DE19847628C2

DE19847628C2 - Helicobacter pylori-Impfstoff

Info

Publication number: DE19847628C2
Application number: DE19847628A
Authority: DE
Inventors: Bernhard Knapp; Klaus-Dieter Diehl; Erika Hundt
Original assignee: Chiron Behring GmbH and Co KG
Current assignee: GSK Vaccines GmbH
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2000-10-19
Anticipated expiration: 2018-10-16
Also published as: WO2000022135A1; DE19847628A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 und die nachstehend beschriebenen Varianten dieses Proteins sowie diese Proteine codierende DNA-Sequenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gegen dieses Protein gerichtete Antikörper oder Fragmente davon, sowie Impfstoffe bzw. Arzneimittel, die dieses Membranprotein bzw. die dagegen gerichteten Antikörper enthalten und zur aktiven oder passiven Immunisierung verwendet werden können. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Diagnoseverfahren zum Nachweis einer Helicobacter pylori-Infektion unter Verwendung des erfindungsgemäßen Membranproteins oder des erfindungsgemäßen Antikörpers sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.

Helicobacter pylori ist ein gramnegatives, mikroaerophiles und spiralförmiges Bakterium, das die Mukosa des menschlichen Darms besiedelt. Dieses Bakterium verursacht chronische aktive Gastritis sowie peptischen Ulkus, insbesondere Ulkus duodeni, und spielt auch eine Rolle bei der Entstehung von Magenkarzinomen. Somit ist Helicobacter pylori ein wichtiger humanpathogener Erreger. Die Schraubenform und Mobilität durch vier bis sechs Flagellen ermöglicht dem Bakterium ein Durchwandern des Magenschleims, um dann die nahezu pH-neutrale Grenzschicht zwischen Schleim und Mukosa zu erreichen. Ammoniumionen, die bei der enzymatischen Spaltung von Harnstoff durch bakterielle Urease entstehen, schützen den Erreger vor der aggressiven Magensäure. Das Bakterium adhäriert an den Endothelzellen des Magens unter Verwendung spezifischer Adhäsine. Eine Folge der chronischen Schleimhautbesiedlung mit Helicobacter pylori kann eine entzündliche granulozytäre, später monozytäre Infiltration des Epithels sein, die über Entzündungsmediatoren wiederum zur Gewebedestruktion beiträgt. Die Infektion stimuliert sowohl eine lokale als auch eine systemische humorale Immunantwort, ohne dabei jedoch eine wirksame Eliminierung des Erregers bewirken zu können.

