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Die
Erfindung betrifft Verfahren zur elektrischen Behandlung biologischer
Zellen, insbesondere zur Elektroporation oder Elektropermeabilisierung
biologischer Zellen, die an einem festen Trägerelement angeordnet sind,
und Elektroporationsvorrichtungen zur Durchführung der Verfahren.
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Die
Technik der Elektroporation (auch Elektropermeabilisierung, -injektion
oder -transfektion genannt) stellt ein allgemein bekanntes Mittel
zum Einschleusen membranimpermeabler Xenomoleküle (wie z. B. Farbstoffe, Medikamente,
Hormone, Proteine, Plasmide usw.) in lebende Zellen oder zur kontrollierten
Freisetzung intrazellulärer
Stoffe aus den Zellen dar. Die Elektroporation hat eine weite Verbreitung
und Anerkennung gefunden, da sie kontrollierbarer, reproduzierbarer
und effizienter als andere (chemische oder virale) Methoden zum
intrazellulären
Transport von Fremdmolekülen
ist. Die Technik der Elektroporation basiert auf einem zeitweisen
Anstieg der Membranpermeabilität,
welcher durch einen reversiblen elektrischen Durchbruch der Plasmamembran
von Zellen bewirkt wird, die externen elektrischen Pulsen hoher
Intensität
und sehr kurzer Dauer (Feldstärken
von wenigen kV/cm, Pulsdauern von einigen 10 μsec) ausgesetzt werden. Das
angelegte elektrische Feld trennt Ladungsträger über die Zellmembran, so dass
ein Transmembranpotential Vg induziert wird.
Es ist bekannt, dass der Membrandurchbruch erfolgt, wenn die induzierte
Membranspannung Vg bei Raumtemperatur einen
Wert von Vg von ungefähr 1 Volt erreicht.
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Für frei bewegliche,
suspendierte Zellen hängt
die induzierte Membranspannung Vg linear
von der angelegten Feldstärke
E0 und vom Zellradius a ab und folgt der
allgemein bekannten integrierten Laplace-Gleichung: Vg =
1.5α·E0·cosθ (1)wobei θ der Winkel
zur Richtung des elektrischen Feldes ist. Setzt man für den Zellradius
einen mittleren Wert von z. B. 7 μm
ein, kann die minimale kritische Feldstärke Ekrit die
für den
reversiblen elektrischen Durchbruch der den Elektroden zugewandten Membranbereiche
(cosθ =
1) benötigt
wird, mit Gleichung (1) berechnet werden: Ekrit =
Vc/(1.5·a) ≈ 1 kV/cm. Für kleinere Zellen werden entsprechend
wesentlich höhere
Feldstärken
benötigt,
um einen elektrischen Durchbruch ihrer Zellmembranen zu erzielen.
So ist für
Zellen mit einem mittleren Radius von z. B. 3 μm eine minimale kritische Feldstärke Ekrit von ca. 2,5 kV/cm nötig. Sobald die Plasmamembran durch
den Mechanismus des elektrischen Durchbruchs permeabilisiert wurde,
können
Fremdmoleküle über Diffusion
(oder andere Mechanismen) in die Zelle eindringen oder intrazelluläre Moleküle ins Außenmedium
ausfließen.
Die theoretisch berechneten Werte für die kritische Feldstärke Ekrit stimmen sehr gut mit experimentellen
Ergebnissen überein,
die in Elektropermeabiliserungsversuchen mit Fluoreszenzfarbstoffen
wie z. B. Propidium Iodid oder anderen kleinen Reportermolekülen bestimmt
wurden.
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Zur
effizienten Elektroinjektion von Makromolekülen (Proteine, Plasmide, DNA
usw.) in frei suspendierte Zellen werden in der Praxis wesentlich
höhere
Feldstärken
benötigt
als die mittels Gleichung (1) berechneten. Die Elektropermeabilisierungsausbeute
kann weiterhin durch die Anwendung nicht-physiologischer, schwach
leitender Medien mit niedrigem Ionengehalt (und reduzierter Osmolarität) erhöht werden.
