DE2050982C3

DE2050982C3 -

Info

Publication number: DE2050982C3
Application number: DE19702050982
Authority: DE
Priority date: 1969-10-24
Filing date: 1970-10-16
Publication date: 1977-06-02

Description

1-Aminocyclohexylpenicillin ist ein Breitspektrum-Penicillin, das gegenüber den verschiedensten gramnegativen und grampositiven pathogenen Keimen wirkt.

Dieses Penicillin ist gegenüber zahlreichen bakteriellen Erregern, die beim Menschen Infektionen hervorrufen, in vivo aktiver als in vitro. In dieser Hinsicht unterscheidet es sich von a-Aminobenzylpenicillin, das

35 ebenfalls ein Breitspektrum-Penicillin ist jedoch hinsichtlich der In-vivo-Aktivität dem 1-Aminocyclohexylpenicillin unterlegen ist.

l-Aminocyclohexylpenicillin wurde bisher durch Acylierung von 6-Aminopenicillansäure, nachstehend mit 6-APS bezeichnet, mit l-Aminocyclohexylcarbonsäure bzw. einem reaktionsfähigen Derivat dieser Verbindung hergestellt

Aufgabe der Erfindung war es, em neues Verfahren zur Herstellung von l-Aminocyclohexylpenicillin auf mikrobiologischem Wege zu schaffen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst

Die Erfindung betrifft somit den im Anspruch gekennzeichneten Gegenstand.

Das verfahrensgemäß eingesetzte Penicillin G oder V oder die 6-Aminopenicillansäure werden als Alkalioder Erdalkalimetallsalz, insbesondere als Natrium-, Kalium- oder Calciumsalz.eingesetzt 6-Aminopenicillansäure kann auch in Form eines Salzes, einer Säure, z. B. als Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid oder Hydrogenphosphat, verwendet werden.

Die im Verfahren der Erfindung eingesetzte 1-Aminocyclohexylcarbonsäure kann in Form der freien Säure verwendet werden. Vorzugsweise werden das Amid, ein Alkylester mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkylrest und Alkalimetallsalze der 1-Aminocyclohexylcarbonsäure, insbesondere ein Salz einer Säure dieser Derivate, verwendet Besonders bevorzugt sind die Methyl- oder Äthylester. Es können jedoch auch die Natrium- oder Kaliumsalze der Säure verwendet werden. Als Salze einer Säure können Salze verwendet werden, die sich von Mineralsäuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure ableiten. Das Hydrochlorid ist bevorzugt. Die nachstehenden Reaktionsgleichungen erläutern das Verfahren der Erfindung.

(a) Verwendung von 6-APS als Substrat:

COOH

+ H₂N-C-C

O=C N—C—COOH

NH,

CO—NH-C—C

NH,

1-Aminocyclo- 6-Aminopenicillansäure (6-APS) hexylcarbonsäure

O=C N—C-COOH

1 -Aminocyclohexylpenicillin

(b) Verwendung von Penicillin G als Substrat:

COOH

y\

NH,

H H
CH₇-CO-NH-C-C

O=C N—C-COOH

l-Aminocyclo- Penicillin G

hexylcarbonsäure

CH₇-COOH +

H H
CO—NH-C—C

O=C N —C—COOH

Phenylessigsäure

1 -Aminocyclohexylpenicillin

Die im Verfahren der Erfindung eingesetzten Mikroorganismen haben eine sehr hohe Aktivität zur Bildung von 1-Aminocyclohexylpenicillin aus o-APS oder Penicillin G oder V und l-Aminocyclohexylcarbonsäure und deren Amid oder Alkylester mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkylrest.

Zur Gewinnung des im Verfahren der Erfindung verwendeten Enzyms bzw. Enzymsystems werden die vorgenannten Mikroorganismenstämme gezüchtet, damit sich das gewünschte Enzym bzw. Enzymsystem innerhalb der Zellkörper und vorzugsweise auch innerhalb der Kulturflüssigkeit bildet. Die Züchtungsdauer wird vorzugsweise so eingestellt, daß das Enzym auf die nachstehend geschilderte Weise extracellular gebildet und angereichert werden kann.

