DE1598756A1

DE1598756A1 - Mittel zur Bestimmung von Harnstoff in Fluessigkeiten

Info

Publication number: DE1598756A1
Application number: DE19651598756
Authority: DE
Inventors: Hendershot William Fred; Shrawder Elsie June; Harvill Edward K; Mast Raymond L
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1964-07-20
Filing date: 1965-07-20
Publication date: 1970-12-03
Also published as: CH465916A; ES315287A1; BE667092A; GB1112251A; JPS494673B1; FR1472956A; DE1598756B2; DE1598756C3; BR6571425D0

Description

rauroir 22 08 01

1Α-30 1 81

Beschreibung zu der Patentanmeldung

MILES LABOEATOHIES, INOOBPORATION 1127 Myrtle Street, Elkhart, Indiana, USA

betreffend
"Mittel zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten".

Die Erfindung betrifft ein Mittel für die Harnstoffbestimmung, das sich eignet zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten mittels bestimmter Versuchsmethoden und Anordnungen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine zur Diagnose verwendbare Zubereitung zur HarnstoffbeStimmung in Körperflüssigkeiten, wie Blut.

Für praktische Zwecke wird die Konzentration des Harnstoffs, beispielsweise im Blut, im allgemeinen ausgedrückt in Werten für den Stickstoff des Blutharnstoffes (BUN). Dieser BUK-Wert gibt die Menge des in Form von Harnstoff anwesenden oticksfcoffs an und beträgt etwa die Hälfte des

BAD

f] Π ⁽) fi A 9 / O :>' R ß

gesamten Harnstoffwertes. Bestimmt man also entweder den Harnstoff wert oder den Stickstoffwert, so kann der andere entsprechende Wert hieraus errechnet werden. Der normale Bereich für die BUN-Werte in einzelnen Individuen schwankt zwischen 5 und 20 mg%. Niedrigere Werte bleiben im allgemeinen außer Betracht. Bin Anstieg des BUN-Wertes deutet jedoch im allgemeinen darauf hin, daß anormale Bedingungen herrschen. Die häufigste Ursache des Anstiegs des Stickstoff- bzw. Harnstoffwertes im Blut ist eine ungenügende Ausscheidung, die gewöhnlich auf einer Nierenkrankheit oder einer mangelhaften Harnabsonderung beruht. So steigt beispielsweise bei akuter Nephritis der BUN-Spiegel von 25 mg % bis zu einer Höhe von 160 mg j6 an. Eine erhöhte Harnstoffretension tritt auch bei weitgehender parenchymatöeer Zerstörung des Nierengewebes auf, z. B. bei Pyelonephritis, fortgeschrittener Nierensclerose, Nierentuberkulose, renaler corticaler Necrose, renaler Malignltät, Nierenvereiterung oder chronischer Gicht. Hierbei können die BUN-Werte bis auf 400 mg % ansteigen, obwohl sie im allgemeinen 200 mg % nicht überschreiten.

Ein Hilfsmittel für die genaue Bestimmung des Harnstoffs in Körperflüssigkeiten ist von größer Wichtigkeit und zwar nicht nur fUr die Feststellung der oben genannten physiologischen Störungen, sondern auch für ihre ijekäinpfung. Ein Individuum mit einer bekunnben Nierendysfunktion muß eine besbLmrate Ui'ib

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0 0 D 8 4 9 / 0 Ί 8 ß

einhalten oder seinen Proteinstoffwechsel auf andere Weise, regulieren und sein Verhalten wird gewöhnlich mit Hilfe regelmäßiger Bestimmungen der Konzentration seines Blutharnsttffes gesteuert. Außer zur BurohfÜhrung von regelmäßigen Untersuchungen bei bekaater Hlerenstörung, die sowohl vom Patienten wie vom Arzt durchgeführt werden können, läßt eich jedoch ein Harnst off indikator mit Vorteil bei Routine-Harnstoffanalysen der Krirperflüssigkeiten in Krankenhäusern und in der Arztpraxis verwenden.

Ein Hilfsmittel zur Bestimmung des Stickstoffs im Blutharnstoff ist von größtem Wert, wenn der Test entsprechend rasch, zuverlässig und einfach genug ist, um vom Techniker leicht erlernt zu werden; außerdem müssen derartige Untersuchungen exakt genug sein, um dem Kliniker Anhaltspunkte zu geben und sie müssen so empfindlich sein, daß Schwankungen in der Verfassung des Patienten wiedergegeben werden und erkannt werden können. Im übrigen müssen alle derartigen Zubereitungen und Mittel, die für solche Bestimmungen benützt werden, entsprechend stabil sein.

Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff in den verschiedensten Körperfliissigkeiten sind dem klinischen Chemiker bereits bekannt. Ein derartiges Verfahren nutzt beispielsweise die chemische i.ydrol.vse aus, verlangt Jedoch spezielle Vorrichtungen,

O O 9 8 Λ 9 / O 3 8 6. B^AD

die in den üblichen Laboratorien nicht immer verfügbar sind. Gemäß einem anderen Verfahren wird eine direkte colorimetrische Reaktion von Harnstoff in einem proteinfreien Filtrat mit einem organischen Reagens, wie Diacetylmonoxim, angewendet. Wieder ein anderes bekanntes Verfahren besteht in einem Test, der darauf beruht, daß das Enzym Urease Harnstoff in ein Ammoniumsalz umwandelt, das durch Titrieren oder "Nesslerisieren" gemessen werden kann. Diese bekannten Verfahren haben den Wachteil, daß sie eine beträchtliche Geschicklichkeit und Vertrautheit mit komplizierten Laboratoriumstech'niken verlangen. !Sie benötigen außerdem eine beträchtliche Menge an Untersuchungs· flüssigkeit, die nicht immer ohne weiteres zur Verfügung steht.

In neuerer Zeit wurde eine brauchbare Diagnose-Zubereitung vom enzymatischen Typ zur Bestimmung von Harnstoff in Körperflüssigkeiten entwickelt, wodurch die BUN-Bestimmung wesentlich vereinfacht wurde. Selbst in-Anbetracht dieses höchst bedeutsamen Portschrittes,besteht jedoch noch immer Bedarf an einem empfindlicheren und genaueren Mittel zur Harnstoffbestimmung.

Ein derartiges Mittel wird durch die Erfindung bereiV gestellt, die bei Anwendung der entsprechenden Versuchsanorthiung mit genügender Empfindlichkeit und Genauigkeit die Anwesenheit von Harnstoff in sehr kleinen Körperflüssigkeit zu bestimmen gestattet. Die erfindungsgemäße Zubereitung ist in trockener Form stabil und ermöglicht eine einfache, rasche und auiier-

009849/0386 BAD OftctXA''

ordentlich empfindliche Harnstoffbestimmung, wodurch die oben erwähnten Nachteile der früheren Zubereitungen und Methoden vermieden werden. Die erfindungsgemäße Harnstoffbestimmung beruht auf einem colorimetrischen Test.

Die erfindungsgemäße Zubereitung stellt eine Kombination dar aus einem Enzymsystem, einem Indikatorsystem und einer Pufferverbindung besonderer Art, die in Lösung Ammoniumionen produziert; gegebenenfalls kommen noch Farbstabilisatoren und andere Zusätze hinzu. Die erwähnten beiden Systeme arbeiten mit der Ammoniumionen produzierenden und abgebenden Pufferverbindung derart zusammen, daß das Indikatorsystem bei Einwirkung des E/nzymsystems auf den in der zu prüfenden Flüssigkeit anwesenden Harnstoff eine feststellbare Veränderung erfährt.

Der Erfindung liegt eine enzymatische Reaktion zugrunde, die an sich bekannt ist, insbesondere in Fällen,in welchen das Enzymsy3tem Urease enthält. Urease katalysiert die Hydrolyse des Harnstoffs zu im wesentlichen Ammoniak und Kohlendioxyd, wobei gegebenenfalls noch Ammoniumcarbonat und vermutlich gewisse Zwi3chenverbtndungdn, wie die unstabile Carbaminsäure, gebildet werden. Die Hydrolyse des Harnstoffs unter Enzymeinfluß kann durch folgende Gleichungen wiedergegeben werden: 00(NH₂J₂ ^BH₂GOOH/ » GO^NH₃ > (JiH₄J₂OO₃

Urease ^

NH

BAD OWGINAL

0098Λ9/0388

Ein Produkt dieser Hydrolyse kann mittels des in den erfindungsgemäßen Mitteln anwesenden Indikatorsystems bestimmt werden. Enthält beispielsweise das Indikatorsystem einen pH-Indikator, der aus einem gegen pH-Änderungen sensitiven Farbstoff besteht, so tritt bei Berührung dieses Systems mit einem Hydrolyseprodukt ein Farbumschlag ein, der durch folgende Gleichung wiedergegeben werden kann:

