurden hauptsächlich aufgrund der geringen löslichkeit der Aminosäuren in Wasser gewählt, welche die Gewinnung besonders vereinfacht. Das beste Verhalten in dieser Hin-, sieht zeigen Phenylalanin, 3,4-Methylendioxyphenylalanin, Phenylglycin und Tryptophan.

Die Art und der Ursprung der Acyläse ist ohne Bedeutung oder nur von geringer Bedeutung, solange die Acylase befähigt ist, die gewünschte selektive Entacylierung zu bewirken. Acylasen, die von Schimmelpilzen (Aspergillus, Penicillium), Bakterien (Achromobacter, Pseudomonas, Micrococcus, Alkaligenes) und Actinomyceten (Streptomyces) stammen, wurden mit Erfolg verwendet. Die Acylasekonzentration in dem Ausgangsmaterial liegt anfänglich zwischen 0,5 Gew.-$ und 1 Gew.-^, wenn auch eine so geringe Menge wie 0,1 Gew.-# wirksam ist und unter geeigneten Umständen eine hohe Menge wie 3 % angewendet werden kann. Die angegebenen Mengen sind auf das Gewicht der N-Acyl-DL-aminosäure in dem Hydrolysegemisch bezogen und gelten für Acylase mit guter Aktivität. Acylase mit niedrigerer Aktivität als der besten Aktivität kann in größeren Mengen zu verwenden sein, als die vorstehend als bevorzugt genannten Mengen«

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Es ist "bekannt, daß zahlreiche Acylasen durch Kobaltionen aktiviert und/oder stabilisiert werden und solche Ionen können selbstverständlich zugeführt werden. Die Hydrolysetemperatur ist nicht kritisch; muß jedoch so eingestellt werden, daß sie dem verwendeten Enzym entspricht. Zahlreiche Acylasen wirken am besten bei 35 bis 40⁰C und die meisten zeigen ihre optimale Aktivität zwischen 20 und 6O⁰C.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter verdeutlic ht.

Beispiel 1

Sine konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung wurde zu einer Aufschlämmung aus 650 ml Wasser und 140 g N-Acetyl-DL-phenylalanin gegeben, bis eine lösung mit einem pH-Wert von 6,5 gebildet war. 2,8 g Acylase (15000 Einheiten/g) wurden zu der lösung gegeben, die 30 Stunden bei 37⁰C gerührt wurde. Sie wurde dann unter fortgesetztem Rühren auf 15⁰C abgekühlt und ein kristalliner Niederschlag von !-Phenylalanin wurde abfiltrierir. Das gewonnene !-Phenylalanin hatte ein Gewicht von 27 g und eine optische Reinheit von 100 %.

Die Mutterlauge wurde mit 145 g N-Acetyl-DL-phenylalanin-ammoniumsalz vermischt. Das Gemisch wurde kurz auf 40⁰C erhitzt, danach unter Rühren auf 15⁰C abgekühlt und die nicht gelösten Kristalle wurden abfiltriert. Sie bestanden aus N-Acetyl-D-phenylalaninammoniumsalz einer optischen Reinheit von 96,3 $ und wogen 68 g.

Das Filtrat wurde erneut 30 Stunden bei 37⁰C gerührt, um einen neuen Verfahrenszyklus zu beginnen. Die vorstehend beschriebene Verfahrensweise wurde über 9 Zyklen hinweg wiederholt, wobei 324 g L-Phenylalanin einer optischen Reinheit von 100 $ oder 115 g I-Phenylalanin pro g der anfänglich in das Reaktionssystem einge-.führten Acylase erhalten wurden.

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Beispiel 2

Eine wässrige lösung des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-DL-phenylalanin wurde wie in Beispiel 1 aus HO g der freien Säure, 650 ml Wasser und konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung hergestellt. 2,0 g Acylase wurden zugesetzt und die lösung wurde 24 Stunden bei 37⁰C gerührt und danach unter fortgesetztem Rühren auf 15⁰O abgekühlt. 28 g L-Pheny!alanin einer optischen Reinheit von 100 # wurden gewonnen.