Eine Impfung ist der klassische Weg, um Infektionskrankheiten zu verhindern. Dabei beinhaltet die Entwicklung eines Impfstoffs die Identifikation von Faktoren, die für die Virulenz ausschlaggebend sind, bzw. von Strukturen, die für das menschliche Immunsystem zur Eliminierung eines Erregers zugänglich sind. Solche Antigene sind in der Regel in der äußeren Membran des Erregers zu finden. So sind in der äußeren Membran von Helicobacter pylori Adhäsine von 19,6 kD (Doig et al. (1992)) und 20 kD (Evans et al. (1993)) lokalisiert, die mögliche Kandidaten für einen experimentellen Impfstoff sind, mit dem Ziel, Antikörper zu induzieren, die die bakterielle Adhäsion an der mukosalen Oberfläche verhindern. Außerdem verfügt die äußere Membran von Helicobacter pylori über Porine mit Molekulargewichten von 30 kD (Tufano et al. (1994)), 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al. (1995)) und 31 kD (Doig et al. (1995)), sowie über Eisen-regulierte äußere Membranproteine mit den Molekulargewichten 48 kD, 50 kD und 77 kD (Worst et al. (1995)), Erythrocyten-bindende Antigene mit den Molekulargewichten 25 kD und 59 kD (Huang et al. (1992)) und Bindungsproteine für Laminin, Kollagen I und IV, Fibronektin und Vitronektin (Kondo et al. (1993)). Weiterhin sind Proteine mit Molekulargewichten von 19 kD (Drouet et al. (1991)), 50 kD (Exner et al., (1995)) und 30 kD (Bölin et al. (1995)) sowie ein Lipoprotein mit 20 kD (Kostrzynska et al. (1994)) und stammspezifische, oberflächenlokalisierte Antigene von 51 kD, 60 kD und 80 kD (Doig und Trust (1994)) beschrieben worden. Die Gene für die Proteine mit den Molekulargewichten von 20 kD (HpaA; Evans et al. (1993)) und 20 kD (Ipp20; Kostrzynska et al. (1994)) sind inzwischen isoliert worden. Die N-terminalen Proteinsequenzen für das Adhäsin mit den Molekulargewichten von 19,6 kD (Doig et al. (1992)), für die Porine mit den Molekulargewichten von 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al. (1995)), 30 kD (Tufano (1994)) und 31 kD (Doig et al. (1993)) und für das 50 kD-Protein (Exner et al. (1995)) wurden inzwischen bestimmt. Die Porine mit den Molekulargewichten von 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al., (1995)) und 31 kD (Doig et al., (1995)) wurden als Hop A, Hop B, Hop C, Hop D und Hop E bezeichnet. Diese gehören zu einer Familie von 32 hoch homologen äußeren Membranproteinen (Tomb et al. (1997)). Ein weiteres Mitglied dieser Familie wurde von Ilver et al. (1998) als ein Blutgruppenantigen-bindendes Antigen, Bab A, identifiziert. Allerdings konnte mit den bisher aus Helicobacter pylori isolierten und charakterisierten Proteinen kein zufriedenstellend wirksamer Impfstoff entwickelt werden.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, einen wirksamen Impfstoff gegen Helicobacter pylori bereitzustellen.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Das erfindungsgemäße Antigen ermöglicht die Entwicklung eines Impfstoffs, der die Induktion einer Immunantwort gegen Helicobacter pylori in einem mit diesem Impfstoff geimpften Wirt auslöst. Es konnte ein von Helicobacter pylori stammendes äußeres (wahrscheinlich Eisen-reguliertes) Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 97 kD charakterisiert werden, das sich überraschenderweise als einen ausgezeichneten Impfschutz bewirkend herausstellte.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine DNA-Sequenz, die ein äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 codiert oder die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfaßt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften des äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori codiert, wobei sich die DNA-Sequenz von der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 (1) in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Code unterscheidet, (2) mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder (1) hybridisiert, oder (3) ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 ist.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Protein mit den immunogenen Eigenschaften des äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori bezieht sich auf jedes Protein, Polypeptid oder Peptid, das (1) als Antigen für Antikörper dienen kann, die an Helicobacter pyloris spezifisch binden oder (2) bei Verabreichung als Impfstoff eine Schutzwirkung gegenüber einer Infektion mit Helicobacter pylori hervorruft. Der Fachmann kann mittels üblicher Verfahren Proteine, Peptide oder Polypeptide bestimmen, die solche Eigenschaften aufweisen, beispielsweise mit den in den nachstehenden Beispielen offenbarten Verfahren. Beispielsweise besitzen diese Proteine, Polypeptide oder Peptide 50%, 60%, 70% oder 80%, vorzugsweise 90%, stärker bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt 98% Homologie zu dem Membranprotein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, wobei diese Homologie beispielsweise durch den "Smith-Waterman"-Homologiesuche-Algorithmus, beispielsweise mit dem "MPSRCH"-Programm (Oxford Molecular), bestimmt werden kann, wobei eine "affinity gap search" (affine Lückensuche) mit den folgenden Parametern verwendet wird "gap open penalty 12, gap extension penalty 1".

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridisieren" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, bei denen als Lösung 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet werden und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)).

Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Varianten" oder "Fragment" umfassen DNA-Moleküle, die sich gegenüber der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nukleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Moleküle codierte Protein noch die vorstehend erwähnten Eigenschaften aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nukleinsäuresequenz codiertes Protein noch über die vorstehend erwähnten Eigenschaften verfügt, beispielsweise über die in den Beispielen beschriebenen Verfahren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch DNA- Sequenzen, die das äußere Membranprotein von Helicobacter pylori von der Aminosäure Nr. 17 bis 863 (aa17-863) von SEQ ID NO: 1 (d. h., das Protein ohne Signalsequenz) oder von der Aminosäure Nr. 254 bis 323 (aa254-323) von SEQ ID NO: 1 codieren.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in einen Vektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen enthaltende Vektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (z. B. pUC18, pBR322, pBlueScript), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E. coli, zählen der lac-trp-Promotor oder T7- Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. Zu geeigneten Vektoren zählen beispielsweise auf T7 basierende Expressionsvektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al. (1987)), pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans (1988)), und von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierten äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori oder eines Fragments oder eines Proteins mit dessen immunogenen Eigenschaften, das die Kultivierung einer vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen umfaßt, die die Expression des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren (1985); LaVallie et al. (1993); Wong (1995); Romanos (1995); Williams (1995); Davies (1995)). Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung somit auch ein von den vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen codiertes oder nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenes äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften. Die erfindungsgemäßen Proteine können außerdem gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren modifiziert sein. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine immunologischen Eigenschaften im Wesentlichen erhalten bleiben. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z. B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine immunogene Zusammensetzung, vorzugsweise einen Impfstoff, (die) der das vorstehend beschriebene äußere Membranprotein von Helicobacter pylori ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften enthält. Der erfindungsgemäße Impfstoff enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Impfstoffe sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung des Impfstoffs kann oral oder parenteral, beispielsweise intradermal, subkutan oder intramuskulär, erfolgen. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von der Art der Verabreichung, von dem Alter und Gewicht des Empfängers etc. Sie kann beispielweise im Bereich von 10 µg bis 40 µg pro Patient liegen. Bei Kindern erniedrigt sich die Dosis auf 5 µg und bei Hämodialyse- Patienten erhöht sich die Dosis auf 40 µg.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die Verwendung des vorstehend beschriebenen äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori, eines Fragments davon oder eines Proteins mit dessen immunogenen Eigenschaften zur Herstellung eines Impfstoffes zur Induktion einer Immunantwort gegen Helicobacter pylori in einem mit dem Impfstoff geimpften Empfänger.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper gegen das vorstehend beschriebene äußere Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise als ersten Schritt die Herstellung von polyclonalen Antikörpern unter Verwendung des erfindungsgemäßen äußeren Membranproteins oder Fragmenten davon (beispielsweise synthetische Peptide) mit geeigneten Ligandensequenzen, beispielsweise die in den Beispielen beschriebenen Peptide oder Fragmente davon, als Immunogen zur Immunisierung geeigneter Tiere und die Gewinnung von gegen das definierte Antigen sensibilisierten B-Lymphozyten. Dann werden beispielsweise Zell-Hybride aus Antikörper produzierenden Zellen und Knochenmark-Tumorzellen hergestellt und cloniert. Anschließend wird ein Clon selektioniert, der einen Antikörper produziert, der für das verwendete Antigen spezifisch ist. Dieser Antikörper wird dann hergestellt. Beispiele von Zellen, die Antikörper produzieren, sind Milzzellen, Lymphknotenzellen, B-Lymphozyten etc.. Beispiele von Tieren, die zu diesem Zweck immunisiert werden können, sind Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und Kaninchen. Die Myelomzellen lassen sich aus Mäusen, Ratten, Menschen oder anderen Quellen erhalten. Die Zellfusion kann man beispielsweise durch das allgemein bekannte Verfahren von Köhler und Milstein durchführen. Die durch Zellfusion erhaltenen Hybridome werden mittels dem Antigen nach dem Enzym-Antikörper- Verfahren oder nach einem ähnlichen Verfahren abgesucht. Clone werden beispielsweise mit dem Grenz-Verdünnungsverfahren erhalten. Die erhaltenen Clone werden beispielsweise BALB/c-Mäusen intraperitoneal implantiert, nach 10 bis 14 Tagen wird der Ascites der Maus entnommen, und der monoclonale Antikörper durch bekannte Verfahren (beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktionierung, Ionenaustausch chromatographie, Gelchromatographie oder Affinitätschromatographie) gereinigt.

Der gewonnene Antikörper kann direkt verwendet werden oder es kann ein Fragment davon verwendet werden. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al., 1989; Verhoeyan et al., 1988). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Bereich(e) stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus- Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems besser interagieren, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.

Die vorstehend beschriebenen Antikörper oder Fragmente davon können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und RIA. Die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Antikörper können auch für eine passive Immunisierung verwendet werden, d. h. zur Bekämpfung einer bereits bestehenden Infektion mit Helicobacter pylori, wobei hinsichtlich der Herstellung des, diesen Antikörper bzw. die vorstehend beschriebenen Fragmente etc. enthaltenden Arzneimittels, der Art der Verabreichung und der Dosierung im Prinzip die üblichen Kriterien zugrundegelegt werden, wie diese für andere passive Impfstoffe, beispielsweise für Tetagam® oder Beriglobin®, erfüllt werden.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, enthaltend die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Antikörper bzw. ein Fragment davon, bzw. deren Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur passiven Immunisierung.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Diagnoseverfahren zum Nachweis einer akuten, chronischen oder früheren Infektion mit Helicobacter pylori, bei dem man gegen Helicobacter pylori gerichtete Antikörper aus einer Probe mit dem erfindungsgemäßen äußeren Membranprotein von Helicobacter pylori, einem Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob diese an das Antigen gebunden sind. Dabei findet der Nachweis dadurch statt, daß in der Probe vom Wirt erzeugte Antikörper gegen Helicobacter pylori nachgewiesen werden (mittels des erfindungsgemäßen Antigens).

Bei diesem Diagnoseverfahren wird eine Blutprobe entnommen, das Serum gewonnen und mit dem erfindungsgemäßen Antigen in Berührung gebracht und sodann bestimmt, ob Antikörper aus dem Serum an das Antigen gebunden sind. Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren kann als ELISA, RIA oder ein anderes gängiges Nachweisverfahren ausgestaltet sein, bei dem beispielsweise der aus dem Serum gebundene Antikörper mit Hilfe eines Zweitantikörpers nachzuweisen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens ist das Antigen oder ein Fragment davon immobilisiert, d. h. beispielsweise an der Wand einer Plastikschale so adsorbiert, daß die spezifische Bindungsspezifität erhalten bleibt.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der das erfindungsgemäße äußere Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften oder den vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Antikörper oder das Fragment davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können das vorstehend beschriebene äußere Membranprotein von Helicobacter pylori, das Fragment davon oder Protein mit den gleichen immunogenen Eigenschaften bzw. der vorstehend beschriebene Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert sein.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Präparation der Membranfraktion und Herstellung von Seren in Kaninchen

