DE19913206A1 - Verfahren zur Herstellung von CMP-Sialat-Synthetase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit CMP-Sialat-Synthetase-Aktivität, insbesondere eines Enzyms der Klassifizierung EC 2.7.7.43 mit CMP-Sialat-Synthetase-Aktivität aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B, sowie seine Verwendung zur Herstellung von Nukleotid-aktivierten CMP-Sialinsäuren und deren Strukturanaloga, zur Synthese von Sialinsäure-haltigen Oligosacchariden und deren Strukturanaloga, sowie zur Analyse von sialylierbaren Akzeptorverbindungen mittels fluoreszierender Sialinsäurekonjugate.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit CMP-Sialat- Synthtetase-Aktivität, insbesondere eines Enzyms der Klassifizierung EC 2.7.7.43 mit CMP-Sialat-Synthetase-Aktivität aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B, sowie seine Verwendung zur Herstellung von Nukleotid-aktivierten CMP-Sialinsäuren und deren Strukturanaloga, zur Synthese von Sialinsäure-haltigen Oligosacchariden und deren Strukturanaloga, sowie zur Analyse von sialylierbaren Akzeptorverbin­ dungen mittels fluoreszierender Sialinsäurekonjugate.

Sialinsäuren wie z. B. die N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) spielen als Bestandteile von Glycoproteinen und Glycolipiden auf Zelloberflächen eine wichtige Rolle bei physiologisch und pathologisch relevanten Erkennungsprozessen, wie u. a. bei Ent­ zündungsvorgängen, bei der Regulation des Zellwachstums und der Zelldifferenzie­ rung, bei maligner Zellentartung und Metastasierung oder auch als Erkennungsdo­ mäne pathogener Viren und Bakterien, die damit das Immunsystem des Wirtsorga­ nismus unterlaufen (Rosenberg: Biology of the Sialic Acids, Plenum Press: New York 1995; Holzer et al., Glycoconjugate J. 1993, 10, 40-44; Paulson et al., Pure Appl. Chem. 1984, 56, 797-805). Zur Herstellung solcher komplexen Kohlenhydratstrukturen ha­ ben sich chemische Synthesen insbesondere bei der Einführung der Sialinsäure­ gruppierung wegen der Notwendigkeit zeitaufwendiger und kostspieliger Schutz­ gruppenmanipulationen als wenig effizient erwiesen (Okamoto et al., Tetrahedron 1990, 46, 5835-5857; DeNinno, Synthesis 1991, 583-593). Eine wertvolle Alternative zu chemischen Synthesen bieten enzymatische Glycosylierungsverfahren, die wegen der Fortschritte bei der Klonierung von Glycosyltransferasen zunehmend an Bedeutung gewinnen. Für derartige enzymatischen Verfahren werden aktivierte Zuckernukleo­ tide benötigt, im Fall von sialinsäurehaltigen Oligosacchariden sind dies die Cytidin- 5'-monophospho-N-Acetylneuraminsäure (CMP-Neu5Ac) bzw. davon abgeleitete, im Sialatfragment entsprechend modifizierte strukturanaloge Derivate.

Die Umsetzung von Neu5Ac oder deren Derivaten zu CMP-aktivierten Zuckern un­ ter Verbrauch von CTP wird durch Enzyme der Klassifizierung EC 2.7.7.43 kataly­ siert, den sogenannten CMP-Sialat-Synthetasen. Hierzu werden vorwiegend Enzyme aus bestimmten tierischen Geweben wie z. B. Kalbshirn verwendet, worin allerdings die Synthetasen nur in geringer Konzentration enthalten und daher nur in kleinen Mengen bei hohem Trennaufwand zugänglich sind (Tabelle 1). Die spezifische Akti­ vität gereinigter tierischer Synthetasen ist mit 0.2 U/mg sehr gering und ihre Stabili­ tät unbefriedigend, was ihren Einsatz für präparative Synthesen stark beschränkt.

Tabelle 1. Vorkommen tierischer CMP-Sialat-Synthetasen

Die CMP-Sialat-Synthetase aus dem pathogenen Mikroorganismus Escherichia coli K- 235 ist bislang das einzige für Syntheseanwendungen untersuchte bakterielle Enzym (Shen et al., Biocatalysis 1992, 6, 31-42; Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3901-­ 3910). Diese rekombinant produzierte CMP-Sialat-Synthetase ist kommerziell er­ hältlich (Calbiochem-Novabiochem Corp., USA), weist aber in gereinigter Form nur eine geringe spezifische Aktivität von ca. 3 U/mg auf. Die präparative Nutzung des Enzyms ist in der Anwendungsbreite stark beschränkt, da es außer der Neu5Ac nur wenige, vorwiegend an C-9 modifizierte Strukturen akzeptiert (Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3901-3910) (Tabelle 2).

Tabelle 2. Tolerable Substratmodifikation der CMP-Sialat-Synthetase aus E. coli

Weitere Verbindungen mit Substitution von NHAc an C-5 durch N₃, OH, F oder H sowie Substitution von OH an C-7 durch F waren inaktiv.

Kürzlich wurde auch die Klonierung des Strukturgens einer CMP-Sialat-Synthetase aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B beschrieben (Edwards et al., FEMS Microbiol. Lett. 1992, 75, 161-166; Ganguli et al., J. Bacteriol. 1994, 176, 4583-4589), jedoch konnte das dadurch kodierte Enzym nur unter hohen Verlusten gereinigt werden. Bei der Klonierung des Gens einer CMP-Sialat-Synthetase aus Neisseria meningitidis der Serogruppe Y (Gilbert et al., Biotechnol. Lett. 1997, 19, 417-420) wurde nur ein gentechnisch modifiziertes Protein erzeugt, das von der natürlichen Aminosäuresequenz durch einen sogenannten "4-His-Tail" abweicht. Für die Neisseria-Enzyme wurden Synthetase-Aktivitätsausbeuten im Rohextrakt von nur ca. 1 U/mg erreicht. In allen Fällen wurden jedoch weder das Substratspektrum der Enzyme noch deren Brauchbarkeit für präparative Synthesen untersucht. Eine Über­ sicht über die Produktivität bekannter Expressionssysteme für bakterielle CMP- Sialat-Synthetasen gibt Tabelle 3.

Tabelle 3. Expression bakterieller CMP-Sialat-Synthetasen

Ziel der Erfindung ist daher ein Produktionsverfahren für eine CMP-Sialat-Syntheta­ se mit im Vergleich zu den bisher bekannten Enzymen aus Tieren oder Bakterien er­ heblich verbesserter Zugänglichkeit, sowie im Hinblick auf enzymkatalysierte Syn­ thesereaktionen einer signifikant höheren spezifischen Aktivität, deutlich breiteren Substrattoleranz und befriedigender Stabilität.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen re­ kombinanten Expressionsvektors CMP-Sialat-Synthetase effizient produziert werden kann. So ist insbesondere der Expressionsvektor pKKCMP nachstehender Sequenz zur Herstellung der CMP-Sialat-Synthetase aus Neisseria meningitidis Serogruppe B geeignet.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit

• (1) ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit CMP-Sialat-Synthetase (nachfolgend "Synthetase" genannt) Aktivität umfassend das Kultivieren eines pro­ kariotischen Wirtsorganismus, der mit einem Expressionsvektor, der ein die Synthe­ tase codierendes Strukturgen enthält, transfofmiert ist, wobei in dem Expressions­ vektor sich das Startcodon des die Synthetase codierenden Strukturgens 8 bis 12 Basen stromabwärts einer ribosomalen Bindungsstelle befindet;
• (2) den in (1) definierten Vektor zur Expression eines Proteins mit Synthetase-Aktivi­ tät;
• (3) Verwendung der durch das Verfahren gemäß (1) erhältlichen Synthetase zur Herstellung von Cytidinmonophosphat-aktivierten, strukturanalogen Derivaten der N-Acetylneuraminsäure, wobei die strukturanalogen Derivate der N-Acetyl­ neuraminsäure in Gegenwart der Synthetase und Cytidintriphosphat zur Reaktion gebracht werden;
• (4) Verwendung der durch das Verfahren gemäß (1) erhältlichen Synthetase zur Herstellung von nicht-natürliche Sialinsäuren enthaltenden Oligosacchariden und Glycokonjugaten, wobei die nicht-natürlichen Derivate und Analoga der N-Acetyl­ neuraminsäure in Gegenwart von als Sialylakzeptoren geeigneter Oligosaccharide oder Glycokonjugate, der Synthetase und Cytidintriphosphat zur Reaktion gebracht werden;
• (5) cytidinmonophosphataktivierte Derivate der N-Acetylneuraminsäure der For­ meln (I) bis (III) und (V)wie nachfolgend definiert; und
• (6) Verwendung der gemäß (1) erhältlichen Synthetase zum Nachweis von Sialyl- Akzeptorverbindungen, umfassend
• - Umsetzen einer fluoreszierenden Sialinsäure-Ausgangsverbindung mit der Synthe­ tase in Gegenwart von Cytidintriphosphat, der nachzuweisenden Akzeptorverbin­ dung und einer Sialyltransferase, und
• - Nachweis der fluoreszenzmodifizierten Akzeptorverbindung mittels eines selekti­ ven chromatografischen Trennverfahrens.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren (1) ist der rekombinanten Expressionsvektors, der das für die Synthetase kodierende DNA-Fragment maßgeschneidert so mit der Ribosomenvindungssequenz bzw. mit der Promotor- und Ribosomenbindungsse­ quenz kombiniert, daß in einem geeigneten Wirtsorganismus hohe Ausbeuten an Synthetase-Aktivität im Zellextrakt (z. B. 20 U/mg Protein) erreicht werden. Die so erzeugte Synthetase kann für Anwendungszwecke leicht aufgereinigt werden durch ein zweistufiges Reinigungsverfahren, welches das Enzym in hoher Ausbeute, frei von störenden Nebenaktivitäten und mit hoher spezifischer Aktivität liefert (z. B. ³134 U/mg Protein).

