DE1642653C3 - Mehrstufiges Gärverfahren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein mehrstufiges Gärverfahren in einem durch perforierte Platten in Kammern geteilten Gärturm, der eine Luftzufuhr vom Boden aus aufweist.

Aus der DT-AS 1 207 324 ist eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Vergären von Würze bekannt, bei der über die Höhe eines Gärturms verteilt sich über den Querschnitt erstreckende perforierte Verteilerelemente vorgesehen sind, welche die mit der Würze unten zugeführte Luft über den Querschnitt des Gärturms zur Erzielung einer gleichmäßigen Strömungsgeschwindigkeit verteilen und die Ausbildung größerer Gasblasen verhindern. Demgegenüber geht die Erfindung von mehreren getrennt arbeitenden Gärkammern aus, die in Reihe geschaltet sind.

Die mikrobiologische Fermentation wird industriell gewöhnlich diskontinuierlich durchgeführt. Kontinuierliche Verfahrensweisen wurden entweder mit einer einzigen Gärvorrichtung oder mehreren in Reihe angeordneten Gärvorrichtungen angestrebt, jedoch wurde keine Verfahrenstechnik so weit entwickelt, daß sie für technische Zwecke besonders geeignet wäre. Allgemein wird ein kontinuierliches Verfahren mit einer einzigen Gärvorrichtung im Falle der mit Wachstum verbundenen Fermentation durchgeführt, bei der die Bildung eines gewünschten Produkts zusammen mit dem Wachstum des Mikroorganismus in dem Kulturmedium stattfindet. Im Falle von nicht mit Wachstum verbundener Fermentation, bei der die Bildung eines gewünschten Produkts nicht mit dem Wachstum des Mikroorganismus erfolgt, sondern nach Beendigung des mikrowellen Wachstums stattfindet, muß die kontinuierliche Fermentation mit mehr als zwei Gärvorrichlungen durchgeführt werden, wobei in jeder eine besondere Züchtungsphase, die von der anderen verschieden ist, vorgenommen wird, so daß das mikrobielle Wachstum und die Produktbildung während des Verfahrens getrennt stattfinden. Dies erfordert jedoch zusätzliche Einrichtungen, wie beispielsweise ein Belüftungssystem, eine Vorrichtung zum Durchmischen, eine Dosierpumpe mit einer Kapazität, die der Anzahl der verwendeten Gärvorrichtungen proportional ist, und dergleichen. Beim Einsatz im technischen Maßstab ist die zur Durchführung dieses Verfah/CnS auf der Basis eines stationären Zmtands erforderliche Anlage sehr kostspielig.

Der ErSndnsg liegt die Aufgabe zugrunde, ein mehrstufiges Gärverfahren der eingangs angegebenen Art so zu vereinfachen, daß es bei minimalem Kostenaufwand in technischem Maßstab eingesetzt werden kann.
Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch

ίο gelöst, daß die Luft zur Erzielung eines freien Raumes im oberen Teil jeder Kammer des Gärturms geleitet wird. Damit wird eine Luftschicht unter jeder perforierten Platte aufrechterhalten, die eine freie Durchmischung dsr Flüssigkeit zwischen den einzel-

nen Kammern verhindert, so daß jede Kammer wie ein unabhängiger Fermenter arbeitet.

Durch diese Verfahrensweise kann nicht nur diskontinuierlich und kontinuierlich gearbeitet werden, sondern es kann auch eine synchrone Züchtung und

»0 Gewinnung von Zellen sehr wirksam vorgenommen werden. Gegenüber den bekannten kontinuierlichen Verfahren ergeben sich eine Reihe von Vorteilen. Die zur Durchfühiung des Verfahrens erforderliche Vorrirhtt'jig ist in ihrem Aufbau äußerst einfach, es

»5 ist keine Einrichtung zum Durchmischen notwendig, da die Flüssigkeit durch Belüftung gut gerührt wird, und es ist keine Pumpe zum Überführen der Brühe von einem Gefäß zu einem anderen erforderlich. Der Betrieb ist einfach und leicht zu automatisieren, und der stationäre Zustand kann ohne Schwierigkeiten aufrechterhalten werden. Das Kühlen und Erhitzen erfolgt mit hohem Wirkungsgrad aufgrund der großen Wärmeübergangsfläche je Einheit Innenvolumen. Wird ein festes Subsiratmaterial bei der Fermentation verwendet (im folgenden als »Feststoff-Fermentation« bezeichnet), so herden die dispergierten Feststoffteilchen in dem Gärturm durch den Betrieb dei Vorrichtung gehalten, wodurch gewöhnlich eine gute Ausbeute im Verhältnis /u dem eingesetzten Rohmaterial erzielt wird, da wenig Materialverlust durch den Überlauf der Flüssigkeit auftritt. Bei der Feststoff-Fermentation ist c!> weder erforderlich, das Material zu pulverisieren noch ein Lösungsmittel zu verwenden, das für den Mikroorganismus schädlich sein kann. Ferner kann hei einem kontinuierlichen Betrieb das Zellenaiter in der abgezogenen fermentierten Brühe enger in Beziehung zu der durchschnittlichen Verweilzeit gehalten werden als bei einem einzigen Rührbehälter, bei welchem das Zellenalter in der fermentierten Brühe zwischen Null und Unendlich liegt.

