CH620471A5 - - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung einer sauren Protease mit breitem pH-Wirkungsbereich, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Pilzstamm der Gattung Rhizopus rhizopodiformis in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, aerob bei einem pH-Wert von 3-7 und einer Temperatur von 25-50 °C züchtet und das erzeugte Enzym abtrennt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer sauren Protease mit breitem pH-Wir-kungsbereich durch Züchtung eines spezifischen, aus Erdproben isolierten Mikroorganismus, der eine Rhizopus Spezies darstellt.

Es ist allgemein bekannt und Gegenstand vieler industrieller Herstellungsverfahren, proteolytische Enzyme mit saurem pH-Wirkungsbereich durch Züchtung von Mikroorganismen verschiedener Gattungen, z. B. Stämmen der Gattung Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Paecilomyces, Pénicillium, Rhizopus und Trametes zu gewinnen. Diese Proteasen besitzen eine optimale Wirkung bei einem allgemein als «pH-Optimum» bezeichneten pH-Wert, ihre Aktivität fällt jedoch beiderseits dieses pH-Wertes rasch ab. Ein sinnvoller Einsatz dieser Proteasen setzt daher eine Kenntnis des bei der Anwendung herrschenden pH-Wertes voraus, die nicht immer gegeben ist. Zudem ist man gezwungen, jeweils eine für den vorliegenden pH-Wert geeignete Protease auszusuchen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, eine saure Protease mit breitem pH-Wirkungsbereich und hoher enzyma-tischer Aktivität aufzufinden. Diese Eigenschaft ist besonders nützlich bei einem Einsatz dieser Protease in der Nahrungsmittel* und Tierfuttermittelindustrie, da gerade hier mit pH-Schwankungen in jeweils unbekannter Grösse gerechnet werden muss.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer sauren Protease mit breitem pH-Wirkungsbereich durch aerobes Züchten eines Pilzstammes der Gattung Rhizopus rhizopodiformis in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bei pH-Werten zwischen 3 und 7 und Temperaturen zwischen 25 und 50 °C, und Abtrennen des erzeugten Enzyms.

Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Spezies Rhizopus rhizopodiformis wurde mit der Hinterlegungsnummer CBS 227.75 im Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn (Nederland), am 23. März 1975 deponiert.

Dieser Stamm wurde beispielsweise unter spezifischen Anreicherungsbedingungen bei pH-Werten zwischen 3 und 5 und mit Proteinen, wie Casein oder Gelatine, als C- und N-Quelle aus Erdproben isoliert. Er wurde im Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn (Nederland), klassifiziert.

Das Verfahren zur Herstellung der Protease kann in einem flüssigen oder festen Nährmedium durchgeführt werden, wobei das flüssige Nährmedium im allgemeinen bevorzugt wird. Bei Züchtung in einer Nährlösung kann nach dem üblichen aeroben Schüttelkultur- oder Fermentationsverfahren gearbeitet werden.

Der im erfindungsgemässen Verfahren zu verwendende Nährboden kann in üblicher Weise hergestellt werden und soll eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und zweckmässig andere, von dem Mikroorganismus benötigte, Nähr- und Wuchsstoffe enthalten. Als geeignete Kohlenstoffquellen sind Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glukose, Fruktose, Maltose und zuckerhaltige Abfallstoffe zu nennen. Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, Harnstoff, Casein, Gelatine, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl bzw. -kuchen in Frage. Weiterhin können anorganische Salze, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammoniumhydrogenphosphate, Calcium- und Magnesiumsalze, dem Nährboden zugesetzt werden. Ferner kann es vorteilhaft sein, Wuchsstoffe, wie z. B. Hefeextrakt und Vitamine, dem Nährboden zuzusetzen.

Die Fermentationstemperatur bewegt sich in den Grenzen von 25 bis 50 °C, ist aber vorzugsweise zwischen 27 bis 32 °C zu wählen. Der pH-Wert des Nährbodens liegt zwischen 3,0 und 7,0 und beträgt vorzugsweise 4,0 bis 6,0. Die Züchtung wird im allgemeinen in einer Zeitdauer von 20 bis 96 Stunden durchgeführt.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Protease kann aus der filtrierten oder zentrifugierten Nährlösung nach üblichen Methoden durch Zusatz organischer Lösungsmittel oder durch Aussalzen mit z. B. Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Calciumchlorid ausgefällt und konzentriert werden. Eine Reinigung lässt sich durch Dialyse-Verfahren oder durch Behandlung an Ionenaustauscherharzen bewerkstelligen.

