DE1593086C3

DE1593086C3 - Process for the isolation of peruvoside from plant materials

Info

Publication number: DE1593086C3
Application number: DE19661593086
Authority: DE
Inventors: Georg Dr. 6100 Darmstadt; Ripphahn Johannes Dr. 6101 Nieder-Ramstadt Seitz
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1966-09-17
Filing date: 1966-09-17
Publication date: 1976-01-22

Description

Das Glukosid »Peruvosid« verfügt über eine ausgeprägte cardiotonische Wirkung, die etwa der des Strophanthins entspricht. Zum Unterschied von diesem therapeutisch viel gebrauchten Cardenolid wird es jedoch bei oraler Applikation erheblich besser resorbiert. Peruvosid ist ein Naturprodukt und beispielsweise in der Apocynocee Thevetia neriifolia Juss. (syn. Thevetia peruviana Merr.) enthalten. Es ist bekannt, die Verbindung aus den entfetteten und fermentierten Samen dieser Pflanzen durch Extrahieren und chromatographische Trennung der extrahierten Stoffe zu isolieren. Entsprechende Verfahren sind beschrieben in der IN-PS 66 196, referiert in Chemical Abstracts, Bd. 55, Spalte 14 832 (1961), und in Helvetica Chimica Acta, Bd. 43, S. 652 (1960) und Bd. 45, S. 938 (1962). Bei diesen bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren werden Alkohole als Lösungsmittel verwendet. Die Ausbeuten an Peruvosid bei den bekannten Verfahren sind außerordentlich niedrig und in den meisten Fällen nicht reproduzierbar.The glucoside »Peruvosid« has a pronounced cardiotonic effect, similar to that of des Strophanthins corresponds. In contrast to this therapeutically widely used cardenolide however, it is absorbed much better when administered orally. Peruvosid is a natural product and for example in the Apocynocee Thevetia neriifolia Juss. (syn. Thevetia peruviana Merr.) included. It is known to extract the compound from the defatted and fermented seeds of these plants and to isolate chromatographic separation of the extracted substances. Appropriate procedures are described in IN-PS 66 196, referred to in Chemical Abstracts, Vol. 55, Column 14 832 (1961), and in Helvetica Chimica Acta, Vol. 43, p. 652 (1960) and Vol. 45, p. 938 (1962). With these well-known Isolation and purification processes use alcohols as solvents. The yields at Peruvoside in the known methods are extremely low and in most cases not reproducible.

Es wurde nun gefunden, daß man überraschenderweise zu erheblich höheren und eindeutig reproduzierbaren Ausbeuten kommt, wenn man die Isolierung des Peruvosids mit Halogenkohlenwasserstoffen als Lösungsmittel durchführt.It has now been found that, surprisingly, significantly higher and clearly reproducible values can be obtained Yields come from isolating the Peruvoside with halogenated hydrocarbons performs as a solvent.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Isolierung von Peruvosid aus entfetteten fermentierten peruvosidhaltigen Pflanzenmaterialien, insbesondere aus Samen von Thevetia neriifolia Juss. durch Extraktion und anschließende chromatographische Trennung der extrahierten Stoffe, das dadurch charakterisiert ist, daß beide Stufen des Verfahrens mit Halogenkohlenwasserstoffen als Lösungsmittel durchgeführt werden.The present invention accordingly provides a method for isolating Peruvoside from defatted fermented peruvoside-containing plant materials, in particular from seeds of Thevetia neriifolia Juss. by extraction and subsequent chromatographic separation of the extracted Substance, which is characterized in that both stages of the process with halogenated hydrocarbons be carried out as a solvent.

Als Halogenkohlenwasserstoffe kommen beispielsweise die folgenden in Frage: Chloroform, Methylenchlorid, 1,1-Dichloräthan, 1,2-Dichloräthan, 1,1,2-Trichloräthan, l,l-Dichlor-2-fluor-äthan. Gegebenenfalls können auch Gemische dieser Lösungsmittel eingesetzt werden. Bevorzugte Lösungsmittel für die Extraktion ist Chloroform.As halogenated hydrocarbons, for example, the following are possible: chloroform, methylene chloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichloroethane, 1,1,2-trichloroethane, l, l-dichloro-2-fluoroethane. If appropriate, mixtures of these solvents can also be used can be used. The preferred solvent for the extraction is chloroform.