In dem erfindungsgemäßen Vektor beträgt der Abstand zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startcodon vorzugsweise 10 Basen. Die bevorzugte Sequenz dieser 10 Basen ist vorzugsweise die in SEQ ID NO:5 gezeigte Sequenz 5'- AACAGAATTC, jedoch auch in 1- bis 3-Positionen modifizierte Analoga dieser Se­ quenz sind einsetzbar.

Der erfindungsgemäße Vektor kann weiterhin andere funktionelle Sequenzab­ schnitte wie z. B. Promotorsequenzen, Terminatorsequenzen, Resistenzgene und für Sekretionsproteine codierende Sequenzen umfassen. Ein bevorzugter Promotor ist der tac-Promotor.

Das die Synthetase codierende Strukturgen stammt vorzugsweise aus Neisseria meningitis der Serogruppe B und codiert besonders bevorzugt das in SEQ ID NO:4 gezeigte Enzym der Klassifizierung EG 2.7.7.43 mit Synthetase-Aktivität bzw. ein Mutein dieses Enzyms. Als "Mutein" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind da­ bei Enzyme zu verstehen, die vergleichbare Aktivität wie der in SEQ ID NO:4 ge­ zeigte Wildtyp aufweisen, insbesondere Muteine in denen ausgehend vom Wildtyp homologe Aminosäureaustausche vorgenommen wurden. Besonders bevorzugt ist, daß der Vektor die in SEQ ID NO:3 gezeigte Sequenz aufweist.

Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor der durch

• - Modifizieren des kodierenden Stukturgens siaB mit der SEQ ID NO:3 aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B mittels PCR-Primern entsprechend der SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2,
• - EcoRI- und Xmal-Restriktionsverdau des modifizierten Strukturgens und
• - Einfügen des verdauten Strukturgens in die EcoRI- und Xmal-Schnittstellen des kommerziellen cyclischen Vektors pKK223-3 erhältlich ist. Hierdurch entsteht der besonders bevorzugte Expressionsvektor pKKCMP (Abb. 1). Als Wirtsorganismen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Prokarioten, insbesondere E. coli besonders bevorzugt.

Der Aspekt (3) der Erfindung betrifft die Verwendung der Synthetase für die Her­ stellung von CMP-Neu5Ac aus CTP und Neu5Ac, sowie für die Herstellung von ent­ sprechend CMP-aktivierten, strukturell breit modifizierbaren Derivaten und Analo­ ga der Neu5Ac. Besonders vorteilhaft kann dieses Verfahren für die Synthese von Sialinsäure-haltigen Glycokonjugaten genutzt werden, wobei die Herstellung von derartigen CMP-aktivierten Sialinsäuren in Gegenwart einer Sialyltransferase und einer geeigneten Sialyl-Akzeptorverbindung erfolgt. Daraus resultierende Oligosac­ charide und Glycokonjugate, die nicht-natürliche Derivate und Analoga der Sialin­ säure enthalten, sind von therapeutischem Interesse wegen ihrer metabolischen Sta­ bilität gegen den Abbau durch Sialidasen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Synthetase zur Her­ stellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) verwendet:

sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon, worin
CMP für den Cytidinmonophosphatrest steht und
R¹ bis R⁵ gleich oder verschieden sein können und für Wasserstoff, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Alkyloxy, Azido, Alkanoylamino, Alkenoylamino, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Alkyloxycarbonyl, Alkyliden, Oxo, oder ein Carbobenzoxy(Cbz)-, tert-Butyloxycarbonyl(Boc)- oder Allyloxycarbonyl(Alloc)- geschütztes Amin, oder für einen Glycosyloxy- oder Glycosyloxymethylrest stehen.

Die Verbindungen der Formel (I) enthalten mehrere Stereozentren. Sie können daher in stereoisomeren Formen existieren, die sich wie Diastereomere verhalten. Die Er­ findung betrifft sowohl die reinen Diastereomere als auch deren jeweilige Mischun­ gen.

Verfahrenstechnisch akzeptable Salze sind solche, die als Gegenion einwertige Ka­ tionen wie Alkali- oder Tetraalkylammoniumionen, oder protonierte Stickstoffbasen enthalten.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin
R¹ oder R⁵ für Alkanoylamino, Alkenoylamino, Azido, Hydroxy, Wasserstoff oder ein Carbobenzoxy(Cbz)-, tert-Butyloxycarbonyl(Boc)- oder Allyloxycarbonyl(Alloc)- geschütztes Amin stehen,
R² und R³ für Wasserstoff stehen und
R⁴ für Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl steht;
sowie Verbindungen der Formel (II),
R¹ für Alkanoylamino, Alkenoylamino, Azido, Hydroxy, Wasserstoff oder ein Car­ bobenzoxy(Cbz)-, tert-Butyloxycarbonyl(Boc)- oder Allyloxycarbonyl(Alloc)-ge­ schütztes Amin, oder für einen Glycosyloxy- oder Glycosyloxymethylrest steht und R² für Wasserstoff steht.

"Alkyl" als eigener Substituent oder als Teil anderer Reste wie Hydroxyalkyl, Alkyl­ oxy, Alkyliden, Arylalkyl, Alkanoylamido, oder AIkyloxycarbonyl bedeutet einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkanrest mit bis zu 8, bevorzugt bis zu 4 und besonders bevorzugt bis zu 2 Kohlenstoffatomen.

"Alkenyl" als eigener Substituent oder als Teil anderer Reste wie Arylalkenyl oder Alkenoylamido bedeutet einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alken- oder Alkadienrest mit bis zu 8, bevorzugt bis zu 4 und besonders bevorzugt bis zu 2 Kohlenstoffatomen.

"Alkinyl" steht für einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkinrest mit bis zu 8, bevorzugt bis zu 5 und besonders bevorzugt bis zu 3 Kohlenstoffatomen.

"Aryl" als eigener Substituent oder als Teil anderer Reste wie Arylalkyl oder Arylal­ kenyl steht für einen Arylrest oder Heteroarylrest mit bis zu 10, bevorzugt bis zu 6 Kohlenstoff-, beispielsweise für Phenyl, oder Kohlenstoff- und Stickstoffatomen, bei­ spielsweise für Pyridinyl.

"Glycosyl" als eigener Substituent oder als Teil anderer Reste wie Glycosyloxymethyl steht für einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Zuckerrest mit bis zu 9 und be­ sonders bevorzugt bis zu 6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise für Glucopyranosyl, Mannopyranosyl, Galactopyranosyl. Einzelne oder mehrere Hydroxygruppen in den Glycosylresten können ausgetauscht sein gegen Wasserstoff, Carboxy oder Alka­ noylamino, wie in Rhamnopyranosyl, Fucopyranosyl, 2-Acetylamino-2-desoxy­ glucopyranosyl, 2-Acetylamino-2-desoxygalactopyranosyl oder Glucuronopyrano­ syl.

Weiterhin wird die erfindungsgemäße Synthetase zur Herstellung von Verbindun­ gen der allgemeinen Formeln (III), (IV) oder (V) verwendet:

sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon, worin CMP für den Cytidinmonophosphatrest steht und R¹ für eine fluoreszierende Gruppe steht,
R² für Alkanoylamino, Hydroxy oder Wasserstoff steht,
X für einen Sauerstoff oder eine NH-Gruppe steht und
Sp für eine Valenz oder einen divalenten Rest wie Alkyl, Alkylcarbonyl, Carbamoy­ lalkyl, Carbamoylalkylcarbonyl, (Alkyloxy)_n-alkyl oder (Alkyloxy)_n-alkylcarbonyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 0 bis 5 annehmen kann.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (III), (IV) oder (V), worin
R¹ für Acridonyl, Dansyl, Fluoresceinylamino oder Fluoresceinylcarboxamido steht,
R² für Alkanoylamino, Hydroxy oder Wasserstoff steht,
X für eine NH-Gruppe steht und
Sp für einen divalenten Rest wie Alkylcarbonyl, Carbamoylalkylcarbonyl oder (Alkyloxy)_n-alkylcarbonyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 1 oder 2 steht, sowie Verbindungen der Formeln (III), (IV) oder (V),worin
R¹ für Acridonyl, Dansyl, Fluoresceinylamino oder Fluoresceinylcarboxamido steht,
R² für Alkanoylamino, Hydroxy oder Wasserstoff steht,
X für ein Sauerstoffatom steht und
Sp für einen divalenten Rest wie Alkyl, Carbamoylalkyl oder (Alkyloxy)_n-alkyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 1 oder 2 steht.

Die fluoreszierenden Gruppen Acridonyl, Dansyl, Fluoresceinylamino und Fluores­ ceinylcarboxamido weisen die folgenden Strukturen (A) bis (D) auf:

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Synthetase für den Nachweis von Sia­ lyl-Akzeptorverbindungen durch Herstellung von CMP-aktivierten, fluoreszieren­ den Neu5Ac-Derivaten in Gegenwart einer Sialyltransferase und der Akzeptorver­ bindung mittels eines darauffolgenden Nachweises der fluoreszenz-modifizierten Akzeptorverbindung ist das intermediär auftretende CMP-aktivierte, fluoreszie­ rende Sialinsäurederivat vorzugsweise eine Verbindung mit der Formel (III), (IV) oder (V).

Figurenbeschreibung

Abb. 1.

