DE2050982A1

DE2050982A1 - Verfahren zur Herstellung von Amino cyclohexylpemcillin

Info

Publication number: DE2050982A1
Application number: DE19702050982
Authority: DE
Inventors: Takashi Tokio Okachi Ryo Machida Tokio Nara, (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-10-24
Filing date: 1970-10-16
Publication date: 1971-05-06
Also published as: DE2050982B2; CH553813A; FR2070155B1; GB1320974A; FR2070155A1; JPS4944351B1; US3717548A; CA976099A

Description

¹¹ Verfahren zur Herstellung von Aminocyclohexylpenicillin " Priorität: 24. Oktober 1969, Japan, Nr. 84 653 /69

Aminocyclohexylpenicillin ist ein Breitspektrum-Penicillin, das gegenüber den verschiedensten gramnegativen und grampositi ven Keimen wirkt, die pathogenetisch von grosser Bedeutung sind. Dieses Penicillin ist gegenüber zahlreichen bakteriellen Erregern, die beim Menschen Infektionen hervorrufen,in vivo aktiver als in vitro. In dieser Hinsicht unterscheidet es sich von tf-Aminobenzylpenicillin, das ebenfalls ein Breitspektrum-Penicillin ist, jedoch hinsichtlich der in vivo-Aktivität dem Aminocyclohexylpenicillin unterlegen ist.

Aminocyclohexylpenicillin wurde bisher durch Acylierung von 6-Aminopenicillansäure, nachstehend mit 6-APS bezeichnet, mit l-Aminocyclohexylcarbonsäure bzw. einem reaktionsfähigen Derivat dieser Verbindung hergestellt.

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Aufgabe der Erfindung war es, ein neues Verfahren zur Herstellung von Aminocyclohexylpenioillin auf mikrobiologischem Wege zu schaffen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Aminocyclohexylpenicillin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass· man eine Penicillinverbindung mit Aminocyclohexylcarbonsäure, einem Derivat dieser Verbindung oder Säureadditionssalz in Gegenwart eines Aminocyclohexylpenicillin bildenden Enzyms, das bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattungen Peeudomonas, KDuyvera, Escherichia, Aerobaeter, Micrococous, Streptomyces, Nocardia, Aspergillus oder Penicillium anfällt, zur Umsetzung bringt.

Im Verfahren der Erfindung wird als Penicillinverbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel I ...'..

H	H C	Hy — C	]	CH₅
O =	I C	-N-	/	3

	ϊ

COOH

verwendet, in der R ein Wasserstoffatom oder ein üblicher Aeyl rest von Penicillinen ist. Ferner können die Ester, Salze und Säureadditionssalze dieser Verbindung eingesetzt werden. Der Rest R ist gewöhnlich ein pharmakologisch verträglicher Rest, wie er z.B. im Penicillin V oder G vorliegt. Typische Reste R sind die Phenoxyacetyl-, Phenylacetyl-, (f-Chlorcrotyl- und Mercaptoacetylgruppe. Mir den Rest R kommt praktisch jede Grup pe in Frage, wenn nur das Penicillingrundgerüst vorhanden ist. Vorzugsweise wird im Verfahren der Erfindung 6-APS, Penicillin

6 oder Penicillin.V verwendet. Penicillin V ist Phenoxymethylpenieillin und Penicillin G- Benzylpenicillin.

Das verfahrensgemäss eingesetzte Penicillin wird vorzugsweise als Salz, gewöhnlich als Alkali- oder Erdalkalimetallsalz, insbesondere als Natrium-, Kalium- oder Calciumsalz,eingesetzt. Das verfahrensgemäss eingesetzte Penicillin kann auch in Form eines Säureadditionssalzes, z.B. als Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid oder Hydrogenphosphat,verwendet werden.