Nach dem neuen Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung erhält man Peruvosid in Ausbeuten von etwa 1 bis 1,2%, bezogen auf das entfettete unfermentierte Ausgangsmaterial. Die erzielte Ausbeute ist damit beispielsweise doppelt so hoch wie die nach dem Verfahren der IN-PS 66 196 erreichte Ausbeute.According to the new process according to the present invention, Peruvoside is obtained in yields from about 1 to 1.2%, based on the defatted, unfermented starting material. The scored The yield is therefore twice as high as that obtained using the process of IN-PS 66 196 achieved yield.

Im einzelnen wird das neue Verfahren wie folgt durchgeführt:In detail, the new procedure is carried out as follows:

Das als Ausgangsmaterial verwendete entfettete, fermentierte, peruvosidhaltige Pflanzenmaterial wird aus den zerkleinerten peruvosidhaltigen Pflanzenteilen, vorzugsweise aus Samen von Thevetia neriifolia in bekannter Weise gewonnen. Folgendes Vorgehen hat sich für die Herstellung des Ausgangsmaterials als zweckmäßig erwiesen:The defatted, fermented, peruvosid-containing plant material used as the starting material is from the crushed parts of the plant containing peruvoside, preferably from seeds from Thevetia neriifolia obtained in a known manner. The following procedure has been adopted for the production of the starting material proven to be useful:

Zunächst wird das glykosidhaltige Pflanzenmaterial gequetscht und anschließend mit einem fettlösenden organischen Lösungsmittel, z. B. mit einem Kohlenwasserstoff wie Petroläther, einem Halogenkohlenwasserstoff wie Chloroform oder einem Äther wie Diäthyläther, vorentfettet. Hierauf wird das vorentfettete Material erneut gemahlen und nochmals mn einem fettlösenden organischen Lösungsmittel perkoliert. First the glycoside-containing plant material is squeezed and then with a fat dissolving agent organic solvents, e.g. B. with a hydrocarbon such as petroleum ether, a halogenated hydrocarbon such as chloroform or an ether such as diethyl ether, pre-defatted. Then the pre-defatted The material was ground again and percolated again in a fat-dissolving organic solvent.

Der so erhaltene feingemahlene Rückstand wird in üblicher Weise in wäßriger Suspension fermentiert. Zum Fermentationsgemisch wird vorteilhaft eine geringe Menge Toluol zugefügt, um einen Verderb des Pflanzenmaterial durch Einwirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen zu verhindern. Die Fermentationszeit liegt im allgemeinen zwischen 3 und 5 Tagen, vorzugsweise bei etwa 3 Tagen. Die Fermentationstemperatur liegt zwischen 30 und 50° C, vorzugsweise bei etwa 40° C. Zum Einsatz für das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wird zweckmäßigerweise das Wasser von dem fermentierten Pflanzenmaterial durch Abschleudern entfernt.The finely ground residue obtained in this way is fermented in the usual way in an aqueous suspension. A small amount of toluene is advantageously added to the fermentation mixture to prevent the Prevent plant material from exposure to microorganisms such as bacteria and fungi. The fermentation time is generally between 3 and 5 days, preferably around 3 days. the Fermentation temperature is between 30 and 50 ° C, preferably around 40 ° C. For use for the process according to the present invention is expediently the water from the fermented Plant material removed by spinning.

In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das fermentierte, entfettete Ausgangsmaterial mit einem Halogenkohlenwasserstoff, vorzugsweise mit Chloroform, extrahiert.In the first stage of the process according to the invention, the fermented, defatted starting material is used extracted with a halogenated hydrocarbon, preferably with chloroform.