Zusammenfassung der Klonierungsstrategie

Abb. 2. Schematische Darstellung der Konstruktion des Expressionsvektors zur Produktion der Synthetase durch gerichtete Insertion des mit den Primern CMP5/CMP3 vervielfältigten DNA-Fragments siaB (Kasten, ATG Startsignal bis TAA Stopcodon; SEQ ID NO:3) in den Vektor pKK223-3 durch Ligation zwischen die Restriktionsschnittstellen EcoRI und XmaI stromabwärts vom tac-Promotor (p_tac) und der ribosomalen Bindungsstelle (SD, unterstrichen).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung A. Produktion der Synthetase

Die Klonierung der CMP-Sialat-Synthetase erfolgt nach molekularbiologischen Stan­ dardverfahren, die in der Fachliteratur gut dokumentiert sind (Sambrook et al., Mo­ lecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York 1989; Gassen et al., PCR: Grundlagen und Anwendungen der Po­ lymerase-Kettenreaktion, Gustav Fischer Verlag: Stuttgart, Jena, New York 1994; Mullis et al., U.S. Patent 4 683 202, 1987) und problemlos von einschlägig ausgebilde­ ten Fachleuten nachgearbeitet werden können.

Mit Kenntnis der Sequenz (GenBank Accession Number NMM95053; SEQ ID NO:3) kann das für die erfindungsgemäße CMP-Sialat-Synthetase kodierende Gen siaB di­ rekt aus der genomischen DNA von Neisseria meningitidis Serotyp B oder aus einem das siaB-Gen enthaltenden Plasmid (z. B. pMF32.35, Frosch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 1669-1673) vervielfältigt und gezielt in einen geeigneten Expressi­ onsvektor eingebracht werden. Der kommerziell erhältliche Vektor pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Freiburg; GenBank Accession Number M77749) erlaubt die Re­ gelung der Proteinexpression über den tac-Promotor (Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 6929-6933). Dieser Promotor wird über den wirtszelleignen lac- Repressor reguliert und kann durch externe Zugabe von 0.1-5 mM nicht metaboli­ sierbarem Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zum Medium induziert wer­ den. Die Transkription der Fremd-DNA wird durch den starken ribosomalen Ter­ minator rrnB beendet. Darüber hinaus enthält der pKK223-3 ein Ampicillin-Resi­ stenzgen als Selektionsmarker zugunsten plasmidhaltiger Zellen, die auf einem Ampicillin-haltigen Nährmedium wachsen können. Als Wirtsstämme sind vorzugs­ weise E. coli-Stämme mit der lac Iq-Mutation wie z. B. E. coli JM105 (Pharmacia Biotech, Freiburg) oder E. coli Sure (Stratagene GmbH, Heidelberg) geeignet, da diese den lac-Repressor im Übermaß produzieren. Zur Expression wird das entspre­ chende Gen in die unmittelbar dem tac-Promotor und der Ribosomenbindungsstelle benachbarten ämultiple cloning site" (MCS) eingebaut, die zuvor mit Hilfe von orts­ spezifischen Restriktionsendonucleasen aufgeschnitten wird. Der Abstand des Start­ codons des zu exprimierenden Bakterien-Gens von der ribosomalen Bindungsstelle und die Sequenz der Basen sind dabei besonders kritisch (Kozak et al., Microbiol. Rev. 1983, 47, 1; Gold et al., Ann. Rev. Biochem. 1988, 57, 199). Im Falle des erfin­ dungsgemäßen Expressionsvektors pKKCMP wurden zur Genamplifikation die PCR-Primer CMP5 (SEQ ID NO:1) und CMP3 (SEQ ID NO:2) nachstehender Basen­ sequenz verwendet (Tabelle 4), mit deren Hilfe das siaB-Gen (SEQ ID NO:3) durch ortsspezifische Mutagenese an den Enden mit einer künstlichen Basensequenz so ergänzt wird, daß in gezielter Position neue Schnittstellen für zwei verschiedene Re­ striktionsendonucleasen eingeführt werden. Nach PCR-Vervielfältigung der Zielsequenz und enzymatischer Verkürzung der Enden durch EcoRI und XmaI-Ver­ dau wird das modifizierte Gen gerichtet zwischen die EcoRI- und XmaI-Schnittstellen der Vektor-MCS eingesetzt (Abb. 1 und 2).

Tabelle 4

Sequenzen der PCR-Primer

Nach Einbringen des Expressionsvektors in eine geeignete Wirtszelle und deren Vermehrung muß die im Zellinnern befindliche CMP-Sialat-Synthetase durch Zel­ laufschluß freigesetzt werden. Die Zerstörung der Zellwand kann mit unterschiedli­ chen Methoden erfolgen, wobei für größere Zellmengen mechanische Methoden wie z. B. Ultraschall, Druckentspannung oder die Naßvermahlung in einer Kugelmühle mit Glasperlen bevorzugt sind. Die resultierenden Enzymmengen bzw. -aktivitäten werden in Unit pro mg Protein angegeben. Ein Unit an CMP-Sialat-Synthetase-Akti­ vität katalysiert die Bildung von 1 µmol CMP-Neu5Ac aus CTP und Neu5Ac pro Minute bei einer Temperatur von 37°C und einem pH-Wert von 8.5. Die Abtrennung unerwünschter Begleitproteine zur Reinigung des gewünschten Proteins kann nach den verschiedenen physikalischen Eigenschaften wie Ladung, Größe, Hydrophobi­ zität etc. mittels Standardverfahren (Scopes: Protein Purification - Principles and Practice, Springer-Verlag: New York 1994) erfolgen.

Mit dem Expressionsvektor pKKCMP transformierte Zellen des Wirtsstamms E.coli JM105 produzieren bei Anwesenheit von 0.5 mM IPTG im Nährmedium die erfin­ dungsgemäße CMP-Sialat-Synthetase in Mengen von ca. 7500 U/l Kultur.

Nach Zellaufschluß durch Naßvermahlung enthält der Rohextrakt ³20 U/mg Protein, das durch Anionenaustauschchromatografie an DEAE-Sepharose (Pharmacia Bio­ tech, Freiburg) und selektive Fällung mit Ammoniumsulfat mit einer Gesamtausbeu­ te von ³85% leicht auf eine spezifische Aktivität von ³135 U/mg Protein gereinigt werden kann.

B. Herstellung von CMP-aktivierten Sialinsäuren und von Sialinsäure-haltigen Gly­ cokonjugaten

CMP-Sialat-Synthetasen katalysieren die Umsetzung von Sialinsäuren zu CMP-akti­ vierten Zuckern unter Verbrauch von CTP. Gemäß der Erfindung können bei Ver­ wendung der hier beschriebenen rekombinanten CMP-Sialat-Synthetase als Substrate Neu5Ac (5-Acetamido-3,5-didesoxy-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranulosonsäure) und davon abgeleitete Strukturanaloga mit unterschiedlichen Substituenten an den Kohlenstoffatomen C-4, C-5, C-6, C-7, C-8 und C-9 eingesetzt werden. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren können hierzu wahlweise einzelne oder mehrere Positionen durch gleichartige oder verschiedene Substituenten wie beispielsweise OH, Halogen, Azid, OR (R gleich Acyl-, niederkettige Alkyl- oder Arylreste), NHR oder NRR' (R gleich Acyl-, niederkettige Alkyl- oder Arylreste) ersetzt sein und sowohl in der natürlichen als auch einer epimeren, nicht der Neu5Ac ent­ sprechenden natürlichen Konfiguration auftreten. Besonders vorteilhaft sind solche Verbindungen, bei denen an C-5 oder C-7 über O- oder N-Atome kovalent Reste mit Fluoreszenz-Chromophoren oder mit selektiv reaktiven funktionellen Gruppen wie beispielsweise C=C-Doppelbindungen oder Carbonylgruppen angeknüpft sind.

Zur Vermeidung einer Inhibition der CMP-Sialat-Synthetase durch bei der Reaktion freigesetztes anorganisches Pyrophosphat (PP_i) wird der Reaktion vorzugsweise eine anorganische Pyrophosphatase (EC 3.6.1.1) zugesetzt. Dieses Enzym ist kommerziell erhältlich (z. B. Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim; Sigma, Deisenhofen) und katalysiert die Hydrolyse von Pyrophosphat zu Phosphat, das als schwerlösliches Magnesium-Ammonium-Salz gefällt und auf diese Weise aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden kann.

Die Reaktionstemperatur kann zwischen 10°C und 40°C variiert werden. Um hohe Umsatzgeschwindigkeiten bei hinreichender Enzym- und Substratstabilität zu ge­ währleisten, wird im allgemeinen bei 20°C bis 30°C gearbeitet, besonders vorteilhaft bei 25°C. Der pH-Wert der Reaktionslösung sollte für eine optimale Enzymaktivität bei pH 7.0 bis 9.0, vorzugsweise bei pH 8.5 liegen. Durch Zusatz eines Puffers (z. B. Tris-HCl) kann der gewählte pH-Wert für die Dauer der Reaktion annähernd kon­ stant gehalten und damit der im schwach Sauren (pH ²6.9) rasch einsetzende hydro­ lytische Zerfall des gebildeten CMP-Konjugats verhindert werden.

Für die Enzymaktivität der CMP-Sialat-Synthetase ist der Zusatz von zweiwertigen Metallsalzen wie Mg²⁺ oder Mn²⁺ entscheidend. Vorzugsweise wird Magne­ siumacetat oder -chlorid in einer Konzentration von 25 bis 100 mM verwendet. Um der Enzyminaktivierung durch Oxidation vorzubeugen, wird unter Zusatz von Thiolen gearbeitet (z. B. Mercaptoethanol, Cystein, Glutathion; vorzugsweise 0.2 mM Dithiothreitol).

CMP-Neu5Ac und entsprechende strukturanaloge Reaktionsprodukte können vor­ teilhaft durch fraktionierte Fällung mit Ethanol oder Größenausschlußchromatogra­ phie an BioGel P-2 (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) aufgereinigt und bei­ spielsweise als Natrium-Salze in fester Form isoliert werden (Higa et al., J. Biol. Chem. 1985, 260, 8838-8849; Simon et al., J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 7159-7163).

