DE19725371A1 - Verfahren zur Beschleunigung der evolutiven Optimierung von Biopolymeren und zur Verbesserung der damit hergestellten Biopolymere - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß Anspruch 1.

Ein wichtiger Zweig der modernen Biotechnologie befaßt sich mit der Herstellung neuer Bio­ polymere.

Das Design größerer Moleküle mit komplexen Funktionen ist mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, im Vergleich etwa zu dem einfacher Oligomere.

Seit der Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sind Verfahren zur gerichteten mo­ lekularen Evolution entwickelt worden, die sich zum Design von Biopolymeren eignen. Ein solches Verfahren ist beispielsweise die evolutive Optimierung funktionaler Biopolymere entsprechend der Patentanmeldung WO 92/18645. Es verwendet eine Mischung verschiedener Polynukleotidstränge, aus denen mittels eines Selektionsverfahrens diejenigen Nukleinsäureketten selektiert werden, die den gesuchten Kriterien am nächsten kommen. Diese werden dann mit einer Polymerase repliziert. Durch dabei auftretende Replikationsfehler (durch äußere Bedingungen einstellbar) oder sonstige chemische oder physikalische Einwirkung wird eine kontrollierte Mutagenese eingeführt. Das Ver­ fahren kann zyklisch wiederholt werden bis Nukleinsäureketten mit den gewünschten Eigenschaften gefunden werden. Das Selektionsverfahren kann sich dabei auf Eigenschaften der Nukleinsäuren sel­ ber oder denen von daraus abgeleiteten Stoffen, z. B. den transkribierten Proteinen, stützen. Ein solches Selektionsverfahren ist beispielsweise in der Patentanmeldung DE 43 01 005 beschrieben. Es basiert auf der konfokalen Fluoreszensspektroskopie kleiner Stoffmengen und ermöglicht, Biopoly­ mere im Hinblick auf die gesuchten Kriterien mit einem Fitness-Wert zahlenmäßig zu bewerten.

Etliche Varianten dieses Verfahrens zur gerichteten molekularen Evolution sind denkbar. Z.B. wird in der Patentanmeldung WO 95/22625 die Möglichkeit der Rekombination eingeführt: Nu­ kleinsäureketten werden fragmentiert und in veränderter Weise wieder zusammengesetzt.

Den Verfahren zur evolutiven Optimierung von Biopolymeren ist gemeinsam, daß jeder einzelne Zyklus mit einem nicht unerheblichen Aufwand an Zeit und Material verbunden ist. In besonderem Maße trifft dies dann zu, wenn jede Fitness-Bewertung mit einer Transkription der Nukleinsäure­ ketten verbunden ist. Daher ist man an einer Minimierung der Zyklenzahl des Verfahrens auf das unbedingt nötige Maß interessiert.

Es ist nun von zentraler Bedeutung, die Stärke der Mutagenese geeignet zu wählen, um zu einer gegebenen Zahl von Zyklen den maximalen Fitness-Gewinn zu erreichen. Von den Methoden der kombinatorischen Optimierung wie z. B. dem "simulated annealing" [1] ist bekannt, daß die finale Fitness des Optimierungsprozesses günstig beeinflußt wird, wenn die Stärke der Mutagenese langsam abgesenkt wird (ggf. unterbrochen durch "Aufheizphasen" stärkerer Mutation, die den globalen Charakter der Optimierung wahren sollen). Dieses Verfahren wird auch bei der evolutiven Optimierung von Biopolymeren mit Erfolg angewandt [2].

Dem liegt zugrunde, daß große Mutationsraten zu Beginn des Prozesses das Durchsuchen großer Bereiche des Suchraumes begünstigen, während sich kleine Mutationsraten bei der Adjustierung bereits hochadaptierter Nukleinsäureketten als günstiger erweisen.

Zwar führt ein langsameres Absenken zu den höchsten Fitness-Werten, die optimale Rate des Absenkens unter Berücksichtigung der Resourcen konnte jedoch bisher nicht exakt hergeleitet wer­ den und wird in der Regel heuristisch gewählt.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem betrifft die Regelung der Stärke der Mutagenese in der evolutiven Optimierung von Biopolymeren in einer Weise, daß in jedem Evolutions-Zyklus der jeweils maximale Fitness-Gewinn erreicht wird. Insbesondere ist das Ziel dieser Rege­ lung, daß die Zyklenzahl des Verfahrens auf das unbedingt nötige Maß reduziert wird.

Gelöst wird dieses Problem durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungs­ gemäßen Verfahrens.

