DE2708493A1

DE2708493A1 - Neues antibiotikum am-1042

Info

Publication number: DE2708493A1
Application number: DE19772708493
Authority: DE
Inventors: Juichi Awaya; Chiaki Kitao; Akira Nakagawa; Satoshi Omura; Ruiko Otwa; Haruo Tanaka
Original assignee: Kitasato Institute; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kitasato Institute; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1976-02-27
Filing date: 1977-02-26
Publication date: 1977-09-01
Also published as: FR2342300A1; US4226879A; FR2342300B1; DE2708493C2; GB1541512A

Description

9-1, Shirogane 5-chome, Minato-ku,

Tokyo-to, Japan und

Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
25-1 Dojima-Hamadori 1-chome, Kita-ku,
Osaka-shi, Japan

Neues Antibiotikum AM-1042.

Die Erfindung betrifft eine neue Verbindung, welche die Bezeichnung AM-1042 oder auch Asukamyzin erhalten hat. AM-1042 ist gegenüber gram-positiven Bakterien und Eimeria sowie außerdem gegenüber verschiedenen anderen Mikroogranlsmen antibiotisch aktiv. Seine akute Giftigkeit (LD₅₀, intrapenetriale Injektion) bei Mäusen betrug 48,5 mg/kg. AM-1042 besitzt eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung bei verschiedenen Infektionskrankheiten,

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welche durch einen Parasiten gram-positiver Bakterien und Eimeria verursacht werden. Die Eigenschaften von AM-1042 unterscheiden sich von denen bekannter antibiotischer Substanzen wie beispielsweise Amicetin B, Azomycin und Manumycin. AM-1042 wird durch Fermentierung eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium hergestellt, welcher AM-1042 erzeugen kann und zum Genus Streptomyces gehört.

Das erfindungsgemäße AM-1042 bezw. Asukamycin besitzt antibiotische Aktivität, ist in einer reinen kristallinen Form neutral und hat nachstehende physikalische und chemische Eigenschaften:

1) Es besteht im wesentlichen aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff,

2) Schmelzpunkt: I85 bis 190⁰C (zerfallen),

3) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (Fig.l):

Absorptionen bei 315 nm und 265 nm (Absatz) in 90#-iger Methanollösung, bei 305 und 250 nm (Absatz) in O,1N NaOH-9O#-iger Methanollösung und bei 320 und 28o nm (Absatz) in O,1N HCl-90#-iger Methanollösung.

4) Spezifische Rotation: I

I p - +175 bis 184°; und +181° im Durchschnitt (c-0,5 in J

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5) Infrarotes Absorptionsspektrum (Fig.2):

Durch die KBr-Methode wurden Absorptionen beobachtet bei 3330-33^0 cm" infolge des Vorhandenseins einer Amino- oder Hydroxygruppe, bei 2925 und 2850 cm" infolge des Vorhandenseins von Methyl- und Methylengruppen, bei I660 und I600 cm" infolge des Vorhandenseins von Carbonyl- und Doppelbindungsgruppen und bei 1365 cm" infolge des Vorhandenseins einer Methylgruppe.

6) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (Fig.3):

Das NMR-Spektrum deutet hin auf das Vorhandensein einer Amino- oder Hydroxygruppe bei ^- 13*6, von zwei aromatischen Protonen bei <■? 7*^1 * von neun oelfinischen Protonen bei <5 7*0-5,8, einer mit einem Stickstoffatom verbundenen Methylgruppe oder einer solchen mit Doppelbindung bei & 2,6 und von zwei Methylgruppen bei ό 1,0-0,9·

'7) Farbreaktion:

Positiv in den Reaktionen von Ehrlich, Dragendorff und Jod. Negativ in den Reaktionen von Molisch, Fehling, Ninhydrin, Beilstein und Rydon-Smith.

8) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:

Leicht löslich in Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid. Löslich in Aceton, Chloroform, Äthylacetat, Äthanol und Methanol. Unlöslich in Petroleumäther, η-Hexan und Wasser.

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-X-• 6·

9) Rf-Werte durch Chromatographie:

Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel (Kieselgel G, 0,3 mm, erhältlich bei Merck Inc., USA), welche in herkömmlicher Weise durchgeführt wurde, ergab nachstehende Rf-Werte:

Benzol-Aceton (13:7) 0,40

Chloroform-Methanol (10:1) 0,56 Äthylacetat-Methanol (87:13) 0,66

10) Elementaranalyse, Molekulargewicht und Molekularformein:

Aufgrund verschiedener Versuche wurde festgestellt, daß durch Elementaranalyse für AM-I042 keine konstanten Werte erzielbar sind. So wurden beispielsweise nachstehende Schwankungen festgestellt, wenn das im nachstehenden Beispiel 1 erhaltene gereinigte Produkt als Probe für drei Untersuchungen verwendet wurde.

	C(Ji)	H(Ji)	H(JO	0(JO
Experiment	65,31	5,71	5,26	23,72
Experiment	67,12	6,19	5,U	21,58
Experiment	65,37	6,03	4,99	23,61

Auch ein definiertes Molekulargewicht von AM-1042 ließ sich kaum durch Massenspektrometrie bestimmen, während nach der Rast-Methode ein Molekulargewicht von 520 bis 58o (angenäherter Wert) für AM-1042 feststellbar war. Unter Berücksichtigung dieser Resultate und verschiedener anderer Paktoren ist daher

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anzunehmen, dal3 die empirische Formel für AM-1042

lautet.

Daneben wurde gereinigtes AM-1042 in einer Mischung aus wasserfreier Essigsäure und Pyridin gelöst und anschließend stehengelassen. Die so erhaltene Substanz dürfte ein Acetyl-Derivat von AM-1042 sein. Diese Substanz ergab einen Wert von m/e 626 durch Massenspektrometrie (C-xcHogNpO,,). Von diesem Wert wurde ein zwei Acetylgrüppen entsprechender Wert m/e 542 abgeleitet, welcher als Molekulargewicht von AM-1042 angenommen wurde und aus welchem eine Molekularformel ^C2Q^H22^N2°9^berecnnet wurde. Allerdings gab es keinen Beweis für die Vorbedingung, daß m/e 626 tatsächlich dem Acetyl-Derivat von AM-1042 entspricht, wenn man einige Symptome berücksichtigt, welche das Vorhandensein anderer Nebenprodukte oder Zerfallsprodukte vermuten läßt, welche bei der Herstellung des Acetyl-Derivats vermutlich angefallen sind.

