DE2062246A1 - Enzympraparate und Verfahren zu lh rer Herstellung - Google Patents
Enzympraparate und Verfahren zu lh rer HerstellungInfo
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Description
Enzympräparat© und Verfahren zu ihrer
Herstellung
Die Erfindung betrifft Verbesserungen von Enzymprä~
paraten und betrifft inabesondere die asiodifizierung
von Enzymen durch Anheften an eine feste Matrix,
Insbesondere betrifft die Erfindung das Unlöslichmachen von Enzymen in Wasser durch chemisches Aufbringen auf ein Cellulosederivat, wodurch Enzyiaprä~
parate geschaffen werden, die in einer Form vorliegen, in welcher sie wiederholt gebraucht werden können und
gegenüber Wärme und anderen inaktivierenden Einflüssen stabiler sind als die entsprechenden löslichen Enzyme»
Sas Verfahren zum Unlöslichmachen von Enzymen in Wasser
kann auch dazu verwendet werden, die Enzyme, die in
einem Gärmedium, einem Zellenextrakt, einer biologischen Flüssigkeit oder anderen wässrigen Flüssigkeiten, die
diese Enzyme für sioh oder im Gemisch mit anderen Verbindungen
enthalten, zu konzentrieren. Weiterhin kann mehr als ein bestimmtes Enzym gleichzeitig an das Cellulosederivat
(d.h. einem Cellulosecarbonat) bei der Unlöaliohmachung
angeheftet warden,
109827/0986
Hydrophile Trägerstoffe werden bei der Herstellung wasserunlöslicher
Enzympräparate begünstigt, weil diese zum Binden der Enzyme wirksamer sind und die erhaltenen Derivate stabiler sindo Beispielsweise wurden Ribonuclease
und Chymotrypsin sowohl an diazotierte p-Arainobenzylcellulose
(ßLAoMitz und LoJo Sumraaria, Nature, Bd0 139»
Seite 576 (1961)) als euch an diazotiarte p-Aminobenzoylcellulose
(M, Lilly» G» Money, W. Hornby und SnMo Crook,
Biochem» J0, Bd0 95, Seite 45p (1965)) gekoppelt« Kürzlich
wurde Creatinphosphotransferase an diasotierte p~Aminobenzoyleellulose
(W0Eo Hornby, MoDn Lilly und EoMo Crook,
BioehemeJ. Bd„ 107, Seit© 669 (196S)) und Aminoaoylase
an diazotierte p-Aminobenzylcellulose gekoppelt (ToTosa,
Te Mori, No Fuse und I0 Chigata, Enzymologie, Bdn 3U
Seite 214 (1966))0 L4itz und Sutnmaria (1961 a,a.0o) verwendeten auch Carboxymethylcellulose-azid zur Herstellung
wasserunlöslicher Derivate von Trypsin, Chymotrypsin und Ribonuclease« Viele andere Ce?boxymethyleellulosepräp£rate
wurden bereits hergestellt: Trypsin und Ribonuclease (CoJo Epstein und C0B0 Anfinsen, J,Biol.Cheme Bd0 237,
Seite 2175 (1962)), Trypsin und Chymotrypsin (ToTakami
und T. Ando, Seikagaku Bd0 40, Seite 749 (1963)), Chymotrypsin, Ribonuclease und Fioin (MoLiIIy, G,Money, Wn
Hornby und EoMo Crook, Biochem„Jo, Bdo 95, Seite 45 P
(1965)) und. viele andere o
Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung von aktiven in Wasser unlöslichen Enzympräparaten, wobei das Enzym
chemisch mit einem Cellulosecarbonat gekoppelt ist»
Insbesondere schafft die Erfindung einen in Wasser unlöslichen Mäusenierenextrakt sowie wasserunlösliche
Präparate von (J-ßlucosidase, Trypsin, d-Amylase, Glucoamylase
und Mäuseleberextrakten, die chemisch an ein
