DE19725371B4

DE19725371B4 - Verfahren zur Beschleunigung der evolutiven Optimierung von Biopolymeren und zur Verbesserung der damit hergestellten Biopolymere

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Publication number: DE19725371B4
Application number: DE1997125371
Authority: DE
Inventors: Stefan Bornholdt
Original assignee: Bornholdt Stefan Dr
Current assignee: Bornholdt Stefan Dr
Priority date: 1997-06-16
Filing date: 1997-06-16
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2017-06-17
Also published as: DE19725371A1

Abstract

Verfahren zur Beschleunigung der evolutiven Optimierung von Biopolymeren und zur Verbesserung der damit hergestellten Biopolymere in einem Verfahren mit einem Satz einfacher oder doppelter Nukleinsäureketten, und mindestens einem Zyklus der folgenden Schritte: Replikation mit einer Polymerase, durch Polymerase oder sonstige chemische oder physikalische Einwirkung erzeugte Mutagenese, sowie Selektion einer Teilmenge der Nukleinsäureketten mit einem Selektionsverfahren, das den Nukleinsäuren selber oder deren Translationsprodukten einen Fitness-Wert zuordnet, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke der Mutagenese in jedem Zyklus so gewählt wird, daß der Erwartungswert der maximalen Fitness nach der Mutation maximiert wird, und für die Berechnung des mittleren Effekts der Mutagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung ein Modell zugrundegelegt wird, das auf der Fitness-Korrelation

beruht, wobei f_α und f m / α die Fitness-Werte einer Nukleinsäurekette vor bzw. nach der Mutagenese sind, α die betrachteten Nukleinsäureketten durchnumeriert und über α bzw. über α und die Mutagenese gemittelt wird. Für eine Mutagenese beliebiger Stärke γ, wobei γ die...

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß Anspruch 1.
Ein wichtiger Zweig der modernen Biotechnologie befaßt sich mit der Herstellung neuer Biopolymere.
Das Design größerer Moleküle mit komplexen Funktionen ist mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, im Vergleich etwa zu dem einfacher Oligomere.

Seit der Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sind Verfahren zur gerichteten molekularen Evolution entwickelt worden, die sich zum Design von Biopolymeren eignen. Ein solches Verfahren ist beispielsweise die evolutive Optimierung funktionaler Biopolymere entsprechend der Patentanmeldung WO 92/18645. Es verwendet eine Mischung verschiedener Polynukleotidstränge, aus denen mittels eines Selektionsverfahrens diejenigen Nukleinsäureketten selektiert werden, die den gesuchten Kriterien am nächsten kommen. Diese werden dann mit einer Polymerase repliziert. Durch dabei auftretende Replikationsfehler (durch äußere Bedingungen einstellbar) oder sonstige chemische oder physikalische Einwirkung wird eine kontrollierte Mutagenese eingeführt. Das Verfahren kann zyklisch wiederholt werden bis Nukleinsäureketten mit den gewunschten Eigenschaften gefunden werden. Das Selektionsverfahren kann sich dabei auf Eigenschaften der Nukleinsäuren selber oder denen von daraus abgeleiteten Stoffen, z.B. den transkribierten Proteinen, stützen. Ein solches Selektionsverfahren ist beispielsweise in der Patentanmeldung DE 4301005 beschrieben. Es basiert auf der konfokalen Fluoreszensspektroskopie kleiner Stoffmengen und ermöglicht, Biopolymere im Hinblick auf die gesuchten Kriterien mit einem Fitness-Wert zahlenmäßig zu bewerten.

Etliche Varianten dieses Verfahrens zur gerichteten molekularen Evolution sind denkbar. Z.B. wird in der Patentanmeldung WO 95/22625 die Möglichkeit der Rekombination eingeführt: Nukleinsäureketten werden fragmentiert und in veränderter Weise wieder zusammengesetzt.