Die Mutterlauge wurde mit zusätzlichem N-Acetyl-DI-phenylalaninammoniumsalz in Berührung gebracht, wobei eine Ausbeute an N-Aeetyl-D-phenylalanin-ammoniumsalz-Kristallen und eine flüssige Fraktion gebildet wurde, die in das Verfahren zurückgeführt wurde. Es wurden 7 Zyklen durchgeführt, die Entacylierungsdauer erhöhte sich jedoch in jedem Zyklus allmählich bis zu einem Endwert von 90 Stunden in dem letzten Zyklus.

Die Gesamtmenge des gewonnenen L-Phenylalanins einer optischen Reinheit von 100 # betrug 266 g oder 133 g pro g der Acylase.

Beispiel 3

Eine Lösung des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-DL-phenylalanin mit einem pH-Wert von 6,5 wurde aus 210 g N-Acetyl-Dl-phenylalanin, 650 ml Wasser und konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung in gleicher Weise wie in den vorstehenden Beispielen hergestellt. Sie wurde mit 1 g Acylase und ausreichend Kobaltacetat vermischt, so daß eine Kobaltionenkonzentration von 10 Mol pro 1 erreicht wurde. Nach dem Rühren bei 37⁰C während 60 Stunden wurde das Gemisch auf 30⁰C gekühlt und das ausgefällte !-Phenylalanin mit einer optischen Reinheit von 100 $> wurde abfiltriert. Es hatte ein Gewicht von 4fj g.

Die Mutterlauge wurde kurz mit 200 g N-Acetyl-DL-phenylalaninajnmoniumsalz auf 45°C erhitzt und auf 30⁰C gekühlt. Die ungelösten Kristalle von N-Acetyl-B-phenylalanin-ammoniumsalz wurden abfiltriert. Sie hatten ein Gewicht von 118 g und eine optische

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Reinheit von 90,8 #. Das Piltrat wurde in der Anfangsphase eines neuen Verfahrenskreislaufs 60 Stunden bei 37°C gerührt.

Das Verfahren wurde viermal wiederholt und die Gesamtausbeute an !-Phenylalanin mit 100 $-iger optischer Reinheit betrug 161 g, d.h., 161 g !-Phenylalanin pro g Acylase mit 15000 Einheiten/g.

Beispiel 4

Eine Lösung des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-DL-tryptopban wurde wie vorher aus 91 g Ii-Aeety1-DL-tryptophan, 670 ml Wasser und einer ausreichenden Menge einer konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung, um einen pH-Wert von 7,0 einzustellen, hergestellt. 1,8 g Acylase und Kobaltacetat wurden wie in Beispiel 3 der Lösung zugesetzt und das Gemisch wurde 30 Stunden bei 40⁰C gerührt.

Die ausgefällten und abfiltrierten Kristalle von L-Tryptophan wogen 16,5 g und hatten eine optische Reinheit von 100 %,

Die Mutterlauge wurde kurz bei 45⁰C mit 75 g des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-DL-tryptophan gerührt und danach auf 4O°C gekühlt. Die zurückbleibenden Kristalle des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-D-tryptophan wurden durch Filtration gewonnen und hatten eine optische Reinheit von 93,8 $ und ein Gewicht von 35 g.

Das Piltrat wurde 48 Stunden bei 4O⁰C gerührt, wobei eine weitere Ausbeute an L-Tryptophankristallen gebildet wurde. Nach 6-maliger Widerholung des Zyklus wurden 145 g optisch reines L-Tryptophan erhalten.

Beispiel 5

Eine Lösung von 300 g N-Acetyl-DL-methionin-ammoniunisalz in 1200 g Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 wurde mit 10 ml einer O,01-molaren Kobaltacetatlösung und 3 g Acylase vermischt und das Gemisch wurde 48 Stunden bei 37⁰C gerührt. Es wurde dann unter Vakuum auf 30 bis 45°C erhitzt, bis 1 1 Wasser verdampft

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war. Aus dem Konzentrat kristallisierte optisch reines !-Methionin, das abfiltriert wurde. Es hatte ein Gewicht von 72 g.