Cellulosecarbonat gebunden sind,
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Erfindungsgeraäse wird auch ein Verfahren zur Herstellung
eines wasserunlöslichen Enzyrapräparats bereitgseteilt,
das dadurch gekennzeichnet ißt, dass man das in einer
wässrigen Lösung gelöste oder suspendierte Ensym mit einein Cellulosecarbonat oder einem diazotierten DiaminobenzoZderivat
davon umsetjst»
Cellulosecarbonat und ein Verfahren zu dessen Herstellung
ist in der. gleichzeitigen Patentanmeldung P 20 6$ Z r<J« *
beschrieben*
Ein diasotiertes Diaminobsnaolderivat von Cellulosecarbonat
und ein Verfahren für dessen Herstellung ist im folgenden
Beispiel 12 beschriebene
Die wässrige Lösung enthält vorzugsweise einen geeigneten
Puffer, wie einen Phosphat- oder Boratpuffer mit einem pH-Bereich von 2,7 bis 11,8 (optimal zwischen 6,5 und 8,5) π
Die Temperatur kann zwischen O0C und 5O0C liegen und liegt
vorzugsweise unterhalb 40Co Die Reaktionsdauer kann zwischen 2 Minuten und 3 Stunden betragen» Obwohl dies für
eine maximale Zurückhaltung der Ensymaktivität oder der
anderen biologischen Aktivität nicht immer erforderlich ist, können Triethylamin oder andere tertiäre organische
Basen die anorganischen Puffer ersetzen oder diesen an
dieser Verfahrensstufe zugesetzt werden, falls dies erforderlich ist. Wenn die Enzymaktivität oder die biologische Aktivität erschöpft ist, kann das Enzym oder die
andere Protein enthaltende Wirkform durch eine selektive saure, basische oder enzymatische Hydrolyse entfernt
werden und die Cellulosematrix kann erneut zur Herstellung von Cellulosecarbonat verwendet werden„ In diesem
Sinn stellt das Enzympräparat ein regenerierbares System zur Herstellung unlöslich gemachter Enzympräparate dar.
109827/09 86.
BAD
— 4 Herstellung von Cellulosecarbonat
Präparat 1
Bs wurde 1 g Cellulose (Sigmacell 38 der Sigma Chemical
Coο England) in 10 ml flüssigem Dimethylsulfoxid, 1,5 ml
p-Dioxan und δ ml Triethylamin suspendiert und 5 Minuten
bei O0C gerührt«, Es wurden tropfenweise 16 ml Chlorameisensäureäthylester
zugegeben und 10 Minuten weiter gerührt« Das Gemisch wurde anschliessend mit ön-Salzsäure auf den
pH-Wert 7,0 neutralisiert. Das Gemisch wurde in 400 ml
90#igem Äthanol bei 200C suspendiert unter Verwendung
eines Waring-Mischers, filtriert und das Cellulosecarbonat
mit 200 ml 90#igem Äthanol, 200 ml Äthanol und 200 ml Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck über
Fhosphorpentoxid bei 200C getrocknet.
Präparat 2
Das Präparat 1 wurde mit dem fünffachen Ansatz hergestellt mit der Ausnahme, dass ein grösserer Anteil Dimethylsulfoxid
(150 ml) zur Suspendierung der Cellulose und nur 400. ml Diäthyläther zum Waschen des Cellulosecarbonats verwendet
wurden.
Präparat 3
Präparat 2 wurde im vierfachen Ansatz von 20 g Cellulose hergestellt, wobei lediglich 1,5 1 90#iges Äthanol, 2 1
Äthanol und 0,SLDiäthyläther zum Waschen des Cellulosecarbonate
verwendet wurden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher
erläutert.