M oder (NH₄)₂00 pH-Indikator

pH-Indikator * ^ P* indikator

(Farbe A) entstanden aus der enzymä- (Farbe B)

sauer tischen Hydrolyse des Harn- basisch

Stoffs

Zur Bereitung des erfindungsgemäßen Enzymsystems kann jedes Enzym benutzt werden, das Harnstoff hydrolysiert. Das Enzym Urease ist besonders gut geeignet, da die Urease eines der wenigen Enzyme ist, welche für die Harnstoffhydrolyse spezifisch sind. Außerdem läßt sich Urease leicht aus zahlreichen Bakterien und Fungii sowie aus verschiedenen Mehlsorten, wie Bohnenmehl (Oanavalia ensiformis, "Jack bean") gewinnen. Bei zur Isolierung der Urease angewandten, zahlreichen Methoden und Techniken schwanken die physikalischen Eigenschaften der handelsüblichen Urease innerhalb eines vielten Bereiches. Die erfindungsgeraäß zu verwendende' Urease soll vorzugsweise

BAD OR»G/NAL

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wasserlöslich sein. Aus nicht ohne weiteres erklärbaren Gründen verstärkt die wasserlösliche Urease die Farbentwicklung und kürzt die zur Hydrolyse des Harnstoffs notwendige Inkubationszeit weseitlioh ab (die Inkubationszeit ist zu definieren als diejenige Zeltspanne, während der die Urease in Kontakt mit dem Harnstoff biiben rauS, um eine im wesentlichen vollständige Hydrolyse des Harnstoffs zu bewirken). Wenn eine wasserlösliche Urease in den Zubereitungen nach der Erfindung verwendet wird, so wird die Inkubationszeit gegenüber derjenigen für andere Ureasetypen am mehr als 50 % herabgesetzt.

Um eine maximale Snpfindlichkeit gegenüber Harnstoff und gleichzeitig eine od-Steuerung im gewünschten Grad zu erreichen, wir! erfindungsf_;emäS in den Zubereitungen ein Puffer eingearbeitet, der fähig ist, Arnaioniuinionen zu produzieren bzw. abzugeben. »J'irde der Puffer keine Ammonium!onen abgeben, so wäre die Zubereitung gegenüber liarnstoff wenig empfindlich. .;etrachtet man beispielsweise eine diagnostisch verwendbare Zubereitung, die neben Urease und einem pH-Indikator wie Bromthymol-ülau einen konventionellen Puffer, wie iVatriumcitrat, enthält, so zeigt es sich, dai3 mit Hilfe dieses Mittels Änderungen im J3U.N-rfert erst bei Schwankungen in der Größenordnung von etwa 50 mg % festzustellen sind. Mit anderen Porten muß der BUjjI-Wert um ungefähr 50 mg /o zurückgehen oder steigen, bevor die Zubereitung überhaupt eine Änderung anzeigt. Verwendet man dagegen erfindungsgemüß einen Puffer, der zur Abgabe von Ammoniuraionen fähig ist, so läßt sich eine Änderung irn BUW-Wert von 10 mg % und weniger

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ohne weiteres feststellen. Dies bedeutet eine Verbesserung der Empfindlichkeit von etwa 500 % oder mehr.

Außer dieser Verbesserung in der Empfindlichkeit dient der Ammoniumionen produzierende Puffer dazu, in der Zubereitung den optimalen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Darunter ist ein pH-Wert zwischen dem Mittelpunkt des Umschlagintervalls für den Indikator und einem Punkt, der sich nach der sauren Seite hin unmittelbar an dieses Umschlagsintervall anschließt, zu verstehen. Das Umschlagsintervall seinerseits läßt sich definieren, als der gesamte pH-Bereich, über den ein Indikator einen Farbumschlag zeigt. So liegt beispielsweise für Bromthymol-Blau das Umschlagsintervall zwischen einem pH- von 6,0 und einem solchen von 7>6. Der Mittelpunkt des Umschlagsintervalls für Bromthymol-Blau liegt daher bei 6,8. Ein pH-Wert, der sich unmittelbar nach der sauren Seite hin an dieses Umschlagsintervall anschließt, würde bei Bromthymol-Blau etwas unter pH 6,0 liegen.

