DE1300710B - Verfahren und Mittel zur Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphate im Serum - Google Patents

Description

• Die Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphatase im Serum ist von Bedeutung für die Diagnose und Verlaufskontrolle von Knochenerkrankungen, Tumorkrankheiten sowie von Leber- und Gallengangkrankheiten.
• Eine solche Enzymbestimmung kann nach einer großen Zahl von verschiedener Verfahren durchgeführt werden, die sich durch das verwendete Substrat, die Substratkonzentration, durch die Art des Nachweises der Reaktionsprodukte, durch die benötigte Serummenge, durch den pH-Wert, die Inkubationsdauer und -temperatur sowie durch die Art des verwendeten Puffers unterscheiden. Eine der wichtigsten Methoden ist das von B e s s e y, L o w r y und Brock in Journal of the Biological Chemistry, Bd. 164 (1956), S. 321, beschriebene Verfahren. Dabei wird Serum in einem Glycin-NaOH-Puffer bei einem pH-Wert von 10,5 zusammen mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat 30 Minuten bei einer Temperatur von 37° C inkubiert und anschließend aus der gebildeten Menge p-Nitrophenol auf den vorhandenen Enzymgehalt geschlossen. Das gebildete p-Nitrophenol kann dabei photometrisch bestimmt werden. Dieser diskontinuierlichen sogenannten Zweipunktmethode haften, wie auch allen übrigen bisher bekannten Verfahren, verschiedene Fehlermöglichkeiten an. So kann z. B. eine während der Inkubationsdauer auftretende Enzymhemmung, d. h. ein nichtlinearer Reaktionsverlauf, hervorgerufen z. B. durch eine p11-Wertverschiebung, nicht beobachtet werden. Das dürfte mit ein Grund gewesen sein, weshalb die Commission of Enzymes of the International Union of Biochemistry (vgl. F 1 o r k i n und S 1 o tz, in Comprehensive Biochemistry, Bd.13 [1964], S. 6) empfohlen hat, wann immer möglich, Enzymreaktionen optisch-kinetisch zu messen, d. h. zum Beispiel bei der Bestimmung der alkalischen Phosphatase die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse des Phosphorsäureesters zu bestimmen.
• Bei dem Substrat p-Nitrophenylphosphat ist der Nachweis des im alkalischen Medium unter der Enzymwirkung gebildeten p-Nitrophenols photometrisch (bei 400 nm) direkt möglich, da der pKä Wert von p-Nitrophenol bei 7,16 liegt. Die Bestimmung ist somit nach der optisch-kinetischen Methode möglich, indem die gepufferte Substratlösung mit Serum versetzt und die durch das freigesetzte p-Nitrophenol bedingte Extinktion fortlaufend abgelesen oder mit Hilfe eines Kompensationsschreibers registriert wird. Methoden auf dieser Grundlage wurden kürzlich beschrieben, z. B. für Serum von W. J. T r a j o 1 a unter anderem in American Journal of Clinical Pathology, Bd.43 (1965), S.261, und für Harn von Wacker, Amador, Dorfman und Zimmermann in »Das ärztliche Laboratorium«, Bd. 11 (1965), S. 204. Bei diesen Verfahren erfolgt die Inkubation in bekannten Puffern von üblicher geringer Molarität und mithin geringer Pufferkapazität.
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei Verwendung eines Diäthanolamin-Hydrochlorid-Puffers bei einem pH-Bereich von 9,4 bis 10,2 die Enzymaktivität etwa 3mal höher ist als in allen bisher bekannten Puffern. Dieser Effekt, nämlich daß in einem Puffer solcher Stärke das Enzym nicht überdurchschnittlich gehemmt, sondern im Gegenteil stark aktiviert wurde, war nicht vorherzusehen.
• Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphatase im Serum unter Verwendung einer gepufferten wäßrigen p-Nitrophenylphosphatlösung als Substrat und mit Hilfe einer photometrischen Messung der Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse dieses Phosphorsäureesters, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Puffersubstanz Diäthanolamin-Hydrochlorid verwendet.
• Ferner betrifft die Erfindung ein Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Gehalt an gepuffertem p-Nitrophenylphosphat als Substrat, das gekennzeichnet ist durch die Verwendung von Diäthanolamin-Hydrochlorid als Puffer.
