DE10313515A1 - Biochip zum quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen - Google Patents

Abstract

Der Biochip ist gekennzeichnet durch eine glasklare Kunststoffoberfläche, die ggf. zusätzlich eine mit biotinyliertem vernetzten Rinder-gamma-globulin und einem Gemisch aus vernetztem Streptavidin- und Avidin-Polymerisat beschichtete Oberfläche aufweist. Als glasklarer Kunststoff wird bevorzugt Polycarbonat verwendet. DOLLAR A Der Biochip ist für ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen geeignet, das darin besteht, dass mittels Enzym-markierten Biomolekülen, die an die Oberfläche des Chips binden, die Biomoleküle einer fotometrischen pixelorientierten Auswertung zugeführt werden, in dem sie mit einem Farbsubstrat für das Enzym sichtbar gemacht werden.

Description

• Die Erfindung betrifft einen Biochip zum quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen mittels Proteinbindungs-, Immuno- oder Hybridisierungsassay gemäß Hauptanmeldung DE 101 48 102.0-52 .
• Einen Überblick über den neuesten Stand der Biochip-Technologien gibt die Monographie: Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, Eaton, 2001. Des weiteren existieren Publikationen zu Protein-Biochips. Einen Überblick gibt das Buch von Weinberger, S.R., Morris, T.S. und Pawlak, M.: Recent trends in protein biochip technology, Ashley Publications, 2000. Im Vordergrund stehen dabei sogenannte high-densitiy-Biochips (Biochips mit hoher Punktdichte und kleinen Spots (p1- bis unterer n1-Bereich), die mit laserangeregter Fluorometrie, mit dem MALDI-TOF-Verfahren (Massenspektrometrie oder Plasmon Pherometrie ausgewertet werden). Gegenstand dieser Schrift ist ein sogenannter Low-Densitiy-Biochip (Biochip mit niedriger Punktdichte und größeren Spots (1 bis 2 μl)), der mittels eines einfachen Durchlichtscanners ausgewertet werden kann.
• In DE 101 48 102.0-52 wurde bereits vorgeschlagen, Biochips zu verwenden, die durch eine Aminosilan-vorbehandelte Glasoberfläche gekennzeichnet sind. Zusätzlich weisen sie eine mit biotinyliertem vernetztem Rinder-gamma-globulin und einem Gemisch aus vernetztem Streptavidin- und Avidin-Polymerisat beschichtete Oberfläche auf. Dabei finden bevorzugt die in der Mikroskopie üblichen Glasobjekträger Verwendung. Andere Gläser, wie z.B. DIA-Gläser sind ebenfalls geeignet.
• Auf den Glasoberflächen erfolgt die Beschichtung eines zuvor mit Reaktionspunkten (Spots) versehenen Glasträgers mit einem Aminosilan, vorzugsweise mit 3-Aminopropyltriethoxysilan und anschließend mit Glutaraldehyd, danach Kopplung von biotinyliertem vernetztem Rinder-γ-Globulin an diesen so vorbehandelten Spots sowie abschließende Beschichtung mit einem vernetztem Streptavidin-Avidin-Polymerisat.
• In der praktischen Anwendung dieses Biochips haben sich einige Nachteile herausgestellt.
• 1) Die Streuung der Biotin-Bindung der Streptavidin-Avidin-Beschichtung zwischen den Spots war trotz Optimierung der Beschichtunsgprozesse auf den Glasoberflächen zu hoch. Selten wurde ein Variationskoeffzient der Biotinbindung unter 20 % erreicht.
• 2) Das Beschichtungsverfahren erwies sich nach weiteren Optimierungen als sehr aufwendig.
• 3) Die Biotinbindungskapazität war insbesondere für die Anwendungen des Biochips für den Sandwich-Immunoassay zu gering.
• Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, einen Biochip zu entwickeln, der diese Nachteile vermeidet.
• Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Kernpunkt der Erfindung ist die Verwendung von glasklaren Kunststoffoberflächen bei der Herstellung von Biochips. Auf diese werden im gleichen Format wie auf den Glasbiochips Streptavidin-Avidin-Mischungen nach dem Beschichtungsverfahren, wie unter Patentanmeldung 197 24787.3 beschrieben, immobilisiert.