Unter den verschiedenen Verbindungen, die in Lösung Ammoniumionen abgeben und daher erfindungsgemäß benutzt werden können, sind die Ammoniumsalze von schwachen Säuren besonders bevorzugt. Beispiele für derartige bevorzugte Puffer sind u.a.j Ammoniumeitrat, Ammoniumlactat, Ammoniumoxalat, Ammoniumbenzoat, Ammoniuraacetat, Ammoniumsalicylat, Aramoniumstearat, Amraoniumpropionat, Ammoniurabutyrat,"Ammoniumphosphat und dergl., sowie

Geraische von zwei oder mehr dieser Salze. "* "

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Außer der "Verwendung von besonderen Pufferverbindungen läßt sich die Empfindlichkeit der Mittel nach der Erfindung, wie gefunden wurde, weiterhin verbessern durch Zusatz eines Sensitivierungsmittels, z. B. eines aliphatischen Araids mit einem Schmelzpunkt von unterhalb etwa 150 O. Bevorzugte Sensitivlerungsmittel sind u. a. die Amide gesättigter und ungesättigter aliphatischer Säuren mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für derartige Sensitivierungsmittel sind u. a. Acetamid, Propionamid, Acrylamid und Butyramid.

Die Konzentration des Sensitivierungsmittels kann über einen weiten Bereich variiert werden. Im allgemeinen kann man den Sensibilisator in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 10 % und höher, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung, verwenden, ohne daß die Urease denaturiert wird. Bevorzugt ist allerdings ein Konzentrationsbereioh für beispielsweise Acetamid als Sensibilisator von etwa 1,5 bis 4,0.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können für die verschiedensten Formen von Versuohsanordnungen benutzt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausf Uhr ung,s form werden saugfähige Streifen mit der Zubereitung getränkt, worauf man diese mit der zu prüfenden Flüssigkeit in Kontakt bringt und das Produkt der enzymatisehen Reaktion, falls eine solche stattfindet, colorlmetrisch bestimmt. Bringt man beispielsweise auf den so vorbereiteten Versuchsstreifen einen Tropfen Blut auf, β-β-

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so katalysiert das Enzym, das Urease-Aktiv!tat aufweist, die Hydrolyse des in dem Blut anwesenden Harnstoffs unter Bildung von Ammoniak, Kohlendioxyd und gegebenenfalls anderen Reaktionsprodukten. Der Menge an hydrolysiertem Harnstoff entspricht ein gewisser Anstieg des pH-Wertes, der seinerseits einen Farbumschlag im Indikator hervorruft. Es kann sogar eine Beziehung zwischen dem Farbumschlag und der Harnstoffkonzentration aufgestellt werden, die eine hochempfindliche quantitative Harnst off bestimmung ermöglicht. So können beispielsweise bei Verwendung von Bromthymol-Blau in der erfindungsgemäßen Zubereitung die verschiedenen Farbtöne zwischen Gelb und Blau (d. h. die Farbnuancen innerhalb des Umschlagsintervalls von Bromthymol-Blau) in Beziehung gesetzt werden zu der verschiedenen Höhe des Harnstoffspiegeis; daraus ergibt sich dann ein deutlich sichtbarer Anzeigewert für die Konzentration des im Blut anwesenden Harnstoffs.

Neben der beschriebenen bevorzugten Anwendung der Zubereitungjnnach der Erfindung auf saugfähigen Trägern können diese auch als flüssige Systeme angewendet werden. Ein geeignetes flüssiges System kann durch Lyophilisierung der Zubereitung hergestellt werden und wird dann mit der zu untersuchenden Flüssigkeit wieder aufgebaut. Gegebenenfalls können die Zubereitungen auch in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern und dergl. verwendet werden.

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Neben dem Bromthymol-Blau, das als pH-Indikator bevorzugt ist, können auch andere pH-Indikatoren verwendet werden, wie ■beispielsweise Brorac res öl-Purpur, Dichlorsulfonphthalein, 6,8-Dirdfcro-2,4-chinazolindion, Alizarin, 2-(2,4-Dinitrophenylazo)·« 1 -naphthol-3,6-dis'ulfonsäure und dergl.

In gewissen Fällen 1st es zweckmäßig, wenn die bei der Einwirkung von Harnstoff auf die Zubereitung nach der Erfindung entwickelte Färbung von solcher Beschaffenheit ist, daß sie 6ü Sekunden oder langer nach ihrem Auftreten nicht verblaßt. Dies kann erreicht werden, indem man der Zubereitung einen Farbstabilisator beimischt.' Geeignete Farbstabilisatoren sind

u. a. Stoffe vom Proteintyp, die Albuminoideigenschaften auf-

weisen, wie Bovinalbumin und Eialbumin. Andere Stoffe vom Proteintyp,die man in den Säften von Pflanzen und Tieren findet und die Albuminoideigenschaften aufweisen, können ebenfalls verwendet werden. Die Konzentration an zugefügtem Albumin liegt im allgemeinen unter 10 % und über 0,1 %, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung. Bevorzugt ist eine Albuminkonzentration zwischen 1 und 5 Gew.-,,o.