Den Verfahren zur evolutiven Optimierung von Biopolymeren ist gemeinsam, daß jeder einzelne Zyklus mit einem nicht unerheblichen Aufwand an Zeit und Material verbunden ist. In besonderem Maße trifft dies dann zu, wenn jede Fitness-Bewertung mit einer Transkription der Nukleinsäureketten verbunden ist. Daher ist man an einer Minimierung der Zyklenzahl des Verfahrens auf das unbedingt nötige Maß interessiert.

Es ist nun von zentraler Bedeutung, die Stärke der Mutagenese geeignet zu wählen, um zu einer gegebenen Zahl von Zyklen den maximalen Fitness-Gewinn zu erreichen. Von den Methoden der kombinatorischen Optinierung wie z.B. dem "simulated annealing" [1] ist bekannt, daß die finale Fitness des Optimierungsprnzessas günstig beeinflußt wird, wenn die Stärke der Mutagenese langsam abgesenkt wird (ggf. unterbrochen durch "Aufheizphasen" stärkerer Mutation, die den globalen Charakter der Optimierung wahren sollen). Dieses Verfahren wird auch bei der evolutiven Optimierung von Biopolymeren mit Erfolg angewandt [2].

Dem liegt zugrunde, daß große Mutationsraten zu Beginn des Prozesses das Durchsuchen großer Bereiche des Suchraumes begünstigen, während sich kleine Mutationsraten bei der Adjustierung bereits hochadaptierter Nukleinsäureketten als günstiger erweisen.

Zwar führt ein langsameres Absenken zu den höchsten Fitness-Werten, die optimale Rate des Absenkens unter Berücksichtigung der Resourcen konnte jedoch bisher nicht exakt hergeleitet werden und wird in der Regel heuristisch gewählt.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem betrifft die Regelung der Stärke der Mutagenese in der evolutiven Optimierung von Biopolymeren in einer Weise, daß in jedem Evolutions-Zyklus der jeweils maximale Fitness-Gewinn erreicht wird. Insbesondere ist das Ziel dieser Regelung, daß die Zyklenzahl des Verfahrens auf das unbedingt nötige Maß reduziert wird.

Gelöst wird dieses Problem durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Erfindungsgemäß werden die im Selektionsschritt gemessenen Fitness-Werte der Biopolymere dazu verwendet, die Stärke der Mutagenese in den folgenden Zyklen optimal zu wählen. Dies erfolgt auf der Basis eines geeigneten Modells für die mittlere Wirkung der Mutagenese auf die Verteilung der Fitness-Werte. Die Parameter dieses Modells können im Verlauf der Optimierung oder in getrennter Weise bestimmt werden. Dieser Rahmen liefert den Erwartungswert des maximalen nach der Mutation auftretenden Fitness-Wertes. Es wir diejenige Stärke der Mutation gewählt, die diesen Wert maximiert. Dadurch entfallen langwierige Testreihen zur Ermittlung einer optimalen Mutationsstärke für ein gegebenes Evolutionsproblem. Ebenso benötigt der Evolutionsprozeß im Mittel weniger Zyklen, um zum gleichen Ergebnis zu kommen, als ein vergleichbares Verfahren mit fester Mutationsstärke. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Vorgehensweise werden durch die nachfolgende Beschreibung weiter verdeutlicht.

Vorzugsweise verwendet man ein Modell für die mittlere Wirkung der Mutagenese auf die Verteilung ρ(f) der Fitness-Werte f, das auf den Kumulanten κ_i dieser Verteilung beruht:

Diese repräsentieren Mittelwert, Varianz sowie die höheren Momente der Verteilung. Die Wahl dieser Variablen zur Beschreibung von Fitness-Verteilungen geht zurück auf die Beschreibung der sogenannten genetischen Algorithmen durch Prügel-Bennett und Shapiro [3]. Diese Autoren haben für die genannten Algorithmen ein Verfahren angegeben, um die Evolution von Fitness-Verteilungen vorherzusagen [4], und einen Vorschlag zur Adjustierung ihrer Mutationsrate auf Basis der Kumulanten der vorhergehenden Fitness-Verteilung gemacht [5]. Das erfindungsgemäße Verfahren wendet diesen Formalismus erstmals auf die evolutive Optimierung von Biopolymeren an.