Zweckmäßige Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben. Anhand der Zeichnungen wird das erfindungsgemäßc Verfahren beispielsweise näher erläutert. Es zeigt

F i g. 1 einen Längsschnitt durch einen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten mehrstufigen Fermenter,

F i g. 2 eine Draufsicht auf eine zwischen den einzelnen Kammern angeordnete perforierte Platte, F i g. 3 einen Längsschnitt durch eine andere Ausführungsform eines Fermenters,

F i g. 4 eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen der Zellenkonzentration und der durchschnittlichen Verweilzeit in jeder Kammer im Vergleich zu einer Wachstumskurve bei diskontinuierlicher Züchtung gemäß Versuch 4, die zeigt, daß die Zellcnkonzentration be einem kontinuierlichen Ver-

fahren unter Verwendung des Mehrstufenfermenters äß der nachfolgend beschriebenen Art einen tationären Zustand erreicht,
Fig. 5 den Betriebszustand innerhalb jeder Kam_r J_es Fermenters, wenn das Kulturmedium sich in der Fermentation befindet,

pjo 6 die Gesamtströmungscharakteristiken des F menters _{in bezug} auf verschiedene Kombinationen von Lochdurchmesser einer Platte mit dem Verhältnis des Öffnungsquerschnitts jeder Platte zu dem resamtunerschnitt dieser Platte unter Verwendung «nn eewotinlichem Wasser gemäß Versuch 1 und

Fie 7 ebenfalls die GesamtströmungscharakterUtiken eines Fermenters in bezug auf verschiedene Kombinationen des Lochdurchmessers einer Platte mit dem Verhältnis des öffnun^querschnitu jeder Pl-iue zu dem Gesamtquerschnitt der Platte unter Verwenüung einer tatsächlichen fermentierten Brühe maß Versuch '

Fs sei nun auf F i g. 1 Bezug genommen, die im Vertikalschnitt einen zylindrischen mehrstufigen Fermpntcr 7eiet der aus vier Kammern 1 besteht, die Eeinamkr mit den Platten 2 als Trennwandungen äSeordnet sind. Fig. 2 «igt die Oberfläche einer Platte. Jede Kammer kann mit einer Temperaturreeuliereinricruung, wie beispielsweise einem Mantel 3 und einer elektrischen Heizung, ausgestattet sein, und das Kopfstück 5 sowie der Boden 6 sind mit einem PaL von Rohren 4 verbunden, die das Einströmen und Abfließen von Luft bzw. Medium ermöglichen. Diese Rohre können direkt an die Kammern angesSssen sein, und in diesem Falle sind Abschlußen TuJd 6 nicht erforderlich.

Der Fermenter weist gewöhnlich eine Anzahl von Kammern von einheitlicher Form und Größe auf, die üSnander angeordnet sind, doch kann er auch Kammern, die in Form und Größe verschieden sind, auSsen Die Hauptsache ist, daß der Fermenter durch e"ne Platte oder Platten unterteilt ist, von denen de zumindest eine öffnung aufweist. Die

mmmm dieren können, in Betracht gezogen werden. Manchmal werden Drahtgewebeplatten oder poröse oder perforierte Platten verwendet. Die Größe von jedem Loch und die Anzahl der Löcher (öffnungsquerschnittsfläche) werden durch solche Faktoren, wie Größe des Fermenters und Art der gewünschten mikrowellen Reaktion, bestimmt. Die Anzahl der Kammern wird durch die besten Bedingungen vom Standpunkt solcher Faktoren, wie gewünschter Jrermentationstyp, Höhe und Volumen des Fermenters, Belüftungssystem, Druckabfall u. dgl., bestimmt Jede eingesetzte Platte kann mit den Flanschen der Oehäuseteile mit Dichtungen dazwischen verscnrauDt sein. Probeentnahme-, Beschickungs- und/oder Abzugsleitungen oder Hähne 7, die an einzelnen dammern montiert sind, sind ebenfalls zur Kontrolle uno Steuerung der Fermentation nützlich, da sie den Austritt oder Eintritt von flüssigem Inhalt ermöglichen^ Ein Luftfilter ist wie bei den üblichen Fermentern vorgesehen. Schließlich kann dieser mehrstufige Fe/-menter entweder allein oder in einer Gruppe verwendet werden. . .

Spezielle Merkmale dieser Fermentationsvornchtung, wie sie oben beschrieben wurde, sind aus den folgenden Versuchen ersichtlich.