Die Anknüpfung einer Sialinsäure an eine geeignete Sialyl-Akzeptorverbindung er­ fordert die Übertragung der entsprechenden Sialinsäure von dem CMP-aktivierten Zucker auf die Glycosyl-Einheit des Akzeptors. Diese Art des Transfers wird von sogenannten Sialyltransferasen katalysiert, die zum Teil kommerziell erhältlich sind (Calbiochem-Novabiochem Corp., USA; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim). Sialyltransferasen übertragen Sialinsäure α-selektiv je nach ihrer Akzeptorspezifität auf terminale Galactose-, N-Acetylgalactosamin-, N-Acetylglucosamin- oder Sialin­ säure-Einheiten. Als geeignete Sialyl-Akzeptorverbindungen kommen somit Struk­ turen in Frage, die eine oder mehrere dieser terminalen Einheiten beinhalten, also Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Glycoproteine, Glycopeptide oder Glycolipide. In der Literatur sind eine Vielzahl verschiedener Sialyltransferasen beschrieben (Ichikawa et al., Anal. Biochem. 1992, 202, 215-238; Beyer et al., Advan­ ces in Enzymology 1981, 52, 28-44), die sich alle hinsichtlich ihres Ursprungs, ihrer Substratspezifität und der Position der von ihnen geknüpften Bindung unterschei­ den. Verschiedene α-2,3-, α-2,4-, α-2,6-, α-2,8- und α-2,9-Sialyltransferasen wurden isoliert und kloniert (Rosenberg: Biology of the Sialic Acids, Plenum Press: New York 1995, 69-96; Kleene et al., Biochim. Biophys. Acta 1993, 1154, 283-325), von denen bis­ her für Oligosaccharidsynthesen vorzugsweise α-2,3- und α-2,6-Sialyltransferasen eingesetzt wurden (Unverzagt et al., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9308-9309; van Dorst et al., Eur. J. Biochem. 1996, 242, 674-681; Gross et al., Biochemistry 1989, 28, 7386-7392). Die Substrattoleranz unterschiedlicher Sialyltransferasen für CMP-akti­ vierte Sialinsäuren, die im Sialatanteil strukturell verschiedenartig modifiziert sind, ist dokumentiert (Khan, O'Neill: Modern Methods in Carbohydrate Synthesis, Harwood Academic Publishers: Amsterdam 1996, 492-517).

Die enzymatische Herstellung von Sialinsäure-haltigen Glycokonjugaten kann prin­ zipiell auf zwei Wegen erfolgen, die sich nach ihrer diskontinuierlichen oder konti­ nuierlichen Verfahrensweisen unterscheiden. Nach der diskontinuierlichen Methode wird in einem ersten Schritt nach der oben beschriebenen Vorgehensweise zunächst die entsprechende Sialinsäure enzymatisch mit der erfindungsgemäßen CMP-Sialat- Synthetase unter Verbrauch von CTP aktiviert, das gebildete CMP-Konjugat wie beschrieben isoliert und anschließend in einem zweiten Schritt separat mit einer Sialyltransferase und der Sialylakzeptorverbindung zum Sialinsäure-haltigen Gly­ cokonjugat umgesetzt (Gross et al., Eur. J. Biochem. 1987, 168, 595-602; Weinstein et al., J. Biol. Chem. 1982, 257, 13845-13853; Higa et al., J. Biol. Chem. 1985, 260, 8838-­ 8849). Die Inhibierung der Sialyltransferase durch im Zuge der Reaktion entstehen­ des Cytidin-5'-monophosphat wird durch Zugabe einer alkalischen Phosphatase (EC 3.1.3.1; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim), verhindert (Unverzagt et al., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9308-9309), welche die Hydrolyse des Inhibitors zu Cyti­ din und Phosphat katalysiert.

Nach der kontinuierlichen Methode können die beiden separaten enzymatischen Schritte der CMP-Aktivierung und des Transfers einer Sialinsäure mittels eines Nucleotid-Regenerierungszyklus praktikabel gekoppelt werden (Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4698-4700; Wong et al., U.S. Patent 5 278 299, 1994). Aus­ gehend von der entsprechenden Sialinsäure, der Sialyl-Akzeptorverbindung, einer Sialyltransferase, anorganischer Pyrophosphatase, Phosphoenolpyruvat und kataly­ tischen Mengen an CMP und ATP, Pyruvatkinase (EC 2.7.1.40), Nucleosidmono­ phosphatkinase (EC 2.7.4.4) sowie der erfindungsgemäßen CMP-Sialat-Synthetase wird die CMP-aktivierte Sialinsäure in situ erzeugt und unter kontinuierlicher Rege­ nerierung von CMP zu CTP auf die Akzeptorverbindung übertragen.

C. Verwendung zur Analytik von sialylierbaren Akzeptorverbindungen

Ein besonderes Interesse bei der Herstellung von CMP-aktivierten Sialinsäuren und von Sialinsäure-haltigen Glycokonjugaten gilt durch Fluoreszenzgruppen modifi­ zierten oder radiomarkierten Strukturvarianten im Hinblick auf die Verwendung zur spezifischen Analytik von sialylierbaren Akzeptorverbindungen sowie für den hochempfindlichen Nachweis von Sialyltransferasen (Gross et al., Eur. J. Biochem. 1988, 177, 583-589; Brossmer et al., Methods Enzymol. 1994, 247, 177-193; Gross et al., Anal. Biochem. 1990, 186, 127-134).

Bekannte Verfahren zur Herstellung von fluoreszenz-markierten CMP-Sialinsäuren (z. B. CMP-9-Fluoresceinylamino-Neu5Ac bzw. CMP-5-Fluoresceinylaminoacetyl­ neuraminsäure) erlauben aufgrund der begrenzten Substratspezifität der bisher be­ kannten CMP-Sialat-Synthetasen keine direkte enzymatische CMP-Aktivierung von mit Fluoreszenzchiomophoren kovalent verknüpften Sialinsäuren. Statt dessen muß ausgehend von CMP-aktivierter 5-N-Aminoacetylneuraminsäure bzw. von CMP- aktivierter 5-N-Acetyl-9-amino-9-desoxy-neuraminsäure die Fluoreszenz-Markie­ rung auf chemischem Weg mit einem Amino-reaktiven Fluoreszenzfarbstoff einge­ führt werden (Brossmer et al., Methods Enzymol. 1994, 247, 177-193; Brossmer et al., DE Patent 40 09 630 C2). Eine direkte enzymatische Übertragung von derart modifi­ zierten Sialinsäuren auf geeignete Akzeptorverbindungen nach dem oben beschrie­ benen Regenerierungsverfahren ist damit nicht möglich.

Dagegen ist die erfindungsgemäße CMP-Sialat-Synthetase gut geeignet zur Herstel­ lung und zum Nachweis von Sialyl-Akzeptorverbindungen mit Hilfe fluoreszenz­ markierter Sialinsäuren nach den beiden oben beschriebenen Verfahrensweisen. Das fluoreszierende Sialinsäure-Derivat kann sowohl separat mit der CMP-Sialat-Synthe­ tase unter Verbrauch von CTP enzymatisch aktiviert und das fluoreszierende CMP- Konjugat isoliert werden, als auch nach der kontinuierlichen Methode in situ akti­ viert und in Gegenwart einer Sialyltransferase auf die nachzuweisende Akzeptor­ verbindung übertragen werden. Mittels einer geeigneten chromatographischen Trennung von nicht umgesetzten Edukten können damit fluoreszenzmarkierte Ak­ zeptorverbindungen durch Fluoreszenz-Detektion hochempfindlich nachgewiesen und quantifiziert werden.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Experimente und Beispiele näher erläutert.

Experimente

Klonierung der CMP-Sialat-Synthetase: Zur Expressions-Klonierung der CMP-Sialat- Synthetase wurde das siaB-Gen von Neisseria meningitidis Serogruppe B (B1940) aus dem Plasmid pMF32.35 (Frosch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 1669-1673) als Templat-DNA mit Hilfe der mutagenen PCR-Primer CMP3 und CMP5 (Tabelle 4) vom Start- bis zum Stopcodon amplifiziert. Für die PCR-Reaktion wurden folgende Reaktionsbedingungen gewählt: 120 s 95°C, dann Zugabe der Taq-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim); Denaturierung 60 s bei 94°C, Annealing 120 s bei 60°C, Extension 120 s bei 72°C (+3 s pro weiterem Zyklus). Nach insgesamt 25 Zyklen wurde noch 5 min bei 72°C inkubiert. Das PCR-Produkt hatte laut Analyse durch DNA-Elektrophorese die erwartete Länge von 687 bp. Zur Übersicht der Klonierungsstrategie siehe Abb. 1.

Gleichzeitig wurden damit die für den Restriktionsverdau und die anschließende Ligation mit dem Expressionsvektor notwendigen Restriktionsschnittstellen einge­ führt. Nach Behandlung mit Proteinase K (Sigma, Deisenhofen; Boehringer Mann­ heim GmbH, Mannheim) zur Zerstörung restlicher Polymerase wurden zur Erzeu­ gung überlappender Enden für die Ligation sowohl das PCR-Produkt als auch der Vektor pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Freiburg) mit den Restriktionsendonukleasen XmaI und EcoRI (Sigma, Deisenhofen; Promega Corp., USA; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) während einer Inkubationszeit von 2-3 h geschnitten. Für die Ligation wurde der geschnittene Vektor pKK223-3 zuerst mit alkalischer Phospha­ tase (Promega Corp., USA; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) am 5'-Ende dephosphoryliert und ein molares Verhältnis von Vektor zu Insert von ∼ 1 : 3 gewählt. Die Transformation des Ligationsprodukts in den E. coli-Stamm JM105 (Pharmacia Biotech, Freiburg) wurde nach gängigen Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York 1989). Um eine Selektion zugunsten Plasmid­ transformierter Zellen, die das Antibiotikumresistenzgen tragen, zu erreichen, wur­ den die Zellen zunächst in Vollmedium vorkultiviert und anschließend auf Ampicil­ lin-haltigen LB-Agarplatten ausgestrichen. Nach etwa 12-16 h wurden 6 zufällig gewählte Einzelklone (∅ = 2-3 mm) isoliert, jeweils in 200 ml LBA-Schüttelkulturen hochgezogen und nach Induktion mit IPTG auf die gewünschte Enzymaktivität hin untersucht. In Rohextrakten von 4 der 6 Klone war Synthetase-Aktivität im Assay nachweisbar, diese positiven Klone zeigten in der SDS-Polyacrylamidgelelektropho­ rese auch die erwartete Bande bei 24,800 Da. Als Blindprobe wurde der gentechnisch unveränderte Wirtsstamm JM105 herangezogen.

