DE1598264C3

DE1598264C3 - Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einer Ghrtaminsäure-Ketosäure-Transaminase

Info

Publication number: DE1598264C3
Application number: DE1598264A
Authority: DE
Inventors: Nobuhiko Prof. Tokushima Katsunuma (Japan)
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1965-05-11
Filing date: 1966-05-10
Publication date: 1974-05-09
Also published as: DE1598264B2; US3458403A; DE1598264A1; GB1143835A

Description

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Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einer Glutaminsäure-Ketosäure-Transaminase mit Ausnahme der Glutaminsäiire-Oxalessigsäure-Transaminase sowie Präparate für diesen Zweck.

Es ist bekannt, daß die Aktivität von Glutaminsäure-Ketosäure-Transaminase in Geweben oder Körperflüssigkeiten bei verschiedenen Herzkrankheiten, Leberkrankheiten od. dgl. schwankt; aus diesem Grunde wurde die Bestimmung der Aktivität der Glutaminsäure-Ketosäure-Transaminase zur Diagnose dieser Krankheiten durchgeführt.

Bisher wurden zwei Verfahren zur Bestimmung der Transaminaseaktivität bei klinischen und biochemischen Untersuchungen routinemäßig angewendet. Diese Verfahren beruhen auf verschiedenen Prinzipien. Bei dem einen Verfahren bedient man sich der Spektrophotometrie, während man sich beim anderen Verfahren die Färbung zunutze macht, die durch 2,4-Dinitrophenylhydrazin von entweder nicht umgesetzten oder umgesetzten a-Ketosäuren entwickelt wird.

Bei dem ersten Verfahren wird die Transaminase mit einer geeigneten Hydrogenasereaktion gekoppelt, und die aus diesen beiden enzymatischen Reaktionen resultierende abnehmende Menge an NADH₂ wird mit dem UV-Meter gemessen. Dieses erste Verfahren ist exakt und einfach durchzuführen, es erfordert jedoch ein UV-Spektrophotometer zur Bestimmung der optischen Dichte mit 340 ΐημ, und es muß daher eine große Anzahl von Proben gemessen werden. Bei klinischen Forschungen erfordert dies einen großen Zeitaufwand.

Beim zweiten Verfahren bringt man eine einzige enzymatische Reaktion in Gang unter Bildung von Ketosäure und 2,4-Dinitrophenylhydrazori, die aus der Einwirkung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin auf die Ketosäure stammen und kolorimetrisch gemessen werden. Bei diesem Verfahren ist kein UV-Spektrophotometer notwendig, es besitzt jedoch den Nachteil, daß es wenig empfindlich und ungenau ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues, einfach durchzuführendes und genaue Werte lieferndes Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Ketosäure-Transaminase zu entwickeln.

■ Überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß mittels der Kopplung einer Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminasereaktion als Indikatorreaktion mit einer anderen Transaminasereaktion und einer sich daran anschließenden Messung der bei beiden Reaktionen erhaltenen Oxalesssigsäure durch die bekannte Verwendung eines Diazoniumsalzes eine einfache und genaue Bestimmung der Enzymaktivität erreicht werden kann. Bei dem Verfahren nach der Erfindung ist die Indikatorreaktion stets konstant, so daß das Substrat und das zu verwendende Enzym ebenfalls in vorteilhafter Weise konstant bleibt. Weiterhin können große Volumina gemessen werden, und außerdem können diese zweckmäßig auch zu einem Farbdiagramm verarbeitet werden.

Die Lösung der genannten Aufgabe besteht somit in einem Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einer Glutaminsäure-Ketosäure-Transaminase mit Ausnahme der Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß man einem geeigneten Volumen einer das zu bestimmende Enzym enthaltenden Probelösung eine Ketosäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase zugibt, dadurch die beiden enzymatischen Reaktionen des zu bestimmenden Enzyms und der Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase in Gang bringt und die Menge der gebildeten Oxalessigsäure in bekannter Weise unter Verwendung eines Diazoniumsalzes kolorimetrisch bestimmt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung werden die Ketosäure, Glutaminsäure und Asparaginsäure in einem molaren Verhältnis von 0,8 bis 3 : 1 bis 5 :10 und vorzugsweise in einem molaren Verhältnis von 1: 2: 15 verwendet.