Allerdings wurde eine gleichmäßige Stelle festgestellt, wenn gereinigtes AM-1042 der Dünnschicht-Chromatographie unterworfen wurde.

Unter den verschiedenen physikalischen und chemischen Merkmalen ^: ist das UV-Absorptionsspektrum durchaus hervorstechend und läßt J sich infolgedessen für die Identifizierung einsetzen. Verschiedene antibiotische Substanzen der bisher bekannten Art mit analogen j Merkmalen wie AM-1042 wurden überprüft und es wurde festgestellt,

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daß z.B. Amicetin B (P. Sensi und andere, Antibiotics and Chemotherapy, 7, 645 (1957)) und Azomycin (E. Maeda und andere, J. Antibiotics, a6, 182 (1953)) Antibiotika sind, welche bei 315 nm ein Peak in der UV-Absorptionskurve haben. Allerdings hat das Spektrum von Amicetin B zusätzlich zu einem Peak bei 32Ί nm ein weiteres Peak bei 249 nm in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0. Diese Peaks werden zu 329 und 273 (Absatz) unter alkalischen Bedingungen und zu 31I und 257 nm unter sauren Bedingungen verschoben. Außerdem liegt in den Molekülen von Amicetin B eine Amid-Kupplung vor, welche in den Molekülen von AM-1042 nicht vorhanden ist, welches bei der Rydon-Smith-Colorreaktion negativ ist. Dadurch bestätigt sich, daß Amicetin B nicht mit AM-1042 identisch ist.

Azomycin besitzt eine maximale Absorption bei 313-314 nm und seine reinen Kristalle sind weiß gefärbt. Allerdings ist Azomycin optisch inaktiv, d.h. es besitzt keine optische Rotation. Aus diesen Peststellungen ergibt sich, daß auch Azomycin nicht mit AM-1042 identisch ist.

Bekannte antibiotische Substanzen mit analogen Infrarot-Absorptionsspektren sind beispielsweise Manumycin (Pharmaceu. Acta, Helvetiae, 38, 87I-874 (I96I) und Tetrahedron Letters (1973) 4995-4998). Allerdings zeigt Manumycin Ultraviolett-Absorptionspeaks bei 281 nm (log. f 4,63) und bei 325 nm (log. e 4,59) sowie eine einheitliche optische Rotation von £*J -, = +124° (c=0,528 in Äthanol) und -I85⁰ (c=0,4 in Chloroform). Diese Merkmale sind nicht mit denen von AM-1042 identisch.

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'S-

Es ist daher Λβίη Zweifel, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum AM-1042 oder Asukamycin neuartig ist und gekennzeichnet ist durch sein einzigartiges UV-Absorptionsspektrum, allein oder in Kombination mit seiner optischen Rotation.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum AM-1042 hat nachstehende biologischen Merkmale. Dabei zeigt Tabelle 1 die durch die Agar-Agar-Verdünnungsmethode bestimmte antibakterielle und antifungizide Aktivität von AM-1042 als mlndest-hemmende Konzentration (MIC) (mcg/ml).

Tabelle 1 Teststoff MIC(mcg/ml)

Staphylococcus aureus FDA 209P⁺ 3*12

S. aureus PDA 209P JC-I⁺ 0,78

ü. aureus FS-1277 (Phenicillin-resistent)⁺ 6,25

S. aureus KB-64 (Tetracyclin- und Erythromycin-

resistent)⁺ 6,25

S. albus⁺ 12,5 Micrococcus flavus 16⁺ 1,56

Sarcina lutea PCI 100I⁺ 6,25

Bacillus subtilis PCI 2Vj⁺ 3,12

B. subtilis ATCC 6633⁺ 6,25

B. subtilis NRRr, B-558^H 100 B. cereus T⁺ 3,12

B. megaterium APF¹" 6,25

B. anthracis⁺ 12,5

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B. agri¹"

Corynebacterium paurometaboluni Mocardia asteroides"¹" Aerobacter aerogenes IAM Il83⁺ Mycobacterium smegmatis ATCC 6O7⁺ Escherchia coli NIHJ⁺ E. coli NIHJ JC-2⁺ E. coli B⁺

Klebsiella pneumoniae PCI 602⁺ Proteus vulgaris IFO 3l63⁺ Salmonelle typhimuriutn Shigella sonnei B-33 Pseudomonas aerginosa P-3⁺ Candida albicans ⁺ Sacchromyces cerevisiae Aspergillus niger Cryptococcus neoformans ⁺⁺ Trichophyton mentagrophytes ⁺⁺ Piricularia oryzae ⁺⁺ Al ternäria kikuchiana Fusariuin oxysporum ⁺ Xanthomonas oryzae Sclerotinia cinerea Botrytis cinerea

12,5 1,56 1,56 100

> 100 100

> 100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100

>1OO >100 >100 >100 100 >100

Anmerkung:

+ — Pepton 0,5 %', Fleischextrakt 0,5 %; Agar 1,2 % (pH 7,0), 37°C, 18 h

++ -- Kartof'felextrakt mit Glucose 1,0 % und Agar 1,2 % (pH 6,8), 27°C,72 h

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'ή/Ι.