Falls eine noch stärker stabilisierte Färbung gewünscht oder notwendig ist, kann ein zweiteiliges (duales) Stabilisationsmittel verwendet werden. Dieses Farbstabilisationsmlttel besteht aus zwei Hauptbestandteilen, von denen einer ein Stoff vom Proteintyp mit Albuminoideigenschaften ist. Wie oben, gilt auch hler, daß

^{4) ßln(lemuteiwel}i.09849/0386 - . . ,

BADORiGlNAL

Bovlnalbumin, Eialbumin und dergl. bevorzugt sind, wobei jedoch auch andere Proteinstoffe, wie man sie in den Säften von Pflanzen und Tieren findet, verwendet werden können. Der andere Bestandteil ist ein Heteropolysaccharid, wie beispielsweise Gummi arabicum (Acacia Senegal), Mesquitegumrai (Prosopsis juliflora), Damsongummi, Tragacanthgummi (Astragalus gummifer), Indischgummi (Anogeissus latifolia) und dergl. Diese Gummiarten erhält man gewöhnlich aus Pflanzen in Form einer dicken, schleimigen, wasserlöslichen Ausscheidung.

Es wurde gefunden, daß man eine optimale Farbstabilisation der diagnostischen Zubereitungen erhält, wenn man gewisse Gewichtsverhältnisse und besondere Konzentrationen für diese Zusätze einhält. Vorzugsweise wird der Gummi mit dem Albumin in einem Gewichtsverhältnis von 2 i 1 kombiniert. Mit anderen Worten soll in dem Stabilisierungsmittel auf je 2 g Gummi 1 g Albumin vorhanden sein. Gewichtsverhältnisse von Gummi zu Albumin zwischen 0,5 : 1 und 4 : 1 können ebenfalls angewendet werden.

dual Auch die Gesamtkonzentration des aufgebauten Farb-

stabilisierungsmittels, falls ein solches in die Zubereitungen eingearbeitet wird, muß innerhalb gewisser Grenzen gehalten werden. Vorzugsweise ist der Farbstabilisator in den erfindungsgeraäßen Zubereitungen in einer Konzentration von etwa ?. >, bezogen auf das GeHfuntgewicht, anwesend, wobei ein Konzentrat,! oin·!- b ere ich von 1 I)Is 4 % möglich ist.

Ü C) 9 IU 9 / O 3 8 6

Auch andere Zusätze, wie Schutzmittel, Verdickungsmittel oder netzmittel können in die Zubereitungen eingearbeitet werden. So kann beispielsweise als Verdickungsmittel Gelatine und als Netzmittel können Polyvinylalkohole und feste Polyäthylenglykole mit einem Molekulargewicht von 6000 bis 7500 verwendet werden. Ein PoIyäthylenglykol, das unter der geschützten Bezeichnung »Carbowax 4000" (Hersteller Union Carbide Chemical Co.) in den Handel kommt, ist besonders brauchbar. Schutzmittel in Form von Polymerfilmen können ebenfalls verwendet werden, um die Beschaffenheit der erfindungs-■ gemäßen diagnostischen Zubereitungen bei ihrer Anwendung in verschiedenen Versuchsanordnungen, z. B. auf saugfähigen Streifen, zu verbessern. Inerte Farbstoffe, die einen einheitlich gefärbten Hintergrund ergeben/können dabei zusätzlich verwendet werden.

Polymerfilme, beispielsweise Filme aus Äthylcellulose, wirken als Dialysemembran, das die in der zu untersuchenden Flüssigkeit anwesenden größeren Moleküle zurückhält. Dies gilt beispielsweise für das Hämoglobin

die
im Blut, das durch/Membran von der Berührung mit der diagnostischen Zubereitung abgehalten wird, während gleichzeitig die übrigen Anteile des Blutes einschließlich des anwesenden Harnstoffes duroh die Membran hindurchgehen und mit der Prüfzubereitung in Berührung kommen. Hierduroh wird verhindert, daß die Prüfzubereitung durch Hämoglobin vereohmutast wird bzw. daß die rote Farbe den auftretenden Farbumeohlag verdeokt.