Fermentation: Die Anzucht des Expressionsstammes E. coli JM105/pKKCMP erfolgte in 1-l-Erlenmeyerkolben mit 200 ml Medium bzw. im Fermenter mit einem Arbeits­ volumen von 10 l. Das Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzung:
LBA (10 Liter): 100 g Pepton
50 g Hefeextrakt
50 g Natriumchlorid

Nach 20 min Sterilisieren bei 121°C wurde 1.0 g Ampicillin zugegeben, gelöst in 50 ml heißem Wasser. Zum Animpfen des Fermenters wurde eine 200 ml-Schüttelkultur verwendet, die mit E. coli JM105/pKKCMP beimpft und für ca. 8 h vorinkubiert worden war. Bei Erreichen einer optischen Dichte OD₆₀₀ von 1.0 wurden die heran­ wachsenden Zellen durch Zugabe von 1.2 g IPTG induziert.

Sofern nicht anders angegeben, wurden während der Fermentation folgende Para­ meter eingehalten:
Drehzahl: 600 rpm
Temperatur: 37°C
Luftdurchsatz: 6 l/min
Antischaum: Olivenöl (handelsüblich)
Kulturdauer: 12-15 h

Die Zellen wurden am Ende der logarithmischen Wachstumsphase mit Hilfe einer Durchlaufzentrifuge bei 13,000 rpm geerntet. Das Feuchtgewicht der Biomasse aus 10 l Fermentationsvolumen betrug 56 g. Der Zellaufschluß erfolgte durch Naßvermah­ lung in einer Kugelmühle (Disintegrator-S; Biomatik GmbH, Rodgau) mit Glasperlen (∅ = 0.1-0.2 mm; Biomatik GmbH, Rodgau) in Gegenwart von Benzonase (Merck KGaA, Darmstadt) zur Zerstörung von Nucleinsäuren.

Die nachfolgend angegebenen Reinigungsschritte wurden bei 4°C mit einem Präpa­ rationspuffer folgender Zusammensetzung durchgeführt:
Tris-HCl (pH 7.8): 20 mM
Magnesiumchlorid: 2 mM
Dithiothreitol: 0.02 mM

Zur Aufreinigung des Enzyms wurden eine Ionenaustauschchromatographie und eine fraktionierende Ammoniumsulfatfällung vorgenommen.

Ionenaustauschchromatographie: Der zellfreie Rohextrakt (1 l) wurde auf eine Su­ perFlo®250-Säule gepackt mit DEAE-Sepharose® Cl-6-B (Pharmacia Biotech, Freiburg) aufgebracht, die zuvor mit Präparationspuffer äquilibriert worden war. Nachdem ein Teil des Fremdproteins durch Spülen mit 0.05 M NaCl-haltigem Präpa­ rationspuffer abgetrennt war, wurde die CMP-Sialat-Synthetase durch einen linearen NaCl-Salzgradienten von 0.05-0.3 M in Präparationspuffer bei einer Flußrate von 2.5-­ 3.0 ml/min eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und direkt für die Ammoniumsulfatfällung eingesetzt.

Fraktionierende Ammoniumsulfatfällung: 935 ml der vorgereinigten Enzymlösung wurden bei 4°C unter Rühren mit festem, feingemahlenem Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung der Lösung von 50% versetzt. Nach 2 h wurde das ausgefallene Pro­ tein durch 30 min Zentrifugieren bei 20,000 g abgetrennt und das so erhaltene Pro­ teinpellet in 250 ml Präparationspuffer resuspendiert. Tabelle 5 zeigt eine Übersicht über die Ergebnisse der Aufreinigung.

Tabelle 5. Reinigung der Synthetase

Molekulargewichtsbestimmung: Eine GPC-Säule (5 × 80 cm) wurde mit Sephadex® G150 (Pharmacia Biotech, Freiburg) in 0.1 M NaCl enthaltendem Präparationspuffer gepackt und durch Elution von Dextranblau (2 MDa), Aldolase (161 kDa), BSA (66 kDa) und ATP (605 Da) geeicht. Die Größe der rekombinanten CMP-Sialat-Synthe­ tase wurde durch einen separaten Elutionslauf bestimmt. Das auf diesem Weg er­ mittelte Molekulargewicht beträgt 45,500 Da und belegt eindeutig, daß das im SDS- Gel mit einer Bande von ca. 24,800 Da erscheinende Enzym in aktiver Form als Di­ mer vorliegt.

Enzymaktivität und Substrataffinität K_m-Werte: Die Aktivität der CMP-Sialat-Syn­ thetase wurde anhand des stöchiometrisch entstehenden Äquivalents an Pyrophos­ phat bestimmt, das enzymatisch durch Zugabe von Pyrophosphatase zu zwei Äqui­ valenten Phosphat hydrolysiert und über den Phosphat-Assay nach Lanzetta (Lanzetta et al., Anal. Biochem. 1979, 100, 95-97) quantifiziert wurde. Dieses Verfah­ ren lieferte die gleichen Werte wie der modifizierte Thiobarbitursäure-Assay (Vann et al., J. Biol. Chem. 1987, 262, 17556-17562).

Die kinetischen Konstanten wurden mit dem gereinigten Enzym bestimmt. Die K_m- Werte für die natürlichen Substrate wurden für Neu5Ac zu 0.43 mM und für CTP zu 0.17 mM ermittelt. Damit weist die erfindungsgemäße CMP-Sialat-Synthetase eine deutlich höhere Affinität zu ihren Substraten auf als das kommerzielle Enzym aus E. coli mit 4.8 mM bzw. 1.99 mM (Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3901-3910).

pH-Optimum und Enzymstabilität: Zur Ermittelung des pH-Optimums wurde die Enzymaktivität der Synthetase bei 25°C zwischen pH 6.0 und pH 9.5 gemessen. Der präparativ nutzbare pH-Bereich mit einer Restaktivität von ca. 50% umfaßt den Be­ reich von pH 7.0-9.5 mit einem Maximum bei pH 8.5.

Die Lagerstabilität der Synthetase wurde an einer aufgereinigten Probe über einen Zeitraum von mehreren Wochen stichprobenartig mit dem Standardassay überprüft. Danach hatte die Synthetase nach Aufbewahrung bei 4°C während 18 Wochen eine Restaktivität von 80%.

Substratspektrum: Zur Ermittlung des Substratspektrums wurden exemplarisch eine Anzahl von strukturanalogen Derivaten des natürlichen Substrats Neu5Ac getestet. Dazu wurde das entsprechende Sialinsäurederivat (ca. 5 mg) in Gegenwart von CTP (ca. 5 mg) in MgCl₂-haltigem Tris-Puffer (je 50 mM) mit der CMP-Sialat-Synthetase und Pyrophosphatase (je 5 U und 1 U) bei 30°C inkubiert. Der Reaktionsverlauf wurde diskontinuierlich dünnschichtchromatografisch kontrolliert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt.

Tabelle 6. Substratspektrum der CMP-Sialat-Synthetase

Eine Anzahl dieser Strukturanaloga wurde zusätzlich im präparativen Maßstab bei 25°C umgesetzt und die isolierten Reaktionsprodukte charakterisiert. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch manuelle Zugabe von 2.0 M NaOH konstant ge­ halten und der Verlauf der Reaktion dünnschichtchromatographisch in konz. Am­ moniak-Ethanol (1 : 1, v/v) verfolgt. Nach ca. 2 h war ein vollständiger Umsatz er­ reicht. Nach Abfiltrieren des gebildeten Phosphatniederschlags wurde das Produkt durch Zugabe von Ethanol (9 : 1, v/v) ausgefällt und im Vakuum getrocknet.

