DE69529953T2

DE69529953T2 - Hitzebeständige rekombinante Enzyme für die Umsetzung von Maltose in Trehalose

Info

Publication number: DE69529953T2
Application number: DE69529953T
Authority: DE
Inventors: Michio Kubota; Toshiyuki Sugimoto; Keiji Tsusaki
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-10-01
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 2003-10-30
Anticipated expiration: 2015-09-30
Also published as: TW575665B; DK0704531T3; EP0704531A3; AU692298B2; DE69529953D1; US6165768A; IL115443A0; KR960014149A; KR100427529B1; JPH08149980A; EP0704531B1; EP0704531A2; US6087146A; ES2197182T3; TW493000B; US5773282A; JP3810457B2; AU3297595A; ATE234928T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges rekombinantes hitzebeständiges Enzym, das Maltose in Trehalose umwandelt.

Beschreibung des Stands der Technik

Trehalose ist ein Disaccharid, das aus 2 Glucosemolekülen besteht, die mit ihren reduzierenden Gruppen miteinander verbunden sind, und kommt in der Natur in Bakterien, Pilzen, Algen, Insekten etc. in extrem geringer Menge vor. Da Trehalose keinen reduzierenden Rest im Molekül besitzt, verursacht sie sogar bei Erhitzung in Gegenwart von Aminosäuren oder dergleichen keine unzufriedenstellende Bräunungsreaktion, und aus diesem Grund kann sie ohne Besorgnis, eine unzufriedenstellende Verfärbung und Beeinträchtigung hervorzurufen, vorteilhafterweise Lebensmittelprodukte süßen. Trehalose ist jedoch weit davon entfernt, ohne weiteres in gewünschter Menge durch herkömmliche Verfahren hergestellt zu werden und wird in der Tat kaum zum Süßen von Lebensmittelprodukten eingesetzt.
Die herkömmlichen Verfahren werden grob in 2 Gruppen unterteilt, d. h. in die eine, bei der Zellen von Mikroorganismen verwendet werden, und in die andere, bei der ein multienzymatisches System eingesetzt wird, wobei Enzymen erlaubt wird, auf Saccharide einzuwirken. Das erstere ist, wie im offengelegten japanischen Patent Nr. 154,485/75 geoffenbart, ein Verfahren, welches das Wachsenlassen von Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien und Hefepilzen, in einem Nährkulturmedium und das Sammeln von Trehalose aus der sich ergebenden Kultur umfasst. Das letztere ist, wie im offengelegten japanischen Patent Nr. 216,695/83 geoffenbart, ein Verfahren, welches das Bereitstellen von Maltose als Substrat, das Zulassen, dass ein multienzymatisches System unter Verwendung von Maltose- und Trehalose-Phosphorylasen auf Maltose einwirkt, und das Isolieren der gebildeten Trehalose aus dem Reaktionssystem umfasst. Obwohl ersteres das Wachstum von Mikroorganismen ohne besondere Schwierigkeit ermöglicht, hat es den Nachteil, dass die sich ergebende Kultur nur höchstens 15 Gew.-% Trehalose auf Trockensubstanzbasis (d.s.b.) enthält. Obwohl letzteres die Abtrennung von Trehalose mit relativer Leichtigkeit ermöglicht, ist es in der Theorie dennoch schwierig, die Trehaloseausbeute zu vergrößern, indem Enzymen erlaubt wird, in beträchtlich hoher Konzentration auf Substrate einzuwirken, da die enzymatische Reaktion an sich eine Gleichgewichtsreaktion von 2 verschiedenen Enzymarten darstellt und sich der Gleichgewichtspunkt stetig der Seite der Glucosephosphatbildung zuneigt.
In Anbetracht des Obenstehenden screenten die gegenwärtigen Erfinder eifrig Enzyme, die Maltose direkt in Trehalose umwandeln, und fanden heraus, dass zu den Gattungen Pimelobacter und Pseudomonas gehörende Mikroorganismen, wie in der japanischen Patentanmeldung Nr. 199,971/93 geoffenbart, ein absolut neuartiges Enzym produzieren, welches Trehalose bildet, wenn es auf Maltose einwirkt. Dies bedeutet, dass Trehalose aus Maltose als Material hergestellt werden kann, das leicht in großer Menge und zu geringen Kosten verfügbar ist, und die Verwendung des Enzyms alle vorgenannten Ziele komplett übertreffen würde.
Es wurde herausgefunden, dass alle Enzyme von diesen Mikroorganismen eine optimale Temperatur von etwa 20-44ºC haben, was angesichts deren Hitzebeständigkeit als einigermaßen unzureichend für die Trehaloseproduktion erscheint. Es wird auf diesem Gebiet erkannt, dass die Saccharifikation von Stärke und stärkeartigen Substanzen im Allgemeinen bei einer Temperatur über 55ºC umgesetzt werden sollte. Wird die Saccharifikationsreaktion bei einer Temperatur von 55ºC oder darunter durchgeführt, so wird die bakterielle Kontamination erhöht, um den pH der Reaktionsmischungen zu senken und die verwendeten Enzyme zu inaktivieren, gefolgt vom Intaktlassen einer relativ großen Menge von Substraten. Wird die Saccharifikationsreaktion unter Verwendung von Enzymen mit geringer Hitzebeständigkeit durchgeführt, so sollte hinsichtlich der pH-Veränderungen gut achtgegeben werden und, sobald eine Absenkung des pH-Werts eintritt, den Reaktionsmischungen rasch Laugen zur Steigerung des pH-Werts zugegeben werden.
In Anbetracht des Obenstehenden führten die gegenwärtigen Erfinder weitere Studien mit hitzebeständigen Enzymen mit einer solchen Wirkungsfähigkeit durch und fanden heraus, dass aus Mikroorganismen der Gattung Thermus, wie z. B. einem Mikroorganismus der Spezies Thermus aquaticus (ATCC 33923), hergestellte Enzyme wirksam Maltose in Trehalose umwandeln, ohne wesentlich inaktiviert zu werden, sogar wenn sie bei einer Temperatur über 55ºC umgesetzt werden. Diese Enzyme haben jedoch keine ausreichende Enzym-produzierende Wirkung, und dies führt zu dem Problem, dass eine Produktion von Trehalose im industriellen Maßstab unvermeidlich die Züchtung solcher Mikroorganismen in beträchtlich großem Umfang erfordert.
Die rekombinante DNA-Technologie erfuhr in den letzten Jahren einen bemerkenswerten Fortschritt. Derzeit kann sogar ein Enzym, von dem nicht die gesamte Aminosäuresequenz offengelegt ist, leicht in gewünschter Menge hergestellt werden, falls einmal ein das Enzym codierendes Gen isoliert und die Basensequenz decodiert wurde, indem eine rekombinante DNA, die eine das Enzym codierende DNA enthält, hergestellt wird, die rekombinante DNA in Mikroorganismen oder Pflanzen- oder Tierzellen eingeführt wird und die resultierenden Transformanten gezüchtet werden. Unter diesen Umständen ist es dringend erforderlich, ein das obenstehende hitzebeständige Enzym codierendes Gen zu finden und die Basensequenz zu decodieren.

Kurzfassung der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines rekombinanten hitzebeständigen Enzyms, das Trehalose bildet, wenn es auf Maltose einwirkt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung einer DNA, welche das rekombinante Enzym codiert.
Wiederum ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung einer replizierbaren rekombinanten DNA, welche die DNA besitzt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Transformanten, in welchen die rekombinante DNA eingeführt wurde.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung des rekombinanten Enzyms unter Verwendung des Transformanten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Umwandlung von Maltose in Trehalose durch das rekombinante Enzym.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Enzym bereit, das Maltose in Trehalose umwandeln kann und sogar, wenn es bei einer Temperatur über 55ºC inkubiert wird, nicht wesentlich inaktiviert wird, und das eine Aminosäuresequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus jenen, die nicht mit SEQ ID NO: 3 identisch sind, sondern Varianten von SEQ ID NO: 3 sind, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren gelöscht, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden; ohne die Eigenaktivität des Enzyms mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 zu verändern, und wobei das rekombinante Enzym nicht die Teilaminosäuresequenz Ala-Val-X-Tyr enthält, wobei X Phe oder Ile bedeutet.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte DNA bereit, welche ein rekombinantes Enzym, das Maltose in Trehalose umwandeln kann, codiert, welches Enzym sogar, wenn es bei einer Temperatur über 55ºC inkubiert wird, nicht wesentlich inaktiviert wird, und das eine Aminosäuresequenz besitzt; die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 und Varianten von SEQ ID NO: 3, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in SEQ ID NO: 3 gelöscht, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die Eigenaktivität des Enzyms mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 zu verändern.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine replizierbare rekombinante DNA bereit, welche einen selbstreplizierbaren Vektor und eine DNA, wie sie obenstehend definiert ist, enthält.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Transformanten bereit, welcher hergestellt wird, indem eine replizierbare rekombinante DNA, welche eine DNA, wie sie obenstehend definiert ist, und einen selbstreplizierbaren Vektor enthält, in einen geeigneten Wirt eingeführt wird.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Enzyms bereit, welches das Züchten eines Transformanten in einem Nährkulturmedium zwecks Bildung des Enzyms umfasst, welcher Transformant hergestellt wird, indem eine rekombinante DNA, welche sowohl einen selbstreplizierbaren Vektor als auch eine DNA, wie sie obenstehend definiert ist, enthält, in einen geeigneten Wirt eingeführt wird, sowie das Sammeln des gebildeten Enzyms aus der sich ergebenden Kultur.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Umwandlung von Maltose bereit, welches einen Schritt umfasst, in dem erlaubt wird, dass das obenstehend definierte, rekombinante Enzym auf Maltose einwirkt, um Trehalose zu bilden.