009849/0386 ^BAD ordinal

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Die erwähnten großen Moleküle können ohne weiteres aus dem polymeren Film ausgewaschen oder abgewischt werden, so daß sich der Farbumschlag amlndikator besser beobachten läßt. Ausserdem schützt der Polymerfilm die diagnostische Zubereitung vor der Zersetzung. Für den Film ist Athyloellulose bevorzugt, jedoch können auch andere polymere Stoffe verwendet werden.

Die Erfindung sei nun an Hand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Aus folgenden Bestandteilen wurde eine erfindungsgemäße Zubereitung hergestellt«.

Gelatine	0,5	g
Urease	0,5	g
Acetamid	1,0	g
4 #iges "Oarbowax 4000··*	11,5	ml.
0,1 M Ammonium- Citrat-Puffer (zweibasisch)	2,5	ml
1,6 #ige wässrige Lösung von Br om- thymol-Blau	3,8	ml

♦ Polyäthylenglykol,
Union Carbide Uhem.Co_e

Die Gelatine wurde in 11,5 ml Wasser unter Erwärmen vollkommen aufgelöst. Die übrigen Bestandteile wurden kombiniert und dann mit der Gelatinelösung zu einer

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klaren Lösung von etwa 3O⁰O vermischt. Durch Zusatz einer geringen Menge -verdünnter Natronlauge wurde der pH-Wert der Lösung auf 6,5 eingestellt. Etwa 5 cm lange und 6 mm breite Papierstreifen wurden in die Lösung eingetaucht und bei 85° getrocknet. Die trockenen Streifen wurden dann mit einem Polymerfilm überzogen, indem sie ganz oder teilweise in eine l,25$ige Lösung von Ä'thyleellulose in Benzol

an
eingetaucht und/der Luft getrocknet wurden bis zur

völligen Verdunstung des Benzols.

Zum Vergleich wurde eine weitere Zubereitung hergestellt, deren Zusammensetzung der obigen entsprach, in dör jedoch der Anmoniumcitratpuffer ersetzt worden war durch einen Natriumeitratpuffer.

Zur Bestimmung BUN-Spiegels wurden nun beide Zubereitungen auf folgende Weise benutzt?

Die überzogenen Enden der Streifen wurden befeuchtet mit einem Tropfen Blut, das eine bekannte Harnstoffkonzentration aufwies. Nach einer zweiminütigen Inkubationsperiode bei Raumtemperatur wurde das Blut duioh Abwaschen mit Wasser entfernt. Die nun entwickelten Färbungen an beiden Streifenserien wurden sofort mit standardisierten Musterfärbungen verglichen, die vorher derart eingestellt worden waren, daß sie der Konzentration des Blutharnstoff- Stickstoffs bei den Blutproben entsprachen. Die Resultate gehen aus Tabelle I hervor«

BAD ORtGINAL

0098/, 9/038 6 ^

TABELLE I

Versuch Nr.	Bekannte Kon zentration	Ablesungen auf Konz. BUN (mg#)	der Farbtabelle in
	BUN in mg.$>	Ammo η iumc it ra t Puffer	Natriumeitrat Puffer
1	10,0	10	20
2	22.1	20	40
3	23,8	25	50
4	34,4	30	. 75
5	35.4	35	60
6	75.6	75	100
7	81.0	80	100
8	84.8	. 80	95
9	107.2	100	100
10	162.0	100+	100+

Wie ersichtlich, erhielt man bei der Zubereitung mit Natriumeitrat als Puffer falsche Werte. Dagegen war die Zubereitung mit Ammoniumeitrat als Puffer ausserordentlich empfindlich, insbesondere in den niedrigeren Bereichen, und stimmte recht gut mit der vorbestimmten BUN-Konzentration Uberein.

Beispiel 2

Es wurde nach Beispiel 1 gearbeitet, wobei Jedoch das als Sensitivierungsmittel benutzte Acetamid in diesem Fall durch Acrylamid ersetzt worden war. Die Resultate

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entsprachen etwa denjenigen von Beispiel 1 und zeigen daß die BUN-Konzentration in den Blutproben genau wiedergegeben wurde.