Beispiel 1 Cytidin-5'-monophospho-5-acetamido-3,5-didesoxy-β-D-glycern-D-galacto- 2-nonulopyranulosonsäure (CMP-Neu5Ac)

Ansatz (2.5 ml):
40 mM Neu5Ac (0.1 mmol)
40 mM CTP (0.1 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
5 U anorganische Pyrophosphatase
50 U CMP-Sialat-Synthetase
Ausbeute 75 mg (quant.; Reinheit ≧ 88%).
R_f

-Wert 0.67
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 7.97 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H6''), 6.13 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-5''), 6.00 (d, 1 H, J = 4.4 Hz, H-1'), 4.39-421 (m, 5 H, Ribose), 4.16 (dd, 1 H, J = 10.7 Hz, H-6), 4.09 (ddd, 1 H, J = 10.7, 4.7 Hz, H-4), 4.03-3.86 (m, 3 H), 3.66 (dd, 1 H, J = 12.1, 7.1 Hz, H-9a), 3.47 (d, 1 H, J = 9.7 Hz, H-7), 2.50 (dd, 1 H, J = 13.2, 4.7 Hz, H- 3eq), 2.07 (s, 3 H, CH₃

), 1.67 (ddd, 1 H, J = 13.1, 11.3, 5.7 Hz, H-3ax)
C₂₀

H₂₉

N₄

O₁₆

PNa₂

658.42 g/mol

Beispiel 2 Cytidin-5'-monophospho-N-Benzyloxycarbonylneuraminsäure (CMP- Neu5Cbz)

Ansatz (8.0 ml):
62.5 mM Neu5Cbz (0.5 mmol)
62.5 mM CTP (0.5 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

10 U anorganische Pyrophosphatase
200 U CMP-Sialat-Synthetase
Ausbeute 391 mg (93% d. Th.; Reinheit ≧ 89%)
R_f

-Wert 0.75
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 7.96 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-6''), 7.48-7.40 (m, 5 H, H_ar

Cbz), 6.11 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-5'') 5.99 (d, 1 H, J = 4.4 Hz, H-1'), 5.18 (d, 1 H, J = 12.5 Hz, H-11_b

Cbz), 5.11 (d, 1 H, J = 12.5 Hz, H-11_a

Cbz), 4.39-4.22 (m, 5 H, Ribose), 4.15 (dd, 1 H, J = 10.4 Hz, H-6), 4.07 (ddd, 1 H, J = 10.6, 4.7 Hz, H-4), 3.98-3.64 (m, 3 H), 3.59 (dd, 1 H, J = 11.8, 6.9 Hz, H-9a), 3.48 (d, 1 H, J = 9.6 Hz, H-7), 2.50 (dd, 1 H, J = 12.9, 4.7 Hz, H-3eq), 1.66 (ddd, 1 H, J = 12.9, 11.7, 5.5 Hz, H-3ax)
C₂₆

H₃₃

N₄

O₁₇

PNa₂

750.52 g/mol

Beispiel 3 Cytidin-5'-monophospho-N-Allyloxycarbonylneuraminsäure (CMP- Neu5Alloc)

Ansatz (4.0 ml):
175 mM Neu5Alloc (0.7 mmol)
175 mM CTP (0.7 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
15 U anorganische Pyrophosphatase
130 U CMP-Sialat-Synthetase
Ausbeute 524 mg (quant.; Reinheit ≧ 94%)
R_f

-Wert: 0.73
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 7.94 (d, 1 H, J = 7.4 Hz, H-6''), 6.12 (d, 1 H, J = 7.4 Hz, H-5''), 6.07-5.91 (m, 2 H, H-12 Alloc, H-1'), 5.35 (dd, 1 H, J = 17.5, 1.3 Hz, H-13_b

Alloc), 5.27 (dd, 1 H, J = 10.7, 1.3 Hz, H-13_a

Alloc), 4.68-4.52 (m, 2 H, H-11 Alloc), 4.40-4.23 (m, 5 H, Ribose), 4.22-3.62 (m, 6 H), 3.59 (d, 1 H, J = 9.6 Hz, H-7), 2.50 (dd, 1 H, J = 4.7 Hz, H-3eq), 1.65 (ddd, 1 H, H-3ax)
C₂₂

H₃₁

N₄

O₁₇

PNa₂

700.46 g/mol

Beispiel 4 Cytidin-5'-monophospho-N-Propionylneuraminsäure (CMP-Neu5Prop)

Ansatz (4.0 ml):
125 mM Neu5Prop (0.5 mmol)
125 mM CTP (0.5 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
15 U anorganische Pyrophosphatase
130 U CMP-Sialat-Synthetase
Ausbeute: 400 mg (99% d. Th.; Reinheit ≧ 83%)
R_f

-Wert: 0.67
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 7.94 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-6''), 6.12 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-5''), 6.00 (d, 1 H, J = 4.1 Hz, H-1'), 4.42-4.24 (m, 5 H, Ribose), 4.19 (dd, 1 H, J = 10.4 Hz, H-6), 4.13 (ddd, 1 H, J = 10.7, 4.6 Hz, H4), 4.04-3.88 (m, 3 H), 3.66 (dd, 1 H, J = 11.5, 6.3 Hz, H-9a), 3.49 (d, 1 H, J = 9.3 Hz, H-7), 2.53 (dd, 1 H, J = 12.9, 4.6 Hz, H- 3eq), 2.35 (q, 2 H, J = 7.6 Hz, H-11 Prop), 1.71 (ddd, 1 H, J = 12.9, 12.2, 5.8 Hz, H-3ax), 1.16 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, H-12 Prop)
C₂₁

H₃₁

N₄

O₁₆

PNa₂

672.45 g/mol

Beispiel 5 Cytidin-5'-monophospho-N-Acryloylneuraminsäure (CMP-Neu5Acryl)

Ansatz (4.0 ml):
87.5 mM Neu5Acryl (0.35 mmol)
87.5 mM CTP (0.35 mmol)
50 mM Tris-HCI (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
15 U anorganische Pyrophosphatase
130 U CMP-Sialat-Synthetase
Ausbeute 265 mg (98% d. Th.; Reinheit ≧ 87%)
R_f

-Wert: 0.69
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 7.95 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-6''), 6.34 (dd, 1 H, J = 17.0, 9.3 Hz, H-11 Acryl), 6.25 (dd, 1 H, J = 17.0, 1.9 Hz, H-12_a

Acryl), 6.12 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-5''), 6.00 (d, 1 H, J = 4.1 Hz, H-1'), 5.83 (dd, 1 H, J = 9.3, 1.9 Hz, H-12_b

Acryl), 4.40- 4.23 (m, 5 H, Ribose), 4.23 (dd, 1 H, J = 10.4 Hz, H-6), 4.17 (ddd, 1 H, J = 10.7, 4.4 Hz, H-4), 4.10-.87 (m, 3 H), 3.64 (dd, 1 H, J = 11.8, 6.6 Hz, H-9a), 3.48 (d, 1 H, J = 9.6 Hz, H-7), 2.54 (dd, 1 H, J = 13.2, 4.4 Hz, H-3eq), 1.71 (ddd, 1 H, J = 13.2, 12.0, 5.5 Hz, H­ 3ax)
C₂₁

H₂₉

N₄

O₁₆

PNa₂

670.43 g/mol

Beispiel 6 Cytidin-5'-monophospho-3-desoxy-(3-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyra­ nulosonsäure (CMP-KDN)

Ansatz (15.0 ml):
100 mM KDN (1.5 mmol)
100 mM CTP (1.5 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
25 U anorganische Pyrophosphatase
530 U CMP-Sialat-Synthetase
Ausbeute 783 mg (80% d. Th.; Reinheit ≧ 94%)
R_f

-Wert: 0.51
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 7.97 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-6''), 6.13 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-5''), 6.00 (d, 1 H, J = 4.4 Hz, H-1'), 4.40-4.22 (m, 5 H, Ribose), 4.13-3.66 (m, 6 H), 3.61 (dd, 1 H, J = 9.6 Hz, H-5), 2.45 (dd, 1 H, J = 13.2, 5.0 Hz, H-3eq), 1.63 (ddd, 1 H, J = 13.2, 12.3, 5.7 Hz, H-3ax)
C₁₈

H₂₆

N₃

O₁₆

PNa₂

617.37 g/mol

Beispiel 7 Cytidin-5'-monophospho-3-desoxy-β-D-galacto-2-octulopyranulosonsäure (CMP-4,6-bisepi-KDO)

Ansatz (6.0 ml):
167 mM 4,6-bisepi-KDO (1.0 mmol)
167 mM CTP (1.0 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 10 U anorganische Pyrophosphatase
530 U CMP-Sialat-Synthetase
Ausbeute 702 mg (97% d. Th.; Reinheit 82%)
R_f

-Wert: 0.51
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 7.97 (d, 1 H, J = 7.7 Hz, H-6''), 6.12 (d, 1 H, J = 7.7 Hz, H-5''), 6.00 (d, 1 H, J = 4.1 Hz, H-1'), 4.40-4.21 (m, 5 H, Ribose), 4.07-3.55 (m, 6 H), 2.44 (dd, 1 H, J = 13.1, 4.9 Hz, H-3eq), 1.62 (ddd, 1 H, J = 13.1, 12.5, 5.8 Hz, H-3ax)
C₁₇

H₂₄

N₃

O₁₅

PNa₂

587.34 g/mol

Beispiel 8 Cytidin-5'-monophospho-3,5-didesoxy-β-D-gluco-2-nonulopyranuloson­ säure (CMP-5deoKDN)

Ansatz (1.0 ml):
100 mM 5-Desoxy-KDN (0.1 mmol)
100 mM CTP (0.1 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
10 U anorganische Pyrophosphatase
100 U CMP-Sialat-Synthetase
R_f

-Wert: 0.58

Beispiel 9 Cytidin-5'-monophospho-3,5-didesoxy-β-D-galacto-2-nonulopyranuloson­ säure (CMP-5deo7epiKDN)

Ansatz (1.0 ml):
100 mM 5-Desoxy-7-epi-KDN (0.1 mmol)
100 mM CTP (0.1 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
10 U anorganische Pyrophosphatase
100 U CMP-Sialat-Synthetase
R_f

-Wert: 0.60

Beispiel 10 Cytidin-5'-monophospho-3-desoxy-β-D-glycero-D-gulo-2-nonulopyra­ nulosonsäure (CMP-5epiKDN)

Ansatz (1.0 ml):
100 mM 5-epi-KDN (0.1 mmol)
100 mM CTP (0.1 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
10 U anorganische Pyrophosphatase
100 U CMP-Sialat-Synthetase
R_f

-Wert: 0.53

Beispiel 11 Cytidin-5'-monophospho-3,5-didesoxy-5-[3-(fluoresceinyl-{5,6}-carba­ moyl)propanoyl]-amino-β-D-glycern-D-galacto-2-nonulopyranuloson­ säure (CMP-5-FCP-NeuAc)

Ansatz (1.0 ml):
100 mM 5-FCP-NeuAc (0.1 mmol)
100 mM CTP (0.1 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
10 U anorganische Pyrophosphatase
100 U CMP-Sialat-Synthetase
R_f