Helicobacter pylori wurde kultiviert und die Membranfraktion isoliert wie in den Beispielen 1 und 2 von WO 98/04702 beschrieben. Drei Kaninchen wurden mit 0,2 mg der Membranfraktion in kompletten Freund'schen Adjuvans (CFA) subkutan an 8 verschiedenen Stellen in der Nähe von Lymphknoten immunisiert. Daraufhin wurden die Kaninchen nach zwei Wochen mit 0,4 mg Membranfraktion in CFA wie oben beschrieben und nach weiteren zwei Wochen mit 0,1 mg Membranfraktion in Aerosil (Siliziumdioxid) insgesamt zehnmal täglich geboostert. Nach einer weiteren Woche wurden die Kaninchen entblutet und die Seren gewonnen. Die gegen Bestandteile von Escherichia coli gerichteten Antikörper wurden aus den Seren nach dem Verfahren von Gruber und Zingales (1995) entfernt.

Beispiel 2 Präparation einer Helicobacter pylori Expressionsgenbank in dem Vektor λTriplEx

Genomische DNA des Helicobacter pylori Stammes ATCC 43504 wurde mit Hilfe der DNAzol Methode von GIBCO/BRL (Katalog-Nr. 10503) präpariert. Diese wurde mit den Restriktionsenzymen AluI und Hae III nach der Vorschrift von Sambrook et al. (1989) partiell verdaut. DNA, die größer als 200 bp war, wurde nach Auftrennung der partiell verdauten DNA mittels LMP-Gelelektrophorese ausgeschnitten, die Agarose durch Gelase (BIOzym Diagnostik GmbH, Hameln) verdaut und die verbleibende DNA nach Phenol-Choroform- Extraktion mit Ethanol gefällt. Anschließend wurde an die Enden der partiell verdauten DNA-Fragmente ein EcoRI/Not I Adaptor (Pharmacia, Cat No. 27-7791) nach der Vorschrift von Sambrook et al. (1989) anligiert. Die Ligationsansätze wurden mit einer Tip5-Säule (Qiagen) gereinigt, die Enden der DNA-Fragmente mit Polynukleotidkinase phosphoryliert und die überschüssigen Adaptormoleküle mittels 1%iger LMP-Agarosegelelektrophorese abgetrennt. DNA, die größer als 200 bp war, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, die Agarose durch Gelase verdaut und die DNA schließlich mit Ethanol gefällt.

Die mit dem EcoRI-Adaptor versehenen AluI- bzw. Hae III-Fragmente der genomischen DNA wurden nach der Vorschrift des Herstellers (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, USA, λTriplEx^TM library, Gebrauchsinformation) in mit EcoRI verdaute, dephosphorylierte λTriplEx-Arme (Cat. No. #6161-1) ligiert und anschließend mit Hilfe des "Gigapack II Gold"- Verpackungsextraktes (Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland; Cat. No. #200216) in Phagenköpfe verpackt. λTriplEx ist ein λ-Vektor, der in zwei unterschiedlichen Leserahmen über zwei Translationsstartstellen verfügt und über eine Thymidinreihe verfügt, die am Beginn der Translation den Ribosomen eine Verschiebung im Leserahmen erlaubt, so daß in den Vektor inserierte DNA in allen drei Leserahmen abgelesen werden kann und somit in einem Immunscreening die Nachweiswahrscheinlichkeit über Antikörper drastisch erhöht wird. Der Titer der Genbanken konnte auf 5,0 × 10⁵ pfu/ml (AluI-Genbank; 6% nicht rekombinant) und 4,5 × 10⁵ pfu/ml (Hae III-Genbank; 11% nicht rekombinant) bestimmt werden. Die Größe der inserierten DNA wurde von acht Phagenplaques nach einem PCR- Protokoll (λTriplEx^TM library, Gebrauchsinformation) auf 0,5 kb bis 5,0 kb bestimmt.

Beispiel 3 Screenen der AluI-Genbank

24000 pfu der AluI-Genbank wurden auf zwei 150 mm LB-Agarplatten mit dem E. coli Stamm XL1-Blue MRF (Stratagene GmbH, Heidelberg) ausplattiert, die Phagenplaques auf Nitrocellulose transferiert, die unspezifischen Bindungsstellen abgesättigt, die Filter mit einem 1 : 500 verdünnten, fünfmal gegen E. coli abgesättigten Kaninchenserenpool von drei Immunisierungen (siehe Beispiel 1) inkubiert und die an die Plaques gebundenden Antikörper mit einem an alkalische Phosphatase konjugierten Sekundärantikörper nachgewiesen (Clontech, λTriplEx^TM-Gebrauchsinformation). Von beiden Agarplatten wurden die positiv reagierenden Phagenplaques gepickt und nochmals einem Screening unterworfen, um die Plaques zu vereinzeln. Aus dem zweiten Screening resultierten insgesamt 60 positive Klone.