Beispiel 1 Kuppeln von Cellulosecarbonat mit Mäusenierenextrakt
Es wurden 4 g gewaschene Mäusenieren in einem Mazeriergerät
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mit oben liegendem Antrieb unter Verwendung eines 0,1 m-Citratpuffers
vom pH-Wert 4,5 (50 ml) 5 Minuten mazeriert«
Das erhaltene Gemisch wurde ansehliessend bei 3 700 g
20 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde abgenommen»
Es wurden 200 ml Cellulosecarbonat (Präparat 1) in 10 al
Wasser von 40O suspendiert und hierzu 5 ml des ivläusenieren-=·
extrakte in 0,05 m~>Ci tratpuff er vom pH-Wert 4,4 sowie 0,2 ml
Triäthylasnin zugegeben» Nachdem mehrere Stunden gerührt wor~
den war, wurde das Gemisch sowie ein Vergleiohsgemisch, wobei
anstelle von Cellulosecarbonat nur Cellulose verwendet wurde, zentrifugiert«, Die festen Stoffe wurden mit einem
0,05 m-Citratpuffer vom pH-Wert 4,4 (5 ml) gewaschen und anschliessend wurde fünfmal hintereinander mit einer m-Natrium-Chloridlösung
im gleichen Puffer und dreimal mit der Pufferlösung gewaschen,, Die zentrifugierte» Endprodukte (MKE 1
und Vergleich 1) wurden in 10 ial 0,05 m-Ci trat puff er vom
pH-Wert 4*4 suspendiert* Die Enzymaktivität wurde dadurch
geprüft, dass 1 ml MKE-Suapension bzw0 der Vergleichslösung
1 mit 1 ml p-Nitrophenyl-2-acetamido-2-'deoxy-|i-D-=-glueopyra"
nosid (10 mg in 5 ml Citratpuffer) bei 400C inkubiert wurden,,
Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens 0,2 m~Natriumcarbonatlösung beendet., Die optische Dichte
der Überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren, abgelesen bei 420 mn betrug beim iiäKE-Präparat 1 0,206, beim
Cellulose-Vergleichspräparat 1 0,036 und beim Vergleiohsversuch
für das Substrat 0,053»
Beispiel 2
Koppeln von Cellulosecarbonat mit Mandel-ß-Glucosidase Ea wurden 200 mg Cellulosecarbonat (Präparat 1) in 10 ml Wasser suspendiert und 10 ml ^-Glucosidase in 5 ml Wasser zugegeben und danach 0,2 ml Triäthylamin zugefügt. Nachdem
Koppeln von Cellulosecarbonat mit Mandel-ß-Glucosidase Ea wurden 200 mg Cellulosecarbonat (Präparat 1) in 10 ml Wasser suspendiert und 10 ml ^-Glucosidase in 5 ml Wasser zugegeben und danach 0,2 ml Triäthylamin zugefügt. Nachdem
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das Reaktionsgemisch drei Stunden bei 40C gerührt worden
war, wurden die Feststoffe abfiltriert, mit einer Lösung von m-Natriumchlorid und m-Saccharose und anschliessend
mit einer Lösung von 0,005 m-Aeetatpuffer vom pH-Wert
4,95 fünfmal hintereinander und noch zweimal mit dem Acetatpuffer gewaschen, bevor das feste Material in
10 ml 0,005 m-Acetatpuffer vom pH-Wert 4,95 suspendiert
wurde» Das Produkt (BoGo1) und der Cellulose-Vergleichsansatz
2, die dem gleichen Verfahren unterworfen wurden, wurden getrennt durch Inkubieren von 1 ml der Suspension
mit 1 ml o-Nitrophenyl-&-D-glucopyranosid (0,1076 g in
10 ml Acetatpuffer) bei 37°C geprüft» Die Reaktion wurde wie in Beispiel 1 nach 3,5 Stunden beendet und die optische
Dichte der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren bei 420 mn gemessen. Sie betrug beim Präparat
B»ao1 2,235, beim Cellulose-Vergleichspräparat 2 0,417
und beim Substrat-Vergleichspräparat 0,130.
Bei der Wiederholung des Versuches, wobei jedoch die Kopplung der ß~Glucosidase bei O0C vorgenommen wurde,
und bei jedem Waschen 20 Minuten ebenfalls bei O0C gerührt wurde, zeigte der zweite Ansatz BoG.2 bei der
Prüfung eine optische Dichte bei 420 mn von 0,761, der Oellulose-Vergleichsversuch 3 0,117 und der Substrat-Vergleichsversuch
0,024 nach einstündiger Inkubierung bei 360C anstelle von 3,5 Stunden wie vorher.