Erfindungsgemäß werden die im Selektionsschritt gemessenen Fitness-Werte der Biopolymere dazu verwendet, die Stärke der Mutagenese in den folgenden Zyklen optimal zu wählen. Dies erfolgt auf der Basis eines geeigneten Modells für die mittlere Wirkung der Mutagenese auf die Verteilung der Fitness-Werte. Die Parameter dieses Modells können im Verlauf der Optimierung oder in getrennter Weise bestimmt werden. Dieser Rahmen liefert den Erwartungswert des maximalen nach der Mutation auftretenden Fitness-Wertes. Es wir diejenige Stärke der Mutation gewählt, die diesen Wert maximiert. Dadurch entfallen langwierige Testreihen zur Ermittlung einer optimalen Mutationsstärke für ein gegebenes Evolutionsproblem. Ebenso benötigt der Evolutionsprozeß im Mittel weniger Zyklen, um zum gleichen Ergebnis zu kommen, als ein vergleichbares Verfahren mit fester Mutationsstärke. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Vorgehensweise werden durch die nachfolgende Beschreibung weiter verdeutlicht.

Vorzugsweise verwendet man ein Modell für die mittlere Wirkung der Mutagenese auf die Verteilung ρ(f) der Fitness-Werte f, das auf den Kumulanten κ_i dieser Verteilung beruht:

Diese repräsentieren Mittelwert, Varianz sowie die höheren Momente der Verteilung. Die Wahl dieser Variablen zur Beschreibung von Fitness-Verteilungen geht zurück auf die Beschreibung der sogenannten genetischen Algorithmen durch Prügel-Bennett und Shapiro [3]. Diese Autoren haben für die genannten Algorithmen ein Verfahren angegeben, um die Evolution von Fitness-Verteilungen vorherzusagen [4], und einen Vorschlag zur Adjustierung ihrer Mutationsrate auf Basis der Kumu­ lanten der vorhergehenden Fitness-Verteilung gemacht [5]. Das erfindungsgemäße Verfahren wendet diesen Formalismus erstmals auf die evolutive Optimierung von Biopolymeren an.

Das Verfahren [3, 4, 5] war zur Regelung der Mutationsrate bislang technisch nicht einsetzbar, da zwei wichtige Voraussetzungen nicht erfüllt waren. Zum einen erfordert es die genaue Kennt­ nis der analytischen Form der Fitness-Funktion, die jedem Genotyp den jeweiligen Fitness-Wert zuordnet. Selbst bei Kenntnis dieser Funktion ist noch nicht gewährleistet, daß die erforderli­ che Rechnung mit dem Verfahren maximaler Entropie durchführbar ist. Zum zweiten sind die gemessenen Kumulanten einer Generation von Strängen starken Fluktuationen unterworfen, die sie praktisch unbrauchbar für die Vorhersage der Mutationsrate machen. Beide Probleme werden durch die folgenden Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst.

Bevorzugt verwendet man als Modell für die mittlere Wirkung der Mutagenese das vereinfachte Modell auf der Basis einer Fitness-Korrelationsfunktion, das in [6] eingeführt wurde. Die Fitness-Verteilung nach der Mutagenese ausgedrückt durch die Kumulanten κ m|i nach der Mutation als Funktion der Kumulanten κ_i vor der Mutation wird durch folgenden Ausdruck approximiert

wobei κ 0|1 und κ 0|2 die mittlere Fitness und Varianz der Fitness einer Population zufällig gewählter Nukleinsäureketten sind. Dies ist eine Vorhersage niedrigster Ordnung für den Ausgang der Muta­ tion, auf der Basis der mittleren Fitness-Korrelation in zwischen einer mutierten Nukleinsäurekette und ihrem unmutierten Pendant. Die benötige Fitness-Korrelation in ist gegeben durch

Sie ist durch Messung zugänglich und das Modell ist für technische Anwendung handhabbar.

Ferner ist es vorteilhaft, den jeweils auftretenden maximalen Fitness-Wert für die Vorhersage zugrundezulegen. Dadurch wird das Problem der starken Fluktuationen gemessener Kumulanten umgangen.

In dieser Formulierung ist der Erwartungswert des maximalen nach der Mutation auftretenden Fitness-Wertes gegeben durch

wobei P die Zahl der parallel betrachteten Selektionseinheiten ist, üblicherweise mit Populations­ größe bezeichnet. In einer vorteilhaften Gaußschen Näherung ist dies

Eine Sattelpunktsintegration liefert dann in führender Ordnung

Mit der über die Kumulanten (4) definierten Fitness-Verteilung kann nun der Erwartungswert der maximalen Fitness f_best in Relation zu m optimiert werden.