Das Verfahren [3, 4, 5] war zur Regelung der Mutationsrate bislang technisch nicht einsetzbar, da zwei wichtige Voraussetzungen nicht erfüllt waren. Zum einen erfordert es die genaue Kenntnis der analytischen Form der Fitness-Funktion, die jedem Genotyp den jeweiligen Fitness-Wert zuordnet. Selbst bei Kenntnis dieser Funktion ist noch nicht gewährleistet, daß die erforderliche Rechnung mit dem Verfahren maximaler Entropie durchführbar ist. Zum zweiten sind die gemessenen Kumulanten einer Generation von Strängen starken Fluktuationen unterworfen, die sie praktisch unbrauchbar für die Vorhersage der Mutationsrate machen. Beide Probleme werden durch die folgenden Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst.

Bevorzugt verwendet man als Modell für die mittlere Wirkung der Mutagenese das vereinfachte Modell auf der Basis einer Fitness-Korrelationsfunktion, das in [6] eingeführt wurde. Die Fitness-Verteilung nach der Mutagenese ausgedrückt durch die Kumulanten κ m / i nach der Mutation als Funktion der Kumulanten κ_i vor der Mutation wird durch folgenden Ausdruck approximiert

wobei κ 0 / 1 und κ 0 / 2 die mittlere Fitness und Varianz der Fitness einer Population zufällig gewählter Nukleinsäureketten sind. Dies ist eine Vorhersage niedrigster Ordnung für den Ausgang der Mutation, auf der Basis der mittleren Fitness-Korrelation m zwischen einer mutierten Nukleinsäurekette und ihrem unmutierten Pendant. Die benötige Fitness-Korrelation m ist gegeben durch

Sie ist durch Messung zugänglich und das Modell ist für technische Anwendung handhabbar. Ferner ist es vorteilhaft, den jeweils auftretenden maximalen Fitness-Wert für die Vorhersage zugrundezulegen. Dadurch wird das Problem der starken Fluktuationen gemessener Kumulanten umgangen.

In dieser Formulierung ist der Erwartungswert des maximalen nach der Mutation auftretenden Fitness-Wertes gegeben durch

wobei P die Zahl der parallel betrachteten Selektionseinheiten ist, üblicherweise mit Populationsgröße bezeichnet, und ρ^m die Verteilung der Fitness-Werte in der Population nach dem Mutationsschritt. Letztere wird hier durch ihre beiden niedrigsten Kumulanten κ m / 1 und κ m / 2 approximiert. In einer vorteilhaften Gaußschen Näherung ist dies

Eine Sattelpunktsintegration liefert dann in führender Ordnung

Mit der über die Kumulanten (4) definierten Fitness-Verteilung kann nun der Erwartungswert der maximalen Fitness f_best in Relation zu m optimiert werden. Erfindungsgemäß kann dann die resultierende optimale Korrelation m dazu benutzt werden, die Mutationsrate so zu wählen, daß der Fitness-Wert der besten zu erwarteten Nukleinsäurekette im kommenden Zyklus maximiert wird.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, in der in jedem Zyklus nur jeweils die Nukleinsäurekette mit dem höchsten Fitness-Wert selektiert wird, sodann P – 1 mal repliziert wird und die Kopien mutiert werden, erhält man für die Fitness-Verteilung nach der Mutation die Gaußsche Näherung

Eingesetzt in (8) wird der erwartete höchste Fitness-Wert f_best(t + 1) maximal wenn

Dieser Wert wird sodann in eine Mutationsrate γ übersetzt, beispielsweise über eine hergeleitete oder eine gemessene Beziehung zwischen der Mutationsrate γ und der Fitness-Korrelation m. Die Mutationsrate γ wird hier vorteilhaft definiert als der Anteil der durch die Mutagenese veränderten elementaren Informationseinheiten.