Allerdings verringern sowohl sehr starke elektrische Felder als
auch schwach leitende Medien die Überlebensfähigkeit der Zellen, was bei seltenen
und wert vollen Zellen (wie z. B. genetisch veränderte Hybridomazellen oder
dendritische Zellen) wiederum die Anzahl der zur Verfügung stehenden
Zellen deutlich reduzieren kann. Deshalb sind für Suspensionszellen sehr sorgfältige und
zeitaufwendige Optimierungen der Elektropermeabilisierungsprotokolle
nötig.
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Die
Wirkung der Elektroporation auf Zellmembranen kann direkt durch
Messung ihres elektrischen Widerstandes (oder der Impedanz) mittels
intrazellulärer
Elektroden bestimmt werden. Allerdings ist dieses Verfahren bei
der Elektroporation von suspendierten Zellen auf ausreichend große Zellen
(z.B. Riesenalgen, Xenopus-Oozyten) beschränkt und auf die meisten tierischen
und pflanzlichen Zellen, die lediglich eine Größe von wenigen Mikrometern
besitzen, nicht übertragbar.
Die Anwendung extrazellulärer
Elektroden zur Impedanzmessung von Zellsuspensionen setzt eine sehr
hohe Zelldichte (d. h. 30–90
% cytocrit-Wert (= Zeltanteil an der Gesamtsuspension)) voraus.
Diese Methode kann nicht zu Messungen in verdünnten Zellsuspensionen (cytocrit < 1 %) eingesetzt
werden, wie sie bei der Elektroporation an suspendierten Zellen
vorgesehen sind.
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Es
ist bekannt, die Elektroporation an eingebetteten Zellen durchzuführen, die
in oder an Mikroporen eines festen Trägerelementes aus einem elektrisch
isolierenden Material eingebettet oder angeordnet sind. Die Elektroporation
von Festphasenadsorbierten Zellen besitzt den Vorteil, dass die
elektrischen Feldlinien zwischen zwei Elektroden, die auf entgegengesetzten
Seiten des Trägerelementes
angeordnet sind, gezwungen werden, durch die Poren des Trägerelements
und damit durch die Zellen zu fließen. Aus der Praxis sind Vorrichtungen
zur Elektroporation von festphasen-adsorbierten Zellen vom Hersteller
Equibio, Großbritannien,
bekannt.
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Beispielsweise
in WO 93/02178 A1 wird eine Vorrichtung zur Elektroporation und
Elektrofusion adsorbierter biologischer Zellen be schrieben. Es ist eine
zylinderförmige
Kammer vorgesehen, die durch eine elektrisch isolierende Membran
mit durchgehenden Poren in zwei Kompartimente getrennt ist. Durch Ausübung eines
Flüssigkeitsdruckes
werden suspendierte Zellen in oder an den Poren festgehalten und
elektrischen Feldern ausgesetzt, die mit Elektroden in den Kompartimenten
erzeugt werden. Diese Technik ermöglicht zwar die Elektroporation
und Elektrofusion in hoch- oder
niedrig-leitenden Lösungen.
Nachteilig ist jedoch, dass die Anordnung der Zellen auf dem Trägerelement
und das Ergebnis der elektrischen Behandlung nicht beobachtet oder überprüft werden
können.
Die aus WO 93/02178 bekannte Vorrichtung ist daher zur Behandlung
insbesondere seltener oder wertvoller Zellen unter praktischen Bedingungen
ungeeignet. Ein weiterer Nachteil der bekannten Vorrichtung besteht
in der Kombination der Kammer mit einem geschlossenen Drucksystem. Der
Aufbau der Vorrichtung ist aufwendig und die Handhabung in der Praxis
kompliziert.