Die erfindungsgemäss hergestellte Protease besitzt ein besonders breites Wirkungsspektrum im schwach sauren Bereich zwischen pH-Wert 2,5 bis 6,5. Das Wirkungsoptimum liegt bei pH-Wert 4,5, der Bereich der 80%igen Maximalaktivität bei pH-Wert 3,3 bis 5,9, der Bereich der 60%igen Maximalaktivität bei pH-Wert 3,0 bis 6,4. Die Protease eignet sich in besonderem Masse als Zusatzstoff für Tierfuttermittel, insbesondere zur Verbesserung der Ergebnisse bei der Aufzucht und Mast von Geflügel, Schweinen, Kälbern und Nutzfischen. Sie kann jedoch darüber hinaus auch für andere Einsatzzwecke, bei denen saure Proteasen verwendet werden können, angewendet werden, wie z. B. in Lebensmitteln verarbeitenden Betrieben, in sauren Wasch-und Reinigungsmitteln, insbesondere Reinigungsmitteln für Kacheln, Fussböden und Tische, in Krankenhäusern und im Haushalt, als Lederhilfsmittel in der Gerberei, ferner in hochgereinigter Form im medizinischen Anwendungsbereich als Digestivum.

Die nachstehenden prozentualen Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig.

Die Feststellung der proteolytischen Aktivität der vorliegenden Protease erfolgte nach dem bekannten Prinzip der Bestimmung nach Anson: Eine entsprechend verdünnte Menge Enzymlösung wird bei 40 °C 20 Minuten lang mit einem gleichen Volumen einer l,2%igen Caseinlösung inkubiert, wobei diese 0,6 Milchsäure, 6 Mol Harnstoff und 0,1 Mol Zitronenoder Essigsäure enthält. Der pH-Wert der Caseinlösung wird durch Zusatz von 2 N Natronlauge auf 4,5 eingestellt. Nach der Inkubation wird im Volumenverhältnis 1:1 mit 0,4 N Trichlor-essigsäure versetzt, der sich bildende Niederschlag von unverdautem Casein abfiltriert und im Filtrat die beim Abbau entstandenen Protein-Spaltstücke nach einer beliebigen Eiweiss-bestimmungsmethode ermittelt. Geeignet hierfür ist z. B. das von Layne in Methods of Enzymology 3 (1957), 448 ff. beschriebene Verfahren.

Für jede Messprobe muss ein Blindwert angefertigt werden, bei dem zuerst Trichloressigsäure und dann Caseinlösung zugesetzt werden. Dieser Blindwert gibt neben dem Reagenzien-leerwert den Anteil an niedermolekularen Peptiden an, der bereits vor der Verdauung in der. Enzymlösung vorhanden ist. Die Differenz zwischen Haupt- und Blindwert wird bei der angegebenen Methode dann mit der Extinktion verglichen, die eine bestimmte Menge Tyrosin bei dieser Bestimmung liefert. Diese Menge Tyrosin ist dann ein Mass für die proteolytische Aktivität des vorliegenden Enzyms: Eine Enzymeinheit (TU) ist diejenige Menge Enzym, die den gleichen Extinktionsunterschied zwischen Haupt- und Blindwert pro Minute verursacht wie eine 1 M Tyrosinlösung, die anstatt der Enzymlösung eingesetzt wird.

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Die Messung der proteolytischen Aktivität bei höheren und tieferen pH-Werten als 4,5 ist durch passende Einstellung der Caseinlösung ohne weiteres möglich, wobei man jedoch den Essigsäurezusatz günstigerweise durch Zitronensäure ersetzt.