Beispiel 3

Bs wurde wieder nach Beispiel 1 gearbeitet, wobei jedoch der Ammoniumeitratpuffer durch Ammoniumaoetat ersetzt worden war. Die Resultate entsprachen etwa denjenigen, die sich bei Verwendung des Ammoniumeitratpuffers ergaben. In allen Fällen betrug die Abweichung von den tatsächlichen Harnstoff-Stickstoffkonzentrationen weniger als 10 i»,

Beispiel 4-

Aus den folgenden Bestandteilen wurde eine erfindungsgemäße Zubereitung hergestellt«

Gelatine 0,5 g

Urease 0,5 g

Acetamid 1,0 g

4 ?6 "Carbowax 4000" 11,5 ml

0,1 M Ammoniumcitrat-Puffer

(zweibasisch) 2,5 ml

1,6 $ige wässrige Lösung von Bromthymol-Blau 3,8 ml

Bovine-Albumin 0,5 g

Wie in Beispiel 1 wurde die Gelatine zunäohst in 11,5 ml Wasser unter Erwärmen völlig gelöst, worauf die Übrigen Beetandteile gemeinsam der Gelatinelösung zugemischt '

009849/038 6 . -i₈-

wurde} bis eine klare Lösung erreicht war, deren Temperatur etwa 3O⁰C betrug. Die Zubereitung wurde auch hier durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf einen pH-Wert von etwa 6,5 eingestellt. Papierstreifen von etwa 5 χ 0,6 cm wurden in die Lösungeingetaucht und bei 85 an der Luft getrocknet, worauf sie mit einem Polymerfilm Überzogen wurden, indem sie in eine l,25#ige Lösung von Äthylencellulose in Benzol eingetaucht und an der Luft getrocknet wurden.

Auch in diesem Fall wurde eine Vergleichszubereitung hergestellt, bei welcher bei sonst gleichen Bestandteilen das Sovinalbumin weggelassen worden war.

Sie Überzogenen Enden der Streifen wurden mit einem Tropfen Blut befeuchtet, das 28 mg# Harnstoff enthielt. Nach 2 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Blut abgewaschen. Die entwickelten Färbungen wurden sofort verglichen mit Standardfärbungen, die vorher auf die in den Blutproben anwesende Stickstoffkonzentration eingestellt worden waren. Nach 60 see. wurden die an beiden Streifen entwickelten Färbungen neuerlich mit den Standardfärbungen verglichen.

Die Zubereitung mit Albumin sowohl wie diejenige ohne Albumin zeigten an, daß in dem untersuchten Blut eine Harnstoffkonzentration von 25 - 30mg# vorhanden war. 60 eeo. naoh der ersten Ablesung wurden die aufgetretenen Farbtöne bei beiden Zubereitungen neuerdings

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ausgewertet. Hierbei zeigte die albuminhaltige Aufbereitungimmer noch eine Harnstoffkonzentration zwischen 20 und 25 mg/# an, während die Färbung der Zubereitung ohne Albumin auf eine scheinbare Harnstoffkonzentration von nur 5 bis 10 mg/$ schließen

en

ließ. Färbungsbestimmung/in Zeitabständen von 30 see. und 90 see. ergaben bei der albuminhaltigen Zubereitung annähernd den gleichen Genauigkeitsgrad.

Beispiel 5

Es wurde nach Beispiel 4 gearbeitet, wobei jedoch das Sensitivierungsmittel Acetamid durch Acrylamid und das Bovinalbumin durch Bialbumin ersetzt wurde. Die Resultate entsprachen&ngefähr denjenigen des Beispiels 4.

Aus den obigen Beispielen geht deutlich hervor, daß die albuminhaltige Zubereitung ihre analytische Wirksamkeit über längere Zeit aufrechterhielt, während bei den Zubereitungen ohne Albumin bei einer verzögerten Auswertung der Färbung gewisse analytische Ungenauigkeiten auftraten.

Beispiel 6

Aus folgenden Bestandteilen wurde eine erfindünrsgemäße Zubereitung hergestellt»

-20

00984 9/0 386 8AD or*ginal

Gelatine . 0,5 g

Urease (wasserlöslich)*

(225.6 Sü-Einheiten)** 0,04 g

Acetamid ο,5 g

4 $> "Carbowax 4000" 6,0 ml.

0,1 M Ammoniumcitrat-Puffer

(zweibasisch) 1,8 ml

1,6 $ wasser. Lösung

von Bromthymolblau 3»8 ml

Bovine-Albumin 0,2 g

Gummi Arabicum 0,4 g

% Wasserlösliche Urease ist ein aus Bohnenmehl (Jack bean meal") gewonnenes hochgereinigtes Enzym,(Hersteller Biochemical Corp., Freehold, New Jersey).

eine"3U-Einheit "(Sumner Unit) für die Ureaseaktivität ist diejenige Einheit, die aus Harnstoff in Phosphatpuffer vom pH 7,0 bei 2O⁰O in 5 Min. 1 Milligramm Amraoniakstickstoff bildet.