Durch Einengung des Extrakts erhält man das Peruvosid im Gemisch mit anderen Substanzen. Werden als Ausgangsmaterial entfettete fermentierte Samen von Thevetia neriifolia verwendet, so fäll: beim Einengen des Extrakts ein kristallines Gemisch von etwa einem Teil Peruvosid mit etwa 2 Teilen Neriifolin mit kleineren Beimengungen von Revusic aus.By narrowing the extract, the Peruvoside is obtained in a mixture with other substances. Will defatted fermented seeds of Thevetia neriifolia are used as starting material, then: when concentrating the extract a crystalline mixture of about one part peruvoside with about 2 parts Neriifolin with small additions from Revusic.

Ungeeignet zur Extraktion sind organische Lösungs mittel mit aktivem Wasserstoff im Molekül, der beispielsweise nach der Methode von Zerewitinofi (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft Bd. 40, S. 2023 [1907]) bestimmt werden kann. Sc sind z. B. Verbindungen mit OH-Gruppen, insbesondere auch Alkohole, ferner Verbindungen mit Amino-, Carboxy- und/oder Mercaptogruppen nicht für die Extraktion geeignet. Dagegen vermindert die Anwesenheit von Wasser bei der Extraktion die Ausbeuten nicht.Unsuitable for extraction are organic solvents with active hydrogen in the molecule, for example according to the method of Zerewitinofi (reports of the German Chemical Society Vol. 40, p. 2023 [1907]) can be determined. Sc are e.g. B. compounds with OH groups, in particular neither alcohols nor compounds with amino, carboxy and / or mercapto groups suitable for extraction. In contrast, the presence of water during the extraction reduces the yields not.

Die Trennung des Extraktionsgemisches in de; 2. Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolg nach den üblichen Methoden der Adsorptionschromatographie. Man kann das Gemisch in einei Säule oder in einer Schicht chromatographisch trennen. Als Sorptionsmittel kommen die in . de; Chromatographie üblichen Verbindungen in Frage beispielsweise feingepulvertes Kieselgel, Aluminiumoxid, Magnesiumsilikate oder Calciumphosphate. Bevorzugtes Sorptionsmittel ist Kieselgel.The separation of the extraction mixture in de; Second stage of the process according to the invention is successful according to the usual methods of adsorption chromatography. You can mix the mixture in one Separate column or one layer by chromatography. The in. de; Compounds customary in chromatography can be used, for example, finely powdered silica gel, aluminum oxide, Magnesium silicates or calcium phosphates. The preferred sorbent is silica gel.

Durch Anwendung von Halogenkohlenwasser stoffen als Elutions- bzw. Fließmittel, beispielsweise der oben im einzelnen genannten Lösungsmittel, er zielt man eine Abtrennung des gewünschten reiner Peruvosids von den unerwünschten Begleitstoffen wit Neriifolin. Es hat sich als besonders vorteilhaft erBy using halogenated hydrocarbons as eluents or flow agents, for example of the solvents mentioned in detail above, it aims to separate the desired purer Peruvosids from undesirable accompanying substances with Neriifolin. It has been found to be particularly beneficial to him

wiesen, für die chromatographische Trennung dasselbe Lösungsmittel anzuwenden, das auch für die vorausgehende Extraktion des Peruvosids eingesetzt wurde, insbesondere Chloroform. In einer bevorzugteen Ausführungsform des Verfahrens wird das nach der ersten Verfahrensstufe erhaltene Gemisch aus Peruvosid mit den unerwünschten Begleitstoffen, beispielsweise Neriifolin, durch Elution mit einem Halogenkohlenwasserstoff, insbesondere Chloroform, über der 8- bis lOfachen Menge Sorptionsmittel (vorzugsweise Kieselgel), bezogen auf die Menge des zu trennenden Gemisches, Chromatographien. In dieser Ausführungsform wird beispielsweise aus dem oben angegebenen Gemisch von 1 Teil Peruvosid mit 2 Teilen Nerriifolin zuerst das Neriifolin praktisch quantitativ eluiert. Danach folgt bei der Elution eine kleine Gemischzone aus Neriifolin und Peruvosid und schließlich eine Fraktion, die aus reinem Peruvosid besteht.instructed to use the same solvent for the chromatographic separation that was used for the previous extraction of the Peruvosids was used, in particular chloroform. In a preferred Embodiment of the process, the mixture obtained after the first process stage is from Peruvoside with the undesired accompanying substances, for example neriifolin, by elution with a halogenated hydrocarbon, especially chloroform, over 8 to 10 times the amount of sorbent (preferably Silica gel), based on the amount of the mixture to be separated, chromatographies. In this Embodiment is for example from the above mixture of 1 part Peruvosid with 2 parts Nerriifolin first elutes the neriifolin practically quantitatively. This is followed by a small one during the elution Mixed zone of neriifolin and peruvoside and finally a fraction that consists of pure peruvoside consists.