In einer vorteilhaften Ausführungsform kann die Relation m(γ) über eine Heuristik im Verlauf der evolutiven Optimierung gemessen werden. Im allgemeinen kann diese Funktion für kleine Mutationsraten als eine monotone Funktion mit einem einfachen Abklingverhalten modelliert werden. Eine Klassifizierung für eine Reihe von Optimierungsproblemen wurde von Stadler [7] vorgenommen. Für kleine Mutationsraten γ ist eine brauchbare Näherung durch γ(m) = 1 – α m gegeben. Diese Näherung kann, ausgehend von einer anfänglichen Schätzung für α, im Verlauf der evolutiven Optimierung stetig verbessert werden, indem zum Beispiel m in jedem Zyklus aus den gemessenen Fitness-Werten mit (5) hergeleitet wird und die Schätzung für α damit korrigiert wird.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in jedem Zyklus die Nukleinsäurekette mit dem höchsten Fitness-Wert nur einmal repliziert. Die mutierte Kopie ersetzt sodann die Nukleinsäurekette mit dem niedrigsten Fitness-Wert. Weiterhin werden alle anderen verbleibenden Nukleinsäureketten der Mutation unterworfen. In dieser Spielart wird einer vorschnellen Konvergenz durch erhöhte Fitness-Varianz vorgebeugt. Es ist vorteilhaft, in diesem Fall anzunehmen, daß die evolutive Optimierung maßgeblich durch die jeweils beste Nukleinsäurekette sowie weiterer Vertreter, die mit dieser eng korreliert sind, vorangetrieben wird. Sei diese Gruppe durch M verschiedene Nukleinsäureketten repräsentiert, so wird der erwartete höchste Fitness-Wert im folgenden Zyklus

wobei ρ^m die Verteilung der Fitness-Werte nach der Mutation und ρ⁰ die einer zufälligen Population darstellt. In niedrigster Ordnung ergibt dies

Die daraus abgeleitete optimale Korrelation ist

Im hier betrachteten Testfall reichen schon wenige Mutationsschritte, um die Fitness einer Mutante von der Ursprungssequenz zu dekorrelieren. In dem Fall ist ln(M – 1) von der Größenordnung eins und wir schreiben

Nach dieser Vorschrift wird dann die optimale Korrelation für den nächsten Zeitschritt berechnet, und daraus die Mutationsstärke bestimmt, die den erwarteten Nutzen im nächsten Zeitschritt maximiert.

Um das erfindungsgemäße Verfahren weiter zu veranschaulichen, werden nun noch einige Abbildungen angefügt, die die Wirkungsweise des Verfahrens an zwei typischen Fitness-Funktionen zeigen. Die erste der betrachteten Fitness-Funktionen ist

mit zufällig gewählten Koeffizienten J_i aus einer Gauß-Verteilung mit Mittelwert 0 und Varianz 1. Die N Variablen S α / i mit i = 1, ..., N und S α / i = ±1 symbolisieren einen binären genetischen Strang wobei α = 1, ..., P. Die zweite Fitness-Funktion ist das NK-Modell [8], das sich durch eine große Zahl lokaler Minima auszeichnet, sowie Netze neutraler Mutationen implementiert, wie sie auch in Fitness-Landschaften von Biopolymeren auftreten:

mit 2^K+1 zufällig gewählten Werten E_i(S^α) aus einer uniformen Verteilung über dem Intervall [0,1] und einer zufällig gewählten Permutation i₁ bis i_K, beides für jedes i.

Die Abbildungen zeigen die evolutive Optimierung auf diesen beiden Fitness-Landschaften mit N = 128, P = 50, wobei die Simulationen jeweils über 200 Läufe gemittelt wurden, und für 100 bzw. 1000 Zyklen. Zum Vergleich ist die Optimierung unter festen Mutationsraten γ gezeigt.