V/ie diese Tabelle zeigt, hemmte ΛΜ-1ο^2 das Wachstum von grampositiven Bakterien innerhalb einer Konzentration von 0,78 bis 12,5 mcg/ml mit Ausnahme von Aerobacter aerogenes IAM 118j>, Mycobacterium smegmatis ATCC 607 und Bacillus subtills NRRL B-558 während keine wahrnehmende Wirkung auf gram-negative Bakterien bei Konzentrationen unter loo mcg/ml feststellbar war. Schwache antifungizide Aktivität wurde gegenüber Trichophyton mentagrophytes bei einer Konzentration von 25 mcg/ml festgestellt, während bei einer Konzentration von unter loo mcg/ml keine bedeutsame Aktivität in bezug auf andere Fungizide feststellbar war.

Die akute Giftigkeit (LD,. ip.) von AM-I o'<2 bei Mäusen, welche

;;O

nach der Behrens-Kärber-Methode berechnet wurde, betrug 48,5 ^mC 'kßi "loch wurden keinerlei Nebenwirkungen an Mäusen festgestellt, wenn Gaben von 450 mg/k per op verabfolgt wurden. Infolgedessen kann man AM-lo^2 alü Medikament verwenden, um Infektionskrankheiten zu verhindern und zu behandeln, welche durch einen Parasiten der vorgenannten Mikroorganismen verursacht wurden.

In verfahrensmäßiger Hinsicht geht die Erfindung bei der Herstellung von AM-Io42 bzw. Asukamycin durch Fermentation in der Weise vor, daß ein Mikroorganismus, welcher zum Genus Streptomyces gehört und fähig ist, AM-Io^? zu produzieren, nerobisch in einem üblicherweise zur Fermentierung von Mikroorganismen des Genus Streptomyces verwendeten Medium gezüchtet wird, um AM-lo42 bzw. Asukamycin in den Kulturbrühen anzusammeln, aus denen AM-Ic42 alsdann gewonnen wird.

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• 41.

FUr. die Zwecke der Erfindung ist es möglich, nicht nur den
nachstehenden beschriebenen AM-lo42-Stamm und irgendwelche
Mutanten desselben zu verwenden, sondern auch irgendeinen Stamm, welcher zum Genus Streptomyces gehört und zur Erzeugung von AM-lo42 fähig ist.

Der in den nachstehenden Beispielen zur Erläuterung der Herstellung von AM-lo42 verwendete AM-lo42-Stamm hat nachstehende mikrobioligischen Merkmale:

1. Morphologische Merkmale:

Ein weit verzweigtes Substrat Mycelium wird reichlich auf den meisten Agar-Medien bis auf einige natürliche Medien ausgebildet. Die Sporenketten-Morphologie gehört zur Sektion Retinaculiaperti oder Spirales mit kurzen Ketten von
Conidiosporen. Die Oberflächen der Sporen sind glatt, zeigen jedoch oftmals Knicke oder Falten. Sporangium, Sclerotium und Zoosporen werden nicht beobachtet. Die Sporen haben
eine Abmessung von o,5-o,8/u χ ο,8-1,ο/λ.

2. Kulturmerkmale in verschiedenen Medien:

Die in nachstehender Tabelle 2 angegebenen Kulturmerkmale wurden nach einer Kulturzeit von Io bis 14 Tagen bei 27°C beobachtet.

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-Hr-

(Es bedeuten: GR

'.■'achstum, PE -. Gegenteil, AM -·= Luf^pilz, chep Pigment)

Medien:

Sucrose-nitrat-ar-ar ülucose-nitrat-a^ar

OR: farblos

PE: Schiefer-hellbraun (° ig)

AM: Schiefer-hellbraun (^ ir>

SP: ohne bis Creme-farbig (1 1/2 ca)

GR: farblos

!"[E: senf braun (2 Ig)

AM: pulverig, schwach,

Schiefer-hellbraun (2 ig)

SP: Senfgold (2 pg)

Glycerol-calclummalat-agar Glucose-asparagin-acar (T.°>p)

: farblos

: maisgelb (2 ea) bis helles senfbraun (2 ie)

AM: pulverig, beige SP: honiggelb

GR: farblos

IiE: senfbraun (Γ ni)

AM: Schiefer-hellbraun (2

SP: senfgold (2 pg)

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ORIGINAL INSPECTED

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Glycerol-asparagin-agar (IS?) GR: farblos

RE: honiggelb (2 ic) bis zimtfarbig

Ie)

AM: pulverig, Schieferhellbraun (2 Lg)

SP: Goldbraun

pg)

Stärke-anorganische Salze Agar (TSP)

senfgolrl (2 pg) oder senfbraun (2 pi)

senfgold (2 pg) oder kupferbraun (2 pi)

AM: Schiefer-hellbraun (2 Ig) SP: goldbraun ("5 pg)

Tyrosin-agar (ISP) OR: Leuchtend gelb (2 pa) RE: senffarben (2 Ie) bis leuchtend gelb (2 na) am Rande und gedecktes braun (2 Ii) bis senfbraun (2 Ig) in der Mitte

Pepton-Hefe^xtrakt-Eiscn-agar (TSP) GR: farblor

RE: senfgold (2 pg) Λ Γ".: ohne

SP: ohne

Γ! 1 nc of e_ pe pt on-agar OR: schwach, farblos RE: leicht ambnr {J> AM: schwach, biskuit (2 o.c)

SP: nenfgold (2 pg) bis senfgold (4 Ie)

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ORIGINAL INSPECTED

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Nähr-agar GR: biskuit (2 ec) RE: biskuit (.? ec) ΛΜ: ohne SP: ohne

Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP)

Hafermehl-agar (ISP)

GR: farblos

RE: senfbraun (2 Ig)

AM: Schiefer-hellbraun (2 ig)

SP: goldbraun (J> pg)

GR: farblos bis blaiägelb (1 1/2 ca)

RE: leuchtend gelb (2 na)

bis gedecktes braun (2 ge)

ΛΜ: pulverig, gedecktes braun (2 ge) bis golden (2 Ic)

SP: honiggelb (2 Ic) bis golden (2 Ic)

Tryρ t on-He fe ex t ra k t bfühe (ISP)

GR: farblos RE;

AM: weiß bis Schiefer-hellbraun (2 ig)

SP: ohne

Anmerkung: Es wurde Bezug genommen auf Color Harmony Manual (1958) der Container Corp. of America.