Versuch 1

Die Wirkung der Plattenbeschaffenhert, d. n. des Durchmessers der Löcher und des Verhältnisses der perforierten Querschnittsfläche jeder Platte zur oesamtquerschnittsfläche dieser Platte, ^a™ «»« ™£ mungscharakteristiken der fur das erfindungsgemaße Verfahren verwendeten Fermentationsvornch ung wurde untersucht. Die Vorrichtung war, wie in F\g. 1

gezeigt, mit perforierten Platten m vier« unterte.lt, von denen ,ede eine η Du rehmesscr von 7 cm und eine Hohe von 12 ^ J?*¹«:^^ wurde mit einer Rate von 61 je Stunde η diese Vor richtung vom Boden aus eingepumpt und floß von

der obersten K-mmer .b. *^™*™£ ^

5HiHES

spiel für die Beziehung des Lochdurchmessers mit dem öffnungsverhältnis e.ner Platte zur Gesamtplattenquerschnittsfläche. Die Kombination dieser Größen variiert, wieim folgenden noch erörtert w,rd, Reihe

hndet

_vier. Wenn jedoch Kammern stattweniger als vier. Dies

ist jeaocn zwecMiiauig, ua uaa ..,,.^,„ »»„„ .

während des Betriebs dann sichtbar ist. Das Material, unier vciwcuuun_B ^*.. ..„.._

aus dem die Platten gefertigt sind, ist ebenfalls frei 65 2 mm Durchmesser und einem Verhältnis von Gewählbar, doch sollten die Bestandteile des Mediums samtlochquerschnittsfläche in jeder Platte zur Ge- und das infolge der Fermentation erzeugte Produkt, samtplattenquerschnittsfiäche im Bereich von 1 bis die auf das Plattenmaterial wirken und dices korro- 30 "/0 wurde das Verhalten des Fermenters nicht

beeinflußt. Bei einem Lochdurchmesser von mehr als 3 mm sollte jedoch das Öffnungsverhältnis kleiner sein, um die Heterogenität in dem Fermenter aufrechtzuerhalten. Aus diesem Versuch ist zu schließen, daß sehr komplizierte Beziehungen zwischen dem Lochdurchmesser und dem Verhältnis der perforierten Querschnittsfläche einer Platte zu der Gesamtquerschnittsfläche dieser Platte existieren, um einen optimalen Zustand für die Kombination von beiden züchtet worden war, vorgenommen. Die zugeführte Luft strömte mit einer linearen Geschwindigkeit von 7 cm/Sekunde durch den Fermenter. Nach dem Beginn des mikrowellen Wachstums füllte die Luft in jeder Kammer einen leeren Raum im oberen Teil dieser Kammer gegen die unmittelbar darüber befindliche Platte aus. Eine bestimmte Menge Flüssigkeit, die in jeder einzelnen Kammer gehalten wurde, wurde in Abhängigkeit von der Menge an zugeführter Luft,

zu erzielen. Der obige Versuch beruhte auf dem io dem Durchmesser der Löcher, dem ÖffnungsverhäK-

reinen Wasser-Luft-System, und die Situation wird daher durch das verwendete System weitgehend beeinflußt.

Versuch 2

nis in jeder Platte, den physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeit u. dgl. bestimmt. Es wurde diese bestimmte Menge Flüssigkeit in jeder Kammer gehalten, wobei selten Mischen mit der Flüssigkeit in der benachbarten Kammer auftrat. Auf diese Weise arbeitete jede Kammer getrennt und einzeln als einzelne Fermentationsvorrichtung.

Die Phasen von bakteriellem Wachstum in der Kultur in den jeweiligen Kammern wurden beobachtet und aufgezeichnet (nachfolgende Tabelle 1). Zusammenfassend gesagt unterscheiden sich die Wachstumsphasen von einer Kammer zu einer anderen, und die Unterschiede zwischen den erhaltenen Werten liegen außerhalb des Bereichs statistischer Fehler.

Die Wirkung der Plattenbeschaffenheit, wie sie in Versuch 1 beschrieben ist, auf die Strömungscharakleristiken eines vorstehend beschriebenen Fermenters wurde untersucht, wobei dieses Mal eine Fermentationsbrühe verwendet wurde.

Xanthomonas campestoris B-324 wurde bei 30 X zwei Tage lang in einem Medium gezüchtet, das 3% Glucose, 0,2°/n Pepton, 0,2«/- Fumarsäure, 0,2⁰O KH.,PO₄, 0,2 °/o Na₂CO₃ und 0,05⁰O MgSO₄ 7H₂O

enthielt und mit NaOH auf pH 6,0 eingestellt war. 25 Die Werte in Tabelle I geben die optische Dichte-Die oben erhaltene viskose Kulturbrühe wurde zur einheit an (im nachfolgenden bezeichnet als O. D.:

Bestimmung der Strömungscharakteristiken dieses Fermentes in der gleichen Weise, wie in Versuch 1 beschrieben, verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt.

Unter Verwendung der Platten nut Löchern mit 5 mm Durchmesser und einem Öffnungsverhältnis in jeder Platte im Bereich von 1 bis 40 ⁰Zo wurde die Heterogenität in dem Fermenter völlig aufrechterhalten. Bei einem Lochdurchmesser von mehr als 8 mm sollte dagegen das Öffnungsverhältnis kleiner sein, um die Heterogenität aufrechtzuerhalten.

Aus den obigen Versuchen 1 und 2 ist ersichtlich, daß eine solche Beziehung eine komplizierte Funktion der Flüssigkeitseigenschaften, wie Dichte, Viskosität und Oberflächenspannung, der Belüftungsrate, der Flüssigkeitsströmungsrate, des Abstands von einer Platte zu einer anderen, des Durchmessers einer Platte (der Größe des Fermenters) usw. ist. Die Wahl optische Dichte bei 610 ηηι
nungen).