In manchen Fällen ist es zweckmäßig, das nach der chromatographischen Trennung anfallende Peruvosid nochmals umzukristallisieren. Für eine solche eventuell erforderliche weitere Aufreinigung ist es vorteilhaft, ein organisches Lösungsmittel, das keinen aktiven Wasserstoff enthält, zu verwenden. Zum Beispiel eignet sich auch für eine Umkristallisation das bei der Extraktion und der chromatographischen Trennung bevorzugt verwendete Chloroform.In some cases it is useful to use the Peruvoside obtained after the chromatographic separation recrystallize again. For any such further purification that may be required, it is It is advantageous to use an organic solvent which does not contain active hydrogen. For example is also suitable for a recrystallization during the extraction and the chromatographic Separation preferably used chloroform.

Das neue Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.The new process according to the present invention will be further illustrated by the following examples explained.

example 1

2 kg geschälte Nüsse von Thevetia neriifolia werden gequetscht und mit Chloroform vorentfettet. Nach Mahlen und nochmaligem Entfetten mit Chloroform teigt man den Rückstand mit Wasser an und fermentiert 70 Stunden bei 40° C unter Zusatz von etwa 10 ml Toluol. Die noch feuchte Droge wird dann erschöpfend mit Chloroform extrahiert und der erhaltene Extrakt auf etwa 200 ml eingeengt. Dabei kristallisieren 35 bis 40 g eines Gemisches von Peruvosid und Neriifolin aus.2 kg of peeled nuts from Thevetia neriifolia are squeezed and pre-degreased with chloroform. After grinding and again degreasing with chloroform, the residue is pasted with water and Ferments for 70 hours at 40 ° C with the addition of about 10 ml of toluene. The still wet drug will then extracted exhaustively with chloroform and the extract obtained concentrated to about 200 ml. Included 35 to 40 g of a mixture of Peruvoside and Neriifolin crystallize out.

Das so erhaltene Gemisch wird von der Mutterlauge befreit und an 400 g Kieselgel für Chromatographie (0,05 bis 0,2 mm Partikelgröße) mit Chloroform als Elutionsmittel getrennt. Die erste Fraktion besteht aus etwa 23 bis 27 g reinem Neriifolin, gefolgt von einer Zwischenfraktion aus 1 bis 2 g eines Gemisches aus Peruvosid/Neriifolin und einer letzten Fraktion, die aus 11 bis 12 g reinem Peruvosid besteht. Man löst die gesamte Menge Peruvosid in 6 ml Aceton und setzt 6 ml Diäthyläther zu. Das Peruvosid kristallisiert in Prismen bzw. Drusen. Die Ausbeute beträgt 10 bis 11g. Der Schmelzpunkt liegt zwischen 160 und 163°. [«] f = -70° ±2° (c = 1,3 in Methanol). Die Substanz ist dünnschichtchromatographisch rein.The mixture obtained in this way is freed from the mother liquor and separated on 400 g of silica gel for chromatography (0.05 to 0.2 mm particle size) with chloroform as the eluent. The first fraction consists of about 23 to 27 g of pure neriifolin, followed by an intermediate fraction of 1 to 2 g of a mixture of Peruvoside / Neriifolin and a last fraction, which consists of 11 to 12 g of pure Peruvoside. The entire amount of Peruvoside is dissolved in 6 ml of acetone and 6 ml of diethyl ether are added. The Peruvosid crystallizes in prisms or druses. The yield is 10 to 11 g. The melting point is between 160 and 163 °. [«] F = -70 ° ± 2 ° (c = 1.3 in methanol). The substance is pure according to thin-layer chromatography.