Beispiel 3 Kopplung von Cellulosecarbonat mit Trypsin
Es wurden 3 Ansätze von je 200 mg Cellulosecarbonat (Präparat 2) in je 10 ml Wasser suspendiert und mit je
0,0261 g Trypsin in 10 ml Wasser gekuppelt, wobei (a) kein Triäthylamin zugegeben wurde,(b) 20 μΐ Triäthylamin
und (o) 2OQ /kl Triäthylamin zugegeben wurde. Ein Vergleiohsversuch
wurde durchgeführt, wobei der Ansatz für
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(b) verwendet wurde mit der Ausnahme» dass anstelle von Cellulosecarbonat 200 mg Cellulose verwendet wurden/
Nachdem die Gemische 3 Stunden bei 40C gerührt worden
waren, wurde gemäss Beispiel 2 in üblicher Weise gewaschen,
wobei jedoch anstelle des Acetatpuffers 0,05 m-Pliosphatpuffer
vom pH-Wert 8,0 verwendet wurdeβ Jedes
Produkt wurde schliesslich in 10 ml 0,05 m-Phosphatpuffer
vom pH-Wert 8,0 suspendiert und es wurden gleiche Teile von 0,5 ml geprüft, wobei N-a-Benzoyl-l-arginin-athylesterhydrochlorid
(0,5 ml, 0,0795 g in Phosphatpuff er) als Substrat verwendet wurden und 30 Minuten bei 370C inkubiert
wurde. Die optische Dichte bei 253 *ua wurde an
den mit dem sechsehnfachen Volumen verdünnten Proben
nach dem Kühlen 10 Minuten in Eiswasser und Zentrifugieren
gemessen» Nach Abzug der Werte des Vergleichssubstrats betrugen die Werte für die optische Dichte bei 253 nm
(a) 0,215, (b) 0,197 und (c) 0,192 gegenüber dem Vergleichsversuch mit Cellulose mit dem Wert 0,026.
Optimaler pH-Wert für das Kuppeln von ß-Glucosidase an
Cellulosecarbonat in Gegenwart organischer Säuren, oder
Basen
Es wurden wechselnde Mengen einer Base (Triäthylamin) oder
einer Säure (Eisessig) zu konstanten Volumina von 10 ml ^ -Grlucosidase (1 mg) in wässriger Lösung zugegebene Der
pH-Wert jedes Ansatzes wurde vor und nach der Zugabe von £00 mg Cellulosecarbonat, Präparat 3 zu jeder Lösung bei
40C aufgezeichnet unter Anwendung der sonst üblichen Verfahrensweise gemäss Beispiel 2 zum Kuppeln des Enzyms
an Cellulosecarbonat und dem anschliessenden Waschen mit
O9OOS ffi-Ace tatpuff er vom pH-Wert 4,95» Die Enzymaktivität
wurde wie gemäee Beispiel 2 bestimmtο Es wurden folgende
Werte erhalten»
1 09827/09 8 &
essig | ~ 8 - | 10,85 | 2062246 | Enzym- ektivität OS 420 nm |
|
Tri- äthyl- aainj^l |
0 |
pH-Wert
vorher nachher |
10,40 | 0,220 | |
100 | 0 | 11,80 | 10,10 | 0,250 | |
50 | 0 | 11,60 | 9,00 | 0,272 | |
25 | 0 | 11,35 | 3,50 | 0,432 | |
5 | 0 | 11,00 | 7,40 | 0,795 | |
2,5 | 0 | 10,75 | 6,30 | 0,924 | |
1 | 0 | 10,45 | 4,00 | 0,492 | |
0 | 1 | 5,90 | 3,70 | 0,192 | |
0 | 2,5 | 3,75 | 3,40 | 0,192 | |
0 | 5 | 3,60 | 2,90 | 0,175 | |
0 | 50 | 3,40 | 2,70 | 0,151 | |
0 | 100 | 2,85 | 0,124 | ||
0 | 2,70 | ||||
Der entsprechende Vergleichsversuch lediglich mit Substrat zeigte eine optische Dichte bei 420 nm von 0,008*
Optimaler pH-Wert beim Kuppeln von jl-Glucosidase an Cellulosecarbonat in Abwesenheit von Triäthylaoin
Es wurden gleiche Teile von 200 ml Cellulosecarbonat (Präparat 3) in jeweils den folgenden Pufferlösungen
suspendiert: 5 ml 0,1 m-Phosphatpuffer pH-Wert 6,1, 0,1 m-Phosphatpuffer pH-Wert 7,05, 0,1 m-Phosphatpuffer
pH-Wert 6,1, 0,1 m-Boratpuffer pH-Wert 9,0 und 0,1 m-Boratpuffer pH-Wert 9,9. Es wurden zu jeder Suspension
1 ng fi-Glucosidase in 5 ml Wasser zugegeben und gemäes
Beispiel 2 gekuppelt, wobei das Waschen mit 0,005 m-Aoetatpuffer vom pH-Wert 4,95 durchgeführt wurde. Es
wurden Vergleichsversuohe mit jeweils 200 mg mikrokristalliner Cellulose in gleicher Weise bei jedem pH-Wert durchgeführt. Die Enzymaktivität wurde gemäss Beispiel 2 bestimmt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten.