Die 60 positiv reagierenden Phagenplaques wurden auf 2 LB-Platten getüpfelt und die Plaques wurden auf mehrere Nitrocellulosefilter transferiert. Anschließend wurde mit verschiedenen Genfragmenten der Helicobacter pylori Gene ureA, ureB und cat, die mit Hilfe des "DIG DNA"-Markierungs- und Nachweiskits (Boehringer Mannheim) mit Digoxigenin markiert wurden, hybridisiert. Es konnten jeweils 14 Plaques indentifiziert werden, die mit Gensonden von ureA, ureB bzw. cat hybridisierten. Bei einem wiederholten Screening der 60 Plaques mit dem anti-Membranserum konnten 19 Plaques nicht mehr eindeutig nachgewiesen werden, so daß nur noch 13 Klone zur weiteren Analyse Verwendung fanden.

Beispiel 4 Charakterisierung der inserieren DNA-Fragmente

Aus den 13 Phagenplaques wurde unter Benutzung des Exzisionsprotokolls von Clontech (λTriplEx^TM-Genbank, Gebrauchsinformation) Plasmid-DNA gewonnen. Dies wird dadurch erreicht, indem eine Plasmid-DNA in dem λTriplEx Vektor mit der λ-spezifischen DNA über die lox P-Stellen verbunden sind, die eine Konversion über eine stellenspezifische Rekombination erlauben. Die inserierte DNA aller 13 Plasmide wurde mit den die multiple Klonierungsstelle von pTriplEx flankierenden Primern von Clontech ("λTriplEx 5' LD-Insert Screening Amplimer", "λTriplEx^TM 3' LD-Insert Screening Amplimer") sequenziert. Acht der 13 inserierten DNA-Fragmente zeigten dabei Sequenzen, die für das Hitzeschockprotein hsp60 von Helicobacter pylori kodieren. Von den restlichen fünf inserierten DNA- Fragmenten erwiesen sich zwei als identisch, so daß die restlichen vier Sequenzen weiteren Untersuchungen unterworfen wurden.

Da die genomische Sequenz des Helicobacter pylori-Stammes 26695 inzwischen bekannt ist (Tomb et al., 1997) konnten die Sequenzen der inserierten DNA-Fragmente der vier Klone mit Hilfe des Programms "FastA" (Wisconsin Package, Unix, Version 8, Genetics Computer Group) bestimmten Genen zugeordnet und deren Aminosäuresequenzen abgeleitet werden. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der vier Gene wurden mit Hilfe des Programms "BlastP" unter Benutzung der Internetseite http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi- bin/BLAST/nph-blast gegen eine nicht-redundante Proteindatenbank (enthält "Gen Bank Translationen", "PDB", "Swiss Prot", "SPupdate", "PIR") verglichen. Damit gelang es, homologe Sequenzen diesen vier Aminosäuresequenzen zuzuordnen. Eine Aminosäuresequenz wurde als homolog zu der "(3R)-Hydroxymyristoyl-[acyl carrier protein]dehydratase" von Yersinia enterolitica (P 32205) gefunden, die schon in WO 98/04702 als 17 kD Protein beschrieben wurde. Die zweite Aminosäuresequenz zeigte sich als homolog zu der ATP-abhängigen DNA Helikase RecG von Escherichia coli (P 24230), die dritte Aminosäuresequenz ist homolog zur Biotin Carboxylase von Anabaena-Arten (Q 06862) und die vierte Sequenz zeigte sich als homolog zu dem Eisen-regulierten äußeren Membranprotein FrpB von Neisseria meningitidis (U 55377).

Die Phagenklone, die für die vier beschriebenen Aminosäuresequenzen kodieren, wurden benutzt, um aus dem mit E. coli abgesättigten Serum gegen die Membranfraktion nach der Methode von Ozaki et al. (1986) monospezifische Antikörper zu isolieren. Eine Western Blot-Analyse gegen ein Ganzkeim-Lysat von Helicobacter pylori zeigte, daß die monospezifischen Antikörper gegen den Clon, der für das Helikase-homologe Protein kodiert, ein ca. 60 kD großes Protein erkennen und daß die monospezifischen Antikörper gegen den Clon, der für das Eisen-regulierte äußere Membranprotein homologe Protein kodiert, ein ca. 97 kD großes Protein erkennen. Als Positivkontrolle wurde ein monospezifisches Antiserum verwendet, das mit einem Phagenclon gewonnen wurde, der ein Gen von ureA beinhaltet. Dieses erkennt im Western-Blot eine deutliche Proteinbande bei ca. 30 kD, was der Urease A-Untereinheit zugeordnet werden kann. Der Nachweis der monospezifischen Antikörper erfolgte mit Hilfe des "Vectastain ABC"-Kits (Vector Laboratories, Burlingame, USA).