-Wert: 0.49

Beispiel 12 Cytidin-5'-monophospho-3,5-didesoxy-5-[2-(9-oxo-10-hydroacridin-10- yl)ethoxy]-acetamido-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranulosonsäure (CMP-5-Acridyl-NeuAc)

Ansatz (1.0 ml):
100 mM 5-Acridyl-NeuAc (0.1 mmol)
100 mM CTP (0.1 mmol)
50 mM Tris-HCl (pH 8.5)
50 mM MgCl₂

0.2 mM Dithiothreitol
10 U anorganische Pyrophosphatase
100 U CMP-Sialat-Synthetase
R_f

-Wert: 0.80

Anwendung zur Synthese von Sialoglycokonjugaten

Ansatz (1.5 ml):
20 mM N-Acetyllactosamin (30 µmol)
20 mM Sialinsäure (30 µmol)
200 mM HEPES (pH 7.8)
200 µM CMP (300 nmol)
20 µM ATP (30 nmol)
40 mM Phosphoenolpyruvat (60 µmol)
20 mM MgCl₂

(30 µmol)
5 mM MnCl₂

(8 µmol)
20 mM KCl (30 µmol)
4.5 Nucleosidmonophosphatkinase
60 U Pyruvatkinase
3 U anorganische Pyrophosphatase
250 mU CMP-Sialat-Synthetase
40 mU α-2,6-Sialyltransferase

Die Reaktionen wurden in verschließbaren Kunststoffreaktionsgefäßen angesetzt und 2 Tage lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (60 rpm) inkubiert. Die Sialyltransferase wurde in 2-3 anteiligen Portionen zugegeben und der Reaktions­ verlauf dünnschichtchromatografisch in n-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser (35 : 35 : 7 : 23, v : v : v : v) verfolgt.

Zur Aufarbeitung wurden die Enzyme und ausgefallene Phosphatsalze durch Ultra­ filtration entfernt. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer im Vakuum bei 30°C eingeengt, der verbleibende Feststoff in 0.5-1 ml Wasser aufgenommen und über eine BioGel P2-Säule (50 × 3 cm) chromatografiert. Produktfraktionen wurden dünn­ schichtchromatografisch detektiert, vereinigt und am Rotationsverdampfer im Va­ kuum bis zur Trockne eingeengt.

Beispiel 13 N-Propionyl-5-amino-3,5-didesoxy-α-D-glycern-D-galacto-2-nonulo­ pyranosylonsäure-(2,6)-β-D-galactopyranosyl-(1,4)-2-acetamido-2- desoxy-D-glucopyranose (Neu5Prop-α:-2,6-LacNAc)

Ausbeute 12.9 mg (72% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.33
¹

H-NMR (500 MHz; D₂

O): δ = 5.21 (d, 0.6 H, J = 2.8 Hz, H-1α), 4.76 (d, 0.4 H, J = 8.2 Hz, H-1β), 4.46 (2d, 1 H, J = 7.9 Hz, H-1'), 4.03-3.51 (m, 19 H), 2.68 (dd, 1 H, J = 12.2, 4.6 Hz, H-3''eq), 2.31 (q, 2 H, J = 7.6 Hz, H-11 Prop), 2.08 (s, 3 H, CH₃

), 1.73 (dd, 1 H, J = 12.2 Hz, H-3''ax), 1.12 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, H-12 Prop)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 181.82 (NAc''), 177.62 (NAc β), 177.36 (NAc α:), 176.47 (C-1''), 106.37 (C-1'), 103.06 (C-2''), 97.58 (C-1β), 93.46 (C-1α), 83.78/83.55 (C4), 77.43 (C-5β), 76.58, 75.47, 75.31, 74.59, 73.64, 72.89, 72.21, 71.30 (C-7''), 71.01 (C-4''), 66.26 (C- 6'), 65.51 (C-9''), 63.24 / 63.05 (C-6), 58.86 (C-2β), 56.32 (C-2α), 54.65 (C-5''), 43.02 (C- 3'') , 32.14 (C-11 Prop), 25.18 (CH₃

β), 24.88 (CH₃

α), 12.41 (C-12 Prop)
C₂₆

H₄₄

O₁₉

N₂

688.25 g/mol

Beispiel 14 N-Acryloyl-5-amino-3,5-didesoxy-α-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyrano­ sylonsäure-(2,6)-β-D-galactopyranosyl-(1,4)-2-acetamido-2-desoxy-D- glucopyranose (Neu5Acryl-α-2,6-LacNAc)

Ausbeute 13.7 mg (77% d. Th.)
R_f

Wert: 0.35
¹

H-NMR (500 MHz; D₂

O): δ = 6.29 (dd, 1 H,.J = 17.1, 9.8 Hz, H-11 Acryl), 6.22 (dd, 1 H, J = 17.1, 1.8 Hz, H-12_a

Acryl), 5.80 (dd, 1 H, J = 9.8, 1.8 Hz, H-12_b

Acryl), 5.21 (d, 0.5 H, J = 2.8 Hz, H-1α), 4.77 (d, 0.5 H, J = 8.2 Hz, H-1β), 4.47 (2d, 1 H, J = 7.9 Hz, H-1'), 4.06-3.52 (m, 19 H), 2.70 (dd, 1 H, J = 12.5, 4.6 Hz, H-3''eq), 2.09 (s, 3 H, CH₃

), 1.75 (dd, 1 H, J = 12.2 Hz, H-3''ax)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 177.65 (NAc β), 177.40 (NAc α), 176.47 (C-1''), 172.23 (NAc''), 132.57 (C-11 Acryl), 130.80 (C-12 Acryl), 106.39 (C-1'), 103.11 (C-2''), 97.58 (C- 1β), 93.48 (C-1α), 83.79/83.55 (C-4), 77.44 (C-5β), 76.59, 75.45, 75.29, 74.62, 73.63, 72.88, 72.23, 71.34 (C-7''), 71.12 (C4''), 66.29 (C-6'), 65.56 (C-9''), 63.06 (C-6), 58.84 (C- 2β), 56.32 (C-2α), 54.84 (C-5''), 42.95 (C-3'') , 25.20 (CH₃

β), 24.89 (CH₃

α)
C₂₆

H₄₂

O₁₉

N₂

686.24 g/mol

Beispiel 15 N-Benzyloxycarbonyl-5-amino-3,5-didesoxy-α-D-glycero-D-galacto-2- nonulopyranosylonsäure-(2,6)-β-D-galactopyranosyl-(1,4)-2-acetamido-2- desoxy-D-glucopyranose (Neu5Cbz-α-2,6-LacNAc)

Ausbeute 7.4 mg (37% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.63
¹

H-NMR (500 MHz; D₂

O): δ = 7.48-7.39 (m, 5 H, H_ar

Cbz), 5.21 (d, 0.2 H, J = 1.8 Hz, H- 1α), 5.16 (d, 1 H, J = 12.5 Hz, H-11_b

Cbz), 5.11 (d, 1 H, J = 12.5 Hz, H-11_a

Cbz), 4.77 (d, 0.3 H, H-1β), 4.46 (2d, 1 H, J = 7.9 Hz, H-1'), 4.02-3.80 (m, 9 H), 3.75-3.52 (m, 10 H), 2.66 (dd, 1 H, J = 12.5, 4.6 Hz, H-3''eq), 2.06 (s, 3 H, CH₃

), 1.71 (dd, 1 H, J = 12.2 Hz, H- 3''ax)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 177.88 (NAc β), 177.42 (NAc α), 176.49 (C-1''), 161.43 (NAc''), 139.41, 131.70, 131.29, 130.56 (Cbz), 106.37 (C-1'), 103.07 (C-2''), 97.60 (C-1β), 93.48 (C-1α), 83.72/83.51 (C-4), 77.27 (C-5), 76.60, 75.54, 75.31, 74.81, 73.62, 72.92, 72.23, 71.36 (C-7''), 69.93 (C-4''), 66.30 (C-6'), 65.68 (C-9''), 63.24/63.06 (C-6), 58.88 (C- 2β), 56.15 (C-2α), 55.63 (C-5''), 42.99 (C-3'') , 25.21 (CH₃

β), 24.89 (CH₃

α)
C₃₁

H₄₆

O₂₀

N₂

766.26 g/mol

Beispiel 16 3-Desoxy-α-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosylonsäure-(2,6)-β-D- galactopyranosyl-(1,4)-2-acetamido-2-desoxy-D-glucopyranose (KDN-α- 2,6-LacNAc)

Ausbeute 9.6 mg (58% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.33
¹

H-NMR (500 MHz; D₂

O): δ = 5.20 (d, 0.3 H, J = 3.1 Hz, H-1α), 4.75 (d, 0.2 H, J = 7.9 Hz, H-1β), 4.45 (2d, 1 H, J = 7.9 Hz, H-1'), 4.02-3.46 (m, 19 H), 2.63 (dd, 1 H, J = 12.2, 4.6 Hz, H-3''eq), 2.08 (s, 3 H, CH₃

), 1.66 (dd, 1 H, J = 12.2 Hz, H-3''ax)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 177.50 (NAc β), 177.27 (NAc σa), 176.61 (C-1''), 106.22 (C- 1'), 102.96 (C-2''), 97.56 (C-1β), 93.50 (C-1α), 83.37/83.22 (C-4), 77.51, 76.69, 76.42, 75.24, 75.07, 73.60, 73.04 (C-5''), 72.92, 72.19, 71.39 (C-7''), 71.04 (C-4''), 66.57 (C-6'), 65.57 (C-9''), 63.15/62.97 (C-6), 58.95 (C-2β), 56.45 (C-2α), 42.68 (C-3'') , 25.22 (CH₃