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pH-Wert des Puffers
beim Kuppeln 6,10 7,05 8,10 9,00 9,90
Enzymaktivität«OD 420 nm
auf Cellulosecarbonat 0,712 1,132 1,323 0,620 0,387
auf Cellulose 0,141 0,160 0,164 0,106 0,106
Der entsprechende Vergleichsversuch lediglich mit dem Substrat
sseigte sine optische Dichte bei 420 nm von 0,013»
Beispiel 6
Wärmestabilität iron unlöslich gemachter p*~ßlueosidsse
Wärmestabilität iron unlöslich gemachter p*~ßlueosidsse
Es wurden gleiche Teile von je 0,5 ml von mittels Cellulosecarbonat
unlöslich gemachter ^-Glucosidase (Beispiel 5, pH-Wert
8,1) und von löslicher |M/lueosidase d©r gleichen Grössenordnung
<3er Aktivität bei 370C inkubiert und nach verschiedenen
Zeiten gemäas Beispiel 2 auf die Beibehaltu&g der Aktivität
geprüft. Sowohl das lösliche wie das unlöslich gemachte Enzym befanden sich in einem 0,005 m-Aöetatpuffer vowi pH-Wert
4,95, jedoch dauerte die Inkubationszeit für die Enzymauswertung hinsichtlich o-Kitrophenyl-f-D-glucopyranosid als
Substrat insgesamt 15 Minuten«. Vergleichsversuche mit dem
Substrat wurden gleichzeitig inkubiert und die Einzelproben wurden korrigierto Es wurden folgende Ergebnisse erhalten»
Zeit Oh 7 h 1 Tag 2 Tage 3 Tage
£ Restaktivi
tät |
100 | 93 | 87 | 74 | 47 | Tage |
Unlösliches
Enzym |
100 | 17 | 11 | 5 | 3 | |
LÖBliohee
Enzym |
4 | Tage 6 | ||||
Zeit | ||||||
£ Reetaktivität
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Beispiel 7 pH-Stabilität von unlöslich gemachter ß-Glucosidase
Se wurden gleiche Teile von 1 ml eines Präparats von
ß-Orlucosidase, das mit Cellulosecarbonat unlöslich gemacht worden war,(Beispiel 5» pH-Wert 7,05) sentrifugiert,
emeut in 2 ml einer Pufferlösung mit unterschiedliohem
pH--Wert suspendiert und 1 £ag bei 370C inkubiert,
bevor die Proben erneut sentrifugiert, mit Acetatpuffer
vom pH-Wert 5 5Ö gewaschen, erneut sentrifugiert und
wiederum in 0,005 m-Acetatpuffer voro pH-Wert 4,95 (1 ml)
suspendiert wurden. Jeder Ansats wurde geiaäss Beispiel 6
geprüft. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten«
pH-Wert 2,2 3,5 5,0 8,0 10,0
OoD. 420 um 0,018 0,045 0,209 0,095 0,105
ß~Gluoosidase, die mit nicht behandeltem Cellulosecarbonat
unlöslich gemacht worden war, gab eine optische Dichte bei 420 nm von 0,428.
pH-Aktivitätsbeziehungen von freier und an Cellulose™ oarbonat gebundener f -Glueosidase mit o-Iiitrophenyl-^-I)-glucopyranosid
als Substrat
Das in diesem Versuch verwendet® gebundene Enzym war ein Gemisch von gekuppelten Produkten bei drei pH-Werten von
6,10, 7,05 und 9»00 gemäss Beispiel 5. Die freien und gebundenen Enzyme wurden bei einer Reihe von pH-Werten auf
ihre Aktivität geprüft, wobei die folgenden Verfahren verwandet wurden.