Die im Verfahren der Erfindung eingesetzte Aminocyclohexylcarbonsäure kann in Form der freien Säure verwendet werden. Vorzugsweise wird ein funktionelles Derivat, insbesondere ein Säureadditionssalz des Derivats ,verwendet. Geeignete Säurederivate sind die Amide, Alkylester und Alkalimetallsalze der Aminocyclohexylcarbonsäure. Die bevorzugten Ester sind die Alkylester mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen im Alkylrest, insbesondere die Methyloder Äthylester. Es können jedoch auch die Natrium- oder Kaliumsalze der Säure verwendet werden. Als Säureadditionssalze können Salze verwendet werden, die sich von Mineralsäuren, wie Salz- ä säure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure ableiten. Das Hydrochlorid ist bevorzugt. Die nachstehenden Reaktionsgleichungen erläutern das Verfahren der Erfindung,

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(a) Verwendung von 6-APS als'Substrat:

H h/

/ \ ^COOH H₀N - C - C -

\ / NHp O=G N C COOH

1-Aminocyclohexyl- 6-Aminopenicillansäure carbonsäure (6-APS)

S.

/—\[ ² H H/ \

< /-CO - NH - C - C C \/ \ /

N— C

^ < /—CO - NH - C - C

v_y ι \ / -oh.

O=C N— C —COOH

Aminocyclohexylpenicillin (b) Verwendung von Penicillin G als Substrat:

COOH _/£-Λ H Η/ \ / ^GH3

+ (J \>— CH₀ -CO-NH-C-C C.

O=C N— C CoSh

l-Aminocyclohexyl- Penicillin G

carbonsäure

NHp

/r\ r~\\ ^H ^k

</ \>-CH_o— COOH + < /-CO - NH - C - C \J ² /

C C \ / ^ CH,

0 = C N-C COOH

Phenylessigsäure Aminocyclohexylpenicillin

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Die im Verfahren der Erfindung verwendeten Mikroorganismen ge-"hören zu den Gattungen Pseudomonas, Kluyvera, Escherichia, Aerobacter, .Micro-coccus,. Streptomyces, Nocardia, Aspergillus oder Penicillium. Vorzugsweise werden solche Stämme verwendet, die durch mutagene Behandlung, z.B. UV-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung oder Behandlung mit mutationsauslösenden Verbindungen> eine sehr hohe enzymatische Aktivität zur Synthese von Aminocyclohexylpenicillin erworben haben. Die Gattungen Pseudomonas und Kluyvera werden bevorzugt.

Die im Verfahren der Erfindung eingesetzten MilrrοOrganismen der vorgenannten Gattungen haben eine sehr hohe Aktivität zur BiI-dung von Aminocyclohexylpenicillin aus 6-APS oder anderen Penicillinen und Aminocyclohexylcarbonsäure und deren Derivaten. Das PjT-Optimum der enzymatischen Aktivität dieser. Mikroorganismen liegt in einem verhältnismässig breiten Bereich, der vom schwach sauren Bereich bis zum schwach alkalischen Bereich reicht.

Zur Gewinnung des im Verfahren der Erfindung verwendeten Enzyms bzw. Enzymsystems werden Stämme der vorgenannten Mikroorganismen gezüchtet, damit sich das gewünschte Enzym bzw. Enzymsystem innerhalb der Zellkörper und vorzugsweise auch innerhalb der KuItürflüssigkeit bildet. Die Züchtungsdauer wird vorzugsweise· · so eingestellt, dass das Enzym auf die nachstehend geschilder-Weise

te /extracellular gebildet und angereichert werden kann.

Als Züchtungsmedium für die verfahrensgemäss eingesetzten Mikroorganismen werden Nährböden verwendet, die eine Kohlenstoffoder Energiequelle, wie Glucose, Rohrzucker, Stärke, Melasse,

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COPY

Sorbit oder andere Naturstoffe,enthalten, die auch noch eine organische Stickstoffquelle enthalten. Beispielsweise können Pep-

• ton, Fleischextrakt, Hefeextrakt oder Maisquellwasser verwendet werden. Der Nährboden enthält weiter geeignete Mengen an einer. Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsulfat oder . Ammoniumchlorid,.oder eine natürliche Stickstoffquelle, wie Haisquellwasser, Pepton,'Fleischextrakt oder Hefeextrakt. Vorzugsweise enthält der Nährboden noch anorganische Salze, wie

. Phosphate, z.B. primäres und sekundäres Kaliumphosphat, Magnesiumsalze, wie' Magnesiumsulfat, Metallionen, wie Eisen-, Natrium-, Kalium™, Mangan-, Zink- oder Caleiumionen, sowie Anionen, wie Chlorid- und Nitrationen. Erforderlichenfalls v/erden noch weitere Nährstoffe zugesetzt, die zum Wachstum der •Mikroorganismen notwendig sind.