ISP = Medien, ausgewählt vom International Streptomyces Projekt.

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3. Physiologische Merkmale:

1) Wachstumstemperatur 15 bis 4o°C

2) Bildung von Melanoidpigment Trypton-Hefeextraktbrühe: negativ Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar: negativ Tyrosinagar: negativ

3) Verflüssigung von Gelatine: positiv

4) Hydrolisierung von Stärke: positiv

5) Coagulation von Magermilch: vermutlich positiv

6) Peptonisierung von Magermilch: positiv

7) Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ

8) Bildung von salpetriger Säure: positiv

9) Hydrolisierung von Zellulose: vermutlich positiv.

4. Assimilierbarkeit verschiedener Kohlenstoffquellen:

Durch Züchtung des erfindungsgemäßen Stammes im Pridham-Qottlieb-Medium ergaben sich nachstehende Resultate.

Assimilierbar: D-Olucose, D-Xylose und L-Rhamnose. Mehr oder weniger assimilierbar: D-Fructose, D-Raffinose und L-Arabinose. Nicht assimilirbar: D-Mannitol, Sucrose und

I-Inositol.

Aus diesen Daten ergibt sich, daß der erflndungsgemäße Stamm eindeutig zum Qenus Streptomyces gehört und dem Streptomyces

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nodosus gleich ist (International J. Systematic Bacteriology, 8, 353 (1968)), was im Hinblick auf verschiedene Stämme gefolgert werden kann, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed. (1974) bzw. International J. of Systematic Bacteriology (I968-I972) beschrieben sind.

Verglichen mit dem ISP-Standardstamm von S. nodosus ergeben der erfindungsgemäße Stamm und S, nodosus farblose oder leioht gefärbte Erzeugnisse, graubraun gefärbte Aero-Mycelien und gelbes lösliches Pigment. Auch andere Merkmale sind fast dieselben wie bei S. nodosus, insbesondere, wenn die Kultur in einem Medium aus Stärke und anorganischen Salzen erfolgt. Bezüglich der physiologischen Merkmale 1st festzustellen, daß S. nodosus nicht-chromogen ist, negativ in der Bildung von Schwefelwasserstoff und positiv in der Bildung von salpetriger Säure und der Hydrolisierung von Stärke. Diese Merkmale entsprechen genau denen des erfindungsgemäßen Stammes. Andererseits ist die Assimilierbarkeit von Zuckern beider Stämme eindeutig verschiedenartig. So werden D-Mannitol und I-Ionostol durch S. nodosus assimiliert, nicht jedfach durch den erfindungsgemäßen Stamm.

Aus diesem Vergleich erscheint es durchaus gerechtfertigt, den erfindungsgemäßen Stamm bezüglich seiner morphologischen und physiologischen Eigenschaften unter S. nodosus zu klassleren, während wegen der Unterschiede in der Assimilierbarkeit von Zuckern der erfindungsgemäße Stamm sicherlich als einer der Subspezies von S. nodosus zu klassifizieren 1st. Der erfindungsgemäße Stamm wurde infolgedessen als "S. nodosus subsp. asukaensis" bezeichnete Dieser Stamm wurde als "S. nodosus subsp. AM-lo42" auf beschränkter Basis bei dem Fermentation Research

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Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba-ken Japan (FERM-P-3^29) und auf unbeschränkter Basis (NRRL 8185) bei der ARS Culture Collection, Peoria, USA, hinterlegt. Man kann auch beispielsweise einen Mutationsstamm in üblicher Weise unter Verwendung von UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, anderer Strahlung, Chemikalien und dgl. erhalten. Ein Mutationsstamm, welcher durch Behandlung mit UV-Strahlen in üblicher Weise hergestellt wurde, zeigt eine ausgezeichnete Produktivität und wurde bei dem ARS Culture Collection, Peoria, USA, auf unbeschränkter Basis (NRRL II070) als "S. nodosus subsp. AM-1042-16" hinterlegt. Die AM-1042-erzeugenden Stämme, welche in den nachstehenden Beispielen verwendet werden, können AM-1042 in den Kulturbrühen bezw. sowohl in der Kulturflüssigkeit wie in den mikrobischen Körpern erzeugen.

Pur das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kann irgendein synthetisches oder organisches Medium verwendet werden, wenn es eine geeignete Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Substanzen und erforderlichenfalls verschiedene andere Nährstoffe enthält, welche hermömmlicherweise zur Züchtung verschiedener Mikroorganismen verwendet werden, die zum Genus Streptomyces gehören.

Als Kohlenstoffquelle wird beispielsweise vorzugsweise Glucose, Maltose, Lactose, Saccharose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Melasse, und dgl. verwendet.

1 Die vorzugsweise für diesen Zweck verwendeten Stickstoffquellen ; sind beispielsweise Sojabohnenmehl, Getreidemaische, Baumwoll-

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saatkuchen, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Hefe, Kasein-Hydrolysat, Ammoniumsalze, Nitrate und dergleichen.

Als anorganische Substanzen können beispielsweise verwendet werden verschiedene Phosphate, Magnesiumsulfat und dergleichen. Man kann auch falls erwünscht beispielsweise verschiedene bekannte Salze von Kalzium, Natrium, Eisen, Mangan und dgl. verwenden.