(a) Freies Enzym. Das Enzym und das Substrat mit Endkonzentrationen
von 1 Kg/ml bzw« 1 mg/ml wurden in den in der folgenden Tabelle angegebenen gepufferten Lösungen
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30 Minuten bei 370C inkubiert· Das Reaktionsgemisch wurde
dann au einem gleichen Volumen von 0,2 m~KatriumcarbonatlöBung
zugegeben und die optische Dichte bei 420 nm gemessen«
(b) Gebundenes Enzymo Das an Cellulosecarbonat gebundene
Enzym (20 ag suspendiert je ml) wurde in Gegenwart des
Substrats mit einer Endkonzentration von 1 mg/kl in den
in der folgenden Tabelle angegebenen Pufferlösungen 30
Minuten bei 37°C gerührt„ Es wurden gleiche Seile der
überstehenden Flüssigkeit nach dom Zentrifugieren zu einem
gleichen Volumen 0,2 m~Natriumcarbonatlösung zugegeben und
die optische Dichte bei 420 nm gemessen«
Sie Ergebnisse sind in der folgenden !Tabelle I wiedergegeben«
Aktivität von freier und an Cellulosecarbonat gebundener p-Glucosidase gegen o-Nitrophenyl-fU
D-glueopyranosid
pH- Puffer (Endkonzentration) 0.3). bei 420 nm
Wert __ i
Freies Gebundenes
Enzym
3*0 Citronensäure-Natriumeitrat 0,024 0,119
(0,05m)
4,0 Citronensäure-Natriumeitrat 0,198 0,322
4,0 Citronensäure-Natriumeitrat 0,198 0,322
(0,05m)
5,0 Citronensäure-Natriumeitrat 0,441 0,540
5,0 Citronensäure-Natriumeitrat 0,441 0,540
(0,05m)
6,0 Citronensäure-Natriumeitrat 0,429 0,388
6,0 Citronensäure-Natriumeitrat 0,429 0,388
(0,05m)
7,0 Phosphat (0,05m) 0,202 0,217
7,0 Phosphat (0,05m) 0,202 0,217
8,0 Phosphat (0,05m) 0,110 0,108
9,0 Borsäure-Borax (0,05m) 0,070 0,098
10,0 Borax-Natriumhydroxid 0,024 0,062
(0,05m)
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Beispiel 9
Kuppeln, von Mäuseleberextraktenzymen an Cellulosecarbonat
Es wurde ein Häuseleberextrakt nach dem in Beispiel 1 für die Herstellung von Mäueeni er en extrakt beschriebenen Verfahren hergestellt.
Es wurden Gemische von 200 mg Cellulosecarbonat in 10 ml
Wasser mit 10 ml Häuseleberextrakt in 0,05 m-Citratpuffer
vom pH-Wert 4,4 gerührt und 0,2 ml Triäthylamin zugegeben«
Das Produkt wurde über Nacht stehengelassen und sechsmal hintereinander mit 0,05 m-Oitratpuffer vom pH-Wert 4,4
und 1 m-Natriumchloridlöeung abwechselnd gewaschen« Bin
Vergleichsversuch, wobei Cellulose anstelle von Cellulosecarbonat verwendet wurde, wurde ebenfalls durchgeführt.
Die Aktivitäten der unlöslich gemachten Enzyme wurden mit je 1 ml der Suspensionen der beiden Produkte in 10 ml
0,05 m-Oitratpuffer vom pH-Wert 4,4 durch Inkubieren mit
den Substraten (1 ml, 25 mg in 10 ml Puffer) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IZ zusammen
mit Vergleichsversuchen für das Substrat bei einer Ablesung bei 420 nm angegebene
Optimaler pH-Wert für das Kuppeln von £-Amylase an
Cellulosecarbonat in Abwesenheit von Triäthylamin
ct-Amylase wurde gemäse Beispiel 5 bei einer Konzentration
von 20 ag je 100 mg Cellulosecarbonat (Präparat 1) gekuppelt, wobei wässrige Pufferlösungen ohne Triäthylamin
vom pH-Wert 4,5 bis 10,0 verwendet wurden und in den entsprechenden Puffern 3 Stunden bei 46C gekuppelt wurde ·
Ee wurden folgende Ergebnisse erhalten·
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Enzyuiaktivität von unlöslich gemachten wläuseleberextraktenzymen
o-Nitrophenyl-A-D- p-fcitrophenyl~«t-L- ppy
Substrat: galaetopyranosid laannopyranosid glucopyranosid
