DE2205733C3

DE2205733C3 - 9-(gamma-Ami nopropyl)-3-aminocarbazol

Info

Publication number: DE2205733C3
Application number: DE2205733A
Authority: DE
Inventors: W Guthlein; H Tiedemann; P Vogel; W Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1972-02-08
Filing date: 1972-02-08
Publication date: 1974-07-18
Also published as: CH578527A5; GB1365651A; CH578528A5; CH577969A5; AT320635B; DE2205733B2; DE2205733A1; NL149791B; CH580074A5; NL7301506A; DE2264438A1; CA1014166A; FR2177735A1; DE2264438B2; FR2177735B1; US3822285A; AT327886B

Description

sowie dessen Salze mit organischen oder anorganisehen Säuren.

2. Verfahren zur Herstellung von 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol und von dessen Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise

A. eine Verbindung der allgemeinen Formel Il

(ID

30

in welcher X ein Wasserstoffatom, eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe oder eine Nitrogruppe darstellt a) mit Acrylnitril umsetzt, Für den Fall, daß X ein Wasserstoffatom darstellt, nitriert und sowohl die Cyanogruppe als auch die gegebenenfalls vorhandene Nitrogruppe zum Amin reduziert und gegebenenfalls die Aminogruppe deacyliert oder b) für den Fall, daß X eine Nitrogruppe darstellt, die N—H-acide Verbindung in ein Alkalisalz überführt und dieses mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III

Y-CH₂-CH₂-CH₂-N

(ΠΙ)

45

in welcher Y eine reaktive Estergruppe und R₁ und R₂ übliche Schutzgruppen für die Aminofunktion darstellen, umsetzt, und anschließend in beliebiger Reihenfolge die Nitrogruppe hydriert und die Schutzgruppen R₁ und R₂ abspaltet, oder

B. eine Verbindung der allgemeinen Formel IV

(IV)

55

60

(CH₂)₃

in welcher Y die obengenannte Bedeutung hat und Z eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe darstellt, mit Ammoniak umsetzt und gegebenenfalls anschließend Z deacyliert und die erhaltenen Verbindungen I gewünschtenfalls mit organischen oder anorganischen Säuren in Salze überführt.

3. Verwendung von 9-(y-Aminopropyl)-3-aminocarbazol oder von dessen Salzen als Indikator für enzymatische Nachweisreaktionen.

IO Schon seit längerer Zeit wird Glucose in Körperflüssigkeiten durch eine enzymatische Nachwehreaktion quantitativ bestimmt, bei welcher Glucose mittels Glucose-oxidase und Luftsauerstoff zu Gluconsäure oxydiert wird. Das bei dieser Reaktion frei werdende Wasserstoffperoxid reagiert mittels Peroxidase mit einem möglichst farblosen Chromogen. Die Extinktion des dabei entwickelten Farbstoffs liefert ein Maß für die Menge der in der untersuchten Flüssigkeit vorhandenen Glucose. Da die im Reagenzglas und in der Küvette durchgeführten Reaktionen nur mittels teurei Geräte und durch ausgebildetes Personal ausgewertet werden können, sind in den letzten Jahren Teststreifen entwickelt worden, die die erforderlichen Reagenzien bereits in richtiger Dosierung enthalten und die Farbreaktion nach dem Befeuchten mit der zu untersuchenden Flüssigkeit unmittelbar auf dem Reagenzienträger entwickeln. Solche Teststreifen können aus einem saugfähigen Träger, wie z. B. Fließpapier, bestehen, es ist jedoch gemäß deutscher Offenlegungsschrift 1 598 153 auch möglich, die Reagenzien in wasserfeste Filme einzuarbeiten. Diese Testfilme können abgewischt werden und eignen sich deshalb besonders zur Untersuchung trüber Flüssigkeiten, wie z. B. Blut.

In jüngster Zeit ist man dazu übergegangen, die an sich nur halbquantitative Auswertung der Teststreifen an Hand von Farbtafeln dadurch zu verbessern, daß Teststreifen nach erfolgter Nachweisreaktion optisch ausgemessen werden. Hierfür sind relativ unkomplizierte Remissionsphotometer entwickelt worden, die eine quantitative Auswertung von Testfilmen erlauben.