Zur Herstellung einer großen Menge von AM-1042 wird vorzugsweise ein flüssiges Medium verwendet, wenn auch ein festes

Medium brauchbar ist. Es ist möglich, ein Zuchtmedium mit gleicher Zusammensetzung wie das Hauptkulturmedium zu verwenden und vorzugsweise werden die Zuchtkeime durch Fermentierung erhalten, welche aerobisch bei einer Temperatut von etwa 27°C während eines oder zweier Tage beispielsweise in einer Sakaguchi-Flasche durchgeführt wird. J

Die Fermentierung wird bei aerobischen Bedingungen unter Schütteln bei einer Temperatur zwischen 15 und 40 C (vorzugsweise zwischen 25 bis 30⁰C) bei einem eingestellten pH-Wert von 6 bis ; 10 (vorzugsweise zwischen 6 und 8), während etwa 2-8 Tagen j (vorzugsweise zwischen 70 bis 150h) durchgeführt, wobei eine große Menge an AM-1042 gleichzeitig im Medium und in der Mikro- j

bensubstanz angesammelt wird. Nach Abschluß der Fermentierung j

wird AM-1042 aus den Kulturbrühen zurückgewonnen. Beispielsweise werden die Brühen in die Mikrobensubstanz und das FIltrat ge-

Kulturbrühen zurückzugewinnen. Wie die vorbeschriebenen physi-

trennt, wenn es auch möglich ist, AM-1042 ohne Trennung der

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kaiischen und chemischen Eigenschaften zeigen, ist AM-1042 in Fett löslich, sodaß im allgemeinen vorzugsweise AM-1042 bezw. Asukamycin dadurch zurückgewonnen wird, daß eine herkömmlicherweise zur Rückgewinnung verschiedener antibiotischer Substanzen dieser Art geeignete Methode wie beispielsweise die Lösungsmittelextraktlonsmethode angewendet wird.

Beispielsweise werden die Kulturbrühen in Peststoffe und Flüssigkeit in herkömmlicher Weise durch Filtern, Zentrifugieren und dgl. getrennt. Die flüssige Phase, d.h. das Filtrat, wird auf einen sauren pH-Wert von vorzugsweise 2 bis 4 mit HCl und dgl. eingestellt und wird dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Äthylacetat oder Butylacetat extrahiert. Andererseits ist es auch möglich, die Säuerung fortzulassen, falls dies wünschenswert erscheint. Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wird bis zur Trockenheit konzentriert und das getrocknete Material wird mit einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise Äthyläther gewaschen, um fettige Unreinheiten zu entfernen, woraufhin es dann in einem Lösungsmittel wie beispielsweise Chloroform gelöst wird, um die Unreinheiten weiter zu entfernen. Anschließend ergibt eine Säulen-Chromatographie auf Kieselgel mit einem Chloroform-Methanol-System die AM-1042 enthaltenden aktiven Fraktionen, welche unter vermindertem Druck kombiniert und bis zur Trockenheit konzentriert werden, wobei gelblich-orange Rohpulver entstehen. Diese : Rohpulver werden in kleiner Menge des Chloroform-Methanol-Systems , gelöst, aus welchem AM-1042 in Form von Nadelkristallen blaß- ι gelblicher Färbung.rekristallisiert wird. Das auf diese Weise i erhaltene AM-1042 wird in herkömmlicher Weise beispielsweise

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unter Verwendung von Bacillus subtilis als Test-Mikroorganismus untersucht.

Wenn auch AM-I042 in Bezug auf Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Bacillus cereus, Nocardia asteroides usw. aktiv ist, hat sich auch herausgestellt, daß AM-1042 eine antibiotische Substanz ist, welche aktiv ist gegen Kokzidiose bei Geflügel und dergleichen. Kokzidiose ist eine Infektionskrankheit, welche durch einen Parasiten von Protozoa verursacht wird, welcher zu Coccidia von Sporozoa gehört und zu Durchfall und Unterernährung von Geflügel und dgl. führt. Diese Infektionskrankheit ist bei Küken und anderem Geflügel weit verbreitet und findet sich auch bei Truthähnen, Hunden, Katzen und anderen Tieren. Oocyst, welches eine der Portpflanzungsarten dieses Protozoa ist, wird vom Wirt ausgeschieden und bildet die Sporen als Quelle der Infektion. Diese Sporen werden oral aufgenommen und wachsen dann in den Zellen an der Oberflächenschicht der Eingeweide des Parasiten und verursachen die Unterernährung und Diarrhöe, welche als Kokzidiose allgemein bekannt ist. Infolge der Notwendigkeit, Kokzidiose zu verhindern und zu heilen, wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, um verschiedene Wirkstoffe zu entwickeln, welche als wirksamen Bestandteil beispielsweise Arsenikverbindungen, Nltrofuran, Bisphenol, Sulfamin, ThiacInderivate, Quinolinderivate, Pyridinderivate, Guanidinderivate und dgl. enthalten. Derartige bekannte Wirkstoffe sind jedoch einerseits nicht wirksam genug und einige Sporozoa-Arten wurden sogar < gegenüber diesen bekannten Wirkstoffen gegen Kokzidiose resis- ,

tent. j

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Überraschenderweise wurde festgestellt, daß AM-lo42 bzw. Asukamycin äußerst wirksam ist gegen Kokzidiose. So ist beispielsweise AM-lo42 äußerst wirksam bei der Herabsetzung der Sterblichkeit von Küken, welche mit Eimerial tenella infiziert wurden.

Erfindungsgemäß ist des weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Arzneimittel vorgesehen, welches AM-lo42 als aktiven Bestandteil besitzt. Zur Verhinderung oder zur Heilung von Kokzidiose bei Tieren wie beispielsweise Geflügel kann man AM-lo42 allejindn fester oder flüssiger Form verabfolgen. Andererseits ist es auch möglich, AM-lo42 der Nahrung zuzusetzen. Die Menge der zu verabfolgenden Gaben kann je nach der Art, den Symptomen und dgl. der Kokzidiose, dem Alter des Wirtes und verschiedenen anderen Umständen schwanken. Vorzugsweise wird jedoch AM-lo42 vor der Beigabe zur Nahrung selbst oder zu einem oder mehreren Bestandteilen derselben verdünnt. Dementsprechend sieht die Erfindung auch eine Nahrung vor, durch welche Kokzidiose bei Geflügel verhindert und/oder geheilt werden kann.