Substrat: galaetopyranosid laannopyranosid glucopyranosid
p-Nitrophenyl-2-
aceta<nido~2-äeoxy·-
ff~I>g;lueopyranosid
Inkubatiqns- 2,5 h bei 370C 2,5 h öei 400C 2,5 h bei 370C 2,5 h bei 37°C
_^ Cellulose- ^ carbonat-
<o üiäuseleber-OO
extrakt-Kj Kondensat
"^ Cellulose-
extrakt, Vergleich
0,1OS
0,030
0,135
0,0
0,370 .0,032
13 -
pH- gebundenes Pro- Enzyaeinheiten i>
Beet-Wert tein mg/g Feet- je mg protein aktivität
stoffe
4,5 | 3,5 | 4,3 | 30,0 |
6,9 | 3,9 | 3,7 | 54,2 |
7,6 | 4,1 | 3,35 | 52,0 |
3,0 | 4,4 | 4,9 | 30,6 |
9,0 | 5,4 | 3,2 | 20,0 |
10.0 | 4,3 | 2,6 | 16,2 |
Eine Einheit von λ-Amyläse ist die aienge, die reduzierenden Zucker entsprechend 1 mg maltose in 3 Minuten bei
200O freisetzt» Die Aktivität des freien Enzyms in Lösung beträgt 16 Einheiten je mg Proteine
et-Amyläse wurde ebenfalls bei einer Konzentration von
20 mg je 100 mg Cellulosecarbonat (Präparat 2) beim pH-Wert 7,6 und oei Kupplungszeiten von 0,5, 1, 3 und
24 Stunden angewendet» Ks wurden folgende Ergebnisse
erhaltenο
Kupplungszeit | 0,5 | Gebundenes | Enzymeinheiten | * |
h | 1 | Protein | Restaktivität | |
3 | 4,1 | 5,11 | 32,0 | |
24 | 3,7 | 6,1 | 40,6 | |
6,1 | 4,7 | 29,3 | ||
5,9 | 4,6 | 23,3 |
Beispiel 11 Kuppeln von Gluooamylase an Cellulosecarbonat
Bs wurden 100 mg Cellulosecarbonat ait einer Lösung von
Gluooamylase (aus Aspergillus niger, 27 Einheiten je mg
Protein, 3,6 mg Protein je ml) in 1 al 0,1 m~Phosphat~
puffer vom pH-Wert 7,3 bei 40C 3 Stunden gerührt„ Sie
festen Stoffe wurden abfiltriert, gemass Beispiel 2 gewaschen und sohlieselich in 5 ml 0,2 m~ Acetat puff er vom
pH-Wert 4,0 suspendiert. Eine Vergleiohareaktion wurde
109827/0986
20622A6
in gleicher \?eise unter Verwendung von 1,0 ml Glucoamylaselösung
und 100 ing Cellulose durchgeführt«
Test auf Glueoamylaseaktivität
Es Würden 4,5 ml 1#ige Stärkelösung in O,2m-Aee tatpuff er
vom pMfert 4,0 unter Rühren mit 0,5 ml der Suspension
des Enzyms in fester Phase eine Stunde bei 450C inkubiertc
Das Testgemiseh wurde anschliessend gekühlt und zentrifugiert und es wurden 0,t ml der überstehenden Flüssigkeit
zur Glucosebestimmung im Gluooseoxidasetest verwendet
, für welchen eine Standard-Vergleichskurve aufgestellt
wurde ο !tee Enzympräparat in fester Phase verursachte die
Freisetzung von 35 f*g Glucose, während das Vergleichspräparat
die Freisetzung von 17 \*£ Glucose verursachte.
Kuppeln von ß-Glucosidase mit einem diazotierten Diaminobenzolderivat
von Cellulosecarbonat
Herstellung des diazotierten Diaminobenzolderivats„ Es
wurde unter vermindertem Druck destilliertes ia-Diaminobenaol
in einem Gemisch von 100 ml Dimethylformamid, 100 ml
Wasser und 2,5 ml üJriäthylamin gelöste Zu der gerührten
Lösung wurden langsam 500 ml Cellulosecarbonat zugegeben« Das Gemisch wurde Über Nacht bei Raumtemperatur gerührt
und danach filtriert. Der Rückstand wurde mit 100 ml Dimethylformamid,
100 ml 0,25 m-Acetat puff er vom pH-Wert
5*0 und 200 ml Wasser gewaschen und danach unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid getrocknet 0
Eine Probe von 100 ml des erhaltenen Materials wurde bei
O0C in 5,0 πα »-Salzsäure gerührt. Es wurden langsam 5,0
ml einer 2?£igen Katriumnitri tlösung zugegeben und das
Gemisch wurde bei'00G 15 Minuten gerührt» Der feste Stoff
wurde absentrifugiert und dreimal durch 15 Minuten Rühren
109827/0986
— 16 —
mit 10 ml 0,1 m-Phoephatpuffer vom pH-Wert 7,3 gewaschen«.