In den 1 und 2 ist das erfindungsgemäße Verfahren (erste Ausführungsform mit totaler Replikation) der Optimierung mit festen Mutationsraten gegenübergestellt.

Die 3 und 4 zeigen dasselbe für die Ausführungsform mit verdünnter Replikation mit nur jeweils einer Kopie, wie oben beschrieben. In beiden Fällen ist die maximale Fitness in jedem Zyklus vergleichbar der für diesen Zeitabschnitt günstigsten Mutationsrate.

Während in diesen Abbildungen jeweils der theoretische Ausdruck für die Beziehung zwischen Mutationsrate und Korrelation m(γ) verwendet wurde, wird in den verbleibenden 5 und 6 die onben beschriebene Heuristik zur Messung dieser Relation verwendet, ohne jegliche Kenntnis über diese Beziehung zu Beginn der evolutiven Optimierung.

Abschließend wird als praktisches Ausführungsbeispiel nachgereicht des beanspruchten Verfahrens die verbesserte evolutive Optimierung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) von Aequorea victoria beschrieben. Die evolutive Optimierung erfolgt nach dem Prinzip des SELEX-Verfahrens [9]. Eine erfolgreiche Anwendung dieses Prinzips auf die evolutive Optimierung des grünen fluoreszierenden Proteins wurde in [10] beschrieben. Dieses System steht daher als validiertes Assay-System für die evolutive Optimierung zur Verfügung. Wir nutzen dieses System hier mit zwei Unterschieden:

1. Die Mutagenese erfolgt im Rahmen einer PCR mit erhöhter Fehlerrate über den fehlerhaften Einbau von Nukleinsäuren durch den Einsatz von Taq DNA Polymerase. Die Stärke dieser Mutagenese wird über die Mg⁺⁺ Konzentration kontrolliert.
2. Die Mutationsrate im jeweils nächsten PCR-Schritt wird gemäß dem hier beanspruchten Verfahren eingestellt.

Der Ablauf des Verfahrens erfolgt in einem zyklischen Verfahren wobei eine einzelne Runde dieses Verfahrens aus folgenden Schritten besteht:

1. Beginne mit der natürlichen GFP Gensequenz.
2. Messung der Fluoreszenz der in E. Coli exprimierten GFP-Gensequenz.
3. Polymerisation und Mutagenese obiger Sequenz durch PCR (hier 35 thermische Zyklen mit 94C 30s, 45C 30s, 72C 30s). In der ersten Runde wird die Stärke der Mutagenese über die Mg⁺⁺ Konzentration auf einen mittleren Wert eingestellt. In allen weiteren Runden wird die Mutationsrate auf den weiter unten bestimmten optimalen Wert eingestellt.
4. Expression des erhaltenen Sequenzgemisches in E. Coli verteilt auf P = 10000 Kolonien.
5. Messung der Flunreszenz jeder Kolonie in einer UV Box, die relative Stärke wird auf einer Skala von 0 bis 100 dargestellt und mit f_α bezeichnet, wobei der Index α die Kolonien durchnumeriert von α = 1, ..., P.
6. Berechnung der Fitness-Korrelation m nach Gleichung (5) mit den Daten der Messungen aus den Schritten 2 (die relative Fluoreszenzstärke vor der Mutagenese f_α = f_best der nativen bzw. zuletzt besten Sequenz) und 5 (die relative Fluoreszenzstärke nach der Mutagenese f m / α).
7. Die Kolonie mit der stärksten Fluoreszenz (nunmehr der neue Wert f_best) wird selektiert und ihre DNA sequenziert.
8. Bestimme die optimale Stärke der Mutagenese für den nächsten Zyklus: Berechne dazu m_opt nach Gleichung (10) aus m und der neuen stärksten relativen Fluoreszenz f_best. Die in dieser Gleichung benötigten ersten beiden Momente κ 0 / 1 und κ 0 / 2 der Leuchtkraftverteilung einer randomisierten Anfangspopulation von Sequenzen wurden vorher in einem unabhängigen Zyklus bestimmt. Dazu wurde ausgehend von der nativen GFP-Sequenz ein PCR-Lauf im Grenzfall starker Mutagenese und ohne weitere Selektion betrieben und die erhaltene Leuchtkraftverteilung gemessen. κ 0 / 1 ist der Mittelwert und κ 0 / 2 die Varianz dieser Verteilung. Die optimale Stärke der Mutagenese für den nächsten Zyklus wird aus der linearen Relation γ(m_opt) = 1 – α m_opt bestimmt. Dabei wird α aus der zuletzt verwendeten Mutationsrate γ und der gemessenen Korrelation m bestimmt als
In jeder weiteren Runde erhält man auf diese Weise einen neuen Meßwert für α, mit dem die Abschätzung dieses Parameters verbessert wird. Für die Berechnung von γ(m_opt) verwendet man dann jeweils das arithmetische Mittel aller in den vorigen Schritten bestimmten Werten für α. Die Stärke der Mutagenese γ(m_opt) ist eine Zahl zwischen 0 und 1 und gibt die Wahrscheinlichkeit an, daß eine fehlerhafte Nukleinsäure an einer gegebenen Position eingebaut wird, und zwar unabhängig für jede betrachtete Position. Die genaue Normierung der Beziehung zwischen der Mg⁺⁺ Konzentration und der Mutationsrate wird vorher in einer unabhängigen Titrationsreihe in der Mg⁺⁺ Konzentration bestimmt. γ(m_opt) wird damit in die entsprechende optimale Mg⁺⁺ Konzentration umgerechnet und im nächsten PCR-Zyklus angewandt.
9. Beginne einen neuen PCR-Zyklus mit der in Schritt 7 gefundenen Sequenz. Die Mutagenese wird nunmehr über die im vorigen Schritt bestimmte optimale Mg⁺⁺ Konzentration eingestellt.
10. wie 4
11. wie 5
12. wie 6, wobei f_best nunmehr die relative Fluoreszenz der hellsten Kolonie ist.
13. wie 8, und dann weiter mit 9, usf.

Dieser iterative Vorgang wird bis zu einer vorgegebenen Höchstzahl von Runden fortgeführt, oder bis zum Erreichen eines Stop-Kriteriums, etwa sobald keine Verbesserung mehr erkennbar ist [9]. Dieses Verfahren ermöglicht in diesem Beispiel eine Verbesserung der Fluoreszenz des GFP bei gleichzeitiger Minimierung der nötigen Rundenzahl des SELEX-Verfahrens zu seiner evolutiven Optimierung. Weitere Varianten dieses Verfahrens sind möglich, insbesondere die Anwendung anderer Methoden der PCR-Mutagenese und die Regelung der Mutagenese über andere Parameter des PCR-Verfahrens. Ebenso möglich ist die Einführung der Mutagenese über externe chemische oder andere Mutagene und die Regelung der Mutationsrate über deren Stärke oder Konzentration.
Literatur