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Von
Y. Huang et al. wird in „Sensor
and Actuators A",
Band 89, 2001, Seiten 242 ff und in
US 6 300 108 B1 die Elektroporation einzelner
biologischer Zellen in Mikrosystemen und insbesondere die Einführung einer
Impedanztechnik beschrieben. In einem Elektroporationschip, der
auf der Grundlage von Halbleitermaterialen hergestellt ist, wird
die Zelle auf einer Verbindungsöffnung
in einer membranförmigen
Wand zwischen zwei Kompartimenten durch Ausübung eines Flüssigkeitsdruckes
gehalten. In den Kompartimenten sind jeweils Elektroden vorgesehen,
mit denen ein Porationsfeld erzeugt werden kann, das die fixierte
Zelle durchsetzt. Von Y. Huang et al. wird beschrieben, dass sich
der Stromfluss über das
Trägerelement
verändert,
je nach dem, ob die Verbindungsöffnung
offen oder von einer intakten oder einer permeabilisierten Zelle
besetzt ist. Zur Detektion der Elektroporation erfolgt während der
Erzeugung des Porationsfeldes, d. h. während der Permeabilisierung
der Zelle, eine Gleichstrommessung und eine Ermittlung von Strom-Spannungs-Verhältnissen. Das
Porationsergebnis kann optisch durch eine transparente Oberseite
des Porationschips überwacht
werden.
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Das
von Y. Huang et al. beschriebene System ermöglicht zwar eine Echtzeitbeobachtung
des Porationsvorganges. Es ist jedoch für praktische Anwendungen nicht
geeignet, bei denen eine Vielzahl biologischer Zellen behandelt
werden sollen. Außerdem
liefert die Gleichstrommessung lediglich eine Aussage über die
Membraneigenschaften während der
Elektroporation, ohne eine weitergehende Charakterisierung der behandelten
Zelle für
ggf. folgende Bearbeitungsschritte zu ermöglichen.
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Weiterentwicklungen
des Porationschips von Y. Huang et al. werden in WO 01/07585 A1,
WO 01/07584 A1 und WO 01/07583 A1 beschrieben. Die Weiterentwicklungen
beziehen sich insbesondere auf die Möglichkeit, eine Vielzahl biologischer
Zellen gleichzeitig zu behandeln. Die in den genannten WO-Publikationen
beschriebene Technik besitzt die folgenden Nachteile. Zur Echtzeitüberwachung
des Porationsergebnisses ist eine Strommessung gleichzeitig zur
Elektroporation vorgesehen. Im Porationschip sind jeweils zwei Mess- und Porationselektroden vorgesehen,
wodurch der Aufbau des Porationschips kompliziert wird. Die Echtzeitüberwachung
des Porationsergebnisses ist lediglich auf den Beginn der Poration
und die Erkennung irreversibler Schäden an den Zellen gerichtet.
Diese Informationen sind jedoch für praktische Anwendungen der
Elektroporation bspw. in der Medizin ungenügend. Eine weitere Charakterisierung
der Zellen vor oder nach der Elektroporation muss mit optischen
Mitteln erfolgen. Eine optische Beobachtung liefert jedoch nur qualitative
Einschätzungen.
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Generell
besteht ein Problem darin, dass bei den herkömmlichen Techniken lediglich
der Strom gemessen wird. Die elektrische Messung liefert nur beschränkt auswertbare
Aussagen. Eine Spezifizierung von Messparametern, die zuverlässige Messergebnisse
liefern, wird nicht gegeben. Das Messobjekt aus Elektrolyt und biologischer
Zelle in der Messkammer stellt jedoch ein kompliziertes, durch Kapazitäten und
Widerstände
charakterisiertes Gebilde dar, das je nach Art der zu behandelnden
Zellen andere Messparameter erfordert.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zur elektrischen
Behandlung biologischer Zellen, insbesondere zur Behandlung biologischer
Zellen mit elektrischen Feldpulsen, anzugeben, mit denen die Nachteile
der herkömmlichen
Verfahren überwunden
werden und die insbesondere eine reproduzierbare Echtzeitbeobachtung
der gesamten Behandlung einschließlich der Vorbereitungsschritte
und/oder des Behandlungsergebnisses ermöglichen. Die Erfindung soll
insbesondere eine schnellere und genauere Optimierung von Elektroporationsprotokollen
für spezielle
Zelltypen ermöglichen.
Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Vorrichtungen zur Umsetzung
der Verfahren, insbesondere Verfahren zur Behandlung biologischer
Zellen mit elektrischen Feldpulsen anzugeben, wobei die Vorrichtungen
eine vollständige
und reproduzierbare Beobachtung des Behandlungsverfahrens und -ergebnisses
ermöglichen
sollen.
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Diese
Aufgaben werden mit einem Verfahren und einer Vorrichtung mit den
Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 oder
8 gelöst.