Als Züchtungsmedium für die verfahrensgemäß eingesetzten Mikroorganismen werden Nährböden verwendet, die neben einer Kohlenstoff- oder Energiequelle, wie Glucose, Rohrzucker, Stärke, Melasse, Sorbit oder andere Naturstoffe, auch noch eine organische Stickstoffquelle enthalten. Beispielsweise können Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt oder Maisquellwasser verwendet werden. Der Nährboden enthält weiter geeignete Mengen an einer Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid, oder eine natürliche Stickstoffquelle, wie Maisquellwasser, Pepton, Fleischextrakt oder Hefeextrakt. Vorzugsweise enthält der Nährboden noch anorganische Salze, wie Phosphate, z. B. primäres und sekundäres Kaliumphosphat, Magnesiumsalze, wie Magnesiumsulfat, Metallionen, wie Eisen-, Natrium-, Kalium-, Mangan-, Zink- oder Calciumionen, sowie Anionen, wie Chlorid- und Nitrationen. Erforderlichenfalls werden noch weitere Nährstoffe zugesetzt, die zum Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind.

Die Züchtung wird bei Temperaturen von 20 bis 50⁰C und einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,0 bis 9,0 unter aeroben Bedingungen, z. B. durch Schüttelkultur oder Submerskultur mit Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich 1 bis 7 Tage. Auf diese Weise wird das für die Synthese verwendete Enzym in den gezüchteten Zellkörpern gebildet, und es hegt gewöhnlich auch in der Kulturflüssigkeit vor.

Die im Verfahren der Erfindung verwendete Enzymquelle kann die Kulturflüssigkeit selbst sein, die Zellkörper, die von Zellkörpern befreite Kulturflüssigkeit oder das freie Enzym, das z. B. durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Dialyse, Fällung mit Aceton oder Äthanol oder Chromatographie gereinigt werden kann. Bei Verwendung dei Zellkörper werden diese vorzugsweise in einer Suspension oder in Aceton getrocknetem Zustand verwendet. Bei Verwendung der Kulturflüssigkeit wird das Substrat der Kulturflüssigkeit zugesetzt und der Umsetzung unterworfen, nachdem der pH-Wert auf den nachstehend angegebenen Bereich eingestellt ist

Die enzymatische Umsetzung wird in einer Reaktionsflüssigkeit durchgeführt, welche die beiden Substrate und eine ausreichende Menge des Enzyms enthält. Das Reaktionsmedium kann die Kulturflüssigkeit selbst sein, der die Substrate zugesetzt wurden. Das Reaktionsmedium wird vorzugsweise mit einer Pufferlösung versetzt, um die Reaktion innerhalb des optimalen pH-Bereiches durchzuführen. Die Umsetzung

ist in einem verhältnismäßig breiten pH-Bereich von 4,5 bis 7,5 möglich. Die Reaktionstemperatur liegt bei etwa 30 bis 38 C. Die Reaktionszeit beträgt 1 bis 24 Stunden.

Nach beendeter Umsetzung wird das t-Aminocyclohexylpenicillin nach bekannten Methoden isoliert, z. B. durch Gegenstromverteilung, Ausfällung mittels eines organischen Lösungsmittels oder durch Einstellung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt. Ferner kann das Produkt zur Reinigung an Ionenaustauschern oder durch Saulenchromatographie gereinigt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Als Mikroorganismus wird Kluyvera citrophila ATCC 21 285 verwendet. Das Einsaatmedium enthält 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt sowie 0,3% Natriumchlorid. Eine Platinöse des Einsaatmikroorganismus wird in 20 ml des Nährmediums in einem 250 ml fasaenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden unter Schütteln bei 30 C gezüchtet. Danach werden 2 ml der Einsaatkulturflüssigkeit in 20 ml eines Nährmediums in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft. Dieses Nährmedium enthält 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0.5% Natrium-L-glutamat und 0,3% Natriumchlorid und 0,2% Phenylessigsäure. Der pH-Wert des Nährmediums vor der Sterilisation wird mit 5 n-Natronlauge auf 7,3 eingestellt. Die Kultur wird 48 Stunden unter Schütteln bei 30⁰C gezüchtet. Sodann werden die Zellkörper von der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt und zweimal mit 0,9%iger wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Hierauf werden die Zellkörper in einem l/30molaren Phosphorsäurepuffer vom pH-Wert 6,8 in einer Konzentration von 10 mg trockene Zellen/ml suspendiert. Die Suspension wird mit 3 mg/ml des Kaliumsalzes von Penicillin G sowie 5 mg/ml l-Aminocyclohexylcarbonsäureamid-

f,₅ hydrochlorid versetzt. Sodann wird die Umsetzung 4 Stunden bei 35° C durchgeführt. Danach haben sich in der Lösung 2,5 mg/ml 1-Aminocyclohexylpenicillin gebildet.