Kurze Beschreibung der angeschlossenen Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die optimale Temperatur eines von Thermus aquaticus (ATCC 33923) produzierten Enzyms.
Fig. 2 zeigt den optimalen pH eines von Thermus aquaticus (ATCC 33923) produzierten Enzyms.
Fig. 3 zeigt die Hitzebeständigkeit eines von Thermus aquaticus (ATCC 33923) produzierten Enzyms.
Fig. 4 zeigt die pH-Stabilität eines von Thermus aquaticus (ATCC 33923) produzierten Enzyms.
Fig. 5 zeigt die Struktur der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA pBTM22.
Fig. 6 zeigt die Struktur der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA pBTM23.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße rekombinante Enzym wirkt auf Maltose ein, um Trehalose zu bilden, ohne wesentlich inaktiviert zu werden, sogar wenn erlaubt wird, dass es bei einer Temperatur über 55ºC reagiert.
Die erfindungsgemäße DNA exprimiert die Produktion des vorliegenden rekombinanten Enzyms, wenn sie in einen geeigneten selbstreplizierbaren Vektor eingeführt wird, um eine replizierbare rekombinante DNA zu erhalten, wonach sie zwecks Bildung eines Transformanten in einen geeigneten Wirt eingeführt wird, der selbst nicht in der Lage ist, das rekombinante Enzym zu bilden, jedoch leicht wuchert.
Die erfindungsgemäße rekombinante DNA exprimiert die Produktion des rekombinanten Enzyms, indem sie zwecks Bildung eines Transformanten in einen geeigneten Wirt eingeführt wird, welcher selbst nicht in der Lage ist, das rekombinante Enzym zu bilden, jedoch leicht wuchert, und der Transformant in einem Nährkulturmedium gezüchtet wird.
Der Transformant bildet bei erfindungsgemäßer Kultivierung eine gewünschte Menge des rekombinanten Enzyms.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur enzymatischen Umwandlung wandelt Maltose in eine Trehalose, Glucose und/oder Maltooligosaccharide umfassende Saccharidzusammensetzung um.
Die vorliegende Erfindung wurde gemacht auf Basis der Entdeckung eines absolut neuartigen hitzebeständigen Enzyms, das Maltose in Trehalose umwandelt. Ein solches Enzym kann aus Kulturen von Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnen werden, und die gegenwärtigen Erfinder isolierten das Enzym unter Anwendung einer Vielfalt von Verfahren, die als Haupttechnik die Säulenchromatographie umfassen, und studierten die Eigenschaften und Merkmale, wobei sich herausstellte, dass die Realität ein Polypeptid mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften ist:
(1) Wirkung
bildet Trehalose, wenn es auf Maltose einwirkt, und umgekehrt;
(2) Molekülmasse (MW)
etwa 100.000-110.000 Dalton bei einer Analyse mittels
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE);
(3) isoelektrischer Punkt (pI)
etwa 3,8-4,8 bei einer Analyse mittels Isoelektrophorese;
(4) optimale Temperatur
etwa 65ºC bei 60-minütiger Inkubation bei pH 7,0;
(5) optimaler pH
etwa 6,0-6,7 bei 60-minütiger Inkubation bei 60ºC;
(6) Hitzebeständigkeit
stabil bis zu einer Temperatur von etwa 80ºC, sogar bei 60-minütiger
Inkubation bei pH 7,0; und
(7) pH-Stabilität
stabil bis zu einem pH von 5,5-9,5, sogar bei 60-minütiger Inkubation bei 60ºC.
Die Versuche zur Darlegung der physikalisch-chemischen Eigenschaften eines von Thermus aquaticus (ATCC 33923) produzierten, hitzebeständigen Enzyms sind wie folgt:

Versuch 1

Enzymreinigung

Versuch 1-1

Herstellung eines Enzyms

100 ml Aliquote eines flüssigen Nährmediums (pH 7,5), enthaltend 0,5 Gew.-% Polypepton, 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,07 Gew.-% Natriumnitrat, 0,01 Gew.-% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,02 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 Gew.-% Calciumchlorid und Wasser, wurden in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, und die Kolben wurden zwecks Durchführung der Sterilisation bei 120ºC 20 Minuten lang in einem Autoklaven behandelt. Nach dem Abkühlen der Kolben wurde in jeden Kolben eine Keimkultur von Thermus aquaticus (ATCC 33923) eingeimpft, gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation bei 60ºC unter Rühr- und Schüttelbedingungen von 200 rpm zum Erhalten einer Keimkultur. Zwanzig 1 Aliquote einer frischen Zubereitung desselben flüssigen Nährmediums wurden in 301- Flaschenfermenter gegeben, sterilisiert und auf 60ºC abgekühlt, gefolgt von der Einimpfung eines Vol.% der Keimkultur in jeden Fermenter und einer etwa 20-stündigen Inkubation des Resultats bei einem pH von 6,0-8,0 und 60ºC unter Durchlüftungs- und Rührbedingungen.
Daraufhin wurde die enzymatische Aktivität der sich ergebenden Kultur analysiert, wobei sich zeigte, dass sie etwa 0,35 Einheiten/ml Enzym enthielt. Ein Anteil der Kultur wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde analysiert, wobei sich zeigte, dass er etwa 0,02 Einheiten/ml Enzym enthielt. Währenddessen wurden die abgetrennten Zellen in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, um ein Gesamtvolumen zu ergeben, das dem ursprünglichen Volumen des Anteils entsprach, gefolgt von einer Analyse der Suspension, wobei sich zeigte, dass sie etwa 0,33 Einheiten/ml Enzym enthielt.
In der gesamten Beschreibung ist die Enzymaktivität durch den in der folgenden Analyse gemessenen Wert ausgedrückt: Man gebe ein ml eines 10 mM-Phosphatpuffers (pH 7,0), enthaltend 20 Gew.-% Maltose, in ein Teströhrchen, füge dem Röhrchen ein ml einer passend verdünnten Enzymlösung hinzu und inkubiere die Lösung in dem Röhrchen 60 Min. lang bei 60ºC, um eine enzymatische Reaktion zu bewirken, gefolgt von einer weiteren 10- minütigen Inkubation bei 100ºC, um die enzymatische Reaktion auszusetzen. Daraufhin wurde ein Anteil der Reaktionsmischung mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) 11-fach verdünnt, und davon wurden 0,4 ml in ein Teströhrchen gegeben und mit 0.1 ml einer Lösung, enthaltend eine Einheit/ml Trehalase, vermischt, gefolgt von einer 120-minütigen Inkubation der sich ergebenden Mischung bei 45.ºC und einer mengenmäßigen Bestimmung des Glucosegehalts mittels des Glucose-Oxidase-Verfahrens. Als Kontrolle wird ein System bereitgestellt, bei dem eine Trehalaselösung und eine Enzymlösung, die durch eine 10- minütige Erhitzung bei 100ºC inaktiviert wurde, verwendet werden, und wird gleichermaßen wie obenstehend behandelt. Der Anteil an gebildeter Trehalose ist abschätzbar auf Basis des obenstehend mengenmäßig bestimmten Anteils an Glucose. Eine Aktivitätseinheit des Enzyms wird als die Menge definiert, welche unter den obenstehenden Bedingungen ein uMol Trehalose pro Minute bildet.

Versuch 1-2

Enzymreinigung

Die im Versuch 1-1 erhaltene Kultur wurde zur Zelltrennung zentrifugiert, und etwa 0,28 kg der so erhaltenen nassen Zellen wurden in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, in üblicher Weise zerstört und zentrifugiert, um etwa 1,8 l Rohenzymlösung zu erhalten. Die Lösung wurde zur Erzielung einer Sättigung von 70 Gew.-% mit Ammoniumsulfat vermischt, durch Stehenlassen über Nacht bei 4ºC ausgesalzt und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand würde mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) vermischt, und die Mischlösung wurde gegen eine frische Zubereitung desselben Puffers 24 Stunden lang dialysiert.
Die dialysierte innere Lösung wurde zentrifugiert, um einen Überstand (1.560 ml) zu erhalten, der danach auf eine mit 530 ml "DEAE-TOYOPEARL® 650", einem von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, in den Handel gebrachten Ionenaustauscher, befüllte Säule aufgegeben wurde, die zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) equilibriert worden war, gefolgt vom Beschicken der Säule mit einem linearen Gradientenpuffer von Natriumchlorid, der von 0 M bis 0,4 M in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) reichte. Fraktionen mit der gegenständlichen Enzymaktivität wurden aus dem Eluat gesammelt, gepoolt, gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend ein M Ammoniumsulfat, 10 Stunden lang dialysiert und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde auf eine mit 380 ml "BUTYL-TOYOPEARL® 650", einem von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, in den Handel gebrachten Gel für die hydrophobe Chromatographie, befüllte Säule aufgegeben, die zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend ein M Ammoniumsulfat, equilibriert worden war, gefolgt vom Beschicken der Säule mit einem linearen Gradientenpuffer von Ammoniumsulfat, der von 1 M bis 0 M in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) reichte.
Fraktionen, die bei 0,2 M Ammoniumsulfat eluiert wurden und die gegenständliche Enzymaktivität hatten, wurden gesammelt, gepoolt und gegen 10 mM Phosphatpuffer tu 7,0), enthaltend 0,2 M Natriumchlorid, 16 Stunden lang dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und in eine mit 380 ml "TOYOPEARL® HW-555", einem von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, in den Handel gebrachten Gel für die Gelchromatographie, befüllt Säule gespeist, die zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,2 M Natriumchlorid, equilibriert worden war, gefolgt vom Beschicken der Säule mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend ein M Natriumchlorid. Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden aus dem Eluat gesammelt und in eine mit "MONO Q HR5/5" befüllte Säule gespeist, die mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) equilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem linearen Gradientenpuffer von Natriumchlorid, der von 0,1 M bis 0,35 M in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) reichte, beschickt, gefolgt vom Sammeln von Fraktionen mit der Enzymaktivität. Das so erhaltene, gereinigte Enzym hatte eine spezifische Aktivität von etwa 135 Einheiten/mg Protein bei einer Ausbeute von etwa 330 Einheiten pro 1 Kultur.
Das gereinigte Enzym wurde in einem 7,5 Gew.-%igen Polyacrylamidgel Elektrophorese-behandelt, um ein einzelnes Proteinband mit der Enzymaktivität zu ergeben, und dies bedeutete, dass es eine beträchtlich hohe Reinheit hatte.

Versuch 2

Physikalisch-chemische Eigenschaft des Enzyms

Versuch 2-1

Wirkung

Einer wässrigen Lösung, die als Substrat 5 Gew.-% Maltose oder Trehalose enthielt, wurden 2 Einheiten/g Substrat des im Versuch 1-2 erhaltenen, gereinigten Enzyms zugegeben, und die Mischung wurde bei 60ºC und pH 7,0 24 Stunden lang inkubiert. Zwecks Analyse der Saccharidzusammensetzung wurde die Reaktionsmischung in vacuo getrocknet, in Pyridin aufgelöst und in üblicher Weise trimethylsilyliert, und das Resultat wurde einer Gaschromatographie unterzogen. Die bei dieser Analyse eingesetzten Ausrüstungen und Bedingungen waren wie folgt: ein von Shimadzu Seisakusho, Ltd., Tokio, Japaxl, in den Handel gebrachter "GC-16A" als Gaschromatograph; eine Edelstahlsäule mit einem Innendurchmesser von 3 mm und einer Länge von 2 m, die mit von GL Sciences Inc., Tokio, Japan, in den Handel gebrachtem 2%igem "SILICONE OV-17/CHROMOSOLB W" befüllt ist, als Säule; eine wasserstoffflammenartige Ionisierung als Detektor; Stickstoffgas als Trägergas (Fließgeschwindigkeit: 40 ml/min); und eine Säulenofentemperatur von 160- 320ºC bei einer programmierten Temperaturanstiegsrate von 7,5ºC/min. Die Saccharidzusammensetzungen der Reaktionsmischungen wurden in Tabelle 1 tabellenförmig aufgelistet: Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 dargestellt, bildete das gereinigte Enzym etwa 70 Gew.-% Trehalose und etwa 4 Gew.-% Glucose, als es auf Maltose als Substrat einwirkte, während es etwa 21 Gew.-% Maltose und etwa 3 Gew.-% Glucose bildete, als es auf Trehalose als Substrat einwirkte. Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass das gereinigte Enzym Wirkungsfähigkeiten hinsichtlich des Umwandelns von Maltose in Trehalose und des Umwandelns von Trehalose in Maltose sowie hinsichtlich des Hydrolysierens einer α-1,4-Bindung in ein Maltosemolekül und einer α,α-1,1-Bindung in ein Trehalosemolekül besitzt. Es existiert kein Bericht über ein solches Enzym, und dies führt zur Einschätzung, hier einen neuartigen enzymatischen Weg vorliegen zu haben.