β), 24.92 (CH₃

α)
C₂₃

H₃₉

O₁₉

N₁

633.21 g/mol

Beispiel 17 3-Desoxy-α-D-galacto-2-octulopyranosylonsäure-(2,6)-β-D-galacto­ pyranosyl-(1,4)-2-acetamido-2-desoxy-D-glucopyranose (4,6-bisepi-KDO- α-2,6-LacNAc)

Ausbeute 9.0 mg (57% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.32
¹

H-NMR (500 MHz; D₂

O): δ = 5.21 (d, 0.3 H, J = 2.7 Hz, H-1α), 4.75 (d, 0.2 H, J = 7.9 Hz, H-1β), 4.45 (2d, 1 H, J = 7.9 Hz, H-1'), 4.01-3.45 (m, 19 H), 2.58 (dd, 1 H, J = 12.5, 4.6 Hz, H-3''eq), 2.08 (s, 3 H, CH₃

), 1.63 (dd, 1 H, J = 12.2 Hz, H-3''ax)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 177.52 (NAc β), 177.29 (NAc α), 176.64 (C-1''), 106.23 (C- 1'), 103.20 (C-2''), 97.59 (C-1β), 93.49 (C-1α), 83.40/83.23 (C-4), 77.51, 77.10, 76.72, 75.39, 75.26, 73.63, 73.12 (C-5''), 72.94, 72.71, 72.22, 71.781, 71.38, 66.44, 66.18, 63.00 (C- 6), 58.94 (C-2β), 56.44 (C-2α), 42.71 (C-3'') , 25.23 (CH₃

β), 24.94 (CH₃

α)
C₂₂

H₃₇

O₁₈

N₁

603.20 g/mol

Anwendung zum Nachweis von Sialylakzeptoren

Ansatz (150 µl):
1 mM N-Acetyllactosamin (150 nmol)
5 mM fluoreszierende Sialinsäure (750 nmol)
200 mM HEPES (pH 7.8)
50 µM CMP (7.5 nmol)
5 µM ATP (0.75 nmol)
10 mM Phosphoenolpyruvat (1.5 µmol)
20 mM MgCl₂

(3 µmol)
5 mM MnCl₂

(800 nmol)
20 mM KCl (3 µmol)
450 mU Nucleosidmonophosphatkinase
6 U Pyruvatkinase
300 mU anorganische Pyrophosphatase
25 mU CMP-Sialat-Synthetase
100 µU α-2,6-Sialyltransferase

Die Reaktionen wurden in verschließbaren Kunststoffreaktionsgefäßen angesetzt. Im Abstand von 10 min wurden 10 µl-Proben entnommen, diese jeweils 1 : 100 mit Wasser (Milli Q-Qualität) verdünnt, über 0.2 µm Membranen filtriert und mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel) oder HPLC auf den Umsatz hin untersucht.
Säulen: Nucleosil 5 µm, 250 mm × 4.6 mm C-18
Vorsäule: 20 mm × 2 mm C-18
Detektor: UV/Vis-Diodenarray-Detektor

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (19)

1. Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit CMP-Sialat-Synthetase ("Synthetase") Aktivität, umfassend das Kultivieren eines prokariotischen Wirtsorga­ nismus, der mit einem Expressionsvektor, der ein die Synthetase codierendes Struk­ turgen enthält, transformiert ist, wobei in dem Expressionsvektor sich das Startcodon des die Synthetase codierenden Strukturgens 8 bis 12 Basen stromabwärts einer ribosomalen Bindungsstelle befindet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Abstand zwischen der ribosomalen Bin­ dungsstelle und dem Startcodon 10 Basen beträgt, wobei die 10 Basen insbesondere die Sequenz 5'-AACAGAATTC aufweisen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Vektor weiterhin eine Promotor­ sequenz, insbesondere eine tac-Promotorsequenz umfaßt.

4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Struk­ turgen aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B stammt und insbesondere die in der SEQ ID NO:4 gezeigte Proteinsequenz oder ein Mutein derselben kodiert.

5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Vektor erhältlich ist durch

• - Modifizieren des kodierenden Stukturgens siaB mit der SEQ ID NO:3 aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B mittels PCR-Primern entsprechend der SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2,
• - EcoRI- und XmaI-Restriktionsverdau des modifizierten Strukturgens und
• - Einfügen des verdauten Strukturgens in die EcoRI- und XmaI-Schnittstellen des kommerziellen cyclischen Vektors pKK223-3.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Wirtsorga­ nismus in einem Fermenter in Gegenwart eines geeigneten Induktors angezüchtet, die Zellmasse von der Kulturflüssigkeit abgetrennt und das Enzym nach Zellauf­ schluß gewonnen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Enzym nach Zellaufschluß durch Chroma­ tografie an DEAE-Ionenaustauscher und fraktionierende Ammoniumsulfatfällung isoliert wird.

8. Vektor zur Expression eines Proteins mit Synthetaseaktivität, wie in Ansprüchen 1 bis 5 definiert.

9. Verwendung der durch das Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 8 erhältlichen Syn­ thetase zur Herstellung von Cytidinmonophosphat-aktivierten, strukturanalogen Derivaten der N-Acetylneuraminsäure, wobei die strukturanalogen Derivate der N- Acetylneuraminsäure in Gegenwart der Synthetase und Cytidintriphosphat zur Re­ aktion gebracht werden.

10. Verwendung der durch das Verfahren gemäß Ansprüche 1 bis 8 erhältlichen Syn­ thetase zur Herstellung von nicht-natürliche Sialinsäuren enthaltenden Oligosaccha­ riden und Glycokonjugaten, wobei die nicht-natürlichen Derivate und Analoga der N-Acetylneuraminsäure in Gegenwart von als Sialylakzeptoren geeigneter Oligo­ saccharide oder Glycokonjugate, der Synthetase und Cytidintriphosphat zur Reak­ tion gebracht werden.

11. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Derivate der N-Acetylneu­ raminsäure die allgemeinen Formel (I) oder (II) aufweisen
sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon,
in welcher CMP für den Cytidinmonophosphatrest steht und
R¹ bis R⁵ gleich oder verschieden sein können und für Wasserstoff, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Alkyloxy, Azido, Alkanoylamino, Alkenoylamino, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Alkyloxycarbonyl, Alkyliden, Oxo, oder ein Carbobenzoxy(Cbz)-, tert-Butyloxycarbonyl(Boc)- oder Allyloxycarbonyl(Alloc)- geschütztes Amin, oder für einen Glycosyloxy- oder Glycosyloxymethylrest stehen.

12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei in der Verbindung gemäß Formel (I) R¹ oder R⁵ für Alkanoylamino, Alkenoylamino, Azido, Hydroxy, Wasserstoff oder ein Carbobenzoxy(Cbz)-, tert-Butyloxycarbonyl(Boc)- oder Allyloxycarbonyl(Alloc)- geschütztes Amin steht,
R² und R³ für Wasserstoff stehen und
R⁴ für Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl steht.

13. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei in der Verbindung gemäß Formel (II) R¹ für Alkanoylamino, Alkenoylamino, Azido, Hydroxy, Wasserstoff oder ein Car­ bobenzoxy(Cbz)-, tert-Butyloxycarbonyl(Boc)- oder Allyloxycarbonyl(Alloc)-ge­ schütztes Amin, oder für einen Glycosyloxy- oder Glycosyloxymethylrest steht und R² für Wasserstoff steht.

14. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Derivate der N-Acetylneuraminsäure die allgemeinen Formeln (III), (IV) oder (V) aufweisen
sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon, worin CMP für den Cytidinmonophosphatrest steht,
R¹ für eine fluoreszierende Gruppe steht,
R² für Alkanoylamino, Hydroxy oder Wasserstoff steht,
X für einen Sauerstoff oder eine NH-Gruppe steht und
Sp für eine Valenz oder einen divalenten Rest wie Alkylen, Alkylcarbonyl, Carba­ moylalkyl, Carbamoylalkylcarbonyl, (Alkyloxy)_n-alkyl oder (Alkyloxy)_n-alkylcar­ bonyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 0 bis 5 annehmen kann.

15. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (III), (IV) oder (V)
R¹ für Acridonyl, Dansyl, Fluoresceinylamino oder Fluoresceinylcarboxamido steht,
R² für Alkanoylamino, Hydroxy oder Wasserstoff steht,
X für eine NH-Gruppe steht und
Sp für einen divalenten Rest wie Alkylcarbonyl, Carbamoylalkylcarbonyl oder (Alkyloxy)_n-alkylcarbonyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 1 oder 2 steht.

16. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (III), (IV) oder (V)
R¹ für Acridonyl, Dansyl, Fluoresceinylamino oder Fluoresceinylcarboxamido steht,
R² für Alkanoylamino, Hydroxy oder Wasserstoff steht,
X für ein Sauerstoffatom steht und
Sp für einen divalenten Rest wie Alkyl, Carbamoylalkyl oder (Alkyloxy)_n-alkyl steht,
wobei n für Zahlenwerte von 1 oder 2 steht.

17. Cytidinmonophosphataktivierte, strukturanaloge Derivate der N-Acetylneura­ minsäure der Formeln (I) bis (III) und (V), wie in Ansprüchen 11 bis 16 definiert.

18. Verwendung der gemaß Ansprüche 1 bis 8 erhältlichen Synthetase zum Nach­ weis von Sialyl-Akzeptorverbindungen, umfassend

• - Umsetzen einer fluoreszierenden Sialinsäure-Ausgangsverbindung mit der Synthe­ tase in Gegenwart von Cytidintriphosphat, der nachzuweisenden Akzeptorverbin­ dung und einer Sialyltransferase, und
• - Nachweis der fluoreszenzmodifizierten Akzeptorverbindung mittels eines selekti­ ven chromatografischen Trennverfahrens.

19. Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei das fluoreszierende Sialinsäure-Derivat aus den in Ansprüchen 13 bis 15 definierten CMP-aktivierte, fluoreszierende Sialin­ säure-Derivate der Formeln (III), (IV) oder (V) ausgewählt ist.