B e i s ρ i el 2B e i s ρ i el 2

Der nach Beispiel 1 hergestellte Chloroformextrakt der fermentierten Samen von Thevtia neriifolia wird mit einem üblichen Trockenmittel wie Natriumsulfat getrocknet und mit Diäthyläther versetzt. Dabei scheidet sich ein kristallines Gemisch aus Peruvosid, Neriifolin und Ruvosid ab, das nach Abfiltrieren und Trocknen ein Gewicht von etwa 50 g hat.The chloroform extract of the fermented seeds of Thevtia neriifolia prepared according to Example 1 is dried with a conventional drying agent such as sodium sulfate and treated with diethyl ether. It separates a crystalline mixture of Peruvosid, Neriifolin and Ruvosid, which after filtering off and Drying has a weight of about 50 g.

Man chromatographiert das erhaltene Gemisch über 350 g Kieselgel analog Beispiel 1 mit Methylenchlorid als Elutionsmittel. Folgende Fraktionen werden dann in der nachstehenden Reihenfolge eluiert: Etwa 25 g reines Neriifolin, etwa 4 g Übergangsfraktion aus Neriifolin und Peruvosid, etwa 11 g reines Peruvosid und schließlich etwa 3 g eines Gemisches aus 2 Teilen Peruvosid und einem Teil Ruvosid. Das Peruvosid wird wie in Beispiel 1 beschrieben, umkristallisiert und zeigt die dort angegebenen physikalischen Eigenschaften.The mixture obtained is chromatographed over 350 g of silica gel analogously to Example 1 with methylene chloride as an eluent. The following fractions are then eluted in the following order: About 25 g of pure neriifolin, about 4 g of transition fraction from neriifolin and peruvoside, about 11 g of pure Peruvoside and finally about 3 g of a mixture of 2 parts Peruvoside and one part Ruvoside. The Peruvoside is recrystallized as described in Example 1 and shows the physical properties given there Properties.

Example 3

Man arbeitet analog Beispiel 1, verwendet jedoch 1,2-Dichloräthan an Stelle von Chloroform zur Extraktion und erhält nach der Chromatographie (mit Chloroform) 24 g reines Neriifolin, 1,8 g einer Zwischenfraktion eines Gemisches aus Peruvosid/Neriifolin und 10,8 g reines Peruvosid mit den in Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften.The procedure is analogous to Example 1, but using 1,2-dichloroethane instead of chloroform for the extraction and obtained after chromatography (with chloroform) 24 g of pure neriifolin, 1.8 g of an intermediate fraction of a mixture of Peruvoside / Neriifolin and 10.8 g of pure Peruvoside with those in Example 1 specified properties.

Example 4

Man arbeitet analog Beispiel 1, verwendet jedoch 1,1,2-Trichloräthan an Stelle von Chloroform zur Extraktion und erhält nach der Chromatographie (mit Chloroform) 22,5 g Neriifolin, 2,5 g einer Zwischenfraktion eines Gemisches aus Peruvosid/Neriifolin und 11 g reines Peruvosid mit den in Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften.The procedure is analogous to Example 1, but uses 1,1,2-trichloroethane instead of chloroform for Extraction and, after chromatography (with chloroform), 22.5 g of neriifolin and 2.5 g of an intermediate fraction are obtained of a mixture of Peruvoside / Neriifolin and 11 g of pure Peruvoside with those in Example 1 specified properties.

Claims

Claim:

Process for the isolation of peruvoside from defatted, fermented, peruvoside-containing Plant materials by extraction and subsequent chromatographic separation of the extracted substances, characterized that both stages of the process with halogenated hydrocarbons as solvents be performed.