Die Züchtung wird bei Temperaturen von 20 bis 5O⁰C und einem, P„-Wert im Bereich von etwa 5,0 bis 9,0 unter aeroben Bedingungen, z.B. durch Schüttelkultur oder Submerskultur mit Belüftung und Rühren,durchgeführt. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich 1 bis 7 Tage. Auf diese Weise wird das für die Synthese verwendete Enzym in den gezüchteten Zellkörpern gebildet,und es liegt gewöhnlich auch in der Kulturflüssigkeit vor.

Die im Verfahren der Erfindung verwendete Enzymquelle kann die Kulturflüssigkeit selbst sein, die Zellkörper, die von Zellkörpern befreite Kulturflüssigkeit oder das freie Enzym, das z.B. durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Dialyse, Fällung mit Aceton oder Äthanol oder Chromatographie gereinigt werden kann. , Bei Verwendung der Zellkörper werden diese vorzugsweise in einer Suspension oder in Aceton getrocknetem Zustand verwendet.

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Bei Verwendung der Kulturflüssigkeit wird das Substrat der Kulturflüssigkeit zugesetzt und der Umsetzung unterworfen, nachdem der Pjj-Wert auf den nachstehend angegebenen Bereich eingestellt ist. ■ '

Die enzymatische Umsetzung wird in einer Reaktionsflüssigkeit durchgeführt, welche die beiden Substrate und eine ausreichende Menge des Enzyms enthält. Das !Reaktionsmedium kann die Kulturflüssigkeit selbst sein, der die Substrate zugesetzt wurden. Das Reaktionsmedium wird vorzugsweise mit einer Pufferlösung f versetzt, um die Reaktion innerhalb des optimalen Pjr-Bereiches durchzuführen. Die Umsetzung ist in einem verhältnismässig breiten PjT-Bereich von 3 bis 8 möglich. Besonders geeignet ist der Bereich von p_H 4,5 bis 7,5. Die Reaktionstemperatur liegt zwischen etwa 25 und 5O⁰C, vorzugsweise bei 30 bis 38⁰C. Die Reaktionszeit beträgt 1 bis 24 Stunden.

Nach beendeter Umsetzung wird das Aminocyclohexylpenicillin nach bekannten Methoden isoliert, z.B. durch Gfegenstromverteilung, Ausfällung mittels eines organischen Lösungsmittels oder " durch Einstellung des Pg-Wertes auf den isoelektrischen Punkt. Ferner kann das Produkt zur Reinigung an Ionenaustauschern oder durch Säulenchromatographie gereinigt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

B e'i spiel 1

Als Mikroorganismus wird Pseudomonas melanogenum ATCC I78O8 verwendet und das Einsaatraedium enthält 1 5» Pepton, 1 fo Fleischextrakt, 0,5 io Hefeextrakt sowie 0,3 96 Natriumchlorid. Eine

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ORIGINAL INSPECTED

Platinöse des Einsaatmikroorganismus wird in 20 ml des Nährmediums in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und • 24 Stunden unter Schütteln bei 30 C gezüchtet. Danach werden 2 ml der Einsaatkulturflüssigkeit in 20 ml eines Nährrnediums in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft. Dieses Nährmedium enthält 0,5 $> Pepton, 0,5 $ Hefeextrakt, 0,5 1° Natrium-L-glutamat und 0,3 °ß> Natriumchlorid. Der p^-Wert des Nährmediums vor der Sterilisation wird mit 5n Natronlauge auf 7,3 eingestellt.