Versuch 2-2

Molekülmasse

Gemäß dem Verfahren, über das U. K. Laemmli in Nature, Band 227, S. 680-68 5 (1970) berichtete, wurde das gereinigte Enzym mittels einer Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Elektrophorese-behandelt, um in einer Position, die etwa 100.000-110.000 Dalton entsprach, ein einzelnes Proteinband zu ergeben. Die bei diesem Versuch verwendeten Markerproteine waren Myosin (MW = 200.000 Dalton), β-Galactosidase (MW = 116.250 Dalton), Phosphorylase B (MW = 97.400 Dalton), Serunalbumin (MW = 66.200 Dalton) und Ovalbumin (MW = 45.000 Dalton).

Versuch 2-3

Isoelektrischer Punkt

Bei einer Isoelektrophorese in 2 Gew.-% "AMPHOLINE®", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, in den Handel gebrachten Polyacrylamidgel, ergab das gereinigte Enzym einen isoelektrischen Punkt von etwa 3,8-4,8.

Versuch 2-4

Optimale Temperatur

Die optimale Temperatur des gereinigten Enzyms betrug, wie in Fig. 1 dargestellt, etwa 65ºC, wenn es in üblicher Weise in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) 60 Min. lang inkubiert wurde.

Versuch 2-5

Optimaler pH

Der optimale pH des gereinigten Enzyms betrug, wie in Fig. 2 dargestellt, etwa 6,0- 6,7, wenn es in üblicher Weise durch eine 60-minütige Inkubation bei 60ºC in 10 mM Acetatpuffer, Phosphatpuffer oder Natriumcarbonat/Natriumhydrogencarbonat-Puffer mit verschiedenen Pils getestet wurde.

Versuch 2-6

Hitzebeständigkeit

Das gereinigte Enzym war, wie in Fig. 3 dargestellt, bis zu einer Temperatur von etwa 80ºC stabil, wenn es in üblicher Weise durch eine 60-minütige Inkubation in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) getestet wurde.

Versuch 2-7

pH-Stabilität

Das gereinigte Enzym war, wie in Fig. 4 dargestellt, bis zu einem pH von etwa 5,5- 9,5 stabil, wenn es in üblicher Weise durch eine 60-minütige Inkubation bei 60ºC in 50 mM Acetatpuffer, Phosphatpuffer oder Natriumcarbonat/Natriumhydrogencarbonat-Puffer mit verschiedenen pHs experimentell untersucht wurde.

Versuch 2-8

Aminosäuresequenz, enthaltend den N-Terminus

Die den N-Terminus des gereinigten Enzyms enthaltende Aminosäuresequenz wurde mit einem "MODEL 470A", einem von Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norrwalk, USA, in den Handel gebrachten Gasphasen-Proteinsequenzierer, analysiert, und es stellte sich heraus, dass sie die den N-Terminus enthaltende Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 hatte:

Versuch 2-9

Teilaminosäuresequenz

Eine passende Menge des im Versuch 1-2 hergestellten, gereinigten Enzyms wurde gewogen, gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) 18 Stunden lang bei 4ºC dialysiert und mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) vermischt, um eine Lösung zu erhalten, die etwa ein mg/ml des Enzyms enthielt. Die Lösung wurde 5 Min. lang bei 100ºC inkubiert, um das Enzym zu denaturieren, und etwa ein ml davon wurde in ein Teströhrchen gegeben, mit 40 ug Lysylendopeptidase vermischt und bei 30ºC 44 Stunden lang inkubiert, um das Enzym teilweise zu hydrolysieren. Das sich ergebende Hydrolysat wurde auf eine "uBOND ASPERE C18", eine von Japan Millipore Ltd., Tokio, Japan, in den Handel gebrachte Säule für die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie, die mit 0,1 Vol.% Trifluoracetat equilibriert worden war, aufgegeben, gefolgt vom Beschicken der Säule mit 0,1 Vol.% acetonitrilhältigem Trifluoracetat mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min, während die Acetonitrilkonzentration von 0 Vol.% auf 70 Vol.% anstieg.
Fraktionen, die ein Peptidifagment enthielten, das etwa 58 bis 60 Minuten nachdem Beginn der Einspeisung eluiert wurde, wurden gesammelt, gepoolt, in vacuo getrocknet und in 0,5 ml eines 10 mM-Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) aufgelöst, mit 5 ug TPCK-behandeltem Trypsin vermischt und 16 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, um eine Hydrolyse zu bewirken. Die enzymatische Reaktion wurde durch Gefrieren ausgesetzt, und das resultierende Hydrolysat wurde in eine mit "uBONDASPERE C18" befüllte Säule eingespeist, gefolgt vom Beschicken der Säule mit 0,1 Vol.% Trifluoracetat, das wässriges Acetonitril enthielt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min. während die Konzentration des wässrigen Acetonitrils von 15 Vol.% auf 55 Vol.% anstieg. Fraktionen, die ein Peptidfragment enthielten, das etwa 42 Minuten nach dem Beginn der Einspeisung eluiert wurde, wurden gesammelt, gepoolt, in vacuo getrocknet und in 0,1 Vol.% Trifluoracetat, das 50 Vol.% wässriges Acetonitril enthielt, aufgelöst. Gleichermaßen wie im Versuch 2-8 zeigte sich, dass das Peptidfragment die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 enthielt. SEQ ID NO: 2:
Da kein Enzym mit diesen physikalisch-chemischen Eigenschaften bekannt war, kann es als neuartige Substanz eingeschätzt werden.
Die gegenwärtigen Erfinder screenten eifrig die chromosomale DNA von Thermus aquaticus (ATCC 33923), wobei als Sonde ein Oligonucleotid eingesetzt wurde, das auf Basis der in den Versuchen 2-8 und 2-9 enthüllten Aminosäuresequenzen chemisch synthetisiert worden war, und erhielten ein DNA-Fragment, das aus etwa 3.600 Basenpaaren bestand, welche die Basensequenz in SEQ ID NO: 4 hatten. Das Decodieren der Basensequenz zeigte; dass ein hitzebeständiges Enzym von dem Mikroorganismus aus 963 Aminosäuren besteht und die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 hat. SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Die zur Enthüllung der Aminosäuresequenz und der Basensequenz in SEQ ID NO: 3 und 4 eingesetzten, sequentiellen Versuchsschritte sind nachstehend zusammengefasst:
(1) Ein hitzebeständiges Enzym wurde aus einer Kultur eines Donormikroorganismus isoliert, hochgereinigt und hinsichtlich seiner den N- Terminus enthaltenden Aminosäuresequenz bestimmt. Das gereinigte Enzym wurde mit Protease teilweise hydrolysiert, und hieraus wurde ein Peptidfragment isoliert und hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz bestimmt;
(2) Separat wurde eine chromosomale DNA aus einer Zelle des Donormikroorganismus isoliert, gereinigt und teil Weise mit einem Restriktionsenzym aufgeschlossen, um ein aus etwa 4.000-8.000 Basenpaaren bestehendes DNA-Fragment zu erhalten. Mit einer DNA-Ligase wurde das DNA-Fragment mit einem zuvor mittels eines Restriktionsenzyms zerschnittenen Plasmidvektor ligasiert, um eine rekombinante DNA zu erhalten;
(3) Die rekombinante DNA wurde in einen Mikroorganismus der Spezies Escherichia coli eingeführt, um Transformanten zu erhalten, und hieraus wurde ein gegenständlicher Transformant, welcher eine das hitzebeständige Enzym codierende DNA enthielt, durch das Koloniehybridisierungsverfahren ausgewählt, wobei als Sonde ein Oligonucleotid eingesetzt wurde, das auf Basis der vorgenannten Teilaminosäuresequenz chemisch synthetisiert worden war; und
(4) Die rekombinante DNA wurde von dem ausgewählten Transformanten erhalten und wieder mit einem Primer verbunden, gefolgt vom Zulassen, dass eine DNA-Polymerase auf das Resultat einwirkt, um den Primer zu verlängern, und vom Bestimmender Basensequenz der resultierenden Komplementärketten-DNA durch das Didesoxykettenabbruchverfahren. Der Vergleich einer Aminosäuresequenz, welche auf Basis der festgestellten Basensequenz abgeschätzt werden konnte, mit der vorgenannten Aminosäuresequenz erbrachte den Schluss, dass sie das hitzebeständige Enzym codiert.
Die folgenden Versuche 3 und 4 veranschaulichen konkret die obenstehenden Punkte (2) bis (4), und die hierbei verwendeten Techniken waren herkömmliche, die auf diesem Gebiet üblicherweise angewandt werden, beispielsweise jene, die von J. Sumbruck et al. in "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben wurden.

Versuch 3

Herstellung von rekombinanter DNA, die eine das hitzebeständige Enzym codierende DNA enthält, sowie eines Transformanten

Versuch 3-1

Herstellung von chromosomaler DNA

Eine Keimkultur von Thermus aquaticus (ATCC 33923) wurde in ein Nährlösungsmedium (pH 7,0) eingeimpft und bei 60ºC 24 Stunden lang mit einer Umlaufschüttelmaschine kultiviert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation von der sich ergebenden Kultur abgetrennt, in einem TES-Puffer (pH 8,0) suspendiert, mit 0,05 Gew.-% Lysozym vermischt und bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert. Das Resultat wurde bei -80ºC eine Stunde lang gefroren, mit einem TSS-Puffer (pH 9,0) vermischt, auf 60ºC erhitzt und weiters mit einer Mischlösung aus TES-Puffer und Phenol vermischt, und die resultierende Lösung wurde mit Eis gekühlt, gefolgt von einer Zentrifugation zum Erhalten eines Überstands. 2-fache Volumen kalten Ethanols wurden dem Überstand beigegeben, und die ausgefällte chromosomale Roh-DNA wurde gesammelt, in einem SSC-Puffer (pH 7,1) suspendiert, mit 7,5 ug Ribonuclease und 125 ug Protease vermischt und bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert. Daraufhin wurde der Reaktionsmischung eine Mischlösung aus Chloroform und Isoamylalkohol hinzugefügt, um die gegenständliche chromosomale DNA zu extrahieren, und der Extrakt wurde mit kaltem Ethanol vermischt, gefolgt vom Sammeln des gebildeten Sediments, welches die chromosomale DNA enthielt. Die resultierende gereinigte chromosomale DNA wurde in einem SSC-Puffer (pH 7,1) gelöst, um eine Konzentration von etwa einem mg/ml zu ergeben, und die resultierende Lösung wurde bei -80ºC gefroren.