Vorteilhafte Ausführungsformen
der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Die
Grundidee der Erfindung ist es, herkömmliche Verfahren zur elektrischen
Behandlung biologischer Zellen, die an einem Trägerelement Festphasen-adsorbiert
sind, dahingehend weiter zu entwickeln, dass am Trägerelement
eine Wechselstrom-Impedanzmessung zur Ermittlung des Bedeckungsgrades
des Trägerelementes
und/oder der elektrischen Eigenschaften der Zellen vor oder nach der
elektrischen Behandlung erfolgt. Die Wechselstrom-Impedanz ist der
komplexe, frequenzabhängige
Wechselstromwiderstand des betrachteten Systems, dass resistive,
kapazitive und/oder induk tive Eigenschaften besitzt. Die genannten
Maßnahmen besitzen
zwei Gesichtspunkte. Einerseits wird erstmalig eine echte Impedanzmessung
durchgeführt, die
neben einer Aussage über
den elektrischen Widerstand der Zellen vorteilhafterweise zusätzliche
Informationen über
kapazitive Eigenschaften der Zellen liefert. Die Impedanzmessung
besitzt den besonderen Vorteil, frequenzabhängige Messergebnisse zu liefern.
Es kann insbesondere in einem Versuch die optimale Messfrequenz
ermittelt und/oder eine Messfrequenz verwendet werden, bei der eine
minimale Schädigung
der vermessenen Zellen oder Zellbestandteile auftritt. Diese Vorteile
waren bei herkömmlichen
Gleichstrommessungen nicht gegeben. Die Erfinder haben erkannt,
dass bei herkömmlichen Messungen
kapazitive Einflüsse
der Zellen vernachlässigt
wurden. Des Weiteren erfolgt die erfindungsgemäße Impedanzmessung nicht während der
elektrischen Behandlung, sondern vor oder nach der jeweiligen Ausübung elektrischer
Feldpulse auf die Zellen. Es werden reproduzierbare quantitative
Parameter der Zellen und des Trägerelementes,
insbesondere der Bedeckungsgrad des Trägerelementes, ggf. die Deformation
der Zellen im Festphasenadsorbierten Zustand und das Ergebnis der
Zellbehandlung, erfasst. Vorteilhafterweise ist mit erfindungsgemäßen Verfahren
die Behandlung einer Vielzahl von Zellen, wie es bspw. in der Biochemie
oder Medizin gefordert wird, zelltypspezifisch, reproduzierbar und schonend
möglich.
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Die
erfindungsgemäß behandelten
und vermessenen festphasen-adsorbierten
Zellen umfassen Zellen, die aus dem suspendierten Zustand auf einen festen
Träger,
ggf. unter Wirkung eines Flüssigkeitsdruckes,
aufgebracht sind oder adhärente
Zellen. Adhärente
Zellen sind vor der Behandlung und Messung auf dem Trägerelement
gewachsen oder kultiviert. Vorteilhafterweise ist die mechanische
Vorbelastung von Zellen durch Anlegen eines Unterdrucks zur Erhöhung der
Elektropermeabilisierung auch bei adhärenten Zellen möglich.
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Gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung erfolgt die Wechselstrom-Impedanzmessung bei einer
vorbestimmten Messfrequenz, die zelltypspezifisch in Bezug auf die Erfassung
eines möglichst
ausgeprägten
Messsignals optimiert ist. Die Messfrequenz wird vorzugsweise durch
einen Vorversuch bestimmt, der die Aufnahme einer Frequenzabhängigkeit
der Wechselstrom-Impedanz festphasen-adsorbierter Zellen umfasst.