[1] E. Aarts and J. Korst, Simulated annealing and Boltzmann machines – A stochastic approach to combinatonal optimization and neural computing, John Wiley & Sons, 1989.
[2] P. Schuster and P.F. Stadler, Landscapes: Complex Optimization Problems and Biopolymer Structures, Computers Chem. 18 (1994) 295–314.
[3] A. Prügel-Bennett and J.L. Shapiro, An Analysis of Genetic Algorithms Using Statistical Mechanics, Phys. Rev. Lett. 72 (1994) 1305.
[4] A. Prügel-Bennett and J.L. Shapiro, The Dynamics of a Genetic Algorithm for simple random Ising Systems, Physica D 104 (1997) 7451.
[5] J.L. Shapiro and A. Prügel-Bennett, Maximum Entropy Analysis of Genetic Algorithm Operators, Lecture Notes in Computer Science 993 (1997) 14–24.
[6] S. Bornholdt, Genetic Algorithm Dynamics on a Rugged Landscape, Physical Review E 57 (1998) 3853–3860.
[7] P. Stadler, Towards a Theory of Landscapes, in R. Lopez-Pena et. al. (eds.), Complex Systems and Binary Netowrks. Berlin: Springer Verlag, 1995.
[8] S. Kauffman and E. Weinberger, The N-k model of rugged fitness landscapes and its application to maturation of the immune response, Journal of Theoretical Biology 141 (1989) 211.
[9] C. Tuerk and M. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science 249 (1990) 505–510.
[10] A. Crameri, E.A. Whitehorn, E. Tate, and W.P. Stemmer, Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, Nature Biotechnology 14 (1996) 315–319.

Claims

Verfahren zur Beschleunigung der evolutiven Optimierung von Biopolymeren und zur Verbesserung der damit hergestellten Biopolymere in einem Verfahren mit einem Satz einfacher oder doppelter Nukleinsäureketten, und mindestens einem Zyklus der folgenden Schritte: Replikation mit einer Polymerase, durch Polymerase oder sonstige chemische oder physikalische Einwirkung erzeugte Mutagenese, sowie Selektion einer Teilmenge der Nukleinsäureketten mit einem Selektionsverfahren, das den Nukleinsäuren selber oder deren Translationsprodukten einen Fitness-Wert zuordnet, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke der Mutagenese in jedem Zyklus so gewählt wird, daß der Erwartungswert der maximalen Fitness nach der Mutation maximiert wird, und für die Berechnung des mittleren Effekts der Mutagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung ein Modell zugrundegelegt wird, das auf der Fitness-Korrelation
beruht, wobei f_α und f m / α die Fitness-Werte einer Nukleinsäurekette vor bzw. nach der Mutagenese sind, α die betrachteten Nukleinsäureketten durchnumeriert und über α bzw. über α und die Mutagenese gemittelt wird. Für eine Mutagenese beliebiger Stärke γ, wobei γ die Stärke der Mutagenese auf einer Skala von 0 bis 1 (ohne Beschränkung der Allgemeinheit) parametrisiert, verallgemeinert sich obige Definition zu einem funktionalen Zusammenhang m(γ).
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Modell für den mittleren Effekt der Mutagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung zugrundegelegt wird, dessen Variablen die Kumulanten der Fitness-Verteilung sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis dadurch gekennzeichnet, daß für den mittleren Effekt der Mutagenese auf die Fitness-Werte-Verteilung ein Modell zugrundegelegt wird das die Fitness-Verteilung nach der Mutagenese durch die Kumulanten κ m / i als Funktion der Kumulanten κ_i vor der Mutagenese ausdrückt durch
wobei κ 0 / 1 und κ 0 / 2 die mittlere Fitness und Varianz der Fitness in einem gleichgroßen Satz zufällig gewählter Nukleinsäureketten sind.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren Kumulanten höherer Ordnung einschließt.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionale Abbhängigkeit der Fitness-Korrelation von der Stärke der Mutagenese γ über die Funktion γ(m) als eine monoton abfallende Funktion mit den Randwerten γ(0) = 0.5 und γ(1) = 0 gewählt und gemäß der Werte-Paare (γ, m), die aus gemessenen Fitness-Werten ermittelt werden, iterativ verbessert wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Selektionsverfahren der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) bedient.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis6, dadurch gekennzeichnet, daß statt der evolutiven Optimierungauf Basis von Nukleinsäureketten die evolutive Optimierung in einem Rechner durchgeführt wird, wobei Biopolymere zur Selektion über einen Transkriptionsprozeß synthetisiert und deren Fitness-Werte mit den üblichen Selektionsverfahren bestimmt werden.