Die Kultur wird 48 Stunden unter Schütteln bei 3O⁰C gezüchtet. Sodann werden die Zellkörper von der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt und zweimal mit 0,9prozentiger wässriger Natriumchloridlösung gewaschen. Hierauf werden die Zellkörper in einem 1/30 molaren Phosphorsäurepuffer vom Ρττ-Wert· 6,8 in einer Konzentration von 10 mg trockene Zellen/ml suspendiert. Die Suspension wird mit 1,5 mg/ml 6-APS sowie 5 mg/ml Aminocyclohexylcarbonsäuremethylester-hydrochlorid versetzt. Sodann wird die Umsetzung -4 Stunden bei 35°C· durchgeführt. Danach haben sich in der Lösung 1,35 mg/ml Aminooyciohexylpenicillin gebildet.

Beispiel 2

Als Einsaatmikr.oOrganismus wird Kluyvera citrophila ATCC 21285 verwendet. Die Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1, das zweite Züchtungsmedium enthält Jedoch zusätzlich 0,2 $ Phenylessigsäure. Die Umsetzung wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt, es werden die 48 Stunden nach der Züchtung erhaltenen Zellkörper verwendet, anstelle von 6-APS werden jedoch 3 mg/ml des Kaliumsalzes von Penicillin G eingesetzt. Schliesslieh wird anstelle des Aminocyclohexylcarbonsäuremethylester-

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hydrochloride das Aminoeyclohexylcarbonsäureamid-hydrochlorid verwendet. Nach 5-stündiger Umsetzung haben sich in der ■ Reaktionslösung 2,5 mg/ml Aminocyclohexylpenicillin gebildet.

Beispiel 3

In zwei gesonderten Versuchen werden Escherichia coll ATCC 13281 bzw. Aerobacter, aerogenes ATCC 8308 als Einsaatiiikroorganismen verwendet. Die Züchtungsbedingungen sind die gleichen v/ie in Beispiel 1. 48 Stunden nach Beginn der Züchtung werden die Zellkörper isoliert, in dem in Beispiel 1 beschriebenen wässri- ä gen Medium suspendiert und anschliessend in eine grosse Menge Aceton eingegossen. Nach dem Abnutschen werden die Aceton-getrockneten Zellkörper mit Äther gewaschen.

Die enzymatisehe Umsetzung wird unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unter Verwendung der Aceton-getrockneten Zellkörper als Enzymquelle durchgeführt. 3 Stunden nach Beginn der Umsetzung wird die Reaktionslösung mit einer weiteren Menge von 0,5 mg/ml 6-APS versetzt und die Umsetzung weitere 2 Stunden durchgeführt. 5 Stunden nach Zusatz des Substrates haben sich f bei Verwendung von Escheriehia coli 1,20 mg/ml und bei Verwendung von Aerobacter aerogenes 1,18 mg/ml Aminocyclohexylpenicilgebildet.

Beispiel 4

In zwei getrennten Versuchen werden als Einsaatmikroorganismen Streptomyces phaeochormogenes ATCC 21289 bzw. Nocardia globerula ATCC 21292 verwendet. Als Hauptfermentationsmedium wird ein Medium verwendet, das 3 ^oß> lösliche Stärke, 2 fi Soiabohneniaehl, 0,5 i° Hefeextrakt und 0,1 $ Calciumcar'bonat enthält

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Der pjT-V/ert dieses Mediums vor der Sterilisation "beträgt 7,3. Die Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1. Am vierten Züchtungstag wird die Kulturbrühe mit 2,5 mg/ml Penicillin G (bei Verwendung von Streptomyces phaeochromogenes) bzw. Penicillin Y (bei Verwendung von Nocardia globerula) sowie 10 mg/ml Aminocyclohexylcarbonsäureäthylester-sulfat versetzt. Der p_H~Wert der Gärmaische wird auf 6,8 eingestellt und die Fermentation.fortgesetzt. Während der Fermentation wird der p„-Wert der Gärmaische in stündlichen Intervallen mit Salzsäure bzw, natronlauge auf 6,8 eingestellt. 6 Stunden nach Zugabe der Substrate haben sich bei Verwendung von Streptomyces phaeochromogenes 1,12 ing/ml bzw. bei Verwendung von Nocardia globerula 1,85 mg/ml Aminocyclohexylpenicillin gebildet.