Bei der Entwicklung von Teslfilmen stellte es sich heraus, daß die Nachweisreaktionen relativ stark temperaturabhängig sind, so daß es kaum möglich war, ohne Berücksichtigung der Temperaturverhältnisse reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Besonders störend macht sich dies im Remissionsphotometer bemerkbar, da der Meßlichtstrahl die Realctionszone schnell stark erwärmt.

Als Chromogen wurde bisher für Testfilme ein Gemisch der Oxydationsindikatoren o-Tolidin und 3-Amino-9-äthylcarbazoI eingesetzt. Dieses Gemisch hat sich auf Grund seines besonders günstigen Farbumschlags von Rot nach Grün bewährt, jedoch haftet ihm der beschriebene Nachteil einer starken Temperaturabhängigkeit an.

Bisher sind trotz intensiver Forschung überhaupt keine Indikatoren gefunden worden, die temperaturunabhängig reproduzierbare Farbwerte geliefert hätten. Vielmehr traten je nach Reaktionstemperatur und abhängig von der Temperatur, bei der die Teststreifen abgelesen wurden, Farbabweichungen auf, die die Ergebnisse zum Teil erheblich verfälschten. Bei Temperaturschwankungen, wie sie bei der Auswertung im Remissionsphotometer auftreten, waren

lestfihne zur Bestimmung von Glucose im Blut bisher aus den genannten Gründen unbrauchbar.

Es wurde nun gefunden, daß 9-(y-Aminopropyl)-3-amifio-carbazol ein Indikator für den enzymatischen Glucosenachweis ist, der zusammen mit anderen Oxydationsindikatoren, insbesondere mit o-Tolidin, in weiten Grenzen temperaturunabhängige und damit reproduzierbare Farbwerte je nach Glucosekonzentration liefert, über die Temperaturunabhängigkeit hinaus besitzt der erfindungsgemäße Indikator noch eine weitere wertvolle und überraschende Eigenschaft, die dessen Verwendbarkeit in Teststreifen erheblich erweitert. Es hat sich nämlich herausgestellt, daß der erfindungsgemäße Indikator durch störende Bestandteile des Urins nicht beeinflußt wird, so daß es nunmehr möglich ist, mittels Teststreifen quantitative Bestimmungen von Glucose im Harn durchzuführen. Die bisher bekannten Teststreifen, die auf dem Prinzip der enzymatischen Glucosebestimmung nach der Glucose-oxidase/Peroxidase-Methode basierten, enthielten als Indikator meist o-Tolidin, und wurden von bestimmten häufig auftretenden bekann- !en Harnbestandteilen, wie z. B. Acetessigsäure oder Ascorbinsäure, aber auch von vielen unbekannten im Harn anwesenden Stoffen erheblich gestört. Es war dadurch zwar möglich, qualitative oder bestenfalls halbquantitative Aussagen über die Glucosekonzentration zu machen, jedoch waren verläßliche quantitative Auswertungen nicht möglich. Testpapiere zur Bestimmung von Glucose im Harn mit dem erfindungsgemäßen Indikator zeigen in den verschiedenartigsten Urinen (pH, Begleitstoffe, Eiweißgehalt uw.) mit gleichem Glucosegehalt stets die gleichen Reaktionsfarben. Dieser Befund war nicht vorhersehbar und führte zu einem Harndiagnostikum von hohem praktischem Wert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol der Formel I Cyanogruppe als auch die gegebenenfalls vorhandene Nitrogruppe zum Amin reduziert und gegebenenfalls die Aminogruppe deacyliert oder b) für den Fall, daß X eine Nitrogruppe darstellt, die Verbindung in ein Alkalisalz überführt und dieses mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III

Y-CH₂-CH₂-CH₂-N'

(JH)

in welcher Y eine reaktive Estergruppe und R₁ und R₂ übliche Schutzgruppen für die Aminofunktion darstellen, umsetzt, und anschließend in beliebiger Reihenfolge die Nitrogruppe hydriert und die Schutzgruppen Ri und R₂ abspaltet, oder
2. eine Verbindung der allgemeinen Formel IV

(IV)

NH₇

(D

(CH₂)₃—NH₂

sowie dessen Salze mit organischen oder anorganischen Säuren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von 9-(>-Aminopropyl)-3-amino-carbazol oder von dessen Salzen als Indikator für enzymatische Nachweisreaktionen.