Versuch 3-2

Herstellung der rekombinanten DNA pBTM22 sowie des Transformanten BTM22

Etwa ein ml der in Beispiel 3-1 erhaltenen, gereinigten chromosomalen DNA wurde in ein Teströhrchen gegeben, mit etwa 10 Einheiten Sarc 3AI, einem Restriktionsenzym, vermischt und bei 37ºC etwa 20 Minuten Lang enzymatisch umgesetzt, um die chromosomale DNA teilweise zu spalten, gefolgt von der Rückgewinnung eines aus etwa 4.000-8.000 Basenpaaren bestehenden DNA-Fragments mittels einer Sucrose- Dichtegradient-Ultrazentrifugation. Ein ug Bluescript II SK(+), ein von Stratagene Cloning Systems, Kalifornien, USA, in den Handel gebrachter Plasmidvektor, wurde in ein Teströhrchen gegeben, zwecks vollständigen Aufschließens des Plasmidvektors der Wirkung von Bam HI, einem Restriktionsenzym, ausgesetzt, mit 10 ug des DNA-Fragments und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase vermischt und bei 4ºC über Nacht stehen gelassen, um das DNA- Fragment mit dem Plasmidvektorfragment zu ligasieren. 30 ul "Epicurian Coli® XLI-Blue", eine von Stratagene Cloning Systems, Kalifornien, USA, Japan, in den Handel gebrachte kompetente Zelle, wurden der resultierenden rekombinanten DNA beigegeben, wurden unter eiskalten Bedingungen 30 Minuten lang stehen gelassen, auf 42ºC erhitzt, mit SOC- Nährlösung vermischt und bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert, um die rekombinante DNA in Escherichia coli einzuführen.
Der sich ergebende Transformant wurde meine 50 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl- β-galactosid enthaltende Agarplatte (pH 7,0) eingeimpft und bei 37ºC 18 Stunden lang kultiviert, gefolgt vom Bedecken der Agarplatte mit einem Nylonfilm, um darauf etwa 6.000 Kolonien zu befestigen, die sich auf der Agarplatte bildeten. Auf Basis der Aminosäuresequenz Trp-Tyr-Lys-Asp-Ala-Val, wie sie sich in SEQ ID NO: 1 zeigt, wurde die Basensequenz der durch die Basensequenz 5'-TGGTAYAARGAYGCNGT-3' dargestellten Sonde 1 chemisch synthetisiert, mit 32P markiert und mit den am Nylonfilm befestigten Transformantenkolonien hybridisiert, gefolgt vom Auswählen von 5 Transformanten, welche stark mit Sonde 1 hybridisiert hatten.
Die gegenständliche rekombinante DNA wurde in üblicher Weise aus den S Transformanten ausgewählt, und gemäß dem von E. M. Southern im Journal of Molecular Biology, Band 98, S. 503-S17 (1975), beschriebenen Verfahren wurde die rekombinante DNA mit der durch die Basensequenz 5'-AAYATGTGGCCNGARGA-3' dargestellten Sonde 2 hybridisiert, welche Basensequenz auf Basis der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2, d. h. Asn-Met-Trp-Pro-Glu-Glu, chemisch synthetisiert worden war, und wurde mit ³²P markiert, gefolgt vom Auswählen einer rekombinanten DNA, welche stark mit Sonde 2 hybridisiert hatte. Die so ausgewählte, rekombinante DNA und der so ausgewählte Transformant wurden "pBTM22" bzw. "BTM22" genannt.
Der Transformant BTM22 wurde in eine 100 ug/ml Ampicillin enthaltende L- Nährlösung (pH 7,0) eingeimpft und bei 37ºC 24 Stunden lang mit einer Umlaufschüttelmaschine kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die resultierenden Zellen mittels Zentrifuge aus der Kultur gesammelt und mit einem herkömmlichen Alkaliverfahren behandelt, um eine rekombinante DNA aus den Zellen zu extrahieren. Der Extrakt wurde in üblicher Weise gereinigt und analysiert, wobei sich zeigte, dass die rekombinante DNA pBTM22 aus etwa 10.300 Basenpaaren besteht. Wie in Fig. 5 gezeigt, ist ein Fragment, das eine aus etwa 2.900 Basenpaaren bestehende und das hitzebeständige Enzym codierende DNA enthält, stromabwärts in der Nähe der aufgeschlossenen Stelle Hind III, eines Restriktionsenzyms, lokalisiert.

Versuch 3-3

Herstellung eines rekombinanten Enzyms durch den Transformanten BTM22

100 ml Aliquote eines flüssigen Nährkulturmediums (piEl 7,0), bestehend aus 2,0 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Pepton, 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,06 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0,05 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 Gew.-% Calciumcarbonat und Wasser, wurden in 500 ml- Kolben gegeben, und jeder Kolben wurde durch 30-minätiges Erhitzen bei 115ºC sterilisiert, abgekühlt, mit 50 ug/ml Ampicillin vermischt und mit dem im Versuch 3-2 erhaltenen Transformanten BTM22 beimpft, gefolgt vom 24-stündigen Züchten des Transformanten bei 37ºC mit einer Umlaufschüttelmaschine. Die resultierende Kultur wurde zur Zerstörung von Zellen mit einem Ultraschall-Desintegrator behandelt, und die resultierende Suspension wurde zur Entfernung von unlöslichen Substanzen zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wurde hinsichtlich der Enzymaktivität analysiert, wobei sich zeigte, dass ein Liter der Kultur etwa 800 Einheiten rekombinantes Enzym enthielt.
Als Kontrolle wurde eine Keimkultur von Escherichia coli XLI-Blue oder Thermus aquaticus (ATCC 33923) in eine frische Zubereitung desselben flüssigen Nährkulturmediums, das jedoch frei von Ampicillin war, eingeimpft und wurde im Fall des Züchtens von Thermus aquaticus (ATCC 33923) gleichermaßen wie obenstehend gezüchtet und behandelt, abgesehen davon, dass die Kultivierungstemperatur auf 65ºC eingestellt wurde. Bei einer Analyse der Aktivität des Resultats enthielt ein Liter Kultur von Thermus aquaticus etwa 350 Einheiten des Enzyms, und die Ausbeute war bedeutend niedriger als jene des Transformanten BTM22. Das als Wirt verwendete Escherichia coli XLI-Blue bildete das hitzebeständige Enzym nicht.
Daraufhin wurde das vom Transformanten BTM22 produzierte Enzym gleichermaßen wie in den Versuchen 1 und 2 gereinigt und hinsichtlich seiner physikalisch- chemischen Eigenschaften und Merkmaie untersucht. Als Ergebnis zeigte sich, dass es im Wesentlichen dieselben physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist wie das hitzebeständige Enzym von Thermus aquaticus (ATCC 33923), d. h. bei SDS-PAGE eine Molekülmasse von etwa 100.000-110.000 Dalton und bei einer Isoelektrophorese einen isoelektrischen Punkt von etwa 3,8-4,8, und sogar, wenn es bei 80ºC 60 Minuten Lang in Wasser (pH 7,0) inkubiert wird, nicht wesentlich inaktiviert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass das vorliegende hitzebeständige Enzym mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt und die Ausbeute dadurch beträchtlich gesteigert werden kann.

Versuch 4

Herstellung einer Komplementärketten-DNA und Bestimmung ihrer Basensequenz und Aminosäuresequenz