Die Ermittlung einer optimalen Messfrequenz stellt einen wichtigen
Vorteil gegenüber
der herkömmlichen
Gleichstrommessung dar, da erfindungsgemäß die Einstellung möglichst
schonender Messparameter ermöglicht
wird. Erfindungsgemäß können Messspannungen
verwendet werden, deren Amplituden im Vergleich zur herkömmlich verwendeten
Messspannung vermindert sind.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur elektrischen Behandlung
biologischer Zellen, insbesondere eine Elektroporationsvorrichtung,
die mit einem Wechselstrom-Impedanzmessgerät ausgestattet ist. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
wird eine Messkammer durch ein festes Trägerelement mit einer Vielzahl
von durchgehenden Öffnungen
in zwei Kompartimente geteilt, wobei in jedem Kompartiment eine
Elektrode vorgesehen ist, die wahlweise zur Impedanzmessung oder
zur elektrischen Behandlung von Zellen auf dem Trägerelement
eingerichtet ist. Im Unterschied insbesondere zu den herkömmlichen
Porationschips ist vorteilhafterweise in der Messkammer lediglich
ein Elektrodenpaar vorgesehen, das für Mess- und Behandlungszwecke doppelt genutzt
wird. Gemäß einem
weiteren vorteilhaften Gesichtspunkt ist die erfindungsgemäße Vorrichtung
nicht mit einem geschlossenen Drucksystem verbunden. Das obere Kompartiment der
Messkammer ist dem Umgebungsdruck ausgesetzt.
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Die
Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Es wird erstmalig ein
für die
routinemäßige Anwendung
elektrischer Behandlungen biologischer Zellen geeignetes Verfahren
bereitgestellt. Es können
sowohl der Permeabilisierungsgrad der Zellen als auch die Kinetik
des Ausheilens der Zellen nach der Behandlung (Resealing) erfasst
werden. Durch eine nach der Behandlung andauernde Impedanzmessung
kann kontrolliert werden, wie viele Zellen ausheilen. Damit ist
eine Kontrolle des Stoffeintritts von der Suspension in die Zellen
gegeben. Vorteilhafterweise müssen
erfindungsgemäß nicht
alle Öffnungen (Poren)
des Trägerelementes
von Zellen besetzt sein. Die erfindungsgemäße Impedanzmessung ermöglicht auch
bei teilweise besetzten Trägerelementen
quantitative Aussagen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit Vorteil
in weitere standardmäßige Prozeduren
zur Zellbehandlung integrierbar. An die elektrische Behandlung kann
sich bspw. unmittelbar eine Kultivierung der behandelten Zellen
anschließen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung
ermöglicht simultan
eine elektrische und eine optische Kontrolle des Behandlungsergebnisses
und des Ausheilvorganges. Der Aufbau der erfindungsgemäß verwendeten
Messkammer ist im Vergleich zu herkömmlichen Vorrichtungen vereinfacht.
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Im
Gegensatz zu konventionellen Elektropermeabilisierungsmethoden,
welche sehr hohe Feldstärken
und Eingangsspannungen benutzen, arbeitet das erfindungsgemäße Verfahren
ggf. mit mittleren oder sogar geringen Eingangsspannungen. Dies
ist dadurch möglich,
dass das applizierte Feld durch die erfindungsgemäße Anordnung
des Trägerelementes
gezwungen wird, durch die in die Poren eingebetteten Zellen hindurchzufließen, was
die Aufladung und den Durchbruch der Zellmembran begünstigt.
Weiterhin bewirkt der kleine hydrostatische Unterdruck, dem die
Zellen ausgesetzt sind, eine Deformation der Zellen in Feldrichtung.
Dieser zusätzliche
mechanische Stress führt
vorteilhafterweise, wie unten illustriert wird, zu einer weiteren
Verbesserung der Elektroper- meabilisierungsausbeute. Ein weiterer
Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Elektropermeabilisierung
in physiologischen, d. h. salzreichen, Medien durchgeführt werden
kann, wogegen konventionelle Methoden zur Elektropermeabilisierung
von Suspensionszellen vor allem in niedrigleitenden Medien durchgeführt werden,
da die Permeabilisierung in solchen Medien mit ge ringerem Ionengehalt
effizienter abläuft.
Durch den Gebrauch physiologischer Medien in Kombination mit der
mechanisch bedingten Unterstützung
durch das Trägerelement
wird die Überlebensfähigkeit
der Zellen nach einer Elektropermeabilisierung signifikant erhöht, ohne die
Elektropermeabilisierungsausbeute signifikant zu beeinflussen.