Anzahl von Verdün-

Versuch 4

Kammer (vom Boden aus)	OD 0	zu verseil 1	tedenen Zu 2	ohtungsstu 3	lden 4
Nr. 1	0,10	0,220	0,421	0,756	1,02
Nr. 2	0,10	0,210	0,412	0,743	0,98
Nr. 3	0,11	0,207	0,410	0,735	0,95
Nr. 4	0,11	0,205	0,405	0,731	0,95

Versuch 4

Nach den obigen Arbeitsweisen wurde eine Fer-

der Platte bezüglich der obigen Kombination von 45 mentation in einem anderen Fermenter durchgeführt, Lochdurchmesser und Öffnungsverhältnis hängt auch der dieses Mal in 10 Kammern mit in gleichem Abstand angeordneten Platten unterteilt war, wobei jede Platte Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm und

ein Öffnungsverhältnis von 11⁰O aufwies.

von dem Fermentationsobjekt ab. Unter Berücksichtigung der oben beschriebenen Faktoren sollte die optimale Beschaffenheit einer Platte indmduell bei

jedem Versuch vor dem tatsächlichen Einsatz des 50 Nach 3stündiger Vorkultivierung wurde ein Medium Fermenters bestimmt werden. Es ist zwar sehr schwie- mit der gleichen Zusammensetzung wie in Versuch 3 rig, solche Plattenbeschaffenheiten zu verallgemei- " ~

nern, doch liegt die am häufigsten angewendete Kombination im Bereich zwischen 1 und 20 mm bezüglich mit einer konstanten Rate vom Boden des Fermenters aus zugeführt. Die Verdünnungsrate, bezoger auf das Gesamtvolumen des Mediums, betrug Vs j<

des Durchmessers der Löcher und 1 und 40·/« bezug- 55 Stunde. Insbesondere wurde die Menge an zugeführ Hch des Öffnungsverhältnisses. tem Medium so eingestellt, daß die Verdünnungsrat«

,_ in der Bodenkammer die maximale spezifische Wachs

Versucn S tumsrate des Mikroorganismus nicht überstieg. Über

Ein Zochtungsmednim (pH 7,0), das je Liter 1 g schüssige Flüssigkeit, die durch den Fermenter nacl

Glucose, 0,5 g Hefeextrakt, 5,0 g NH₄Cl, 1,0 g 60 oben geführt wurde, floß vom oberen Ende über.

NH₁NO₃. 2.0 g Na₂SO,, 0,1 g MgSO₄ · 7 H.O, 3,0 g Die Unterschiede in der Zellenkonzentration vo

K.HPO₄ und 1,0 g KH₄PO₄ enthielt, wurde in einen einer Kammer zu der nächsten wurden mit fortschrei

zyiinderförmigen "Fermenter mit einer Höhe von tender Zeit ersichtlicher, and nach 17 bis 20 Stunde

130 cm und einem Durchmesser von 7 cm einge- kam der Gradient in der Zellenkonzentration in eine

bracht, der dutcJi fünf quer angeordnete Platten 65 stationären Zustand. Die ZeJlenkonzentration (O. D

gleichmäßig in sechs Kammern unterteilt war. bei diesem Zustand und der Nudeinsäuregehalt :

Die Beimpfunp wurde mit 5 Volumprozent einer O. D. in den einzelnen Kammern sind in Tabelle

Imnfkiiitur von I coli B-548. die IC Stunden cc- anccpcbcn. In Fip. 4 sind ebenfalls die Zcllci

konzentrationen in einigen Kammern in Abhängigkeit von der durchschnittlichen Veirweilzeit, zu Vergleichszwecken zusammen mit der Wachstumskurve bei diskontinuierlicher Kultur, gezeigt.

Tabelle II	Kammer	Zellenkonzentration	Nucleinsäure
(vom Boden aus)	(O. D.)	J--RNS/O. D.
Nr. 3	0,310	15,0
Nr. 5	0,492	10,0
Nr. 7	0,698	8,3
Nr. 9	0,792	8,0
Nr. 10	0,810	7,9

Die obigen beiden Versuche 3 und 4 zeigen, daß die mehrstufige Fermentationsvorrichtung die folgenden Merkmale aufweist: Wenn Mikroorganismen in einem solchen Fermenter wie in Versuch 3 gezüchtet werden, wirkt jede Kammer als einzelner Fermenter, in welchem die Luft den oberen Teil des Raums angrenzend an die darüber befindliche Platte ausfüllt und hier als Kissen wirkt. Mit anderen Worten, das Medium innerhalb einer Kammer wird durch Belüftung gründlich gemischt, doch mischt es sich kaum mit dem Medium in den benachbarten Kammern. Die Gehalte an Zellen variieren daher zwischen den einzelnen Kammern.