Zwei ug der rekombinanten DNA pBTM22 von Versuch 3-2 wurden in ein Teströhrchen gegeben, mit 2 M wässriger Natriumhydroxidlösung vermischt, um eine Degeneration zu bewirken, und mit einer passenden Menge kalten Ethanols vermischt, gefolgt vom Sammeln des eine Matrizen-DNA enthaltenden Sediments, das sich bildete, und vom in vacuo-Trocknen des Sediments. 50 pMol/ml eines durch die Basensequenz 5'- GTAAAACGACGGCCAGT-3' dargestellten, chemisch synthetisierten Primers und 10 ul eines 40 mM-Tris-HCl-Puffers (pH 7,5), der 20 mM Magnesiumchlorid und 20 mM Natriumchlorid enthielt, wurden der Matrizen-DNA beigegeben, und die Mischung wurde zwecks Bewirkung einer Wiederverbindung 2 Minuten Lang bei 65ºC inkubiert und mit 2 ul einer wässrigen Lösung, die dATP, dGTP und dTTP jeweils in Mengen von 7,5 uM enthielt, 0,5 ul [α-³²P]dCTP (2 mCi/ml), einem ul 0,1 M Dithiothreitol und 2 ul von 1,5 Einheiten/ml T7 DNA-Polymerase vermischt, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation der resultierenden Mischung bei 25ºC, um den Primer vom 5'-Terminus zum 3'-Terminus zu verlängern. Somit wurde eine Komplementärketten-DNA gebildet.
Das die Komplementärketten-DNA enthaltende Reaktionsprodukt wurde in vier gleiche Teile geteilt, wobei jedem 2,5 ul einer wässrigen 50 mM-Natriumchloridlösung, die 80 uM dNTP und 8 uM ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP enthielt, hinzugefügt wurde, und die sich ergebende Mischung wurde bei 37ºC 5 Minuten lang inkubiert, gefolgt vom Aussetzen der Reaktion durch Zugabe von 4 ul einer 98 Vol.%igen wässrigen Formamidlösung, die 20 mM EDTA, 0,05 Gew.-% Bromphenolblau und O,05 Gew.-% Xylencyanol enthielt. Die Reaktionsmischung wurde im kochenden Wasserbad 3 Minuten Lang erhitzt, und ein kleiner Teil davon wurde auf ein 6 Gew.-%iges Polyacrylamidgel gegeben und durch Zuführung einer konstanten Spannung von etwa 2.000 Volt Elektrophorese-behandelt; um DNA-Fragmente abzutrennen, gefolgt von der Befestigung des Gels in üblicher Weise, seiner Trocknung und dem Unterziehen des Resultats einer Autoradiographie.
Die Analysen der am Radiogramm abgetrennten DNA-Fragmente zeigten, dass die Komplementärketten-DNA die aus etwa 3.600 Basenpaaren bestehende Basensequenz in SEQ ID NO: 5 enthält. Eine aus der Basensequenz abschätzbare Aminosäuresequenz war wie die parallel dazu in SEQ ID NO: 5 gezeigte und wurde mit der den N-Terminus enthaltenden Aminosäuresequenz oder den Teilaminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 1 und 2 verglichen, wobei sich zeigte, dass die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 jener entsprach, die in SEQ ID NO: 5 von 1 bis 20 positioniert war, und die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 jener entsprach, die in SEQ ID NO: 5 von 236 bis 250 positioniert war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das vorliegende rekombinante Enzym die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 besitzt und die Aminosäuresequenz der von Thermus aquaticus (ATCC 33923) stammenden DNA von der Basensequenz in SEQ ID NO: 4 codiert wird. SEQ ID NO: 5:
Wie obenstehend beschrieben, wurde das vorliegende hitzebeständige Enzym, das Maltose in Trehalose und umgekehrt umwandeln kann, als Ergebnis der von den gegenwärtigen Erfindern durchgeführten Langzeitforschung entdeckt und besitzt das Enzym, im Gegensatz zu herkömmlichen Enzymen, spezifische physikalisch-chemische Eigenschaften. Die vorliegende Erfindung zielt ab auf die Herstellung eines rekombinanten Enzyms mittels rekombinanter DNA-Technologie. Unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele werden das Verfahren zur Herstellung eines solchen rekombinanten Enzyms, seine Zubereitung und seine Anwendungen im Detail beschrieben.
Das rekombinante Enzym, auf das bei der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, umfasst im Allgemeinen jene, welche mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden und Maltose in Trehalose und umgekehrt umwandeln können. Üblicherweise besitzt die vorliegende rekombinante DNA eine enthüllte Aminosäuresequenz, z. B. die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 oder eine dazu homologe Aminosäure. Varianten, die Aminosäuresequenzen enthalten, welche zur Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 homolog sind, können hergestellt werden, indem eine oder mehrere Aminosäuren in SEQ ID NO: 3 durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die Eigenaktivität des Enzyms zu verändern. Sogar bei Verwendung derselben DNA und obwohl es auch von den Wirten abhängt, in welche die DNA eingeführt wird, sowie von den Bestandteilen und Komponenten der zur Züchtung von Transformanten eingesetzten Nährkulturmedien sowie von deren Kultivierungstemperatur und pH, können modifizierte Enzyme produziert werden, welche die enzymatische Aktivität haben, die dem von der DNA codierten Enzym zueigen ist, welche jedoch eine oder mehrere defekte Aminosäuren haben, die in der Nähe der N- und/oder C-Termini der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 lokalisiert sind, oder welche eine oder mehrere Aminosäuren haben, die dem N-Terminus neu hinzugefügt werden, und zwar durch die Modifikation von intrazellulären Wirtsenzymen nach der DNA-Expression. Solche Varianten können in das vorliegende rekombinante Enzym inkludiert werden, solange sie die gewünschten Eigenschaften aufweisen.
Das erfindungsgemäße rekombinante Enzym kann aus Kulturen von Transformanten erhalten werden, welche die spezifische DNA enthalten. Bei der vorliegenden Erfindung verwendbare Transformanten können erhalten werden, indem die Basensequenz in SEQ ID NO: 4, dazu homologe Basensequenzen oder zu diesen Basensequenzen komplementäre Basensequenzen in geeignete Wirte eingeführt werden. Eine oder mehrere Basen in den obenstehend erwähnten Basensequenzen können mittels der Degeneration des genetischen Codes durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Aminosäuresequenz, für welche sie codieren, zu wechseln. Selbstverständlich kann bzw. können eine oder mehrere Basen in der das Enzym oder dessen Varianten codierenden Basensequenz leicht durch andere Basen ersetzt werden, um zu erlauben, dass die DNA die Enzymproduktion in den Wirten tatsächlich exprimiert.
Jegliche DNA, die aus natürlichen Ressourcen stammt, und jene, die künstlich synthetisiert wurde, können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange sie die obenstehend erwähnten Basensequenzen aufweisen. Die natürlichen Ressourcen der erfindungsgemäßen DNA sind beispielsweise Mikroorganismen der Gattung Thermus aquaticus (ATCC 33923), aus denen ein Gen, das die bei der vorliegenden Erfindung verwendete DNA enthält, erhalten werden kann. Diese Mikroorganismen können in Nährkulturmedien eingeimpft und etwa 1-3 Tage lang unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden, und die resultierenden Zellen wurden aus den Kulturen gesammelt und einer Ultrabeschallung ausgesetzt oder mit einem Zellwand-Lyseenzym, wie z. B. Lysozym oder β-Glucanase, behandelt, um Gene zu extrahieren, welche die vorliegende DNA enthalten. In diesem Fall kann ein proteolytisches Enzym, wie z. B. Protease, in Kombination mit dem Zellwand-Lyseenzym verwendet werden, und im Fall der Ultrabeschallungsbehandlung können die Zellen in Gegenwart eines Tensids, wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), oder durch das Gefrier- und Auftauverfahren behandelt werden. Die gegenständliche DNA ist zu erhalten durch die Behandlung des Resultats mit einer Phenolextraktion, Alkoholsedimentation, Zentrifugation, Proteasebehandlung und/oder Ribonucleasebehandlung, welche im Allgemeinen auf diesem Gebiet eingesetzt werden. Um die erfindungsgemäße DNA künstlich zu synthetisieren, kann diese durch Verwendung der Basensequenz in SEQ ID NO: 3 chemisch synthetisiert werden oder kann sie in Plasmidform erhalten werden, indem eine DNA, welche die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 4 codiert, in einen geeigneten selbstreplizierbaren Vektor eingefügt wird, um eine rekombinante DNA zu erhalten, die rekombinante DNA in einen geeigneten Wirt eingeführt wird, um einen Transformanten zu erhalten, der Transformant gezüchtet wird, die wuchernden Zellen von der resultierenden Kultur abgetrennt werden und Plasmide, welche die rekombinante DNA enthalten, aus den Zellen gesammelt werden.
Eine solche rekombinante DNA wird zum Beispiel in Form einer rekombinanten DNA üblicherweise in Wirte eingeführt. Im Allgemeinen enthält die rekombinante DNA die vorgenannte DNA und einen selbstreplizierbaren Vektor und kann durch ein herkömmliches Verfahren mit relativer Leichtigkeit hergestellt werden, wenn die Material-DNA zur Verfügung steht. Beispiele für einen solchen Vektor sind Plasmidvektoren, wie z. B. pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3, pUB110, pTZ4, pC194, pUV14, TRp7, TEp7, pBS7, etc.; und Phagenvektoren, wie z. B. λgt.λC, λgt.λB, ρ11, φ1, φ105, etc.. Unter diesen Plasmid- und Phagenvektoren werden pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3, λgt.λC und λgt.λB im Fall, dass die vorliegende DNA in Escherichia coli exprimiert werden soll, zufriedenstellend eingesetzt, während pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1 und φ105 zufriedenstellend zur Exprimierung der DNA in Mikroorganismen der Gattung Bacillus eingesetzt werden. Die Plasmidvektoren pHV14, TRp7, TEp7 und pBS7 werden geeigneterweise eingesetzt, wenn die rekombinante DNA in 2 oder mehreren Wirtstypen wachsen gelassen wird.
Die Verfahren, die bei der vorliegenden Erfindung zur Einführung der vorliegenden DNA in derartige Vektoren eingesetzt werden, können auf diesem Gebiet allgemein angewandte, herkömmliche Verfahren sein. Ein die vorliegende DNA enthaltendes Gen und ein selbstreplizierbarer Vektor werden zuerst durch ein Restriktionsenzym und/oder einen Ultraschall-Desintegrator aufgeschlossen, und danach werden die resultierenden DNA- Fragmente und Vektorfragmente ligasiert. Zur Ligase von DNA-Fragmenten und Vektoren können diese, falls notwendig, wieder verbunden werden, wonach sie der Wirkung einer DNA-Ligase in vivo oder in vitro ausgesetzt werden. Die so erhaltene rekombinante DNA ist ohne wesentliche Einschränkung replizierbar, indem sie in einen geeigneten Wirt eingeführt und der resultierende Transformant gezüchtet wird.
Die erfindungsgemäße rekombinante DNA kann in geeignete Wirtsmikroorganismen, umfassend Escherichia coli und jene der Gattung Bacillus sowie Actinomycene und Hefepilze, eingeführt werden. Im Fall der Verwendung von Escherichia coli als Wirt kann dieses in Gegenwart der rekombinanten DNA und von Calciumionen kultiviert werden, während im Fall der Verwendung der Mikroorganismen der Gattung Bacillus das kompetente Zellverfahren und das Koloniehybridisierungsverfahren angewandt werden können. Gewünschte Transformanten können durch das Koloniehybridisierungsverfahren oder durch das Züchten einer Vielfalt von Transformanten in Nährkulturmedien, die entweder Maltose oder Trehalose enthalten, und das Auswählen von Trehalose oder Maltose bildenden Transformanten kloniert werden.
Die so erhaltenen Transformanten produzieren das gegenständliche Enzym extrazellulär, wenn sie in Nährkulturmedien gezüchtet werden. Im Allgemeinen können flüssige Medien, die im Allgemeinen mit Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und/oder Mineralien und, falls notwendig, weiters mit einer geringen Menge von Aminosäuren und/oder Vitaminen ergänzt sind, als Nährkulturmedien eingesetzt werden. Beispiele für die Kohlenstoffquellen sind Saccharide wie Stärke, Stärkehydrolysat, Glucose, Fructose und Sucrose. Beispiele für die Stickstoffquellen sind organische und anorganische stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrat, Pepton, Hefeextrakt, entfettete Sojabohnen, Maistränkflüssigkeit und Rinderextrakt. Kulturen, die das gegenständliche Enzym enthalten, können erhalten werden, indem die Transformanten in Nährkulturmedien eingeimpft und bei einer Temperatur von 20-50ºC und einem pH von 2-9 etwa 1-6 Tage lang unter aeroben Bedingungen mittels Durchlüftung- Rührbewegung etc. inkubiert werden. Solche Kulturen können intakt als Rohenzymzubereitung verwendet werden, und üblicherweise können die Zellen in den Kulturen vor der Verwendung mit einem Ultraschall-Desintegrator und/oder Zellwand-Lyseenzymen zerstört werden, gefolgt von der Abtrennung des Enzyms von intakten Zellen und Zellbruchstücken mittels Filtration und/oder Zentrifugation sowie der Enzymreinigung. Die Verfahren, die bei der Erfindung zur Enzymreinigung angewandt werden, umfassen im Allgemeinen herkömmliche Verfahren. Intakte Zellen und Zellbruchstücke werden den Kulturen entnommen und einem oder mehreren Verfahren, wie z. B. der Konzentration, Aussalzung, Dialyse, Trennsedimentation, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophoben Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelelektrophorese und Isoelektrophorese, unterzogen.
Wie obenstehend beschrieben, übt das vorliegende rekombinante hitzebeständige Enzym eine ausgeprägte Aktivität hinsichtlich der Bildung von Trehalose oder Maltose aus Maltose bzw. Trehalose aus, sogar wenn erlaubt wird, dass es bei einer Temperatur über 55ºC wirkt, und eine solche Aktivität wurde bei herkömmlichen Enzymen nicht entdeckt. Trehalose besitzt eine milde und qualitativ hochwertige Süße und weist den großen Vorteil auf, dass sie ohne Besorgnis, eine unzufriedenstellende Verfärbung und Beeinträchtigung hervorzurufen, Lebensmittelprodukte süßen kann, da sie keinen reduzierenden Rest im Molekül besitzt. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaften des vorliegenden rekombinanten hitzebeständigen Enzyms kann Maltose, die aufgrund ihrer Reduzierbarkeit auf manchen Gebieten nicht zu verwenden gewesen wäre, in brauchbare Trehalose mit zufriedenstellender Hantierbarkeit und im Wesentlichen ohne Reduzierbarkeit umgewandelt werden.
Bei der nunmehrigen detaillierteren Erläuterung des vorliegenden Verfahrens zur enzymatischen Umwandlung bedeutet der Begriff "Maltose", wie er bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, üblicherweise eine Maltose-hältige Saccharidzusammensetzung, und jedwedes Material oder Verfahren kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange Trehalose gebildet wird, wenn das vorliegende rekombinante hitzebeständige Enzym auf diese einwirkt oder dabei gebildet wird. Um Trehalose wirksam in einem industriellen Maßstab herzustellen, können Saccharidzusammensetzungen mit relativ hohem Maltoseanteil, d. h. üblicherweise etwa 70 Gew.-% oder mehr, vorzugsweise etwa 80 Gew.-% oder mehr, beliebig verwendet werden. Derartige Saccharidzusammensetzungen können durch allgemein auf diesem Gebiet angewandte, herkömmliche Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch jene, die in den japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 11,437/81 und 17,078/81 geoffenbart sind, wobei erlaubt wird, dass β-Amylase auf gelierte oder verflüssigte Stärke einwirkt, und die gebildete Maltose durch das Trennsedimentationsverfahren oder Dialyseverfahren abgetrennt wird, oder durch jene, die in den japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 13,089/72 und 3,938/79 geoffenbart sind, wobei erlaubt wird, dass β-Amylase zusammen mit einem Stärke-entzweigenden Enzym, wie z. B. Isoamylase oder Pullulanase, auf gelierte oder verflüssigte Stärke einwirkt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur enzymatischen Umwandlung wird erlaubt, dass eine wirksame Menge des vorliegenden rekombinanten hitzebeständigen Enzyms in einem Maltose-hältigen, wässrigen Medium koexistiert, gefolgt vom Halten der resultierenden Mischung bei einer vorgeschriebenen Temperatur und einem vorgeschriebenen pH-Wert, um enzymatisch umzusetzen, bis die gewünschte Menge an Trehalose gebildet ist. Obwohl die enzymatische Reaktion sogar bei einer relativ niedrigen Konzentration von etwa 0,1 Gew.-%, d.s.b., fortschreitet, kann die Konzentration auf etwa 2 Gew.-% oder mehr, d.s.b., vorzugsweise etwa 5-50 Gew.-%, d.s.b., eingestellt werden, um das Verfahren zur enzymatischen Umwandlung im industriellen Maßstab fortzusetzen. Die Reaktionstemperatur und der pH werden innerhalb des Bereichs, in dem Maltose wirksam gebildet wird, ohne das rekombinante Enzym zu inaktivieren, festgesetzt, d. h. bei einer Temperatur über 55ºC, vorzugsweise bei etwa 56-63ºC, und bei einem pH von etwa 5-10, vorzugsweise etwa 6-7. Die Menge des rekombinanten Enzyms und die Reaktionszeit werden in Abhängigkeit von den Bedingungen der enzymatischen Reaktion passend festgesetzt. Das vorliegende Verfahren zur enzymatischen Umwandlung wandelt Maltose wirksam in Trehalose um, und die Umwandlungsrate erreicht etwa 50% oder in manchen Fällen mehr.
Die durch das vorliegende Verfahren zur enzymatischen Umwandlung erzielbaren Reaktionsmischungen können intakt verwendet und üblicherweise vor der Verwendung gereinigt werden. Beispielsweise werden die Reaktionsmischungen filtriert und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und die sich ergebenden Lösungen werden mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit einem Ionenaustauschharz gereinigt und zu sirupartigen Produkten konzentriert. In Abhängigkeit von der Verwendung können die sirupartigen Produkte in vacuo getrocknet und zu festen Produkten sprühgetrocknet werden. Um Produkte zu erhalten, die im Wesentlichen aus Trehalose bestehen, werden die sirupartigen Produkte einem oder mehreren Chromatographieverfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern, Aktivkohlen oder Kieselgels, einer Fermentation unter Verwendung von Hefepilzen und einer Abscheidung durch den Abbau reduzierender Saccharide mit Laugen unterzogen. Zur Behandlung einer relativ großen Menge von Reaktionsmischungen werden Ionenaustauschchromatographien, wie z. B. Festbett-, Wanderbett- und Pseudo- Wanderbettverfahren, wie sie in den offengelegten japanischen Patenten Nr. 23,799/83 und 72,598/83 geoffenbart sind, beliebig bei der Erfindung angewandt, und diese ermöglichen die wirksame und umfangreiche Herstellung von Produkten mit hohem Trehaloseanteil, welche in großen Mengen schwer zu erhalten waren.
Die Trehalose und die Trehalose-hältigen Saccharidzusammensetzungen, die so erhalten werden, können bei einer Vielfalt von Produkten verwendet werden, welche aufgrund der Reduzierbarkeit von Saccharidsüßungsmitteln vermieden werden sollten, und können daher bei Lebensmittelprodukten im Allgemeinen, Kosmetika und Pharmazeutika beliebig als Süßungsmittel, geschmacksverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Stabilisierungsmittel, Füllinittel, Adjuvans oder Arzneimittelträger verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung des rekombinanten hitzebeständigen Enzyms und das Verfahren zur enzymatischen Umwandlung von Maltose gemäß der vorliegenden Erfindung:

Beispiel A-1

Herstellung eines rekombinanten Enzyms

100 ml Aliquote eines Nährkulturmediums, bestehend aus 2,0 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Pepton, 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,06 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0,05 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 Gew.-% Calciumcarbonat und Wasser, wurden in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, und jeder Kolben wurde durch 30-minütiges Erhitzen bei 115ºC sterilisiert, abgekühlt, mit 50 gg/ml Ampicillin vermischt und mit dem im Versuch 1-2 erhaltenen Transformanten BTM22 beimpft, gefolgt von der 24-stündigen Inkubation bei 37ºC unter Rühr/Schüttelbedingungen, um eine Keimkultur zu erhalten. 18 l Aliquote einer frischen Zubereitung desselben Nährkulturmediums wurden in 30 l-Flaschenfermenter gegeben, gleichermaßen wie obenstehend sterilisiert, mit 50 ug/ml Ampicillin vermischt und mit 1 Vol.% der Keimkultur beimpft, gefolgt von der 24-stündigen Inkubation bei 37ºC und einem pH von 6-8 unter Durchlüftungs/Rührbedingungen. Die resultierenden Kulturen wurden gepoolt, zur Zerstörung von Zellen mittels Ultrabeschallung behandelt, zur Entfernung von unlöslichen Substanzen zentrifugiert, gefolgt von einer Analyse der enzymatischen Aktivität des resultierenden Überstands. Als Ergebnis enthielt ein Liter Kultur etwa 800 Einheiten des rekombinanten Enzyms. Die mittels des Verfahrens des Versuchs 1-1 durchgeführte Analyse des Überstands ergab, dass in dieser Kultur eine wässrige Lösung von etwa 5 ml erhalten wurde, welche etwa 152 Einheiten/ml eines rekombinanten Enzyms mit einer spezifischen Aktivität von etwa 135 Einheiten/mg Protein enthielt.

Beispiel A-2

Herstellung eines rekombinanten hitzebeständigen Enzyms

Beispiel A-2(a)

Herstellung des Transformanten BTM23

Die mittels des Verfahrens des Beispiels 3-2 erhaltene, rekombinante DNA pBTM22 wurde mit Hind III,, einem Restriktionsenzym, gespalten, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das aus etwa 8.100 Basenpaaren bestand, welche die Basensequenz-Positionierung von 107 bis 2.889 in SEQ ID NO: 4 enthalten.
Acht Oligonucleotide; die Basensequenzen enthielten, welche durch 5'-AGCTTG AATTCTTTTTTAATAAAATCAGGAGGAAAAACCATGGACC-3',5'-CCCTCTG GTACAAGGACGCGGTGATCTACCAGCTCCAC-3',5'-GTCCGCTCCTTCTTT GACGCCAACAACGACGGCTACGG-3',5'-GGACTTTGAGGGCCTGAGGCGGA-3', 5'-AGCTTCCGCCTCAGGCCCTCAAAGTCCCCGTAGCCGTCGTTGTTG-3',5'- GCGTCAAAGAAGGAGCGGACGTGGAGCTGGTAGATCACC-3'; 5'-GCGTCCTT GTACCAGAGGGGGTCCATGGTTTTTCCTCC-3' und 5'-TGATTTTATTAAAAAA GAATTCA-3' dargestellt waren, wurden in passenden Mengen vermischt, und die Mischung wurde nacheinander bei 100ºC, 65ºC, 37ºC und 20ºC 20 Minuten lang inkubiert, um die Oligonucleotide wieder zu verbinden. Eine erste rekombinante DNA, welche die Basensequenz in SEQ ID NO: 6 und eine aus den Basen der Positionen 1-2.889 in SEQ ID NO: 3 bestehende Basensequenz enthielt, wobei die in den Positionen 1-961 lokalisierten Guanine (G) durch Adenine (A) ersetzt wurden, wurde erhalten, indem das obenstehende DNA-Fragment zu einer doppelsträngigen DNA aus 141 Basenpaaren, die an jedem Terminus ein kohäsives 5'-Ende aus 4 Basen hatten, hinzugefügt wurde, welche DNA aus der Basensequenz in SEQ ID NO: 6 und den Basen der Positionen 1-110 in SEQ ID NO: 4 bestand, wobei das in der Position 1 in SEQ ID NO: 4 lokalisierte Guanin (G) durch Adenin (A) ersetzt wurde, ohne die Aminosäuresequenz, die aus jenen der Positionen 1-36 in SEQ ID NO: 3 bestand, zu wechseln, und indem die Mischung bei 4ºC über Nacht in Gegenwart von T4 DNA-Ligase stehen gelassen wurde, um die Inhalte wieder zu verbinden.

SEQ ID NO: 6:

AGCTTGAATT CTTTTTTAAT AAAATCAGGA GGAAAAACC 39
Die mittels des Verfahrens des Versuchs 3-2 erhaltene, rekombinante DNA pBTM22 wurde mit Bam HI, einem Restriktionsenzym, gespalten, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das aus etwa 2.400 Basenpaaren bestand, welche die Basensequenz-Positionierung von 1.008 bis 2.889 in SEQ ID NO: 4 enthalten, welches DNA-Fragment danach mit "M13tv19 RF DNA", einem von Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japan, in den Handel gebrachten Phagenvektor, ligasiert wurde, der mit Bam HI gespalten worden war; um eine zweite rekombinante DNA zu erhalten.
Ein Oligonucleotid, das eine durch 5'-CGGTAGCCCTGCAGCCCCGGG-3' dargestellte Basensequenz enthielt, was der Basensequenz-Positionierung von 3.438 bis 3.458 in SEQ ID NO: 5 entsprach, wobei "Thymin (T)", die Basenpositionierung 3.448 in SEQ ID NO: 5, durch "Guanin (G)" ersetzt wurde, wurde in üblicher Weise chemisch synthetisiert. Unter Verwendung des synthetisierten Oligonucleotids und "MUTAN-G", eines von Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japan, in den Handel gebrachten, sequenzspezifischen Mutationssystems, wurde eine dritte rekombinante DNA erhalten, welche die Basensequenz-Positionierung von Base 1.008 bis 2.889 in SEQ ID NO: 4 enthielt, wobei "Thymin (T)", d. h. die Basenpositionierung 3.448 in SEQ ID NO: 5, durch "Guanin (G)" ersetzt wurde, ohne die Aminosäuresequenz-Positionierung von Base 337 bis 963 in SEQ ID NO: 5, welche in der zweiten rekombinanten DNA enthalten war, zu wechseln. Der Vorgang der sequenzspezifischen Mutation folgte dem Handbuch, das dem "MUTAN-G" beigefügt war.
Ein DNA = Fragment, das aus etwa 1.390 Basenpaaren bestand, welche die Basensequenz-Positionierung von Base 1 bis 1.358 in SEQ ID NO: 4 enthielen, wobei "Guanin (G)", d. h. die erste Base in SEQ ID NO: 4, durch "Adenin (A)" ersetzt wurde, welches DNA-Fragment durch eine Furchungsteilung mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Bgl II erhalten wurde, und ein DNA-Fragment, das aus etwa 1.550 Basenpaaren bestand, welche die Basensequenz-Positionierung von 1.359 bis 2.889 in SEQ ID NO: 4 enthielten, welches DNA-Fragment durch eine Furchungsteilung der dritten rekombinanten DNA mit den Restriktionsenzymen Bgl II und Pst I erhalten wurde, wurden mittels einer T4 DNA- Ligase mit "pKK223-3", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, in den Handel gebrachten Plasmidvektor, ligasiert, um die rekombinante DNA pBTM23 zu erhalten, welche die Basensequenz in SEQ ID NO: 4 enthielt.
Die so erhaltene rekombinante DNA pBTM23 wurde in Escherichia coli LE 392 (ATCC 33572) eingeführt, das zuvor gemäß dem von J. Sambrook in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, S. 1.74-1.81 (1989), veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, beschriebenen Verfahren zu einer kompetenten Zelle zubereitet worden war, um den vorliegenden Transformanten BTM23 zu erhalten, welcher die das vorliegende Enzym codierende DNA enthält. Der Transformant wurde mittels des Verfahrens des Versuchs 3-2 gezüchtet, und die wuchernden Zellen wurden aus der resultierenden Kultur gesammelt und lysiert, um die rekombinante DNA zu extrahieren, welche danach gereinigt und analysiert wurde, wobei sich zeigte, dass die rekombinante DNA pBTM23 der Fig. 6 aus etwa 7.500 Basenpaaren bestand und ein 2.889 Basenpaare enthaltendes DNA-Fragment hatte, das stromabwärts von Nco I, einem Restriktionsenzym, ligasiert wurde.