Beispiel 5

In zwei getrennten Versuchen werden als Einsaatmikroorganismen Aspergillus oryzae ATCC 16450 bzw. Penicilliuin chrysogenum ATCC

»10135 verwendet. Als Hauptfermentationsmedium wird ein Medium verwendet, das 3 % Rohrzucker, 0,2 f> Natriumnitrat, 0,1 ^sekundäres Kaliumphosphat, 0,05 i> Magnesiumsulfat, 0,05 $ Kalium- ": Chlorid und 0,001 tfo Eisen(II)-sulfat enthält. Der p_H~Wert des Mediums vor der Sterilisation beträgt 6,8. 50 ml des Hauptfermentationsmediums werden in eine 500 ml fassende Sakaguchi-Flasche abgefüllt und mit einer Platinöse des Einsatzmikroorganismus beimpft. Sodann wird die Kultur 5 Tage bei 27°C geschüttelt, hierauf mit 6-APS in einer Konzentration von 2,0 mg/ml und dem Kaliumsalz der Aminocyclohexylcarbonsäure in einer Konzentration von 10 mg/ml versetzt. Der p_H~Wert der Gärmaische

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wird hierauf auf 5,0 eingestellt und die Züchtung fortgesetzt. 6 Tage nach Beginn der Züchtung haben sich bei Verwendung von Aspergillus oryzae 2,02 mg/ml und bei Verwendung von Penicillium chrysogenum 2,31 mg/ml Aminocyclohexylpenicillin in der G-ärmaische gebildet.

Nach. Abtrennung des Hycels werden etwa 2 Liter der Kulturflüssigkeit durch eine Kolonne geleitet, die mit 50 ml Dowex 50 W χ 4 in der Hatri uniform - ein stark saurer Kationenharzaustauscher gefüllt ist, und der vor der Verv/endung mit 0,2 molarem .Citrat- f puffer vom p_H-Wert 2,0 abgepuffert wurde. Das am Harzaus tauscher adsorbierte Produkt wird anschliessend mit 0,2 molarem Gitratpuffer vom p^-Wert 4,0 und anschliessend mit 0,2 molarem Citratpuffer vom p^-Wert 7,0 eluiert. Die Fraktionen, die das Äminocyclohexylpenicillin enthalten, werden vereinigt, an 1,5 liter Aktivkohle adsorbiert und anschliessend mit 70prozentigem wässrige tn Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 40 C eingedampft. Bei "der langsamen Zugabe von Aceton zum Konzentrat scheidet sich das Produkt in kristalliner Form aus. g Ausbeute 2,3 g.

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Claims

- 12 Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von Aminocyclohexylpenicillin, dadurch gekennzeichn et, dass man eine Penicillinverbindung mit Aminocyclohexylcarbonsäure, einem Derivat dieser Verbindung oder Sätireadditionssalz in Gegenwart eines Aminocyclohexylpenicillin bildenden Enzyms, das bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, Kluyvera, Escherichia, Aerobacter, Micrococcus, Streptomyces, Nocardia,

_ Aspergillus oder Penicillium anfällt, zur Umsetzung bringt.

W .'·■■■■■. .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

als Penicillinverbindung 6-Aminopenicillansäure, deren Alkylester, Alkali- oder Erdalkalimetallsalz oder Säureadditionssalz verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Penicillinverbindung Penicillin G verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ^ man als Penicillinverbindung Penicillin V verv/endet.
5« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung bei einem p^-Wert von 3 bis 8 und bei Temperaturen von 25 bis 50°G durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung bei einem prr-Wert von 4,5 bis 7,5 und bei Temperaturen von 30 bis 38 C durchführt.

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- LO —
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung während 1 bis 24 Stunden durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym durch aerobe Züchtung der Mikroorganismen in einem Nährmedium bei Temperaturen von 20 bis 5O⁰C und einem ρττ-Wert von 5 bis 9 erzeugt. '
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die. Umsetzung in Gegenwart der enzymhaltigen Zellkörper durchführt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung in Gegenwart der enzymhaltigen Kulturflüssigkeit durchführt.

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ORIGINAL IHSPECTEO