• Dadurch vereinfacht sich der Schichtenaufbau für die Streptavidin-Avidin-Beschichtung gegenüber der Hauptanmeldung.
• Auf den Kunststoffoberflächen kann die Voraktivierung mit Aminosilan, vorzugsweise mit 3-Aminopropyltriethoxysilan und die anschließende Kopplung mit Glutaraldehyd entfallen. Die Beschichtung beginnt mit der Adsorption des biotinylierten vernetztem Rinder-γ-Globulin an den Spots der Kunststoffoberfläche. Als bevorzugter glasklarer Kunststoff wird Polycarbonat verwendet.
• Vorteile sind nun eine Verkürzung und Vereinfachung der Beschichtung des Biochips, eine Erhöhung der Biotin-Bindungskapazität der Spots des Biochips und eine erhebliche Verringerung der Streuung der Biotinbindungskapazität zwischen dem Spots.
• Die Erfindung soll nachfolgend an Ausführungsbeispielen erläutert werden.
• Beispiel 1 zeigt in einem Bindungsassay für biotinylierte Proteine die erhöhte Biotin-Bindungskapazität, die auf einem Polycarbonat-Biochip im Vergleich zum Glasbiochip gleichen Formats erreicht wird, Im Beispiel 2 wird darüberhinaus gezeigt, daß die Reproduzierbarkeit der Messungen auf dem Polykarbonatbiochip wesentlich besser ist als auf dem Glasbiochip.
• Quantifizierung der Meßergebnisse des Biochips mit Hilfe eines Pseudostandards
• Die Vorteile des Biochips kommen dann erst zum Tragen, wenn eine analytische Probe (ein Serum, ein Plasma, ein Extrakt aus Körperflüssigkeiten oder aus Lebens- oder Futtermitteln etc.) gleichzeitig auf mehrere analytisch oder diagnostisch relevante Substanzen untersucht werden kann. Probe und Nachweiskonjugate werden dann in einer Inkubationskammer über den Spots des Biochips gemischt. In diesem Falle kann für die quantitative Messung keine Standardreihe des Analyten verwendet werden, die zur Messung der unbekannten Probe herangezogen wird, wie es sonst bei Immunoassays auf Mikrotiterplatten üblich ist, da ja gleichzeitig mehrere Analyten in einem Reaktionsgefäß (Inkubationskammer) bestimmt werden müssen.
• Um hier trotzdem zu quantitativen Abstufungen in den Konzentrationen zu gelangen, ist es erforderlich Nachweiskonjugate zu benutzen, die mit den Spots der zu bestimmenden Analyten nicht kreuzreagieren. Die Färbung, die durch Konzentrationsstufen dieses Nachweiskonjugates an den dafür vorgesehenen Spots des Biochips hervorgerufen werden, sind dann ein indirektes Maß für die Konzentration der Analyten an den für diese vorgesehenen Spots.
• Beispiel 3 erläutert diesen Sachverhalt am Beispiel eines Mykotoxin-Biochips.
• Beispiel 1:
• Vergleich von Biochips aus Glas und aus Polykarbonat im Bindungsassay für biotinyliertes Immunglobulin G (b-IgG)
• Bindungskapazität für biotinylierte Proteine
• Biochip 1: PC-Biochip 16 vom 18.02.03
• Biochip 2: Glas-Biochip 5 vom 19.12.02
• Materialien:
• Doppelmarkiertes (mit Biotin und POD) Immunglobulin G: Biotin-IgG-POD (PD 04/030401) 25 ng/ml
• Biotinyliertes IgG (Biotin-IgG): in den Konzentrationen 0/1,56/3,25/6,25/12,5/25/50/100 μg/ml
• Versuchsaufbau:
• Der Biochip bildet ein Feld von 32 Spots a 8 Zeile und 4 Spalten. In den Spalten werden die Replikate bei gleicher Konzentration und in die Zeilen die Konzentrationsstufen des Biotin-IgG aufgetragen. Die jeweiligen Konzentrationstufen des Biotin-IgG , in PBS-Puffer, 0,05 M pH = 7,4 mit 0,1 % RSA gelöst, werden vor Auftragung auf die Spots mit dem Biotin-IgG-POD gemischt. Es werden je Spot 4 μl aufgetragen. Die Belegung des Biochips erfolgt entsprechend dem nachstehenden Schema 1.
• Schema 1:

  
• Der so beschichtete Biochip kommt zwecks Reaktion für eine Stunde in eine feuchte Inkubationskammer, danach wird er entnommen und mit Leitungswasser und Aqua dest. gewaschen. Der Nachweis der an den Spot gebundenen Sonde erfolgt mit 2 μl/Spot präzipitierendem TMB (Tetramethylbenzidin) als gebrauchsfertige Lösung über 30 Minuten in einer feuchten Inkubationskammer.
• Die Messung und Auswertung erfolgen über einen optischen Durchlichtscanner, wie z.B. Agfa Scan e50 und ähnlichen Scannern und DIA-Scannern, die über eine Durchlichtscanfläche für Glas-Objekträger (mindestens 2,6·7,6 cm) verfügen, wie bereits in DE 101 48 102.0-52 beschrieben.
• Ergebnis des Vergleichs von Biochips aus Glas und aus Polykarbonat im Bindungsassay für biotinyliertes Immuglobulin G (b-IgG) siehe Tabelle 1 und 1.
• Besonders beim Datenpunkt Biot-IgG = 25 ug/m1 wird deutlich, daß die Bindungskapazität für Biotin-IgG beim Polycarbonat-Biochip (PC-Biochip) wesentlich höher ist als auf dem Glas-Biochip. Auch die Reproduzierbarkeit des Assays auf den PC-Biochips mit einem durchschnittlichen Variationskoeffizient (VK) von 4,9 % ist erheblich besser als auf dem Glas-Biochip mit einem VK 14,2 %.
• Beispiel 2:
• Reproduzierbarkeit des Assays auf dem Glas-Biochip und dem Polycarbonat-Biochip
• Materialien:
• Biotin-IgG-POD, 5 ng/ml in in PBS-Puffer, 0,05 M pH = 7,4 mit 0,1 % RSA
• Versuchsdurchführung
• Der Biochip bildet ein Feld von 32 Spots a 8 Spalten und 4 Zeilen. In alle Spots wird die gleiche Biotin-IgG-POD-Konzentration a 4 μl pro Spot aufgetragen.
• Der so beschichtete Biochip wird in einer feuchten Inkubationskammer für eine Stunde reagieren lassen, danach wird er entnommen und unter Leitungswasser und mit Aqua dest. gewaschen. Der Nachweis der an den Spots gebundenen Sonde erfolgt mit 2 μl/Spot präzipitierendem TMB (Tetramethylbenzidin) als gebrauchsfertige Lösung über 30 Minuten in einer feuchten Inkubationskammer.
• Die Messung und Auswertung erfolgen über einen optischen Durchlichtscanner, wie z.B. Agfa Scan e50 und ähnlichen Scannern und DIA-Scannern, die über eine Durchlichtscanfläche für Glas-Objekträger (mindestens 2,6·7,6 cm) verfügen, wie bereits in DE 101 48 102.0-52 beschrieben.
• Ergebnis des Versuchs Reproduzierbarkeit des Assays auf dem Glas-Biochip und dem Polycarbonat-Biochip siehe Tabelle 2
• Der mittlere Variationskoeffizient (VK) bei 32-facher Wiederholung bei einer mittleren Biotin-IgG-POD-Konzentration von 5 ng/ml liegt beim Polycarbonat-Biochip bei 10,7 % und beim Glas-Biochip bei 21,4 %. Damit liefert der Polycarbonat-Biochip erheblich besser reproduzierbare Meßergebnisse als der Glas-Biochip.
• Beispiel 3:
• Quantifizierung der Meßergebnisse des Biochips mit Hilfe eines Pseudostandards am Beispiel eines Mykotoxin-Biochips
• Es werden auf 3 Streptavidin-Avidin-Biochips biotinylierte Antikörpern mit folgender Belegung (entsprechend Schema 2) gespottet
• Schema 2