Kuppeln von ß-Glucosidase„ Das feste Präparat wurde mit
20 ml einer Lösung von 5 ml ß-Glueosidase in 0,1 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,3 bei 50C 13 Stunden gerührte
Es wurden 5 ml siner eiskalten gesättigten ii-Naphthol-Lösung in gesättigter Hatriumacetatlösung zugefügt und
das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt. Die feste Substanz
wurde durch Zentrifugieren isoliert und wie oben zweimal gewaschen. Ein Vergleichspräparat wurde in genau der gleichen Weise unter Verwendung von Cellulose anstelle des
diazotierten Diaminobenzolderivats von Cellulosecarbonat hergestellt. Beide Präparate wurden mit 0,05 m-Aoetatpuff er vom pH-Wert 5,0 auf 5 ml aufgefüllt«,
Test auf ß-Glucosidaseaktivitäto Dieser Versuch wurde in
üblicher Weise durchgeführt« Das Testpräparat setzte 1,06
jif.jdol O-Nitrophenol in 15 Minuten bei 370C frei während der
Vergleichs versuch 0,05 jyijaol freisetzte 0
Kuppeln von Glucoamylase mit dem diazotierten Diaminobenzolderivat von Cellulosecarbonat
100 mg des diazotierten Diaminobenzolderivats wurden
gemäss Beispiel 12 hergestellt. An das Derivat wurden 1,0 ml GlucoamylaselÖBung gemäss Beispiel 12 gekuppelt.
Es wurde das gleiche Waschverfahren durchgeführt und das feste Produkt wurde schliesslich in 5 ml 0,2 a$-Acetatpuff er vom pH-Wert 4,0 suspendiertο Ein Vergleichsversuch
wurde durchgeführt, wobei das diazotierte Derivat durch Cellulose ersetzt wurde.
Die Enzymaktivitäten der beiden Präparate wurden gemäße Beispiel 11 bestimmt. Das Enzym in fester Phase setzte
69 JAg Glucose je ml in 1 Stunde frei, während das Vergleichs·
präparat 23 J*g Glucose freisetzte ο
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Claims (12)
1. Wasserunlösliche aktive Enzympräparat©, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym chemisch
an Cellulosecarbonat gekuppelt ist«,
2 o Enzympräparat nach Anspruch t, dadurch gekennzeichnet , dass es <ain chemisch an Cellulosecarbonat gekuppelter Mäusenierenextrakt ist,
3 ο Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet^
dass es an Cellulosecarbonat chemisch gekuppelte ß-Glucosidase ist.
4 ο Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es an Cellulosecarbonat chemisch
gekuppeltes Trypsin ist»
5° Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es an Cellulosecarbonat chemisch
gekuppelte 4-Amylase ist»
6 ο Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ι dass es an Cellulosecarbonat chemisch
gekuppelte Glueoamylasg ist.
7 ο Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch e a k β η η zeichnet
, dass es an Cellulosecarbonat chemisch gekuppelter iÄäueeleberextrakt ist λ
8. Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Enzympräparaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet
f dass man das in einer wässrigen Lösung
gtlötte oder euependierte Enzym mit einem Celluloaecarbonat
um··tZtο
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass man als Enzym xdäusenierenexfcrakt,
ß-Glucosidase, Trypsin, ct-Aiaylase, Glucoaiaylas© oder
fääuseleberextrakt verwendete
1Oo Verfahren nach Anspruch 3 bis 9» dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung
Phosphatpuffer oder Boratpuffer in einem pH-Wertbereich
von 2,7 bis 11,8 enthält*
11o Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , dass der pH-Wertbereich 6,5 bis 3,5
beträgt.
12. Verfahren nach Anspruch 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet , dass man die Umsetzung bei
einer Temperatur von O0C bis 50°C und einer Reaktionsdauer zwischen 2 Minuten und 3 Stunden durchführt»
13- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass man die Umsetzung bei einer
Temperatur unterhalb 40O durchführt,
14« Verfahren nach Anspruch 3 bis 13i dadurch g e kennzeichne
t , dass man anstelle des Puffers oder zusätzlich zum Puffer eine tertiära organische Base
verwendetα
15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man als tertiära organische Base
Triethylamin verwendeto
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