Die Verbindung der Formel I wird dadurch hergestellt, daß man in an sich bekannter Weise

1. eine Verbindung der allgemeinen Formel 11

(H)

in welcher X ein Wasserstoffatom, eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe oder eine Nitrogruppe darstellt a) mit Acrylnitril umsetzt, für den Fall, daß X ein Wasserstoffatom darstellt, nitriert und sowohl die (CH₂)₃-Y

in welcher Y die obengenannte Bedeutung hat und Z eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe darstellt, mit Ammoniak umsetzt und gegebenenfalls anschließend Z deacyliert und die erhaltenen Verbindungen I gewünschtenfalls mit organischen oder anorganischen Säuren in die Salze überführt.

Die in 3-Stellung des Carbazolsystems der allgemeinen Formel II und IV befindliche Aminogruppe kann mit aliphatische oder aromatische Reste tragenden Gruppen acyliert sein. Bevorzugt sind Alkanoylreste mit 2 bis 6 C-Atomen, insbesondere der Acetylrest.

Die Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formel II mit Acrylnitril erfolgt in Gegenwart eines basischen Katalysators, wie z. B. Benzyl-trimethylammoniumhydroxid in einem inerten Lösungsmittel wie z. B. Benzol. Für den Fall, daß X ein Wasserstoffatom darstellt, wird in Eisessig mit Salpetersäure nitriert. Sowohl die in 3-Stellung befindliche Nitrogruppe, als auch die Nitrilgruppe wird dann katalytisch, beispielsweise mit Raney-Nickel, hydriert. Die Abspaltung einer eventuell vorhandenen Acylgruppe vom 3-Aminorest erfolgt am einfachsten durch Erhitzen in wäßrigen Mineralsäuren. Mit Salzsäure erhält man auf diese Weise direkt das wegen seiner Haltbarkeit bevorzugte Dihydrochlorid.

Als Alkalisalze von 3-Nitrocarbazol kommen praktisch nur das Natrium- oder Kaliumsalz in Frage; es lassen sich aber auch starke quaternäre Ammoniumbasen verwenden. Die Salze bilden sich beim Lösen von 3-Nitrocarbazol in einer alkoholischen Lösung der eingesetzten Basen.

Reaktive Estergruppen Y sind vor allem die Halogenide insbesondere die Chloride und Bromide; es lassen sich jedoch auch Alkylsulfonate, Tosylate, Brosylate und ähnliche reaktive Ester einsetzen.

Als Reste R, und R₂ kommen an sich alle üblichen 65 Aminoschutzgruppen, wie z. B. Acylgruppen, insbesondere Acetylgruppen, sowie die bifunktionelle Phthaloylgruppe in Frage, wobei im letzteren Fall die Abspaltung besonders einfach mit Hydrazin

durchgeführt werden kann. Für den Fall, daß X eine Nitrogruppe darstellt, kann die Abspaltung der Phthaloylgruppe zusammen mit der Reduktion der Nitrogruppe im Eintopfverfahren durch Kochen mit Hydrazin und anschließende Zugabe von Raney-Nickel 5 in wäßriger Lösung erfolgen. Acylgruppen können wie üblich mit verdünnten Mineralsäuren abgespalten werden.

Die Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formel IV mit Ammoniak, die in wäßriger Lösung ι ο in der Wärme erfolgt, führt zu den Verbindungen I, welchr gegebenenfalls mit Mineralsäuren in einfache oder Doppelsalze übergeführt werden können.

Als Säuren kommen beispielsweise in Frage: Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Borsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Benzoesäure, Malonsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Buttersäure, Propionsäure.

Das folgende Beispiel soll zur weiteren Erläuterung der Erfindung dienen.