Beispiel 5 Clonierung und Expression des Gens, das für das 97 kD Protein kodiert

Da unter den gefunden Genen nur dasjenige, das für das 97 kD Protein codiert, für ein äußeres Membranprotein codiert und somit ein potentieller Kandidat für die Gewinnung eines Impfstoffs darstellt, wurde dieses näher charakterisiert. SEQ ID NO: 1 zeigt die DNA- Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Gens, das für das 97 kD Antigen kodiert. Von der abgeleiteten Aminosäuresequenz entsprechen offensichtlich die 16 N- terminalen Reste einer Signalsequenz (Heijne (1985)). Das reife Protein von 847 Aminosäuren besitzt ein kalkuliertes Molekulargewicht von 94.1 kD und einen isoelektrischen Punkt von 9.90. Somit liegt das Molekulargewicht recht nahe zu dem Molekulargewicht von 97 kD, das durch SDS-Gelelektrophorese bestimmt wurde. Mit Hilfe von genomischer DNA des Helicobacter pylori-Stammes ATCC 43504 wurde nach bekannten Verfahren (Ausubel et al.) das Genfragment, das für das reife Protein des 97 kD Antigens kodiert, durch PCR amplifiziert und in den Vektor pQE30 (Qiagen, Hilden, Deutschland) insertiert. Die Expression des 97 kD-Antigens in dem E. coli-Stamm "XL1 Blue" (Stratagene GmbH, Heidelberg) ließ sich mit dem Nachweis einer Proteinbande bei 97 kD nach SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Coomassie-Blau Färbung zeigen. Diese Proteinbande reagierte nach einer Western Blot-Analyse intensiv mit dem Antiserum, das gegen die Membranfraktion von H. pylori gerichtet ist.

Beispiel 6 Expression von Genfragmenten

Da die Expressionsrate des kompletten 97 kD-Antigens niedrig war und nach Expression des Proteins in E. coli viele Abbauprodukte auftauchten, sollten Subgenregionen zur Expression gebracht werden, die unter Vorhersage des GCG-Programmes "Peptide Structure" (Wisconsin Package, Unix, Version 8) eine hohe Wahrscheinlichkeit auf Hydrophilizität und Oberflächenlokalisation haben. Hierzu wurden drei Regionen ermittelt: aa17-aa69, aa148-aa224 und aa254-aa323. Diese Regionen wurden nach bekannten Methoden amplifiziert und in dem Vektor pQE30 in E. coli "XL1 Blue"-Zellen zur Expression gebracht. Im Coomassie Blau-gefärbten SDS-Polyacrylamidgel ließen sich prominente Expressionsbanden nachweisen, die mit dem anti-Membranfraktionsserum bei der Western- Blot Analyse reagierten.

Beispiel 7 Reinigung der Expressionsprodukte

Die Reinigung der Expressionsprodukte erfolgte durch Bindung der N-terminal fusionierten Histidin-Reste an eine Nickel-Chelatsäule unter denaturierten Bedingungen nach einem modifizierten Protokoll von Qiagen ("The QIA expressionist, a handbook for high level expression and purification of 6 × His-tagged proteins", März 1997). Nach Aufschluß der E. coli-Bakterien mit Hilfe einer Glaskugelmühle (10 min bei 4000 U/min; 0,1-0,2 mm große Glaskugeln) wurde das Zellpellet in 0,1 M NaH₂PO₄, 8 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 0,02 M Imidazol, pH 8,0 solubilisiert, der Überstand über eine Nickel-Chelatsäule gegeben und nach dem Waschen das gebundene Protein schließlich mit 0,1 M NaH₂PO₄, 8 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 0,5 M Imidazol, pH 8,0 eluiert. Das Eluat wurde schrittweise gegen verschiedene Puffer, die 0,02 M Tris/HCl, Harnstoff, 0,8 M L-Arginin, 0,15 M NaCl, pH 8,0 enthielten, mit abnehmender Harnstoffkonzentration dialysiert.

Außerdem wurde versucht, die Proteine im neutralem pH-Bereich, sowie ohne den Zusatz von Arginin löslich zu halten. Die Proteine waren dabei noch in folgenden Puffern löslich:
97 kD Antigen: 20 mM Tris/HCl, 1 M Harnstoff, 0,8 M Arginin 0,15 M NaCl, pH 7,5
aa17-69: 20 mM Tris/HCl, 0,8 M Arginin, 0,15 M NaCl, pH 7,0
aa148-224: 20 mM Tris/HCl, 3 M Harnstoff, 0,8 M Arginin, 0,15 M NaCl, pH 7,0
aa254-323: 20 mM Tris/HCl, 0,15 M NaCl, pH 7,0

Die Konzentration der gereinigten Proteine wurde nach Messen der Extinktion unter Benutzung der Formel E = ε × c × d (E = Extinktion; ε = molarer Extinktionskoeffizient; d = Schichtdicke der Küvette) berechnet.