Wenn AM-lo42 durch Vermischung mit der Nahrung oder dessen Bestandteilen vor der Verabfolgung verdünnt wird, erfolgt diese Verdünnung vorzugsweise z. B. durch Hafermehl, Weizenmehl, Roggenmehl, Maismehl, Sojabohnenmehl, Sojabohnenkuchen, Rapssaatkuchen, entfettete oder nicht entfettete Reiskleie, Stärke von irischen Kartoffeln, Rückstand von Sojabohnenquark, Hefe, Fisch- ' mehl, Rückstand von Fermentierungsbrühen und dergleichen. Es ist I auch möglich, einer derartigen Nahrung Vitamine, Minerale, Antiseptika, enzymhaltige Präparate, Proteine, Kohlehydrate, Amino- ί säuren, Antifiebermittel, Sedative, anthiphlogistische Mittel, ^!

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Germicide und verschiedene andere Substanzen zuzusetzen oder gleichzeitig mit AM-1042 zu verabfolgen. Wenn auch die Dosierung von AM-1042 zur Verhinderung und zur Heilung von Kokzidiose bei Geflügel Je nach den verschiedenen Umständen schwanken kann, so kann man doch im allgemeinen AM-1042 in einer Menge zwischen 0,003 bis 0,03 Gew.-Ji der Nahrung zusetzen. Eine typische Dosierung der Nahrung für Küken zeigt nachstehende Tabelle 3· Bei alleiniger Verabfolgung von AM-1042 oder auch bei Verabfolgung zusammen mit der Nahrung lassen sich gute Resultate trotz der Form von AM-1042 erreichen. Da durch Fermentierung hergestelltes AM-1042 sowohl in der Mikrobensubstanz wie im Filtrat der KulturbrUhen enthalten ist, läßt sich AM-1042 auch in Form von Rohpulvern verwenden, bevor diese gereinigt werden oder auch in der Form getrockneter Brühen oder getrockneter Mikrobensubstanzen.

	Tabelle 3	(g/Tag)
Alter in Wochen	Nahrungsmenge	Eis
	Fleischart	5
1	15	14
2	23	23
3	41	30
4	53	36
5	60	46
6	66	53
7	79	55
8	93

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- ee -

9 lol 59

10 111 63

11 — 66

12 — 7o

13 — 75

14 ,»τ 79

15 — 85

Bei einem bevorzugten Durchführungsbeispie1 wurde AM-lo42 durch Zusatz von Sojabohnenmehl, entfettete oder nicht entfettete Reiskleie und Kalziumcarbonat auf eine Konzentration von 1/2 bis l/2oo verdünnt und diese Mischung dann der Nahrung beigegeben, so daß die in vorstehender Tabelle angegebene Konzentration von AM-lo42 erreicht wurde.

Durch Verabfolgung des erfindungsgemäßen Arzneimittels bzw. der erfindungsgemäß zusammengestellten Nahrung, läßt sich Kokzidiose bei Geflügel wie bei Küken, Truthähnen und dgl. ohne jegliche Nebenwirkung verhindern und/oder heilen. Verschiedene Versuche ergaben, daß AM-Io42 nicht nur wirksam 1st gegen Eimeria tenella, selbst wenn eine Resistenz gegenüber verschiedenen chemischen Wirkstoffen wie beibpielsweise Amprolium (HCl), Clopidol und , Robenidln (HCl) vorliegt, sondern auch gegenüber anderen Prototoa-Arten, welche zur Eimeria gehören, wie beispielsweise [ E. necatrix, E. acervulina, E. brunetti und Eimeria maxima. |

Es wurde auch festgestellt, daß AM-lo42 eine wachstumsfördernde Wirkung besitzt, wenn es in der an das Geflügel verfütterten Nahrung in einer Menge von ο,οοΐ bis o,o2 Gew.-# der Nahrung

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enthalten ist. Infolgedessen schafft die Erfindung außerdem ein wuchsförderndes Mittel für Geflügel, welches AM-1042 als aktiven Bestandteil enthält. Die Art der Verabfolgung ist der vorbeschriebenen analog.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Beispiele des weiteren erläutert.

Beispiel 1;

Ein Zuchtmedium (pH 7,0; 100 ml), welches Glucose (0,1 %) Stärke (2,4 %), Pepton (0,3 %), Fleischextrakt (0,3 %), Hefeextrakt (0,5 %) und Kalziumcarbonat (0,4 %) enthielt, wurde als Keimmedium in eine 500 ml Sakaguchi-Plasche gefüllt. Mit einer Platinschlinge wurde von einer schrägliegenden Kultur Streptomyces nodosus subsp. AM-1042 (FERM-P-3429; NRRL 8185) entnommen und damit das Keimmedium geimpft, welches dann bei einer Temperatur von 27°C 48 h lang unter Schütteln gezüchtet wurde.

Mit den auf diese Weise erhaltenen Zuchtkeimen wurde ein Hauptkulturmedium (pH 7,Oj 100 ml) in einem 30 1 Fermentierungsstandgefäß, welches Dextrin (2,0 %), Glucose (0,2 %), Sojabohnenmehl (1,5 %), Hefeextrakt (0,3 #) und Kalziumcarbonat (0,3 %) enthielt, geimpft. Die Fermentierung wurde bei einer Temperatur von 27⁰C während 96 h unter Schütteln (250 U/min) und Belüftung (10 l/min) durchgeführt. Beide Medien wurden bei einer Temperatur von 120⁰C 20 min lang vor Verwendung sterilisiert. Nach Abschluß der Fermentierung wurden die Mikroben-