Die Mutterlauge wurde mit 1 1 Wasser und 260 g N-Acetyl-Dl-methionin-ammoniums-alz vermischt und das Gemisch wurde auf 44⁰C erhitzt und danach auf 37⁰C abgekühlt. Die verbliebenen Kristalle wurden durch Filtration gewonnen; sie bestanden aus 135 g N-Acetyl-D-methionin-amraoniumsalz einer optischen Reinheit von 94 #·

Das Filtrat wurde in der ersten Stufe eines neuen Zyklus erneut 48 Stunden bei 37⁰C gerührt. Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde fünfmal wiederholt, wobei eine Gesamtausbeute von 310 g L-Methionin einer optischen Reinheit von 100 # erhalten wurde.

Beispiel 6

300 g des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-DL-phenylglycin wurden in 1000 ml Wasser gelöst und die lösung wurde mit 10 ml einer 0,01-molaren Kobaltacetatlösung und 3 g Acyläse 72 Stunden bei 37⁰C gerührt. Sie wurde unter. Vakuum bei 30 bis 40⁰C teilweise eingedampft, bis 670 ml Wasser entfernt waren. Die ausgefällten*Kristalle vom optisch reinem L-Phenylglyein wurden durch Filtration entfernt. Sie wogen 93 g.

Die Mutterlauge wurde mit 670 ml Wasser verdünnt und mit 270 g N-Acetyl-DL-phenylglycin-ammoniumsalz vermischt und das Gemisch wurde kurz auf 45⁰C erhitzt und danach unter Rühren auf 30⁰C abgekühlt. Die verbliebenen Kristalle von N-Acetyl-D-phenylglycinammoniumsalz mit einer optischen Reinheit von 96 fo wurden abfiltriert j sie hatten ein Gewicht von 137 g. Das IiItrat wurde erneut der Hydrolysestufe des nächsten Zyklus zugeführt. Nach viermaliger Wiederholung des Verfahrenskreislaufs unter Verwendung der anfänglich zugeführten Acylase wurden 325 g L-Phenylglycin einer optischen Reinheit von 100 # und'472 g N-Acetyl-D-phenylglycin-ammoniumsalz einer optischen Reinheit von 96 $> in fester kristalliner Form erhalten.

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Beispiel 7

Eine lösung des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-Dl-phenylalanin mit einem pH-Wert von 6,5 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 aus 370 g der freien Säure, 1000 ml Wasser und einer Ammoniumhydroxidlösung hergestellt. Sie wurde auf einmal mit 10 ml einer 0,01-molaren Kobaltacetatlösung, 2 g Acylase und 320 g kristallinem N-Aeetyl-DL-phenylalanin-ammoniumsalz vermischt. Die so hergestellte Aufschlämmung wurde 48 Stunden "bei 37°C gerührt. Sie wurde dann abfiltriert. Die isolierten Peststoffe hatten ein Gewicht von 348 g und enthielten 124 g !-Phenylalanin.

260 g des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-DL-phenylalanin wurden zu der Mutterlauge gegeben und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37⁰C gerührt. Es wurde dann filtriert, wobei 265 g Feststoffe gewonnen wurden, die 87 g !-Phenylalanin enthielten.

Die beiden Kristallausbeuten wurden kombiniert und in 1,5 1 Wasser auf geschlämmt. Die Aufschlämmung wurde 1 Stunde bei 40⁰C gerührt und dann filtriert. Die gewonnenen Peststoffe bestanden aus 152 g Ir-Phenylalanin einer optischen Reinheit von 100 ^.

Beispiel 8

Ein Hydrolysegemisch wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 7 aus 105 g des Ammoniumsalzes von N-Acetyl-DL-tryptophan, 750 ml Wasser, 3 ml einer 0,01-molaren Kobaltacetatlösung, 1,8 g Acylase und 210 g kristallinem N-Acetyl-DL-tryptophan-ammoniumsalz in der angegebenen Reihenfolge hergestellt. Die resultierende Aufschlämmung wurde 120 Stunden bei 37⁰C gerührt und danach filtriert. Die gewonnenen Feststoffe wogen 205 g und enthielten 92 g !-Tryptophan. Sie wurden mit 1500 ml Wasser 1 Stunde bei 4O⁰C gerührt und die Suspension wurde cfann filtriert. Die gewonnenen Feststoffe bestanden aus 79 g !-Tryptophan einer optischen Reinheit von 100 %,

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In den vorstehenden Beispielen können die D- und Ir-Formen ausgetauscht werden, ohne daß die erreichten Ergebnisse beeinträchtigt werden; es wurde jedoch die I-Form der Aminosäure in jedem Pail zur Veranschaulichung als gewünschtes Produkt gewählt, wie es bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens am häufigsten' der Pail ist.