Erfindungsgemäß kann dann die resultierende optimale Korrelation m dazu benutzt werden, die Mutationsrate so zu wählen, daß der Fitness-Wert der besten zu erwarteten Nukleinsäurekette im kommenden Zyklus maximiert wird.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, in der in jedem Zyklus nur jeweils die Nukleinsäurekette mit dem höchsten Fitness-Wert selektiert wird, sodann P - 1 mal repliziert wird und die Kopien mutiert werden, erhält man für die Fitness-Verteilung nach der Mutation die Gaußsche Näherung

Eingesetzt in (8) wird der erwartete höchste Fitness-Wert f_best (t + 1) maximal wenn

Dieser Wert wird sodann in eine Mutationsrate γ übersetzt, bespielsweise über eine hergeleitete oder eine gemessene Beziehung zwischen der Mutationsrate γ und der Fitness-Korrelation in. Die Mutationsrate γ wird hier vorteilhaft definiert als der Anteil der durch die Mutagenese veränderten elementaren Informationseinheiten.

In einer vorteilhaften Ausführungsform kann die Relation m(γ) über eine Heuristik im Verlauf der evolutiven Optimierung gemessen werden. Im allgemeinen kann diese Funktion für kleine Mu­ tationsraten als eine monotone Funktion mit einem einfachen Abklingverhalten modelliert werden. Eine Klassifizierung für eine Reihe von Optimierungsproblemen wurde von Stadler [7] vorgenom­ men. Für kleine Mutationsraten γ ist eine brauchbare Näherung durch γ(m) = 1 - α m gegeben. Diese Näherung kann, ausgehend von einer anfänglichen Schätzung für α, im Verlauf der evolutiven Optimierung stetig verbessert werden, indem zum Beispiel in in jedem Zyklus aus den gemessenen Fitness-Werten mit (5) hergeleitet wird und die Schätzung für α damit korrigiert wird.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in jedem Zyklus die Nukleinsäurekette mit dem höchsten Fitness-Wert nur einmal repliziert. Die mutierte Kopie ersetzt sodann die Nukleinsäurekette mit dem niedrigsten Fitness-Wert. Weiterhin werden alle anderen verbleibenden Nukleinsäureketten der Mutation unterworfen. In dieser Spielart wird einer vor­ schnellen Konvergenz durch erhöhte Fitness-Varianz vorgebeugt. Es ist vorteilhaft, in diesem Fall anzunehmen, daß die evolutive Optimierung maßgeblich durch die jeweils beste Nukleinsäureket­ ten vorangetrieben wird. In dieser Näherung wird der erwartete höchste Fitness-Wert im folgenden Zyklus

Die daraus abgeleitete optimale Korrelation ist

Eine anwachsende Korrelation der Nukleinsäureketten in der Population kann durch eine Kom­ bination der beiden betrachteten Regimes berücksichtigt werden:

wobei θ(χ) die gewöhnliche Stufenfunktion ist mit θ(χ) = 0 für χ ≦ 0 und θ(χ) = 1 sonst.

Um das erfindungsgemäße Verfahren weiter zu veranschaulichen, werden nun noch einige Ab­ bildungen angefügt, die die Wirkungsweise des Verfahrens an zwei typischen Fitness-Funktionen zeigen. Die erste der betrachteten Fitness-Funktionen ist

mit zufällig gewählten Koeffizienten J_i aus einer Gauß-Verteilung mit Mittelwert 0 und Varianz 1. Die N Variablen S α|i mit i = 1, . . ., N und S α|i = ±1 symbolisieren einen binären genetischen Strang, wobei α = 1, . . ., P. Die zweite Fitness-Funktion ist das NK-Modell [8], das sich durch eine große Zahl lokaler Minima auszeichnet, sowie Netze neutraler Mutationen implementiert, wie sie auch in Fitness-Landschaften von Biopolymeren auftreten:

mit 2^K+1 zufällig gewählten Werten E_i(S^α) aus einer uniformen Verteilung über dem Intervall [0, 1] und einer zufällig gewählten Permutation i₁ bis i_K, beides für jedes i.

Die Abbildungen zeigen die evolutive Optimierung auf diesen beiden Fitness-Landschaften mit N = 128, P = 50, wobei die Simulationen jeweils über 200 Läufe gemittelt wurden, und für 100 bzw. 1000 Zyklen. Zum Vergleich ist die Optimierung unter festen Mutationsraten γ gezeigt.