Beispiel 2

In zwei getrennten Versuchen werden als Einsaatmikroorganismen Streptomyces phaeochromoeenes ATCC 21 289 bzw. Nocardia globerula ATCC 21 292 verwendet. Als Hauptfermentationsmedium wird ein Medium verwendet, das 3% lösliche Stärke, 2% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt und 0,1% Calciumcarbonat enthält. Der pH-Wert dieses Mediums vor der Sterilisation beträgt 7,3. Die Züchtungsbedingungeü sind die gleichen wie im Beispiel 1. Am vierten Züchtungsiag wird die Kulturbrühe mit 2,5 mg/ml Penicillin G (bei Verwendung von Streptomyces phaeochromogenes) bzw. Penicillin V (bei Verwendung von Nocardia globerula) sowie 10 mg/ml 1-Aminecyclohexylcarbonsäureäthylester-sulfat versetzt. Der pH-Wert der Gärmaische wird auf 6,8 eingestellt und die Fermentation fortgesetzt. Während der Fermentation wird der pH-Wert der Gärmaische in stündlichen Intervallen mit Salzsäure bzw. Nal.onlauge auf 6,8 eingestellt. 6 Stunden nach Zugabe der Substrate haben sich bei Verwendung von Streptomyces phaeochromogenes 1,12 mg/ml bzw. bei Verwendung von Nocardia globerula 1,85 mg/m) 1-Aminocyclohexylpenicillin gebildet.

Die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens geht aus den folgenden Verglcichsversuchen hervor:

Versuch 1

Die Herstellung von l-Aminocyclohexylpenicillin wurde gemäß Beispiel 14 der DT-OS 18 00 698 durchgeführt, anstelle von 0,8 Mo! Dimethylanilin-dihydrochlorid wurden jedoch 1,6 Mol Dimethylanilin-monohydrochlorid verwendet, da das Dihydrochlorid nicht zugänglich war. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Ausbeute 16,8 g

Umwandlungsrate von 6-APS 49,3%

Reinheit des Produkts 97%

Versuch 2

Die Herstellung von l-Aminocyclohexylpenicillin wurde mit den nachstehend aufgeführten Stämmen gemäß Beispiel 1, jedoch ohne Zusatz von Phenylessigsäure und unter Verwendung von 1,5 mg/ml 6-APS sowie 5 mg/ml 1 -Aminocyclohexylcarbonsäuremethylester-hydrochlond wiederholt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Stamm	Gebildete	Ausbeute	Urnwind-	Reinheit
	Menge an		lungs-	des
	Produkt		rate von	Pro
			6-APS	dukts
	(mg ml)	(B)	(%)	(%)
K. citrophila	2,13	30,5	56,5	98,5
ATCC 21 285
N. globerula	2.07	26,0	54,6	99
ATCC 21 292
S. phaeochromo-	2,05	25.7	54.0	98
genes
ATCC 21 289

Das Produkt wurde wie folgt isoliert:
Nach Abtrennung des Mycels werden etwa 2 Liter der Kulturflüssigkeit durch eine Kolonne geleitet, die mit einem stark sauren Kalionenharzaustau-

}o scher in der Natriimiform gefüllt ist. und der vor der Verwendung mit 0,2molarem Citratpuffer vom pH-Wert 2,0 abgepuffert wurde. Das am Harzaustauscher adsorbierte Produkt wird anschließend mit 0,2molarem Citratpuffer vom pH-Wert 4,0 und anschließend

3s mit 0,2molarem Citratpuffer vom pH-Wert 7,0 eluiert. Die Fraktionen, die das l-Aminocyclohexylpenicillin enthalten, werden vereinigt, an 1,5 Liter Aktivkohle adsorbiert und anschließend mit 70%igem wäßrigem Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 40⁰C eingedampft. Bei der langsamen Zugabe von Aceton zum Konzentrat scheidet sich das Produkt in kristalliner Form aus.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von f-Aminocyclohexylpenicillin,dadurch gekennzeichnet, daß man 6-Aminopenicillansäure, ihr Alkali- oder Erdalkalimetallsalz oder ihr Salz mit einer Säure oder Penicillin G, Penicillin V oder deren Alkalioder Erdalkalimetallsalz mit 1-Aininocyclohexyl- ι ο carbonsäure oder deren Amid oder Alkylester mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkylrest oder Salz einer Säure in Gegenwart eines 1-Aminocyclohexylpenicillin bildenden Enzyms, das bei der aeroben Züchtung von Kluyvera citrophila ATCC 21 285, Nocardia globerula ATCC 21 292 oder Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21 289 in einem üblichen Nährmedium bei Temperaturen von 20 bis 50° C und bei einem pH-Wert von 5 bis 9 anfällt, bei Temperaturen von 30 bis 38° C und bei :o einem pH-Wert von 4,5 bis 7,5 zur Umsetzung bringt.