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substanzen von den KulturbrUhen durch Zentrifugieren entfernt. Das Filtrat (15 1) wurde auf einen pH-Wert 3,0 mittels 6N-SaIzsäure eingestellt, mit Ähtylacetat (5 1) versetzt und während 1 h bei Raumtemperatur extrahiert. Die Lösung wurde nochmals in gleicher Weise extrahiert. Die Äthylacetat-Schicht wurde abgenommen und unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, wobei sich gelb-oranges Pulver (4,3 g) ergab, welches mit 200 ml Äthyläther gewaschen wurde, um fettige Unreinigkeiten zu entfernen, woraufhin es an einer kalten Stelle eine Nacht lang stehengelassen wurde. Anschließend wurde die Lösung zur Entfernung unlöslicher Substanzen gefiltert und unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert. Das getrocknete Material wurde in eine Säule übergeführt, welche mit Kieselgel (54 g Kieselgel G der Firma Merck Inc., USA) gefüllt war, und mit einem Lösungssystem von Chloroform-Methanol (1,5 Ii 60:1 v/v) entwickelt. Das Eluat wurde in seine einzelnen Fraktionen von jeweils 10 ml geteilt. Jede Fraktion wurde dann quantitativ durch Bioversuche unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI bestimmt, wobei man auch mit einem Rf-Wert von 0,56 rechnete, welcher durch eine Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungssystems von Chloroform-Methanol (60:1) erhalten wurde. Fraktionen Nr. 111 bis I50 wurden als aktive Fraktionen kombiniert und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein gelbes Pulver (350 mg) entstand. Die Pulver wurden in einer geringen Menge (5 ml) einer Mischung aus Chloroform und Methanol (95:5) gelöst und dann über Nacht an einer kühlen Stelle aufbewahrt, wodurch blaß-gelbe Nadelkristalle (300 mg) mit einem Reinheitsgrad von mehr als 99 % und folgenden Merkmalen entstanden:

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Schmelzpunkt: I85 bis 190⁰C (zerfallen) Spezifische Rotation:

fl - +175 bis 184°;

(c=0,5 in CHCl,)

UV-Absorptionsspektrum:

90# Me-OH

nm: 315 und 265 (Absatz)

IR-Absorptionsspektrum durch KBr-Methode:

Charakteristisch starke Absorptionen bei

, 2925, 2850, 1660, 1600 und 1365 cm"¹.

Beispiel 2:

Ein Stamm von Streptomyces nodosus subsp. AM-1042 (EERM-P-3429; NRRL 8185) wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet. Auch die nachfolgende Behandlung wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 mit nachstehenden Ausnahmen durchgeführt. Das FiItrat mit einem eingestellten pH-Wert wurde durch zweimaligen Zusatz von Butylacetat (jeweils 6 1) extrahiert und dann getrocknet, wobei sich gelblich-orange Pulver (5,5 g) ergaben, welche dann in Chloroform (400 ml) gelöst wurden. Die Säulen-Chromatographie wurde unter Verwendung von Kieselgel (65 g) und eines Lo'sungssystems aus Benzol-Aceton (2,5 1; 8:1 v/v) durchgeführt, wobei sich die Einzelfraktionen von jeweils I5 ml ergaben. Die Fraktionen Nr. 111 bis 150 wurden zu einer aktiven Fraktion kombiniert. Die auf diese Weise erhaltenen geIbIich-orangen Rohpulver

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- ve -

(480 mg) wurden in einer Mischung von Äthylacetat und Methanol (5 ml insgesamt; 95:5) gelöst. Die schließlich erhaltenen gelblich-orangen Nadelkristalle (360 mg) hatten einen Reinheitsgrad von mehr als 99 #. Die das Produkt identifizierenden Eigenschaften waren die gleichen wie im Beispiel 1.

Beispiel

Ein Kulturmedium (pH 7,0; 100 ml), welches Glucose (2 %), Sojabohnenmehl (2 #) und Tafelsalz (0,2 #) enthielt, wurde in eine 500 ml Sakaguchi-Flasche gefüllt und bei einer Temperatur von 120⁰C 20 min lang sterilisiert. Dieses Medium wurde als Keimmedium verwendet und mit einem Stamm von Streptomyces nodosus subsp. AM-1042-16 (NRRL 11070) geimpft, um anschließend bei einer Temperatur von 27°C 24 h unter Schütteln gezüchtet zu werden. Mit diesen Keimen wurde dann ein Hauptkulturmedium (pH 7,0; 20 l) geimpft, welches sich in einer 50 1 Fermentierungs-Standflasche befand. Dieses Hauptkulturmedium enthielt 2 % Glycerin, 2 % Sojabohnenmehl und 0,2 % Tafelsalz und wurde bei einer Temperatur von 120⁰C 20 min lang vor Verwendung sterilisiert. Die Fermentierung erfolgte bei einer Temperatur von 27 C während einer Zeitspanne von 72 h unter Schütteln (250 U/min) und Belüftung (10 l/min). Nach Abschluß der Fermentierung wurde die Mikrobensubstanz nicht von der Kulturbrühe getrennt, vielmehr wurde diese im Ganzen mit 20 1 Äthylacetat versetzt. Nach Extraktion bei Raumtemperatur während 1 h unter Umrühren, wurde die Äthylacetat-Schicht (15 1) durch Zentrifugieren getrennt und unter vermindertem Druck getrocknet. Das

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-tt.

auf diese Weise erhaltene geIbIich-orange Pulver (25,8 g) wurde dann mit Äthyläther (500 ml) gewaschen, um fettige Unreinheiten zu entfernen und dann in Chloroform (500 ml) gelöst. Anschliessend wurde die Chloroformschicht unter vermindertem Druck auf eine Menge von 20 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wurde in eine mit Kieselgel (200 g; Kieselgel G der Firma Merck Inc., USA) gefüllte Säule übertragen und mit einem Lösungssystem von Chloroform-Methanol (31; 60:l v/v) entwickelt. Das Eluat wurde in die Einzelfraktionen von jeweils 20 ml geteilt. Jede Fraktion wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 untersucht. Die Fraktionen 91 bis 150 wurden zusammengefaßt und unter vermindertem Druck getrocknet. Die Trockenmasse (12 g) wurde in einer geringen Menge (20 ml) einer Mischung aus Chloroform und Methanol (95:5 v/v) gelöst und dann über Nacht an einer kühlen Stelle stehengelassen, wobei gelbe Nadelkristalle (10 g) mit einem Reinheitsgrad von mehr als 99 % entstanden.

Die Identifikationsmerkmale des Produktes waren die gleichen wie bei dem Produkt im Beispiel 1.