Wird andererseits das Kulturmedium mit einer bestimmten Rate vom Boden des Fermenters aus eingeführt, d. h. die Fermentation kontinuierlich durchgeführt, so ist die Verteilung der Zellen etwas anders. Während das Medium in jeder Kammer gut gerührt und gemischt wird, bewegt sich eine gewisse Menge des Mediums, die der vom Boden aus einströmenden Menge entspricht, aufwärts von einer Kammer zu der nächsten durch die Löcher in der oberen Platte. Hierbei hindern Faktoren, wie die Reibung an der Platte, der Flüssigkeitsgehalt, die Belüftung u.dgl., das Medium am Aufströmen und bewirken so, daß die Luft den oberen Teil einer Kammer unter der oberen Platte ausfüllt, wie wenn alle Kammern gesondert, wie oben beschrieben, betrieben werden. Diese Bedingungen sind in F i g. 5 gezeigt. Die Aufwärtsströmung und Zufuhr des Mediums werden jedoch quantitativ durchgeführt. Wenn das Medium in jeder Kammer gründlich gemischt ist, nimmt die Strömung des Mediums als Ganzes die deutliche Form einer Kolbenströmung an. Das Medium wird so nach oben gedrückt und am oberen Ende des Fermenters quantitativ abgezogen. Das gleiche Prinzip kann auf den Betrieb mit einer Batterie von Fermentern, die in Reihe angeordnet sind, angewendet werden.

Der Versuch 4 zeigt, daß, wenn das Wachstum den stationären Zustand erreicht, jede Kammer Zellen bei der durchschnittlichen Verweilzeit hält. Die Zellenkonzentration variiert daher mit den Kammern. Spezieller ausgedrückt erfolgt die Züchtung kontinuierlich unter solchen Bedingungen, daß die Zellen sich am Boden stets am Beginn ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden, diejenigen in der Mitte in der Zwischenphase und diejenigen am oberen Ende in der Endphase, und zwar durch eine geeignete Kombination der Strömungsrate des Mediums mit der Zellenwachstumsrate. Wird ein gewünschtes Produkt bei dem Zellenwachstum oder bei einer gewissen Periode der Wachstumsphase gebildet, so tritt die unterschiedliche Verteilung der Produktkonzentration in der gleichen Weise auf.

Die Tatsache, daß der Unterschied in der Zellenkonzentration in den jeweiligen Kammern nicht nur auf physikalischen Faktoren beruht, wurde mittels der biologischen Aktivitäten von Zellen nachgewiesen, die aus den jeweiligen Kammern entnommen wurden,

ίο beispielsweise durch den Nucleinsäuregehalt der Zellen. Es ist wesentlich, daß beim Betrieb jeder Kammer als einzelne Fermentiervorrichtung in einem kontinuierlichen Verfahren das Verhältnis des Volumens der Kammer zu der Strömungsrate des Mediums. d. h. die Verdünnungsrate, die maximale spezifische Wachstumsrale des Mikroorganismus nicht übersteigt. Die aus dem Überlauf erhaltenen Zellen haben daher unter stationären Züchtungsbedingungen eine gewisse durchschnittliche Verweilzeit oder ein

ao gewisses Zellenalter. Je mehr der Fermenter unterteilt ist, um so mehr arbeitet das Gesamtverfahren nach einem perfekten Kolbenströmungsmuster und um so deutlicher wird das Muster des Zellenkonzentrationsgradienten. Dies kann sowohl theoretisch als auch experimentell nachgewiesen werden.

Es wurde ein kontinuierliches Verfahren beschrieben, bei welchem das Medium vom Boden des Fermenters aus eingeführt wird, doch kann das gleiche Grundverfahren statt dessen auch umgekehrt unter Einführung des Mediums vom oberen Ende her ohne Einbuße der vorteilhaften Charakteristiken des bereits beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden. In diesem zweiten Falle tritt die Verteilung der Zellen natürlich vom oberen Ende nach dem Boden zu auf.

Bei anaerober Fermentation wird durch Inertgas, wie beispielsweise Stickstoff oder Kohlendioxyd, und im Verlaufe der Fermentation entwickelte Gasblasen der gleiche Effekt wie mit Luft oder Belüftung bei aerober Fermentation erzielt.

Im folgenden wird die Erfindung beispielhaft erläutert.

Beispiel 1

Ein zylindrischer Fermenter mit einem Innendurchmesser von 6 cm und einer Höhe von 120 cm war durch vier quer angeordnete Platten in gleiche Teile unterteilt, wobei jede Platte mehrere Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm aufwies und das Öffnungsverhältnis 20%> ausmachte (vgl. Fig. 1).

Rohes technisches Naphthalin wurde in einer Menge von 10 Gewichtsprozent der Gesamtflüssigkeit in die zweite Kammer von unten eingeführt, und ein von Bakterien freies Züchtungsmedium, das 0,25 ⁰Zo Ammoniumchlorid, 2% Manganchlorid, 0,005 ^β,Ό Ferrosulfat und 0,05⁰O Calciumchlorid enthielt, wurde eingegossen, wonach die Kammer mit Pseudomonas aeruginosa Nr. B-344 beimpft wurde. Bei der Durchführung der Fermentation bei 30⁰C unter Belüftung mit einer linearen Geschwindigkeit von 8 cm/Sekunde gelangte eine gewisse Menge des in dieser Kammer vorhandenen festen Naphthalins durch die Löcher in den Platten in die benachbarten Kammern. Nach 36stündiger Fermentation waren 10,6 g Salicylsäure je Liter erzeugt. Diese Salicyl säure wird durch weitere Fermentation nicht vermin dert oder zersetzt.