Beispiel

Herstellung von 9-(j-Aminopropyl)-3-aminocarbazol-dihydrochlorid

11,7g 9-(ß-Cyanoäthyl)-3-nitrocarbazol werden in 50 ml Dioxan, 75 ml 5-n methanolischem Ammoniak und 4,5 g Raney-Nickel 6 Stunden bei HOC und 65 Atmosphären im Autoklav hydriert. Nach Absaugen des Katalysators und Einengen des Lösungsmittels erhält man 12 g braunes öl. Dieses wird in 50 ml Methanol gelöst und mehrmals heiß mit Kohle 3:i behandelt. Zu dem abgekühlten Filtrat tropft man unter Eiskühlung 35 ml 8,5-n ätherische Salzsäure. Die gebildeten Kristalle werden abgesaugt und mit Äther gewaschen. Man erhält 11,6g gelblichgrünes Dihydrochlorid. Zur Reinigung wird dieses in 50 ml Wasser unter Erwärmen durch Zugabe von Kohle geklärt, abgesaugt und eingeengt. Nach nochmaligem Umkristallisieren aus Methanol und wenig Wasser erhält man 9,7 g 9-(y-AminopropyI)-3-aminocarbazoldihydrochlorid (70,2% der Theorie) als farblose Kristalle; Schmp. 290⁰C (Zers.).

Das als Ausgangsprudukt verwendete 9-{/i-Cyanoäthyl)-3-nitrocarbdzol wird wie folgt hergestellt:

Variante A

66.8 g (0,4 Mol) Carbazol werden im 1000-ral-Dreihaiskolben mit Rührer, Kühler, Thermometer und Tropftrichter in einer Mischung von 100 ml (1,66 MoI) Acrylnitril und 250 ml Benzol suspendiert, unter Rühren auf 6O⁰C erwärmt und mit einigen Tropfen einer 40%igen wäßrigsn Lösung von Benzyltrimethylammoniumhydroxid versetzt. Unter starkem Schäumen erwärmt sich das Reaktionsgemisch auf 78° C. Es wird noch 45 Minuten bei dieser Temperatur weitergerührt, wobei das Carbazol vollständig in Lösung geht. Nach Abdampfen des Lösungsmittels und des überschüssigen Acrylnitril wird das rohe 9-(/S-Cyanoäthyl-carbazol aus Aceton umgelöst. Man erhält 75,1 g = 85,3% der Theorie beigefarbene Kristalle, Schtip. 154°C (Lit. 155 bis 156°C). Die Substanz ist chromatographisch einheitlich.

17,9 g (0,08 Mol) des so erhaltenen 9-(y?-CyanäthyI)-carbazols werden in einem Dreihalskolben mit Rührer, Kühler, Thermometer und Tropftrichter in 108 ml Eisessig suspendiert und bei 8O⁰C eine Mischung aus 13,5 ml Eisessig und 6,75 ml 65%iger Salpetersäure unter Rühren zugetropft, dabei geht das Nitril in Lösung. Es wird noch 15 Minuten bei 8O⁰C nachgerührt, danach tropft man die erkaltete Lösung auf 200 ml Eiswasser. Man saugt die ausgefällte Nitroverbindung ab, wäscht mit wenig Wasser nach und kristallisiert das Rohprodukt aus Aceton um. Man erhält 17,2 g (= 79,9% der Theorie) als gelbgrüne Kristalle, Fp. 225°C.

Variante B

In einem Dreihalskolben mit Rührer, Kühler und Thermometer werden im ölbad 21,2 g (0,1 Mol) 3-Nitrocarbazol in 250 ml Benzol suspendiert, mit 50 ml Acrylnitril versetzt, auf 50° C erwärmt und nach Zugabe von 2 Tropfen Benzyltrimelhylammoniumhydroxid 2 Stunden unter Rühren bei 70⁰C umgesetzt. Nach Einengen des Reaktionsgemisches und Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton/Wasser erhält man 22 g 9-(/i-Cyanoäthyl)-3-nitrocarbazoI, das direkt weiterverarbeitet werden kann.

Claims

Patentansprüche:

1. 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol der Formel I

NH,

(D

(CH₂)₃—NH₂