Beispiel 8 Lokalisation des 97 kD Antigens

Mit dem 97 kD-Expressionsprodukt wurden zur Herstellung von Antikörpern wie in Beispiel 1 beschrieben Kaninchen immunisiert. Nach Absättigung der Antiseren mit E. coli- Bestandteilen wurden die Antiseren für eine Western Blot-Analyse mit Ganzkeim-Lysat von H. pylori eingesetzt. Die Antikörper erkennen dabei eine spezifische Proteinbande von 97 kD. Diese Proteinbande wird auch von Antiseren erkannt, die gegen die drei Subregionen aa17-69, aa148-224 und aa254-323 gerichtet sind.

Zur Durchführung der Immunfluoreszenz wurden kultivierte H. pylori-Zellen mit PBS, 1% BSA gewaschen und 2 × 10⁸ Zellen mit dem jeweiligen Antiserum (1 : 480) in 100 µl Volumen über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dreimaligen Waschen der Zellen wurden diese mit 20 µg/ml eines Ziegen-Anti-Kaninchen Ig (H + L)-FITC-markierten Antikörpers (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, USA) eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Wiederum wurde dreimal gewaschen und das Pellet in 50 µl PBS, pH 7,2 aufgenommen. 10 µl wurden auf einen Objektträger getropft und leicht eintrocknen gelassen. Nach Auftropfen von "Mounting Medium" (Sigma, Heidelberg, Deutschland) und Eindeckeln wurde über Nacht getrocknet, mit Nagellack versiegelt und die Bakterien wurden unter Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie betrachtet. Dabei zeigte sich mit den Antiseren, die gegen das reife 97 kD-Antigen gerichtet sind im Vergleich zu den entsprechenden Null-Seren eine sehr intensive Fluoreszenz der lebenden Bakterien, was nicht nur die Lokalisation des 97 kD-Proteins in der äußeren Membran von Helicobacter pylori zeigt, sondern auch deutlich macht, daß bestimmte Epitope des Proteins an der Oberfläche des Bakteriums vorhanden sind und einen Zugang des Bakteriums mit Antikörpern möglich machen. Die Antiseren, die gegen die drei exprimierten Proteinregionen des 97 kD-Antigens gerichtet sind, zeigten im Vergleich zu den entsprechenden Null-Seren nur eine schwach ausgeprägte Immunfluoreszenz.

Beispiel 9 Konserviertheit des 97 kD Antigens

Da Oberflächenlokalisierte Antigene bei Bakterien häufig sehr variabel sind und dann nicht für eine Entwicklung einer Spaltvakzine (Vakzine, die nur einzelne Strukturen eines Erregers enthält) geeignet sind, wurde die Konservierheit des 97 kD-Antigens untersucht. Dazu wurden zwei Bakterienisolate von Patienten (pat 01, pat 02) sowie H. pylori-Bakterien der ATCC-Stämme 51110, 60190, 25392 und 43504 in Kultur gebracht und ihre DNA wurde mit Hilfe des "DNAzol"-Verfahrens (GIBCO/BRL; Katalog-Nr. 10503) präpariert. Ausgehend von diesen DNA-Proben wurden, wie in Ausubel et al. (1987) beschrieben, verschiedene Subfragmente amplifiziert und direkt einer Sequenzierung zugänglich gemacht. Die Sequenzen wurden mit Hilfe von "GCG"-Programmen ausgewertet und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen des 97 kD-Antigens von allen untersuchten H. pylori-Stämmen direkt miteinander verglichen (Tabelle 1). Hierbei fand auch die von Tomb et al. (1997) publizierte Sequenz HP 1512 des H. pylori Stammes 26695 Berücksichtigung. Dabei zeigte sich, daß nur in wenigen Positionen des 97 kD-Antigens Aminosäureaustausche vorhanden sind, welche überwiegend konserviert sind. Das 97 kD-Antigen scheint somit ein hochkonserviertes Antigen zu sein und ist von daher für die Entwicklung eines Impfstoffs geeignet.

Tabelle 1 Vergleich der Aminosäuresequenzen des 97 kD Antigens zwischen den Helicobacter pylori-Stämmen 26695, pat 01, pat 02, ATCC 51110, ATCC 60190, ATCC 25392, und ATCC 43504.

Es ist die Consensussequenz angegeben. Abweichungen sind für die einzelnen Stämmen in den jeweiligen Positionen gekennzeichnet. Die vorhergesagte Signalsequenz ist unterstrichen und die Subregionen, die ebenfalls zur Expression gebracht wurden, sind fett gedruckt.