Beispiel A-2(b)

Herstellung eines rekombinanten hitzebeständigen Enzyms unter Verwendung von Transformanten

Der Transformant BTM23 wurde gleichermaßen wie in Beispiel A-1 gezüchtet, abgesehen davon, dass ein flüssiges Kulturmedium (pH 7,0), bestehend aus einem Gew.% Maltose, 3 Gew.-% Polypepton, einem Gew.-% "MEAST PIG", einem Produkt von Asahi Breweries, Ltd., Tokio, Japan, 0,1 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphatdihydrat, 200 ug/ml Ampicillinnatrium und' Wasser, verwendet wurde. Der resultierenden Kultur wurden ein von Seikagaku-Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japan, in den Handel gebrachtes Eiweißlysozym, und "TRITON X-100", ein Tensid, beigefügt, um Konzentrationen von 0,1 mg/ml bzw. 1 mg/ml zu ergeben, und das Resultat wurde unter Rühren 16 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, um aus den Zellen ein rekombinantes hitzebeständiges Enzym zu extrahieren. Die Suspension wurde eine Stunde lang bei 60ºC erhitzt, um begleitende Enzyme von Escherichia coli zu inaktivieren, gefolgt von einer Zentrifugation der Mischung zur Entfernung von Verunreinigungen und einer Analyse der Enzymaktivität im Überstand, wobei sich zeigte, dass ein Liter Kultur etwa 120.000 Einheiten des rekombinanten hitzebeständigen Enzyms enthielt. Der Überstand wurde mittels des Verfahrens des Versuchs 1 gereinigt, um etwa 177 ml wässrige Lösung, die etwa 1.400 Einheiten/ml des rekombinanten hitzebeständigen Enzyms mit einer spezifischen Aktivität von etwa 135 Einheiten/mg Protein enthielt; zu erhalten.
Die Eigenschaften und Merkmale des gereinigten Enzyms wurden mittels des Verfahrens des Versuchs 2 untersucht, wobei sich zeigte, dass es bei einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelekfrophorese (SDS-PAGE) eine Molekülmasse von 100.000-110.000 Dalton und bei einer Isoelektrophorese einen isoelektrischen Punkt von etwa 3,8-4,8 aufweist und sogar, wenn es bei 80ºC 60 Minuten lang in einer wässrigen Lösung (pH 7,0) inkubiert wird, nicht inaktiviert wird. Diese physikalisch-chemischen Eigenschaften sind im Wesentlichen dieselben wie jene von Thermus aquaticus (ATCC 33923) als Donormikroorganismus.

Beispiel B-1

Herstellung eines Trehalosesirups mittels eines rekombinanten Enzyms

Kartoffelstärkepulver wurde in Wasser suspendiert, um eine Konzentration von 10 Gew.-% zu ergeben, und die Suspension wurde auf pH 5,5 eingestellt, mit 2 Einheiten/g Stärke von "SPITASE HS", einer von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, in den Handel gebrachten α-Amylaseprobe, vermischt und bei 95ºC erhitzt, um eine Gelatinierung und Verflüssigung zu bewirken. Daraufhin wurde die resultierende verflüssigte Lösung zur Inaktivierung des verbleibenden Enzyms bei 120ºC 20 Minuten lang in einem Autoklaven behandelt, unverzüglich auf 500C abgekühlt, auf pH 5,0 eingestellt, mit 500 Einheiten/g Stärke einer von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, in den Handel gebrachten Isoamylaseprobe und 20 Einheiten/g Stärke einer von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, in den Handel gebrachten β-Amylaseprobe vermischt und bei 50ºC einer 24-ständigen enzymatischen Reaktion ausgesetzt, um eine Saccharidlösung zu erhalten, die etwa 92 Gew.-% Maltose, d.s.b., enthielt. Die Saccharidlösung wurde zur Inaktivierung des verbleibenden Enzyms bei 100ºC 20 Minuten lang erhitzt, auf 60ºC abgekühlt, auf pH 6,5 eingestellt, mit einer Einheit/g Stärke des in Beispiel A-1 erhaltenen rekombinanten Enzyms vermischt und einer 96-stündigen enzymatischen Reaktion ausgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung des verbleibenden Enzyms bei 100ºC 10 Minuten lang erhitzt, gekühlt, filtriert und in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt, mit einem Ionenaustauschharz entsalzt und entionisiert und konzentriert, um ein 70 Gew.-%iges Sirup in einer Ausbeute von etwa 95%, bezogen auf die Materialstärke, d.s.b., zu erhalten.
Das Produkt enthält etwa 68 Gew.-% Trehalose, d.s.b., und besitzt aufgrund seines DE (Dextrose-Äquivalents) von 18,4 eine relativ geringe Reduzierbarkeit sowie eine milde Süße, eine mäßige Viskosität und eine mäßige Fähigkeit zur Feuchtigkeitsspeicherung, und dies macht es bei einer Vielfalt von Zusammensetzungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika, beliebig als Süßungsmittel, geschmacksverbesserndes Mittel, Stabilisierungsmittel, Füllinittel, Adjuvans oder Arzneimittelträger verwendbar.

Beispiel B-2

Herstellung eines Trehalosepulvers mittels rekombinanter DNA

Die in Beispiel B-1 erhaltene Reaktionsmischung wurde auf pH 5,0 eingestellt, mit 10 Einheiten/g Stärke "GLUCOZYME", einer von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, in den Handel gebrachten Glucoamylaseprobe, vermischt und bei 50ºC einer 24- stündigen enzymatischen Reaktion ausgesetzt. Die so erhaltene Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung des verbleibenden Enzyms erhitzt und in üblicher Weise entfärbt, entsalzt, gereinigt und unter Verwendung von "XT-1016 (Polymerisationsgrad von 4%)", einem von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan, in den Handel gebrachten Kationenaustauschharz in Na&spplus;-Form, einer Ionenaustauschsäulenchromatographie unterzogen, um den Trehaloseanteil zu vergrößern. Genauer gesagt, das zuvor in Wasser suspendierte Ionenaustauschharz wurde in 4 ummantelte Edelstahlsäulen mit einem Säulen-Innendurchmesser von 5,4 cm gefüllt, und die Säulen wurden kaskadenartig in Serie geschaltet, um eine Gesamtsäulenlänge von 20 m zu ergeben. Etwa 5 Vol.% der Reaktionsmischung wurden in die Säulen gespeist, während die innere Säulentemperatur bei 60ºC gehalten wurde, und wurden durch Beschickung der Säulen mit 60ºC heißem Wasser bei einer 5 V (Raumgeschwindigkeit) von 0,15 fraktioniert, gefolgt vom Sammeln von Fraktionen mit hohem Trehaloseanteil. Die Fraktionen wurden gepoolt und in üblicher Weise konzentriert, in vacuo getrocknet und pulverisiert, um ein Trehalosepulver in einer Ausbeute von etwa 50%, bezogen auf das Material, d.s.b., zu erhalten.
Das Produkt, das etwa 97 Gew.-% Trehalose, d.s.b., enthält und ein relativ geringes Reduktionsvermögen sowie eine milde Süße besitzt, kann als Süßungsmittel, geschmacksverbesserndes Mittel, Stabilisierungsmittel, Füllmittel, Adjuvans oder Arzneimittelträger beliebig in eine Vielfalt von Zusammensetzungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika, eingebaut werden.

Beispiel B-3

Herstellung eines kristallinen Trehalosepulvers mittels eines rekombinanten Enzyms

Eine mittels des Verfahrens des Beispiels B-2 erhaltene Fraktion mit hohem Trehaloseanteil wurde in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt, mit einem Ionenaustauscher entsalzt und zu einer ungefähr 70 Gew.-%igen Lösung konzentriert. Das Konzentrat wurde in einen Kristallisator gegeben und unter Rühren allmählich abgekühlt, um eine Füllmasse mit einem Kristallisationsprozentsatz von etwa 45% zu erhalten. Die Füllmasse wurde mit einem Druck von etwa 150 kg/em² aus einer an der Spitze eines Trockenturms angebrachten Düse gesprüht, während von der Spitze des Trockenturms etwa 85ºC heiße Luft herunterblies und etwa 45ºC heiße Luft unter einen im Fundament des Trockenturms vorgesehenen Drahtgeflechtförderer hindurchblies, und zwar auf ein am Förderer gesammeltes, kristallines Pulver, und das Pulver allmählich aus dem Trockenturm herausgefördert wurde. Daraufhin wurde das kristalline Pulver in einen Alterungsturm übertragen und 10 Stunden lang im heißen Luftstrom abgelagert, um die Kristallisation und Trocknung zu beenden. Somit wurde ein wasserhaltiges kristallines Trehalosepulver in einer Ausbeute von etwa 90%, bezogen auf das Material, d.s.b., erhalten.
Das Produkt ist im Wesentlichen frei von Hygroskopizität und leicht zu handhaben und kann bei einer Vielfalt von Zusammensetzungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten Kosmetika und Pharmazeutika, beliebig als Süßungsmittel, geschmacksverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Stabilisierungsmittel, Füllmittel, Adjuvans oder Arzneimittelträger verwendet werden.

Beispiel B-4

Herstellung eines wasserfreien kristallinen Trehalosepulvers mittels eines rekombinanten Enzyms

Eine mittels des Verfahrens des Beispiels B-2 erhaltene Fraktion mit hohem Trehaloseanteil wurde gleichermaßen wie in Beispiel B-3 gereinigt, und die sich ergebende Lösung wurde in ein Gefäß übertragen und unter reduziertem Druck gekocht, um einen Sirup mit einem Feuchtigkeitsanteil von etwa 3,0 Gew.-% zu erhalten. Der Sirup wurde in einen Kristallisator gegeben, mit etwa 1,0 Gew.-% wasserfreier kristalliner Trehalose als Impfkristall vermischt, bei 120ºC unter Rühren kristallisiert und in ein einfaches Aluminiumgefäß übertragen, gefolgt von einer 6-stündigen Ablagerung der Inhalte bei 100ºC, um einen Block zu bilden. Der so erhaltene Block wurde mit einer Schneidemaschine pulverisiert und durch Fließbetttrocknung getrocknet, um ein wasserfreies kristallines Trehalosepulver mit einem Feuchtigkeitsanteil von etwa 0,3 Gew.-% in einer Ausbeute von etwa 85%; bezogen auf das Material, d.s.b., zu erhalten.
Das Produkt mit stark entwässernder Wirkung kann beliebig als Trocknungsmittel fit Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Pharmazeutika sowie deren Materialien und Zwischenverbindungen und bei Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika auch als weißes pulverförmiges Süßungsmittel von milder Süße verwendet werden.