In den Abb. 1 und 2 ist das erfindungsgemäße Verfahren (erste Ausführungsform mit totaler Replikation) der Optimierung mit festen Mutationsraten gegenübergestellt.

Die Abb. 3 und 4 zeigen dasselbe für die Ausführungsform mit verdünnter Replikation mit nur jeweils einer Kopie, wie oben beschrieben. In beiden Fällen ist die maximale Fitness in jedem Zyklus vergleichbar der für diesen Zeitabschnitt günstigsten Mutationsrate.

Während in diesen Abbildungen jeweils der theoretische Ausdruck für die Beziehung zwischen Mutationsrate und Korrelation m(γ) verwendet wurde, wird in den verbleibenden Abb. 5 und 6 die oben beschriebene Heuristik zur Messung dieser Relation verwendet, ohne jegliche Kenntnis über diese Beziehung zu Beginn der evolutiven Optimierung.

Claims (9)

1. Verfahren zur Beschleunigung der evolutiven Optimierung von Biopolymeren und zur Verbesse­ rung der damit hergestellten Biopolymere in einem Verfahren mit einem Satz von einfacher oder doppelter Nukleinsäureketten, und mindestens einem Zyklus der folgenden Schritte: Replikation mit einer Polymerase, durch Polymerase oder sonstige chemische oder physikalische Einwirkung erzeugte Mutagenese, sowie Selektion einer Teilmenge der Nukleinsäureketten mit einem Selekti­ onsverfahren, das den Nukleinsäuren selber oder deren Translationsprodukten einen Fitness-Wert zuordnet, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke der Mutagenese in jedem Zyklus so gewählt wird, daß der Erwartungswert der maximalen Fitness nach der Mutation maximiert wird, und für die Berechnung des mittleren Effekts der Mutagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung ein Modell zugrundegelegt wird, das auf einfachen Parametern oder Funktionen beruht, die aus gemessenen Fitness-Werten von Nukleinsäureketten vor und nach einer Mutagenese bestimmt werden können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für den mittleren Effekt der Mu­ tagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung ein Modell zugrundegelegt wird, das auf der Fitness-Korrelation
beruht, wobei f_α und f m|α die Fitness-Werte einer Nukleinsäurekette vor bzw. nach der Mutage­ nese sind, α die betrachteten Nukleinsäureketten durchnumeriert und über α bzw. über α und die Mutagenese gemittelt wird. Für eine Mutagenese beliebiger Stärke γ, wobei γ die Stärke der Mutagenese auf einer Skala von 0 bis 1 (ohne Beschränkung der Allgemeinheit) parametrisiert, verallgemeinert sich obige Definition zu einem funktionalen Zusammenhang m(γ).

3. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Modell für den mittleren Effekt der Mutagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung zugrundegelegt wird, dessen Variablen die Kumulanten der Fitness-Verteilung sind.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß für den mittleren Effekt der Mutagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung ein Modell zugrundegelegt wird das die Fitness-Verteilung nach der Mutagenese durch die Kumulanten κ m|i als Funktion der Kumulanten K_i vor der Mutagenese ausdrückt durch
wobei κ 0|1 und κ 0|2 die mittlere Fitness und Varianz der Fitness in einem gleichgroßen Satz zufällig gewählter Nukleinsäureketten sind.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren Kumulanten höherer Ordnung einschließt.

6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Effekt der Mutagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung (wie ausgedrückt in der Fitness- Korrelation m(γ) falls Anspruch 2 zutrifft) auf andere Weise gewonnen wird, z. B. durch analytische Rechnungen oder unabhängige statistische Meßverfahren.

7. Verfahren gemäß Anspruch 2 und eventuellen weiteren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionale Abhängigkeit der Fitness-Korrelation von der Stärke der Mutagenese γ über die Funktion γ(m) als eine monoton abfallende Funktion mit den Randwerten γ(0) = 0.5 und γ(1) = 0 gewählt und gemäß der Werte-Paare (γ, m), die aus gemessenen Fitness-Werten ermittelt werden, iterativ verbessert wird.

8. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Selektionsverfahren der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) bedient.

9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß statt der evolutiven Optimierung auf Basis von Nukleinsäureketten die evolutive Optimierung in einem Rechner durchgeführt wird. Dabei werden Biopolymere zur Selektion über einen Transkriptions­ prozeß synthetisiert und deren Fitness-Werte mit den üblichen Selektionsverfahren bestimmt.