Das Verfahren nach der Erfindung läßt sich besonders vorteilhaft durchführen, wenn die Probelösung als Coenzym Pyridoxalphosphat zugesetzt wird.

Mit dem Verfahren nach der Erfindung erhält man besonders präzise Werte, wenn als Diazoniumsalz das o-Benzamido^-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid oder ein Doppelsalz aus 6-Benzamido-4-methoxy-m~ toluidindiazoniumchlorid und Zinkchlorid verwendet wird.

Der Mechanismus der enzymatischen Reaktionen läuft wie folgt ab: Ketosäure <-, ι—> Glutaminsäure <—.

Aminosäure«—!

L> α-Ketoglutarsäure <—I r-> Asparaginsäure
L> Oxalessigsäure

Glutaminsäure-Ketosäuretransaminase

Wie aus dem vorstehend angegebenen Mechanismus hervorgeht, wird eine der Probelösung zugesetzte Ketosäure durch die Einwirkung der zu bestimmenden Glutaminsäure-Ketosäuretransaminase in eine entsprechende Aminosäure umgewandelt, wobei gleichzeitig die Bildung von «-Ketoglutarsäure aus Glutaminsäure erfolgt. Die gebildete «-Ketoglutarsäure reagiert mit Asparaginsäure durch die Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase unter Bildung der der «-Ketoglutarsäure äquivalenten Mengen an Oxalessigsäure und Glutaminsäure. Daher kann die Glutaminsäure-Ketosäuretransaminaseaktivität durch Messung der Menge an gebildeter Oxalessigsäure bestimmt werden.

Bei der praktischen Durchführung kann die Glutaminsäure-Ketosäuretransaminaseaktivität durch Zugabe einer Ketosäure oder eines ihrer Salze, Glutaminsäure oder eines ihrer Salze, Asparaginsäure oder eines ihrer Salze und Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase zu einer geeigneten Menge einer Probelösung, die Glutaminsäure-Ketosäuretransaminase enthält, Einstellung des pH-Wertes in dem Reaktionsmedium durch Zugabe einer Puffermischung auf ungefähr 7 bis ungefähr 9, vorzugsweise 8,0, eine geeignete Zeit lang, im allgemeinen 6 bis 10 Minuten andauernde Inkubation zur Bildung der Oxalessigsäure bei 30 bis 40° C, vorzugsweise bei 37° C, und Messung der Menge an gebildeter Oxalessigsäure bestimmt werden. Alle diese Agentien können für sich allein, in Form einer Mischung oder in Form von Mischungen, die vorher auf irgendeine geeignete Weise vermischt wurden, zugesetzt werden.

Da die vorstehend erwähnten zwei enzymatischen Reaktionen reversibel sind, können die Substrate nicht in beliebigen Mengen zugesetzt werden. Eine Ketosäure oder deren Salze, Glutaminsäure oder deren Salze und Asparaginsäure oder deren Salze können im allgemeinen in einem molaren Verhältnis von 0,8 bis 3 :1 bis 5 :10 bis 30, vorzugsweise 1:2:15, verwendet werden. Glutaminsäure und Asparaginsäure können entweder in der L-Form oder in der D,L-Form eingesetzt werden. Eine Ketosäure, Glutaminsäure und Asparaginsäure können in Form wasserlöslicher Salze, beispielsweise in Form von Mono- oder Dilithium-, Natrium- oder Kaliumsalzen, verwendet werden.

Die Menge der Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase ist nicht kritisch, es ist lediglich dafür Sorge zu tragen, daß ein nennenswerter Überschuß an dieser Verbindung zugesetzt wird. Wird beispielsweise die Aktivität in Körperflüssigkeiten bestimmt, dann wird Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase vorzugsweise in Konzentrationen von 10 bis ICOm-I. U. (International Units) auf 0,2 ml Körperflüssigkeit zugesetzt.

Vorzugsweise kann Pyridoxalphosphat zur Beschleunigung der Transaminierungsreaktion zugegeben werden.

Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase

Um einen reibungslosen Ablauf der enzymatischen Reaktion zu gewährleisten, wird vorzugsweise eine Puffeimischungzur Aufrechteihaltungeines pH-Wertes in dem Reaktionsmedium während der Messung zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 verwendet. Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer u. dgl. kann in vorteilhafter Weise eingesetzt werden.
Die Menge der gebildeten Oxalessigsäure wird nach Beendigung der Umsetzung nach einem bekannten kolorimetrischen Verfahren unter Verwendung eines Diazoniumsalzes als Farbentwickler bestimmt.

Einige Diazoniumsalze inhibieren nicht die enzymatischen Reaktionen, sondern reagieren mit Oxalessigsäure in spezifischer Weise unter gesteuerten Bedingungen unter Bildung einer gefärbten Kupplerverbindung, die im sichtbaren Spektrum eine Absorption aufweist. Daher kann ein Diazoniumsalz dem enzymatischen Reaktionsmedium vor oder nach der Inkubation zugesetzt werden, wobei die Menge der gebildeten Oxalessigsäure in vorteilhafter Weise unter Verwendung eines Colorimeters oder visuell durch Vergleich der entwickelten Farbe mit einer Standardfarbkarte bestimmt wird. Als Diazoniumsalze seien beispielsweise 4-Amino-2,5-diäthoxyberzani]iddiazoniumchlorid, 6-Eenzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid, tetiazotiertes o-di-Anisidin u. dgl. erwähnt. Einige Diazoniumsalze kennen in vorteilhafterer Weise in Form eines Doppelsalzes mit einem anorganischen Halogenid, Sulfat od. dgl. eines Metalls wie beispielsweise Cadmium, Mangan, Zink, Magnesium u. dgl., beispielsweise Manganchlorid, Magnesiumchlorid, Cadmiumchlorid, Zinkchlorid u. dgl., aus den nachstehend noch näher erläuterten Gründen verwendet werden.

Bei der Messung der Menge an gebildeter Oxalessigsäure unter Verwendung eines Eiazoniumsalzes ist es vorteilhaft, die Messung nach der Abstoppung der enzymatischen und der Farbentwicklungsreaktion durchzuführen. Die enzymatisehe Reaktion kann durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, beispielsweise Methanol, Äthanol, Isopropanol u. dgl., und die Farbentwicklungsreaktion durch Steuerung des pH-Wertes in dem Reaktionsmedium, im allgemeinen durch Zugabe einer organischen und/oder anorganischen Säure, wie beispielsweise Essigsäure, Trichloressigsäure, Schwefelsäure, Salzsäure u. dgl., abgestoppt werden.

Im allgemeinen wird die Messung nach der Abstoppung der Farbentwicklungsreaktion anschließend an die Abstoppung der enzymatischen Reaktion durchgeführt. Wird jedoch 6-Benzamid-4-methoxym-toluidindiazoniumchlorid oder das Doppelsalz dieser Verbindung verwendet, dann können die zwei vorstehend genannten Reaktionen gleichzeitig abgestoppt w erden, da die optimalen pH-Werte der enzj matischen Säure der Farbentwicklungsreaktionen praktisch gleich sind und die gebildete Cxalessigsäure schnell mit

diesem Diazoniumsalz reagiert. In diesem Falle wird daher eine Mischung aus Alkohol und Schwefelsäure oder Salzsäure mit einem Volumenverhältnis von 95 bis 99 : 5 bis 1 in vorteilhafter Weise als Reaktionsstoppmittel verwendet.

Als erfindungsgemäß zu bestimmende Glutaminsäure-ICetosäuretransaminasen seien Glutaminsäure-Brenztraubensäuretransaminase, Glutaminsäure-p-hydroxyphenylbrenztraubensäuretransaminase, Glutaminsäure - Imidazolbrenztraubensäuretransaminase, Glutaminsäure - Glyoxylsäuretransaminase u. dgl. erwähnt. Die erfindungsgemäß verwendete Ketosäure muß je nach der zu bestimmenden Transaminase ausgewählt werden.

Als den zu bestimmenden Transaminasen entsprechende Ketosäuren seien Brenztraubensäure (Glutaminsäure - Brenztraubensäuretransaminase), ρ - Hydroxyphenylbrenztraubensäure (Glutaminsäure-p-Hydroxyphenylbrenztraubensäuretransaminase), Imidazolbrenztraubensäure (Glutaminsäure - Imidazolbrenztraubensäuretransaminase), Glyoxylsäure (Glutaminsäure-Glyoxylsäuretransaminase) erwähnt.