Beispiel B-5

Herstellung eines Trehalosepulvers mittels eines rekombinanten Enzyms

"MALTOSE HHH", eine von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, in den Handel gebrachte Maltose von hoher Reinheit, wurde in Wasser aufgelöst; um eine Konzentration von 40 Gew.-% zu ergeben, auf 57ºC erhitzt, auf pH 6,5 eingestellt und mit 2 Einheiten/g Maltose, d.s.b., eines mittels der Verfahrens des Beispiels A-2 erhaltenen, rekombinanten hitzebeständigen Enzyms vermischt, gefolgt von der 48- stündigen enzymatischen Reaktion. Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung des verbleibenden Enzyms 10 Minuten lang bei 100ºC erhitzt, abgekühlt, filtriert, in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt, mit einem Ionenaustauschharz entsalzt und gereinigt, in vacuo getrocknet und pulverisiert, um in einer Ausbeute von etwa 90%, bezogen auf das Material, d.s.b., ein pulverförmiges Produkt zu erhalten, das etwa 73 Gew.-% Trehalose, d.s.h., enthielt.
Obwohl das Produkt einen DE (Dextrose-Äquivalent) von 19 aufweist, was etwa 30% von jenem der Maltose ist, besitzt es dieselbe Viskosität wie Maltose sowie auch eine milde Süße und eine geeignete Fähigkeit zur Feuchtigkeitsspeicherung. Somit kann das Produkt bei einer Vielfalt von Zusammensetzungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika, beliebig als Süßungsmittel, geschmacksverbesserndes Mittel, Stabilisierungsmittel, Füllmittel, Adjuvans und Arzneimittelträger verwendet werden.
Wie obenstehend beschrieben, basiert die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung eines neuartigen hitzebeständigen Enzyms, das Trehalose oder Maltose bildet, wenn es auf Maltose oder Trehalose einwirkt. Die vorliegende Erfindung zielt ab auf die Erforschung eines Wegs zur Herstellung eines solchen Enzyms im industriellen Maßstab und in einer beträchtlich großen Ausbeute mittels der rekombinanten DNA-Technologie. Das Verfahren zur enzymatischen Umwandlung wandelt unter Verwendung des vorliegenden rekombinanten hitzebeständigen Enzyms Maltose in eine Saccharidzusammensetzung um, welche Trehalose, Glucose und/oder Maltose in beträchtlich großer Ausbeute enthält. Trehalose besitzt eine milde und qualitativ hochwertige Süße und hat keinen reduzierenden Rest im Molekül, und daher kann sie ohne Besorgnis, eine unzufriedenstellende Verfärbung und Beeinträchtigung hervorzurufen, Lebensmittelprodukte im Allgemeinen ohne weiteres süßen. Das rekombinante Enzym, das eine enthüllte Aminosäuresequenz aufweist, kann mit größerer Sicherheit zur Herstellung von Trehalose eingesetzt werden, die zur Verwendung in Lebensmittelprodukten vorgesehen ist.
Daher ist die vorliegende Erfindung eine nützliche Erfindung, welche die zuvor genannte bedeutende Aktion und Wirkung ausübt und dabei auf diesem Gebiet einen großen Beitrag leistet.

Claims

1. Rekombinantes Enzym, das Maltose in Trehalose umwandeln kann und sogar, wenn es bei einer Temperatur über 55ºC inkubiert wird, nicht wesentlich inaktiviert wird, und das eine Aminosäuresequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus jenen, die nicht mit SEQ ID NO: 3 identisch sind, sondern Varianten von SEQ ID NO: 3 sind, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren gelöscht, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die Eigenaktivität des Enzyms mit der Aminosäuresequenz SEQ ED NO: 3 zu verändern, und wobei das rekombinante Enzym nicht die Teilaminosäuresequenz Ala-Val-X-Tyr enthält, wobei X Phe oder Ile bedeutet.

2. Rekombinantes Enzym gemäß Anspruch 1, welches die folgenden physikalisch- chemischen Eigenschaften aufweist:

(a) Wirkung - bildet Trehalose, wenn es auf Maltose einwirkt, und umgekehrt;

(b) Molekülmasse (MW) - etwa 100.000-110.000 Dalton bei einer Analyse mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE);

(c) isoelektrischer Punkt (pI) - etwa 3,8-4,8 bei einer Analyse mittels Isoelektrophorese;

(d) optimale Temperatur - etwa 65ºC bei 60-minütiger Inkubation bei pH 7,0;

(e) optimaler pH - etwa 6,0-6,7 bei 60-minütiger Inkubation bei 60ºC;

(f) Hitzebeständigkeit - stabil bis zu einer Temperatur von etwa 80ºC, sogar bei 60- minütiger Inkubation bei pH 7,0; und

(g) pH-Stabilität - stabil bis zu einem pH von 5,5-9,5, sogar bei 60-minütiger Inkubation bei 60ºC.

3. Isolierte DNA, welche ein rekombinantes Enzym, das Maltose in Trehalose umwandeln kann, codiert, welches Enzym sogar, wenn es bei einer Temperatur von über 55ºC inkubiert wird, nicht wesentlich inaktiviert wird, und das eine Aminosäuresequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 und Varianten von SEQ ID NO: 3, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in SEQ ID NO: 3 gelöscht, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die Eigenaktivität des Enzyms mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 zu verändern.

4. DNA des Anspruchs 3, welche eine Basensequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Basensequenz SEQ ID NO: 4, dazu homologen Basensequenzen, bei denen eine oder mehrere Basen in SEQ ED NO: 4 gelöscht, hinzugefügt oder durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Eigenaktivität des Enzyms mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 zu verändern, sowie Basensequenzen, die zu diesen Basensequenzen komplementär sind.

5. DNA des Anspruchs 4, wobei eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 4 mittels der Degeneration des genetischen Codes durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 zu verändern.

6. DNA des Anspruchs 3, welche die Basensequenz SEQ ID NO: 5 besitzt.

7. DNA gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, welche von einem Mikroorganismus der Gattung Thermus stammt.

8. Replizierbare rekombinante DNA, welche einen selbstreplizierbaren Vektor und eine DNA, wie sie in einem der Ansprüche 3 bis 7 definiert ist, enthält.

9. Replizierbare rekombinante DNA des Anspruchs 8, wobei die DNA eine Basensequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Basensequenz SEQ ID NO: 4, dazu homologen Basensequenzen, bei denen eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 4 gelöscht, hinzugefügt oder durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Eigenaktivität des Enzyms mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 zu verändern, sowie Basensequenzen, die zu diesen Basensequenzen komplementär sind.

10. Replizierbare rekombinante DNA des Anspruchs 9, wobei die das Enzym codierende DNA erhalten wird, indem eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 4 mittels der Degeneration des genetischen Codes durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 zu verändern.

11. Replizierbare rekombinante DNA des Anspruchs 8, wobei die das Enzym codierende DNA die Basensequenz SEQ ID NO: 5 besitzt.

12. Replizierbare rekombinante DNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die das Enzym codierende DNA von einem Mikroorganismus der Gattung Thermus gewonnen wird.

13. Replizierbare rekombinante DNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei der selbstreplizierbare Vektor der Plasmidvektor Bluescript II SK(+) oder pKK223-3 ist.

14. Transformant, welcher hergestellt wird, indem, eine replizierbare rekombinante DNA, welche eine DNA, wie sie in einem der Ansprüche 3 bis 7 definiert ist, und einen selbstreplizierbaren Vektor enthält, in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird.

15. Transformant des Anspruchs 14, wobei die DNA eine Basensequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Basensequenz SEQ ID NO: 4, dazu homologen Basensequenzen, bei denen eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 4 gelöscht, hinzugefügt oder durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Eigenaktivität des Enzyms mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 zu verändern, sowie Basensequenzen, die zu diesen Basensequenzen komplementär sind:

16. Transformant des Anspruchs 15, wobei die DNA erhalten wird, indem eine oder mehrere Basen in der Basensequenz in SEQ ID NO: 4 mittels der Degeneration des genetischen Codes durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 zu verändern.

17. Transformant des Anspruchs 14, wobei die DNA die Basensequenz SEQ ID NO: 5 besitzt.

18. Transformant gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die DNA von einem Mikroorganismus der Gattung Thermus stammt.

19. Transformant gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei der selbstreplizierbare Vektor der Plasmidvektor Bluescript II SK(+) oder pKK223-3 ist.

20. Transformant gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei der Wirt ein Mikroorganismus der Spezies Escherichia coli ist.

21. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Enzyms, welches Folgendes umfasst:

das Züchten eines Transformanten in einem Nährkulturmedium zwecks Bildung des Enzyms, welcher Transformant hergestellt wird, indem eine rekombinante DNA, welche sowohl einen selbstreplizierbaren Vektor als auch eine DNA, wie sie in einem der Ansprüche 3 bis 7 definiert ist, enthält, in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird; und

das Sammeln des gebildeten Enzyms aus der sich ergebenden Kultur.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die das Enzym codierende DNA die Basensequenz SEQ ID NO: 4, dazu homologe Basensequenzen, bei denen eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 4 gelöscht, hinzugefügt oder durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Eigenaktivität des Enzyms mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 zu verändern, sowie Basensequenzen, die zu diesen Basensequenzen komplementär sind, besitzt.

23. Verfahren des Anspruchs 22, wobei die DNA erhalten wird, indem eine oder mehrere Basen in der Basensequenz in SEQ ID NO: 4 mittels der Degeneration des genetischen Codes durch andere Basen ersetzt werden, ohne die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 zu verändern.

24. Verfahren des Anspruchs 21, wobei die DNA die Basensequenz SEQ ID NO: 5 besitzt.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei die DNA von einem Mikroorganismus der Gattung Thermus stammt.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei der selbstreplizierbare Vektor der Plasmidvektor Bluescript II SK(+) oder pKh223-3 ist.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei der Wirt ein Mikroorganismus der Spezies Escherichia coli ist.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 27, wobei das im Nährkulturmedium gebildete, rekombinante Enzym durch Zentrifugation, Filtration, Konzentration, Aussalzung, Dialyse, Trennsedimentation, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelelektrophorese und/oder Isoelektrophorese gewonnen wird.

29. Verfahren zur enzymatischen Umwandlung von Maltose, welches einen Schritt umfasst, in dem erlaubt wird, dass das rekombinante Enzym des Anspruchs 1 auf Maltose einwirkt, um Trehalose zu bilden.

30. Verfahrendes Anspruchs 29, wobei der Schritt das Koexistieren einer wirksamen Menge des rekombinanten Enzyms in einem bis zu 50 Gew.-% Maltose enthaltenden, wässrigen Medium und das Unterziehen der sich ergebenden Mischung einer enzymatischen Reaktion bei einer Temperatur von über 5ºC und einem pH von 5-10 umfasst.

31. Verfahren des Anspruchs 30, wobei die sich ergebende Reaktionsmischung zumindest etwa 50 Gew.-% Trehalose auf Trockensubstanzbasis enthält.