In sämtlichen Beispielen wurden zwar die Acety!aminosäuren genannt; es ist jedoch bekannt, daß auch die U-Pormyl-, N-Ghloracetyl-, N-Propionyl-, N-Benzoyl- und zahlreiche andere ΪΤ-Aeylderivate von DL-Aminosäuren befähigt sind, der selektiven Hydrolyse durch Acylasen zu unterliegen. Salze dieser N-Acyl-DL-aminosäuren können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anstelle der als Beispiele gezeigten N-Acetyi-Dl-aminosäuresalze verwendet werden, wenn ihre löslichkeit größer ist als die der entsprechenden optisch aktiven N-Acylaminosäuresalze.

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Claims

23A4060 IA! E Nf ANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Enantiomorphen einer Aminosäure aus einem Salz eines N-Acylderivats der razemischen 3?orm dieser Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Salz eines Acylderivats der razemischen form einer Aminosäure, das größere Löslichkeit in Wasser hat, als die entsprechenden Salze der Acylderivate der optisch aktiven Enantiömorphen dieser Aminosäure, wobei die Baseneinheit des Salzes keine störenden Einflüsse auf die entaeylierende Wirkung von Acylase hat, mit einer wirksamen Menge an Acylase in Berührung bringt,*" die zur selektiven Entacylierung des Salzes des Acylderivats eines EnantiQ-morphen befähigt ist, bis unter der Einwirkung der Acylas© ein Enantiomorphes der Aminosäure gleichzeitig mit der entsprechenden Menge des Salzes des Acylderivats des anderen Enantiomorphen dieser Aminosäure gebildet ist,

b) das wässrige Medium, welches die Acylase und das Salz des Acylderivats des anderen Enantiomorphen, enthält, mit Kristallen des Salzes dieses Acylderivats der razemisehen Fora in Berührung bringt, bis ein gewisser Anteil des Salzes des Acylderivats dieses ersteren Enantiomorphen aus den Kristallen in des Medium gelöst ist und die verbliebenen Kristalle an dem Salz des Acylderivats des anderen Enantioffiorphen angereichert sind, und

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c) das erstere Enantiomorphe aus dem Medium in praktisch reiner Form gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Gewinnung des ersteren Enantiomorphen der Aminosäure das Medium, in welchem erneut ein Anteil des Salzes des Acylderivats dieses Inantiomorphen gelöst wurde, der Einwirkung der Acyläse überläßt, bis ein weiterer Anteil dieses Enantiomorphen durch die Acyläse gebildet wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das unter der Wirkung der Acyläse gebildete Enantiomorphe aus dem wässrigen Medium gewonnen wird, bevor dieses Medium mit den Kristallen des Salzes des Acylderivats der razemischen Form in Berührung gebracht wird.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die an dem Salz des Acylderivats des anderen Enantiomorphen angereicherten verbleibenden Kristalle aus dem Medium gewonnen werden, bevor dieses der Einwirkung der Acylase, überlassen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e η η -

zeichnet, daß das eine Enantiomorphe und die verbleibenden Kristalle gemeinsam aus dem Medium in Form eines· Gemisches entfernt werden und dieses Enantiomorphe dann von dem restlichen Anteil dieses Gemisches abgetrennt wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gelöste Salz des Acylderlvats der razemischen Form mit der Acylase in Berührung gebracht wird, während das Medium in Berührung mit diesen Kristallen steht und bevor sich das eine Enantiomorphe gebildet hat.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn zei c h net, daß die verbliebenen Kristalle getrennt von dem einen Enantiomorphen aus dem Medium gewonnen werden.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Salz eines Acylderivats von Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Valin, Phenylglycin oder 3,4-Methylendioxyphenylalanin verwendet wird. --

9. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß als Acylderivat ein Acetylderivat verwendet wird.

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