Nach beendeter Fermentation wurde die fermentierte Brühe vom Boden des Fermenters abgezogen,

und 85% des anfänglichen festen Naphthalins wurde in dem Fermenter gesammelt. Unter Verwendung dieses wiedergewonnenen Naphthalins und der Zellen, die in dem Fermenter geblieben waren, wurde ein weiterer Fermentationszyklus durch einfaches Einbringen der oben beschriebenen Minerallösung durchgeführt. Dieser Arbeitsgang wurde sechsmal wiederholt.

Beispiel 2

Ein Züchtungsmedium mit einem Gehalt von 10"« Glucose, 1% Harnstoff, 0,1 «Ό KR₁PO₄, 0,04»« MgSO₁ · 7 K₁O, 0,6% Maisquell wasser, 0,1 «Ό Hefeextrakt, 2 Teile je Million Fe⁺ + , 2 Teile je Million Mn⁺⁺ und 2 mg/1 Biotin wurde in den gleichen Fermenter wie in Beispiel 1 in der gleichen Weise eingebracht. Nach der Sterilisation wurde das Medium auf 30° C abgekühlt und mit der Impfkultur in einer Menge, die 3 Volumprozent des Mediums entsprach, beimpft, wobei die Impfkultur durch Züchtung von Corynebacterium gelatinosum Nr. 7183 in einem Medium erhalten war, das die gleiche Zusammensetzung, wie oben beschrieben, mit der einzigen Ausnahme hatte, daß der Glucosegehalt 8% betrug. Es wurde dann bei 30° C unter einer Belüftung von 200 bis 400 ecm je Minute gezüchtet. Nach 58 Stunden erreichte der Di.-Alanin-Gehalt in dem Medium 40 g/l. Die Anzahl der verwendeten Platten kann frei gewählt werden und beeinflußt selbst das Ergebnis des Arbeitsgangs im Falle dieses diskontinuierlichen Verfahrens nicht.

Ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung der gleichen Bestandteile und von fünf in gleichem Abstand quer in dem Fermenter angeordneten Platten wurde dann durchgeführt. ■''« des Gesamtvolumens des Mediums wurde je Stunde vom Boden des Fermenters aus eingebracht. In etwa 24 Stunden war der stationäre Zustand erreicht. Der Gehalt an Zellen und Alanin in dem Medium war in den jeweiligen Kammern verschieden. Beide Gehalte waren, wie festgestellt wurde, in der obersten Kammer am höchsten, nämlich 34 g/l Alanin und 9,2 O. D. Bakterienzellen. So betrug beispielsweise der Alaningehalt in den jeweiligen Kammern von unten nach oben: (1) 0,5 g/l, (2) 5 g/l, (3) 17 g/l, (4) 29 g/l, (5)34gl.

Beispiel 3

Nach den in Beispiel I beschriebenen Arbeitsweisen wurde das Medium hergestellt und mit dem gleichen Bakterieninoculum beimpft Naphthalin wurde wie in Beispiel 4 verwendet.

Nach 24stündiger Fermentation erreichte der SaIicylsäuregehaU in dem Medium 6,2 gi. Von diesem Zeitpunkt ab wurde eine sterilisierte anorganische Salzlösung vom Boden aus mittels einer Dosierpumpe eingeführt. Der Mengenanteil dieser Lösung zu der Gesamtflüssigkeit in dem Fermenter oder die Verdünnungsrate betrug ¹Zu je Stunde. Nach 40 Stunden vom Beginn des Verfahrens ab enthielt jede Kammer Bakterienzellcn und Salicylsäure, und der stationäre Zustand war erreicht. Die Menge an gebildeter Salicylsäure betrug von der Bodenkammer aus nach oben: (I) 0,8 g I. (2) 0,8 g/l. (3) 6,3 g/l und (4) 7,5 g/l. Der Gehalt in der vierten Kammer war mit dem Gehalt in der abgezogenen fermentierten Brühe identisch. Die Fermentation wurde kontinuierlich etwa 10 Tage durchgeführt, bis das feste Naphthalin in dem Fermenter vollständig verbraucht war.

Beispiel 4

Ein säulenförmiger 5-1-Fermenter war in 6 Kammern unterteilt, wobei bei jeder Platte die Löcher 20% ihrer Gesamtfläche ausmachten und die Löcher jeweils einen Durchmesser von 2 mm aufwiesen. Die Einteilung war so, daß die erste Kammer (Bodenkammer) ein Volumen von 1,5 1 aufwies und die restlichen Kammern jeweils ein Volumen von 0,7 1 hatten. Unter Verwendung von Leichtöl wurde die Fermentation von Hefe (Candida lypolitica) und die Entparaffinierung durchgeführt.