Erfindungsgemäß kann die enzymatische Aktivität einer Glutaminsäure-Ketosäuretransaminase auf einfache und genaue Weise bestimmt werden, ohne daß dabei ein UV-Spektrometer erforderlich ist; das erfindungsgemäße Verfahren ist auch dann bequem durchzuführen, wenn eine große Anzahl von Proben gemessen werden muß. Das Verfahren ist im Hinblick darauf, daß es möglich ist, die gebildete Oxalessigsäure unter Verwendung eines Colorimeters oder visuell durch Vergleich der entwickelten Farbe mit einer Standardfarbkarte zu bestimmen, sehr einfach durch-/ uf uhren.

Die erfindungsgemäß verwendeten Reaktionsmittel sind folgende:

1. Ketosäure oder deren Salze,

2. Glutaminsäure oder deren Salze,

3. Asparaginsäure oder deren Salze,

4. Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase,

5. Diazoniumsalz,

6. Puffermischung, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in dem Reaktionsmedium während der Messung aufrechtzuerhalten.

Außer den vorstehend angegebenen Agentien können, falls erforderlich, Pyridoxalphosphat, ein Mittel oder eine Lösung zur Abstoppung der Reaktion sowie ein inaktives Verdünnungsmittel verwendet werden.

Pyridoxalphosphat wird in vorteilhafter Weise zur Begünstigung eines glatten Verlaufes der enzymatischen Reaktion verwendet, da diese Verbindung ein Coenzym verschiedener Transaminasen ist.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Brenztraubensäuretransaminase

Zu 0,2 ml einer Probelösung, die durch Homogenisierung von Rattenleber, Zugabe des 20fachen Volumens einer physiologischen Kochsalzlösung und Zentrifugieren zur Entfernung des Schlammes hergestellt wurde, wurden 0,1 ml Brenztraubensäurelösung mit einer Konzentration von 100 μΜοΙ/ml und 0,1 ml einer 1,5°/₀'g^en KCl-Lösung von Glutaminsäurc-Oxalessigsäurclransaminasc mit einer Konzentration von 24 m-l. U./0,l ml zugegeben.

Getrennt wurden 7500 μ.Μο1 L-Asparaginsäure, 1000 μΜοΙ L-GIutaminsäure und 2,5 mg Pyridoxalphosphat zu 20 ml Wasser gegeben, worauf der pH-Wert mittels 10%iger KOH-Lösung auf 8,0 eingestellt wurde und das ganze Volumen der Lösung durch Zugabe von Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) auf 50 ml aufgefüllt wurde.

Zu der ersteren Lösung wurde 1,0 ml der letzteren Lösung gegeben, worauf die erhaltene Mischung 10 Minuten lang bei 37° C inkubiert wurde. Nach dem Zusatz von 3,0 ml der Doppelsalzlösung aus 6-Benzamid - 4 - methoxy - m - toluidindiazoniumchlorid und Zinkchlorid mit einer Konzentration von 20 mg/ml zu der Lösung zugegeben, worauf diese erneut 6 bis 10 Minuten lang zur Entwicklung der roten Farbe bei 37°C inkubiert wurde. Dann wurde 1,0 ml 2 n-HCl der Lösung zur Abstoppung der Farbentwicklung zugegeben. Nach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung der Lösung bei 3000 Upm wurde die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit bei 520 πιμ. in einem Colorimeter bestimmt.

Beispiel 2

Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Glyoxylsäuretransaminase

In 3,6 ml destilliertem Wasser wurden 39,53 mg L-Asparaginsäure, 5,84 mg L-Glutaminsäure, 0,1 mg Pyridoxalphosphat, 24,2 mg Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan, 10,0 mg Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase (2400 m-1. U./g) und 1,5 mg Glyoxylsäure gelöst.