Beispiel 4:

7 Tage alte Küken wurden in einige Gruppen aufgeteilt und von 48 h nach der Geburt bis 2 Tage vor Beginn des Versuches mit einer Nahrung gefüttert, welche 0,1 % eines Arzneimittels (SuI-fadimethoxin) zur Verhinderung der Infektion mit Kokzidiose enthielt.

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Die Küken der verschiedenen Testgruppen wurden mit einer Nahrung gefüttert, welche die abgelagerten Oocysten von Eimeria tenella K-2 (resistent gegenüber Amprolium, Clopidol und Robenidin) enthielt.

Die verwendete Nahrung bestand aus 6j % Gelbkorn, 14 # Sojapulver, 15 % Fischmehl, J5 % Alphalpha, 0,25 % Tafelsalz, 0,25 % einer Vitaminmischung, 0,05 # einer Mineralmischung, 0,1 % Arginin, 0,15 % Natriumpropionat und 0,1 % Äthoxyquin. Die der Nahrung zugesetzten Anti-Kokzidiose-Wirkstoffe zeigt nachstehende Tabelle. Jedes Küken erhielt täglich im Durchschnitt 17 g dieser Nahrung. l4o Küken wurden in Gruppen von jeweils 10 Küken aufgeteilt. 7 Tage nach der Fütterung mit der die Oocysten (2,5 x 10 ) enthaltenden Nahrung wurde das Gewicht eines jeden Kükens gemessen und alle Küken getötet und seziert.

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Andrejewski, Honlce, Gesthuysen & Mdsch, Patntanwälte in Essen Tabelle 4

Ausmaß der krankhaften Veränderung des Blinddarmes:

- ohne; + leicht;

++ mittelstark; +++ schwer.

Anti-Kokzidiose- Wirkstoff	Konzen tration (*)	Krankhafte Veränderung des Blinddarmes (Anzahl der Küken)	2	2	10	Über leben rate (*)
AM-1042	o,03		4	5	10	100
	0,02		4	3	10	100
	0,015			1	8	100
	0,01			3	100
	0,0075				100
	0,005	3		90
	0,00375	5	90

Amprolium (Hydrochlorid)	0,025 0,0125	8 10	2	2	70 40
Clopidol	0,025 0,0125	6 10	4		70 50
Robenidin (Hydrochlorid)	0,0066 0,0033	3 8	5 2	100 8o
Ohne	0,0000	10		50

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Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen Beispiel 5:

In der gleichen Weise wie im Beispiel 4 wurde eine Behandlung durchgeführt, mit Ausnahme dessen, daß eine Mischung von abgelagerten Oocysten von Eimeria tenella K-2 (2,5 x 10 ), E. acervulina (1,0 χ 10^) und E. maxima (1,0 χ 10 ) geimpft wurde. Die Resultate zeigt nachstehende Tabelle 5» wobei die Zunahmerate des Körpergewichts (RIW) wie folgt berechnet wurde.

(Durchschnittsgewicht am Schluß des Tests/Durchschnittsgewicht der gesunden Küken (Kontrolle) χ 100 %.

	Konzentration von AM-1042 (#)	Tabelle 5	RIW (*)	Überlebens rate {%)
Gruppe	0,02	Krankhafte Veränderung des Blind darmes	100,2	100
Test-1	0,015	_	101,5	100
Test-2	0,01	-	100,8	100
Test-3	0,0075	-	99,9	100
Test-4	0,005	-	98,7	90
Test-5	* 0,00	+	100,0	100
Kontrolle-1	0,00	-	87,6	45
Kontrolle-2	++

( · nicht geimpft )

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Die Absorptionsspektren von AM-1042 sind in den beiliegenden Zeichnungen wiedergegeben; es zeigt

Fig.l das UV-Absorptionsspektrum; Fig.2 das IR-Absorptionsspektrum, und Fig.3 das NMR-Absorptionsspektrum.

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Claims

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Patentanspriiche:

^y. Antibiotikum AM-1042, dadurch gekennzeich net, daß es in gereinigter kristalliner Form

a) zusammengesetzt ist im wesentlichen aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff,

b) ein UV-Absorptions-Spektrum mit charakteristischen Absorptionen bei 315 nm und 265 nm (Absatz) in 90#-igem Methanol (Fig.l) hat, und

c) eine spezifische Rotation

£ = +175 bis 184°; (c=0,5 in CHCl₅) zeigt.
2. Antibiotikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sein mit der KBr-Methode gemessenes IR-Absorptions-Spektrum (Fig.2) charakteristische Absorptionen bei 333O-334O, 2925, 2850, I66O, I6OO und 1365 cm"¹ zeigt.
3· Antibiotikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß seine Reaktion nach der Rydon-Smith-Farbreaktion negativ ist.
4. Antibiotikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sein Molekulargewicht (gemessen nach der Rast-Methode) 520 bis 380 beträgt.

ORIGINAL INSPECTED

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5· Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus, welcher die Fähigkeit besitzt, ΑΜ-1ο42 zu erzeugen, und welcher zum Genus Streptomyces gehört, aerobisch in einem Medium gezüchtet wird und daß das in der Zuohtbrühe angesammelte AM-Io42 aus dieser gewonnen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus zum Streptomyces nodosus gehört.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß als Mikroorganismus Streptomyces nodosus subsp. asukaensis NRRL 8185 verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Streptomyces nodosus subsp. asukaensis NRRL Ilo7o verwendet wird.
9. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es Af!-lo42 als aktiven Bestandteil enthält.
10. Arzneimittel zur Verhinderung und zur Heilung von Kokzldiose bei Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß es AM-lo42 als aktiven Bestandteil enthält.
11. Wachstumsförderndes Mittel für Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß es AM-io^P a]s aktiven Bestandteil enthält.

1.?. Mischnahrung f^:''V Geflürol, dadurch gekennzeichnet, daii AM-Ic^ »rithält.

"(■<'■ i ι. ' (■ H ^ 7

ORIGINAL INSPECTED