100 Teile Medium (pH 4,5), das 3,0 g Ammoniumsulfat, ! ,0 g Kaliumphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 0,1 g Hefeextrakt und oine kleine Menge an Spurenelementen je Liter enthielt, wurden mit 15 Teilen Leichtöl und 0,02 Teilen eines oberflächenaktiven Mittels so gemischt, daß eine stabile Emulsion gebildet wurde.

Vor dieser Stufe wurde Candida lypolitica 35 Stunden in einem Medium der gleichen Zusammensetzung wie oben gezüchtet. 5 Volumprozent dieser Vorkultur von Candida lypolitica wurde zu dem obigen emulgierten Medium zugegeben und die Züchtung bei 28° C unter Belüftung mit einer Rate von 15 1 Minute durchgeführt.

Nach 24stündiger Fermentation wurde ein emulgiertes Medium, das mit 15 Teilen Leichtöl je 100 Teile Wasser gemischt war, vom Boden her mit einer Rate von 300 ml· Stunde eingeführt und so eine kontinuierliche Fermentation vorgenommen. Die fermentierte Brühe, die aus Hefezellen, nicht verwertetem Leichtöl und Wasser bestand und eine gewisse Verfilzen hatte, wurde fortschreitend am oberen Ende des Fermenters abgezogen.

Nach Erreichen des stationären Zustands wurde aus jeder Kammer eine Probe der Brühe entnommen. Der Gehalt an Hefezellen und Leichtöl war der folgende: 1,6 g/l (Trockengewicht) Zellmasse und 14,0 Teile (Volumteile) ölschicht (je 100 Teile anfänglichem Wasser) in der ersten Kammer, 2,5 g 1 und 12,8 Teile in der dritten und 3,1 g/l und 11,5 Teile in der fünften. Die überfließende Brühe wurde nach bekannten Methoden in Zellkörper, entparaffiniertes Leichtöl und Wasser getrennt.

Beispiel 5

5» In einem l-ermenter mit einem Innendurchmesset von 6,5 cm, der in 10 Kammern unterteilt war, wobei jede der Platten 100 Locher mit 2 mm Durchmesset aufwies, wurde die Produktion von Bakteriensporeti in einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt

Als Impfkultur wurde auf einem Bouillonschräg· agar gelagerter Bacillus stearothermophilus ATCC 8005 in das Glucose-Bouillonmedium eingeimpft unti unter aeroben Bedingungen bei 55 C gezüchtet. Di« Hauptsporenproduktion wurde mit 5 Volumprozent

dieser Kultur begonnen. Das Gesamtvolumen betruf 4,01.

Das Medium enthielt 6 g Glucose, Π g Hefe extrakt, 1 g KH,,PO₄, 0,! g MnSO₁ H₄O, 0,01 j FeSO₄^H₄O, 0,1g CaCl. und 11 destillierte Wasser. Nach 4 bis 5 Stunden wurde zusätzliche: Medium kontinuierlich am Boden des Fermenters it einer Menge von 360 ml/Stunde zugeführt. Die fer mentierte Brühe, uic Sporen enthielt, floß am oberet

Ende über. Der Dipicolinsäuregehalt und die O. D. der Zellen in den jeweiligen Kammern erreichten den stationären Zustand. Die Zellenkonzentration erhöht sich gegen die oberen Kammern zu. In den unteren Kammern wurde keine Dipicolinsäure festgestellt, sondern nur in den Kammern oberhalb der sechsten. Der Dipicolinsäuregehalt wurde bei 60 v/ml gehalten. Dies ermöglichte, daß mehr als 80% der Gesamtzellen unter den Züchtungsbedingungen Sporen bilden. Die Sporen enthaltende Brühe wurde zentrifugiert, oder es wurden die Sporen aus der Sporensuspension durch die Schaumflotationsmethode gesammelt.

Beispiel 6

Unter Verwendung einer Kulturlösung von Escherichia coli IAM-1253, die in einem 2%> Glucose und 1 °/o Hefeextrakt enthaltenden Medium 24 Stunden bei 30° C gezüchtet worden waren, wurden Bakterienzellen konzentriert und/oder fraktioniert. Zu der obigen Kulturlösung wurden 0,2 g/l an Aluminiumsulfat und 40 mg/1 an Laurinsäure (Äthanollösung) zugegeben. Das Gemisch wurde auf pH 7,2 eingestellt und in einen zylindrischen mehrstufigen Fermenter mit einer Höhe von ! 20 cm und einem Durchmesser von 6 cm gegossen, der durch 10 Platten in 11 Kammern unterteilt war, wobei in jeder Platte die Löcher von 5 mm Durchmesser 11 °/o der gesamten Plattenfläche ausmachten. Luft wurde in den obigen Fermenter nach dessen Füllen mit dem Gemisch mit einer Geschwindigkeit von etwa 7 cm/ Sekunde eingeführt. Nach 25minütiger Belüftung wurde eine Probe der Lösung aus jeder Kammer entnommen, und die Anzahl der Zellen wurde darin bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Anzahl der Zellen in der obersten Kammer diejenige in der Bodenkammer um etwa das lOfache überstieg. Die Anzahl der Zellen in den dazwischenliegenden Kammern differierte stufenweise, von einer Kammer zur nächsten vom Boden aus nach oben ansteigend. Obgleich die Zellkörper in den verschiedenen Kammern durch ein Mikroskop nicht sichtbar waren, waren nicht bakterielle Festsubstanzen in den unteren Kammern sichtbar, deren Anzahl gegen den Boden zunahm. Die physiologischen Aktivitäten der aus den jeweiligen Kammern entnommenen Zellkörper wurden in Termen der Aktivität für die Substratoxydation einer Zelleneinheit mit Glucose als Substrat bestimmt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Werte. Die Gesamt-O. D./ml wurde durch Multiplizieren der optischen Dichte bei 610 πΐμ der verdünnten Probe mit der Anzahl der Verdünnungen erhalten. Sie betrug in allen Kammern vor der Belüftung 5,0. Nach Belüftung variierte sie jedoch von 1,0 am Boden bis 10,4 in der neunten Kammer.