Beispiel 10 Nachweis der protektiven Eigenschaften des 97 kD-Proteins

Sechs Gruppen von jeweils 10 Mäusen (CD1; männlich) wurden an den Tagen 1,8 und 15 mit den gereinigtem Proteinen 97 kD (1), 97 kD/aa17-69 (2), 97 kD/aa148-224 (3), 97 kD/aa254-323 (4), einer Mischung der drei Subfragmente (5) und mit physiologischer Kochsalzlösung (6) immunisiert. Die Impfstoffe für die Gruppen 1 bis 4 enthielten 0,2 mg Protein/Dosis in 0,2 ml und wurden mit 10 µg Choleratoxin (CT) pro Dose gemischt und oral verabreicht. Die Gruppe 5 erhielt eine Mischung der Subfragmente aa17-69 und aa254-323 (0,1 mg von jedem Fragment und 10 µ) CT) und nach 10 min 0,1 mg Subfragment aa148- 224 zusammen mit 5 µg CT. Etwa 20 min vor der Immunisierung wurden 0,2 ml 0,2 N NaHCO₂ oral verabreicht. Eine Belastungsinfektion mit 10⁹ cfu des H. pylori Stammes 326 wurde an den Tagen 27, 29 und 31 gegeben. Am Tag 47 wurden die Tiere getötet, die Mägen entnommen, geöffnet, mit Pinzetten gesäubert und anschließend mit 5 ml physiologischer Kochsalzlösung geschüttelt. 0,1 ml dieser Suspension wurden auf 57 cm² große "Columbia"-Agarplatten, die 5% Pferdeblut enthielten, ausplattiert und drei Tage bei 37°C unter mikroaerophilen Bedingungen ("BBL Jar/Camping Pak Plus", Belton & Dickinson) kultiviert. Die Kolonien wurden auf 4 cm² ausgezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt. Die Tiere, die mit dem kompletten 97 kD-Antigen oder mit dem Subfragment 97 kD/aa254-323 immunisiert wurden, zeigten im Vergleich zu den anderen Tieren eine Schutzwirkung gegen eine Belastung mit H. pylori.

Abb. 1 Schutzversuch in Mäusen

H. pylori Infektion in Mäusen nach oraler Impfung mit dem 97 kD Protein (1), den Subfragmenten 97 kD/aa17-69 (2), 97 kD/aa148-224 (3), 97 kD/aa254-323 (4) und einer Mischung der Subfragmente (5) und dem 97 kD Protein (5). 6: Infektionskontrolle.

Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 codiert.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 enthält.

3. DNA-Sequenz, die ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften des äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori codiert,

a) die sich von der DNA-Sequenz von Anspruch 2 in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Code unterscheidet,
b) die mit der DNA-Sequenz von Anspruch 2 oder 3(a) hybridisiert, oder
c) die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der DNA- Sequenz von Anspruch 2 ist.

4. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die das äußere Membranprotein von Helicobacter pylori von der Aminosäure Nr. 17 bis 863 (aa17-863) oder ein Fragment davon von der Aminosäure Nr. 254 bis 323 (aa254-323) codiert.

5. Vektor, der die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionssequenz enthält.

6. Zelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist.

7. Zelle nach Anspruch 6, die eine Säugerzelle, bakterielle Zelle, Insektenzelle oder Hefezelle ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori, eines Fragments davon oder eines Proteins mit dessen immunogenen Eigenschaften, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Züchten einer Zelle nach Anspruch 6 oder 7 oder einer mit der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Vektor nach Anspruch 5 transformierten Zelle, und
b) Gewinnung des Membranproteins aus dem Medium oder aus der Zelle.

9. Äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften, das von der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird oder nach dem Verfahren von Anspruch 8 erhältlich ist.

10. Immunogene Zusammensetzung, die ein äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften nach Anspruch 9 enthält.

11. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 10 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

12. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, die ein Impfstoff ist.

13. Verwendung des äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori, eines Fragments davon oder eines Proteins mit dessen immunogenen Eigenschaften nach Anspruch 9 zur Induktion einer Immunantwort gegen Helicobacter pylori in einem mit dem Impfstoff geimpften Empfänger.

14. Antikörper gegen das äußere Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften nach Anspruch 9 oder ein Fragment davon.

15. Antikörper nach Anspruch 14, der ein monoclonaler Antikörper ist.

16. Antikörper nach Anspruch 15, wobei der monoclonale Antikörper ein aus einem Tier stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper, ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon ist.

17. Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 15 erzeugt.

18. Arzneimittel, enthaltend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 16 oder ein Fragment davon.

19. Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 14 bis 16 oder eines Fragments davon zur passiven Immunisierung gegen Helicobacter pylori.

20. Diagnoseverfahren zum Nachweis einer akuten, chronischen oder früheren Infektion mit Helicobacter pylori, bei dem man eine Helicobacter pylori oder dagegen gerichtete Antikörper enthaltende Probe mit einem äußeren Membranprotein von Helicobacter pylori, einem Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften nach Anspruch 9 oder dem Antikörper oder dem Fragment davon nach einem der Ansprüche 14 bis 16 in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob diese an Helicobacter pylori oder dagegen gerichtete Antikörper gebunden sind.

21. Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 20, der ein äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften nach Anspruch 9 oder den Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 16 oder das Fragment davon enthält.