• Nach dem neuen Verfahren ist es möglich, mit nur wenig Serum in äußerst kurzer Zeit die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion zu messen. Das neue Verfahren gestattet somit die Bestimmung der alkalischen Phosphatase auf optisch-kinetischem Wege unter optimalen Bedingungen.
• Bei den bisher bekannten Verfahren verwendet man üblicherweise einen 0,05- bis 0,5molaren Puffer. Bei dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ist es jedoch besonders vorteilhaft, den Diäthanolamin-Hydrochlorid-Pufffer in einer Konzentration von 0,5- bis 1,5molar, vorzugsweise lmolar, zu verwenden. Durch Anwendung dieser relativ hohen Pufferkonzentration erhält man eine hohe Pufferkapazität, die die schädlichen Einwirkungen von C02 (aus der Luft) ausschließt und den pH-Wert während der gesamten Versuchsdauer konstant hält.
• Eine besonders optimale Steigerung der Enzymaktivität wird erreicht, wenn man bei einem pH-Wert von 9,8 arbeitet und eine lmolare Pufferkonzentration verwendet.
• Ein wesentlicher Vorteil der neuen Methode besteht ferner darin, daß sie schnell und einfach arbeitet und daß sie vor allem eine sehr gute Reproduzierbarkeit besitzt. Gerade die bisher bekannten Methoden zeichneten sich durch eine sehr unvollkommene Reproduzierbarkeit aus, was immer zu relativ unsicheren Meßergebnissen führte.
• Beispiel Herstellung des Puffers und der Puffer-Substratlösung 525,7 g Diäthanolamin (kristallisierbar) werden in 3000 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Unter Rühren (Glasrührer) wird durch Zugabe von etwa 70 ml 25o/oiger Salzsäure auf pH 9,9 eingestellt. Hierzu werden 508,3 mg MgC12 - 6 H20 und 2,5 g Natriumazid gegeben. Die Lösung wird in einen 5000-ml-Meßkolben übergeführt und mit Wasser nachgespült. Der pH-Wert wird durch tropfenweise Zugabe von 25o/oiger Salzsäure auf 9,8 eingestellt, und die Lösung wird anschließend mit bidestilliertem Wasser auf 5000 ml aufgefüllt.
• Eine Tablette, die 39,5 mg 100o/oiges p-Nitrophenylphosphat-Dinatriumsalz enthält und welche bis zum Gesamtgewicht von 100 mg noch Natriumchlorid und gegebenenfalls etwas Feuchtigkeit enthält, wird in 10m1 der obengenannten Pufferlösung gelöst. Diese Lösung ist, bei 4° C unter Lichtausschluß aufbewahrt, für die nachfolgend beschriebene Enzymbestimmung 2 Tage verwendbar.
• Beispiel für eine Enzymbestimmung Puffer-Substrat und Serum werden auf 25° C erwärmt. Die Temperatur wird in der Lösung kontrolliert. 2 ml der Puffer-Substratlösung werden mit 0,02 ml Serum (frisch) versetzt und sehr gut gemischt. Nach etwa einer Minute wird die Extinktion bei 25° C gemessen und gleichzeitig die Zeit festgestellt (Stoppuhr). Die Messung wird jede Minute, 3 Minuten lang, wiederholt.
• Die Extinktionsmessung erfolgt z. B. mit einem Photometer, das mit einem Filter für die Quecksilberlinie bei 405 nm ausgerüstet ist. Die Schichtdicke beträgt 1 cm.
• Sind die Extinktionsdifferenzen 4 E/Min. zu Beginn der Messung größer als 0,2, so wird die Bestimmung mit dem 1:5 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntem Serum wiederholt und das Ergebnis mit 5 multipliziert.
• Internationale Enzymeinheit (U) ist die Enzymmenge, die 1 [Mol Substrat in einer Minute unter Standardbedingungen umsetzt. 1 Millieinheit (mU) = 1/1000 U.
• Die Extinktionsdifferenz pro Minute 4E405 wird in folgende Berechnungsformel eingesetzt: Enzymkonzentration = 4 E405 - 5460 mU/ml. Als Normalbereich gelten 60 bis 170 mU (25° C)/ ml.

Claims (3)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphatase im Serum unter Verwendung einer gepufferten wäßrigen p-Nitrophenylphosphatlösung als Substrat und mit Hilfe einer photometrischen Messung der Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse dieses Phosphorsäureesters, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffersubstanz Diäthanolamin-Hydrochlorid verwendet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Diäthanolamin-Hydrochlorid-Puffer in einer Konzentration von etwa 0,5- bis 1,5molar verwendet.
3. 3. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 und/oder 2 mit einem Gehalt an gepuffertem p-Nitrophenylphosphat als Substrat, gekennzeichnet durch die Verwendung von Diäthanolamin-Hydrochlorid als Puffer.