Die nachfolgende Tabelle zeigt auch die Anzahl der Zellen in jeder Kammer gegenüber der Gesamtanzahl an Zellen: 73⁰O der Gesamtanzahl der Zellen fanden sich in den Kammern 7 bis 10 und die restlichen 27 ⁰Zo in der ersten bis sechsten Kammer. Cj in der Tabelle, die Rate der Sauerstoffabsorption je Zelleneinheit, ist im Vergleich zu dem Wert in der ersten Kammer mit 1,00 als Basiswert angegeben. Es ist ersichtlich, daß die Aktivität in der ersten Kammer am niedrigsten ist und nach den oberen Kammern hin zunimmt.

Tabelle III

Kammer (vom Boden aus)	O. D. (610 πιμ)	Verteilung der Zellen	1,00
Nr. 1	1	1,97	1,10
Nr. 3	2,1	4,13	1,30
Nr. 5 .	3,8	7,48	1,38
Nr. 7	8,1	15,95	1,50
Nr. 9	10,4	20,47

Beispiel 7

Ein Züchtungsmedium (pH 7,0), das 0,5 °/o Glucose, l,3»/o Hefeextrakt, 0,1 ".Ό KR₁PO₄, 0,01 «/■> MnSO₄ ■ H₂O, 0,001 % FeSO₄ · 7 H₂O"und 0,005«,. MgSO₄ · 7 H..O enthielt, wurde mit Bacillus subtilis IAM/1214 beimpft und unter Belüftungsbewegung 24 Stunden bei 30° C gezüchtet. Nach dieser Zeitspanne waren 1,9 -1O¹VcCm Sporen aus insgesamt

2.1 ■ 10⁹/ccm Zellen gebildet. 2 1 der obigen Lösung, in der die Sporen und vegetativen Zellen des obigen Stammes gemischt waren, wurden in einen mehrstufigen Fermenter mit einem Volumen von 3,2 1 eingebracht, der durch 8 Platten (bei denen die Löcher von jeweils 4 mm Durchmesser 16^u/o ihrer Gesamtfläche ausmachten) in 9 Kammern unterteilt war. Die Luft wurde durch eine Belüftungsdüse am Boden mit einer Rate von 4 l/Minute eingeführt. Bei einem pH-Wert von 7,3 und einer Temperatur von 28° C begann das Schäumen in den Kammern, und es wurde

unmittelbar unterhalb von jeder Platte ein fortgeschrittenes Schäumen beobachtet. Die Luftmenge wurde alle 5 Minuten um 0,5 l/Minute erhöht, bis schließlich 19 l/Minute erreicht waren. Hierdurch wurde das Volumen der Schaumschichten an den fortgeschrittenen Stellen erhöht, so daß eine gewisse Menge der Kulturlösung in jeder Kammer gehalter wurde. Nach 120minütiger Belüftung unter der obigen Bedingungen wurde die Anzahl der Sporer für die oberen beiden und unteren beiden Kämmen bestimmt: 1,1 ■ 10¹⁰/ccm und 1,0· 10^I0/ccm für di< beiden oberen Kammern und 2 · 10⁷/ccm un<

1.2 · l0⁷/ccm für die beiden unteren Kammern. Mi anderen Worten 7«gen die obigen Ergebnisse, dal etwa 90 ⁰O oder mehr der Gesamtsporen in dei oberen beiden Kammern gesammelt waren. Sie zeigei auch, daß, da die Anzahl der Zellen in den jeweilige! Kammern sich nicht stark unterschied, die Anzah der Sporen je Anzahl der Zellen in diesen oberei Kammern beträchtlich erhöht war. Die Flüssigkeit ii diesen Kammern wurde abgezogen und als Sporen suspension verwende!.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Mehrstufiges Gärverfahren in einem durch perforierte Platten in Kammern geteilten Gärturm, der eine Luftzufuhr vom Boden aus aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Luft zur Erzielung eines freien Raumes im oberen Teil jeder Kammer geleitet wird.

2. Veifahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Ausbildung des freien Raums im oberen Teil, jeder Kammer ein Nährmedium unter Belüftung vom Boden des Gärturms aufwärts durch den Gärturm geführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium kontinuierlich zugeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Nährmediumkomponente zumindest ein Erdölprodukt eingesetzt wird.