  
• Dabei sind die in Zeile 6–8 aufgetragenen biotinylierten Antikörper gegen Zearalenon, Aflatoxin und Ochratoxin für den eigentlichen Mykotoxinnachweis erforderlich. Die in Zeile 1 – 5 aufgetragenen Antikörper sind die für die den Pseudostandard (Farbstandard) erforderlichen Antikörper.
• Diese drei so belegten Biochips werden in Inkubationskammern gelegt und mit folgenden Mischungen von POD-Konjugaten und Mykotoxinen reagieren lassen. Biochip 1: Mischung für den B0-Biochip (keine Mykotoxine zugefügt):

  

  Biochip 2: Mischung für den B1-Biochip (kleine Mykotoxinkonzentration zugefügt)

  

  Biochip 3: Mischung für den B2-Biochip (größere Mykotoxinkonzentration zugefügt)

  
• 1 ml der jeweiligen Mischungen werden in drei verschiedene die Inkubationkammern gegeben.
• Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für eine Stunde, über Kopf routieren lassen (in Alu-Folie eingewickelt)
• Nach einer Stunde werden die Lösungen absaugt, die Biochips werden in den Kammern 6× mit je 1.2 ml aqua dest. gewaschen. Die Kammern werden leer gesaugt und mit 1.3 ml TMB (Tetramethylbenzidin) gefüllt. Die Kammern werden dunkel gestellt und 30 min. ruhig stehengelassen.
• Die Messung und Auswertung der Spot des Biochips unmittelbar in der Kammer erfolgen über einen optischen Durchlichtscanner, wie z.B. Agfa Scan e50 und ähnlichen Scannern und DIA-Scannern, die über eine Durchlichtscanfäche für Glas-Objekträger (mindestens 2,6 *7,6 cm) verfügen, wie bereits im DE 101 48 102.0-52 beschrieben. Ergebnis: Biochip ohne Mykotoxine (B0-Biochip)

  

  
  F/0: Antikörper für den Pseudostandard = 0
  F/1: Antikörper für den Pseudostandard = 1 ng/ml
  F/3: Antikörper für den Pseudostandard = 3 ng/ml
  F/9: Antikörper für den Pseudostandard = 9 ng/ml
  F/27: Antikörper für den Pseudostandard = 27 ng/ml
  Zea: Zearalenon-Antikörper
  Afla: Aflatoxin-Antikörper
  Ochra. Ochratoxin-Antikörper
• Biochip (B1-Biochip)) mit Mykotoxin-Zugabe (geringe Konzentration)

  
• Biochip (B2-Biochip) mit Mykotoxin-Zugabe (höhere Konzentration)

  
• In 2 ist die Abhängigkeit des Mykotoxin-Biochip von der Mykotoxin-Zugabe grafisch dargestellt.
• In den Spalten 1–5 ist der Pseudostandard (Biotin-IgG-FITC mit anti-FITC-POD) aufgetragen. Mit zunehmender Antikörperkonzentration von 1 – 27 ng/ml steigen von Spalte 2 – 4 die relativen Pixel-Units (RPU) an. In Spalte 1 ist die unspezifische Bindung zu sehen, die zwischen dem B0 und B2 Biochip um einen konstanten Werte fällt (unspezifische Wirkung der zugegebenen hydrophoben Mykotoxine). Spalte 6 zeigt die Reduktion der RPU in Abhängigkeit von der zugegebenen Zearalenonmenge, Spalte 7 die Reduktion der RPU in Abhängigkeit von der zugegebenen Aflatoxinmenge und die Spalte 8 die Reduktion der RPU in Abhängigkeit von der zugegebenen Ochratoxinmenge. Der Pseudostandard repräsentiert im Vergleich eine bestimmte Mykotoxinkonzentration. In diesem Beispiel waren im Biochip 1 und 2 folgende Mykotoxinkonzentrationen enthalten:

  
• Auf den Pseudostandard bezogen repräsentiert z.B ein Biotin-IgG-FITC von 9 ng/ml ca. eine Zearalenonkonzentration von 0,5 pmol/ml, eine Aflatoxinkonzentration von 2,3 pmol/ml eine Ochratoxinkonzentration von 14,3 pmol..
• Mit Hilfe des Pseudostandards ist somit eine größerordnungsmäßige Abschätzung der in Proben enthaltenen Mykotoxinkonzentration möglich, da der Pseudostandard (bis auf eine kleine konstante unspezifische Beeinflussung) von der Mykotoxinkonzentration unabhängig ist.
• Tabellen
• Tabelle 1: Ergebnis des Versuchs: Vergleich von Biochips aus Glas und aus Polykabonat im Bindungsassay für biotinylierte Immuglobulin G (b-IgG)

  
• Tabelle 2: Ergebnis des Vesuchs-Reproduzierbarkeit des Assays auf dem Glas-Biochip und dem Polycarbonat-Biochip

  
• Legende zu den Abbildungen
• 1 zum Beispiel 1 Vergleich Glas-PC-Biochop mit Biot-IgG-POD mit Biot-IgG RPU: relative Pixel Units Besonders beim Datenpunkt Biot-IgG = 25 ug/m1 wird deutlich, daß die Bindungskapazität für Biotin-IgG beim Polycarbonat-Biochip (PC-Biochip) wesentlich höher ist als auf dem Glas-Biochip. Auch die Reproduzierbarkeit des Assays auf den PC-Biochips mit einem durchschnittlichen Variationskoeffizient (VK) von 4,9 % ist erheblich besser als auf dem Glas-Biochip mit einem VK 14,2 %.
• 2 zum Beispiel 3 grafische Darstellung der Abhängigkeit des Mykotoxin-Biochip von der Mykotoxin-Zugabe

Claims (10)

1. Biochip zum fotometrischen, pixelorientierten Nachweis von Biomolekülen gemäß DE 101 48 102.0-52 , gekennzeichnet durch eine mit 2–8 mm² großen Reaktionspunkten (Spots) versehene glasklare Kunststoffoberfläche, wobei die Spots so funktionalisiert sind, dass der Biochip als Assay unter Verwendung eines Enzym-markierten Biomoleküls (Sonde) einsetzbar ist, wobei der Umsatz an Biomolekül mit einem Farbsubstrat bewertet wird, indem die verursachten Farbpunkte auf den Spots sowohl in ihrer Dichte als auch in ihrer relativen Anzahl pro Spot erfasst werden. 1a. Biochip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als glasklarer Kunststoff Polycarbonat eingesetzt wird.
2. Biochip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spotoberfläche mittels biotinyliertem Rinder-γ-Globulin und einem Gemisch aus vernetztem Streptavidin-Avidin-Polymerisat funktionalisiert ist.
3. Biochip nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierte Spot-Oberfläche zur Bindung Peroxidase oder Alkalische Phophatase-markierter Biomoleküle geeignet ist
4. Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierte Spot-Oberfläche ein Volumen von 1 bis 2 μl erfasst.
5. Verfahren zur Herstellung eines Biochips nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit Reaktionspunkten (Spots) versehenen glasklaren Kunststoffträger mit einem Aminosilan vorbehandelt, die Spots aktiviert und anschließend mit biotinyliertem vernetztem Rinder-γ-Globulin sowie mit einem vernetztem Streptavidin-Avidin-Polymerisat beschichtet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Spots mittels Siebdruck festgelegt werden, wobei Größe und Abstand der Spots entsprechend dem Format handelsüblicher Testplatten gewählt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorbehandlung mit 3-Aminopropyltriethoxysilan erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung der Spot-Oberflächen mit Glutardialdehyd in Carbonatpuffer erfolgt.
9. Verwendung eines Biochip gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zum fotometrischen, pixelorientierten quantitativen Nachweis von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass auf den Spots nach entsprechender Vorbeschichtung ein Proteinbindungs-, Immuno- oder Hybridisierungsassay unter Verwendung eines Enzym-markierten Biomoleküls ausgeführt wird, wobei dessen Umsatz mit einem Farbsubstrat auf den Spots sowohl in ihrer optischen Dichte als auch in ihrer relativen Anzahl pro Spot erfasst und mit Standardreihen verglichen wird.
10. Verwendung eines Biochip gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Enzymmarkierung Meerettichperoxidase oder Alkalische Phosphatase eingesetzt werden.