Die PrüfflUssigkeiten wurden wie obenjjdurch Auflösung des Gelatine in Wasser bereitet, worauf die anderen Bestandteile zugefügt wurden und der pH-Wert auf 6,5 eingestellt wurde.Wie oben wurden· Papierstreifen in der Zubereitung getränkt und getrocknet. Sie erhielten auch hier wieder einen Überzug aus einem Polymerfilm, der aus einer l,25#igen Äthylcellulose in Benzol aufgebracht wurde.

BAD OP^

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Zum Vergleich wurde eine zweite Zubereitung hergestellt, die der obigen entspräche wobei jedoch die Farbstabilisatoren, Grummiarabicum und Albumin, weggelassen und die völlig wasserlösliche Urease durch eine nur teilweise wasserlösliche Urease ersetzt wurde.

Die überzogenen Enden der Streifen wurden wiederum mit einem Tropfen der Blutproben mit bekannter Harnstoffkonzentration befeuchtet. Naoh einer Inkubationszeit von 1 Min. bei Raumtemperatur wurde das Blut abgewaschen und die Farbumschläge mit den standardisierten Färbungen verglichen. Bin zweiter Vergleich wurde nach Verlauf von weiteren 60 see. angestellt. Die Prüfung wurde mit Blutproben von verschiedenen Harnstoffkonzentrationen mehrere Male wiederholt. Die Resultate gehen aus Tabelle II hervor.

TABELIE II

CO OO ■C» CO — O Ca> OO

Versuch	Bekannte	Ablesungen	10	auf der Farbtabelle in	10	Zubereitung	5	Zube
Nr	Konzi in mg#	Eonz. BUN (	20	mg#)	20	mit Farb	10	rei
		Ablesezeit:	30		20	stabilisa	25	tung
		Zubereitung	50		50	tor	30	ohne
		mit Farb-	75		75		50	Farb-
		etabillsa-	100	Null See. Ablesezeit: 60 see.	75		75	stabi-
		tor	Zubereitung		lisatc:
			ohne Farb-	O
			etabilisa-	O
			tor	O
IL	13		10
12	19		10+
13	30		30 ₁
14	•54
15	61
16	105

BAD OBiGINAL

Die Resultate lassen ί/ie Verbesserung erkenne^,

die man erhalten kann, wenn man einen Farbstabilisator mit einem Gehalt an Gummiarabicum und Albumin in eine Zubereitung einarbeitet, die wasserlösliche Urease enthält. In diesen Fällen war die Färbung bei der zweiten Ablesung naoh 60 see. nur wenig verblaßt.

Für die obigen Beispiele wurden gewisse bevorzugte Zubereitungen nach der Erfindung benutzt, was
jedoch mannigfache Variationsmäglichkeiten nicht ausschließt. So kann beispielsweise jedes beliebige Enzym mit Ureaseaktivität verwendet werden. Im
übrigen können die erfindungsgemäßen Zubereitungen benutzt werden zur Prüfung von anderen Körperflüssigkeiten wie Urin, Serum, Speichel u. dgl. und überhaupt von allen Flüssigkeiten, die Harnstoff enthalten. Bevorzugt ist allerdings ihre Anwendung zur Bestimmung des Stickstoffs, der ein Maß für den im Blut enthaltenen Harnstoff darstellt, d.h. der BUN-Werte.

Patentansprüche

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Claims

Pa t e nt an s priiohe

1. Mittel zum Haohweis und zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten, insbesondere im Blut, gekennzeichnet duroh einen Gehalt an einem die Hydrolyse dee Harnstoffes fördernden Enzym wie Urease, einer zur Produktion von Ammoiumionen fähigen Pufferverbindung und einem Indikatorsystem, das bei Einwirkung des Enzyms auf den in der Flüssigkeit anwesenden Harnstoff eine feststellbare Veränderung erfährt.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt eines Stoffes vom Proteintyp, der Albuminoideigenschaften aufweist, als Farbstabilisator.

3. Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, mit einem zusätzlichen Gehalt an einem Heteropolysaccharid als Farbstabilisator.

4. Zubereitung nach Anspruch 1, 2 oder 3, g β _ kennzeioh net duroh einen zusätzlichen Gehalt an einem Amid als Sensibilisierungsmittel.

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