0,4 ml der im Beispiel 1 verwendeten Probelösung und 4,0 mg des Doppelsalzes aus 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid und Magnesiumchlorid wurden der Lösung zugesetzt. Nach 8 Minuten dauernder Inkubation bei 37° C wurden 6,0 ml Äthanol und 2,0 ml 2 n-HCl-Lösung der erwähnten Lösung zugefügt. Nach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung bei 3000 Upm wurde die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit bei 520 ΐημ in einem Colorimeter bestimmt.

Beispiel 3

Präparat zur Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Glyoxylsäuretransaminase

1. Tablette A

L-Asparaginsäure 39,53 mg

L-Glutaminsäure 5,84 mg

Pyridoxalphosphat 0,10 mg

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan .... 24,2 mg Glutaminsäure-Oxalessigsäuretrans-

aminase (2400 m-l. U./g) 10,0 mg

Glyoxylsäure 1,50 mg

Zu der vorstehend angegebenen Mischung wurde Lactose bis zu einem Gesamtgewicht von 90 mg zugesetzt, worauf aus der Mischung nach einem üblichen Verfahren eine Tablette hergestellt wurde.

2. Tablette B

Doppelsalz aus 6-Benzamido-4-methylm-toluidindiazoniumchlorid und
Magnesiumchlorid 4,0 mg

Zu diesem Doppelsalz wurde Lactose bis zu einer Gesamtmenge von 10 mg zugesetzt, worauf aus der erhaltenen Mischung nach einem herkömmlichen Verfahren eine Tablette hergestellt wurde.

3. Gemischte Lösung
2,0 ml n-HCl.

aus 6,0 ml Äthanol und

Bei der Verwendung wurde die Tablette A in 3,6 ml destilliertem Wasser gelöst, worauf 0,4 ml einer Probe- S lösung und anschließend die Tablette B zugefügt wurden. Die Mischung" wurde 8 Minuten lang bei 37° C umgesetzt, worauf die dritte gemischte Lösung zugefügt wurde. Nach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung bei 3000 Upm wurde die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit bei 520 πιμ. in einem Colorimeter bestimmt.

Beispiele

Präparat für die Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Brenztraubensäuretransaminase

. Asparaginsäure 39,53 mg

Glutaminsäure 5,84 mg

Pyridoxalphosphat 0,10 mg

Tris(hydroxymethyl)-Aminomethan .. 24,20 mg

Doppelsalz aus 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid und

Manganchlorid 4,0 mg

Brenztraubensäure 2,0 mg

Glutaminsäure-Oxalessigsäuretrans-

aminase (2400 m-I. U./g) 10,0 mg

Zu dieser Mischung wurde Lactose bis zu einer Gesamtmenge von 100 mg zugesetzt, worauf nach einem üblichen Verfahren ein Granulat hergestellt wurde.

2. Gemischte Lösung aus 6,0 ml Äthanol und 2,0 ml 2 n-HCl.

Zur Verwendung wurde diese Tablette in 3,0 ml destilliertem Wasser gelöst, worauf 0,2 ml einer Probelösung zugesetzt wurden. Diese Mischung wurde 10 Minuten lang bei 37° C umgesetzt, worauf die zweite gemischte Lösung zugegeben wurde. Nach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung bei 3000 Upm wurde die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit bei 520 ηιμ in einem Colorimeter bestimmt.

309541/385

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einer Glutaminsäure-Ketosäure-Transaminase mit Ausnahme der Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase, dadurch gekennzeichnet, daß man einem geeigneten Volumen einer das zu bestimmende Enzym enthaltenden Probelösung eine Ketosäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase zugibt, dadurch die beiden enzymatischen Reaktionen des zu bestimmenden Enzyms und der Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase in Gang bringt und die Menge der gebildeten Oxalessigsäure in bekannter Weise unter Verwendung eines Diazoniumsalzes kolorimetrisch bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ketosäure, Glutaminsäure und Asparaginsäure in einem molaren Verhältnis von 0,8 bis 3:1 bis 5: 10 bis 30 und vorzugsweise in einem molaren Verhältnis von 1:2:15 verwendet werden.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Probelösung als Coenzym Pyridoxal phosphat zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Diazoniumsalz 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid verwendet wird.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Diazoniumsalz ein Doppelsalz aus ö-Benzamido^-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid und einem anorganischen Metallsalz verwendet wird.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als anorganisches Metallsalz Zinkchlorid verwendet wird.

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