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Beispiel 1 :

Zur Bereitung des Nährmediums wurden in 11 Wasser 3 g Sojamehl, 3 g Maisquellwasser, 15 g Casein, 7 g Gelatine, 2,4 g KH2PO4,0,5 g MgSCU • 7 H20,0,1 g MnCh • 4 H20,0,1 g CaCb • 2 H2O und 20 g Maisstärke gelöst bzw. dispergiert. Der 10 pH-Wert der Nährlösung betrug 5,3. Die Maisstärke wurde mittels Amylase weitgehendst abgebaut. In die sterilisierte Nährlösung wurden Sporen des Stammes Rhizopus rhizopodiformis eingeimpft, und die Kultur wurde unter optimaler Belüftung bei 30 °C etwa 50 Stunden lang gezüchtet. Nach dieser Zeit wurde 15 das Pilzmycel abfiltriert und die mycelfreie Kulturbrühe zur Bestimmung der Proteaseaktivität gemäss vorgenanntem Verfahren verwendet. Dabei ergab sich, dass die Kulturlösung enzymatische Aktivität bis zu 18 m TU/ml erreichte.

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Beispiel 2:

Zur Bereitung des Nährmediums wurden in 11 Leitungswasser 10 g Sojamehl (entölt), 5 g Maisquellwasser, 12 g Casein, 5 g Gelatine, 5 g Getreidetrockenschlempe, 2,4 g KH2PO4,1 g NaNCh,1 g NH4CI, 0,01 g FeS04 und 30 g native Maisstärke 25 gelöst bzw. dispergiert. Der pH-Wert der Nährlösung wurde nach dem Autoklavieren auf 5,3 eingestellt. Ein mit dieser Nährlösung angesetzter 10-Liter-Fermenter wurde mit 100 ml einer Czapek-Dox-Vorkultur (mit 5% Stärke und 0,5% Hefeextrakt) versetzt, die mit Sporen des Pilzstammes Rhizopus rhizopodi- 30 formis beimpft und 24 Stunden lang bei 30 °C geschüttelt worden war, unter Belüftung bei 30 °C etwa 50 Stunden lang betrieben, bis der pH-Wert auf 6,8 bis 7,0 angestiegen war. Danach wurde das Mycel abfiltriert und die klare Kulturbrühe zur Bestimmung der Proteaseaktivität gemäss vorgenanntem Ver- 35

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fahren verwendet. Dabei ergab sich, dass die Kulturlösung eine enzymatische Aktivität bis zu 20 m TU/ml erreichte. Die Protease wurde isoliert durch Klarfiltration der Brühe unter Zusatz von 5 g «Filter Cel» und 5 g Standard «Super Cel» der Firma Mansville, Einengen bei 66,65 mbar auf einen Drittel des Ausgangsvolumens und Ausfällen unter Zusatz von 39% wasserfreiem Natriumsulfat unter Rühren, wobei die Temperatur auf 38-40 °C gebracht wurde. Alternativ kann die Protease aber auch durch Zutropfen von 2 Volumina Äthanol, Methanol, Aceton oder anderer wassermischbarer Lösungsmittel bei einer Temperatur von —3 bis 5 °C ausgefällt werden. Der Niederschlag wurde abgesaugt und im Vakuum getrocknet.

Unter Anwendung des vorstehend geschilderten Bestimmungsverfahrens wurde die Aktivität der nach Beispiel 1 und 2 isolierten Protease in Abhängigkeit vom pH-Wert ermittelt. In der Tabelle sind die pH-Werte aufgeführt, bei denen die optimale bzw. 50% der beim optimalen pH-Wert gemessenen Aktivität vorliegen. Wie die ebenfalls in dieser Tabelle enthaltenen Werte für literaturbekannte, saure Proteasen erkennen lassen, besitzt die aufgefundene Protease einen breiteren und für die genannten Anwendungsgebiete günstigeren Wirkungsbereich - ausgedrückt in pH-Einheiten - als die bekannten Enzyme.

Tabelle

Enzym pH-Optimum 50%-Werte

«Takamine» 2,5-3,0 1,5-4,0 acid fungal protease

«Denapsin» 3,0 1,5-4,5

Aspergillus acid protease 2,5 1,5-4,0

«Proctase» 2,0-3,0 1,5-4,5

«Samprose» 2,5 2,0-4,5 Protease aus

Rhizopus rhizopodiformis 4,0-4,5 2,5-6,5