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Weitere
Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der Beschreibung
von bevorzugten Ausführungsformen
ersichtlich, die in den beigefügten
Zeichnungen illustriert sind. Es zeigen:
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1 eine
schematische Teilansicht des Aufbaus einer erfindungsgemäß verwendeten
Messkammer,
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2 eine
Schnittansicht einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
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3 eine
mikroskopische Abbildung eines Trägerelements, und
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4, 5 Kurvendarstellungen
zur Illustration erfindungsgemäßer Impedanzmessungen.
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Die
Erfindung ist generell bei Elektromanipulationstechniken anwendbar,
bei denen biologische Zellen oder Zellbestandteile elektrischen
Feldpulsen ausgesetzt werden, bspw. um die genannte Permeabilisierung
der Zellmembran oder eine anderweitige vorübergehende oder dauerhafte
Behandlung der Zelle vorzunehmen. Im Folgenden wird die Erfindung am
Beispiel der Elektroporation biologischer Zellen beschrieben, ohne
auf diese Anwendung beschränkt zu
sein. Für
praktische Anwendungen besteht ein Interesse an der gleichzeitigen
Behandlung einer Vielzahl von Zellen. Die Erfindung bezieht sich
jedoch auch auf den speziellen Anwendungsfall, bei dem lediglich
einzelne Zellen der elektrischen Behandlung ausgesetzt werden.
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1 zeigt
in schematischer Schnittteilansicht die Grundbestandteile der Messkammer
einer erfindungsgemäßen Elektroporationsvorrichtung. Die
Messkammer 10 wird durch ein planares Trägerelement 3 aus
einem elektrisch isolierenden Material in zwei Kompartimente 11, 12 geteilt,
in denen jeweils entsprechend eine obere Elektrode 4 und
eine untere Elektrode 5 angeordnet sind. Die Messkammer 10 ist mit
einem Flüssigkeitsleitungssystem
und einer Mess- und Steuereinrichtung verbunden, die beispielhaft
in 2 dargestellt sind. Das Trägerelement 3 weist
mindestens eine durchgehende Öffnung 2 auf, über die
die Kompartimente 11, 12 in Verbindung stehen.
Zur Behandlung einer Vielzahl von Zellen sind viele Öffnungen 2 vorgesehen.
Allgemein ist eine Zelle 1 auf einer Pore 2 (wie
dargestellt) oder auf mehrere Poren verteilt angeordnet. Es kann
sich bspw. eine Zelle über
rd. 20 bis 50 Poren im Trägerelement 3 erstrecken.
Die Zellen sind auf das Trägerelement 3 aus
der Suspension oder durch Wachstum aufgebracht.
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Die Öffnungen 2 sind
wie dargestellt als durchgehende Poren gebildet. Das Trägerelement 3 kann
alternativ aus einem an sich porösen
Material gebildet sein, dass eine Flüssigkeitsverbindung und somit
einen Druckausgleich zwischen den Kompartimenten 11, 12 gewährleistet.
Bei der Realisierung durchgehender Öffnungen oder Poren 2 ist
das Trägerelement 3 vorzugsweise
mit einer ebenen, platten-, scheiben- oder membranförmigen Gestalt
gebildet. Bei Verwendung von porösem
Material kann das Trägerelement 3 jedoch
alternativ volumenförmig
gebildet sein. In diesem Fall kann sich die untere Elektrode 5 unmittelbar
auf der Unterseite des Trägerelementes 3 befinden.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung wird das Trägerelement 3 durch
einen Membranfilter aus elektrisch hochisolierendem Material gebildet.
Es wird bspw. ein kommerziell verfügbarer Membranfilter aus Polycarbonat,
Siliziumnitrit oder einem anderen elektrisch isolierenden Material mit
einer vorbestimmten Porengröße- und
-verteilung verwendet. Es wird vorzugsweise ein Membranfilter mit
zylindrischen Mikroporen mit einem Durchmesser gewählt, der
kleiner als der Durchmesser der zu behandelnden Zellen 1 ist
und bspw. 0.01 μm
bis 8 μm beträgt.
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Die
Elektroden 4, 5 sind optisch zumindest teilweise
transparent. Sie bestehen bspw. aus einem Drahtgeflecht, das ggf.
auf einem transparenten Träger
angebracht ist, oder aus einem transparenten, leitfähigen Material,
wie z. B. ITO (Indium-Zinn-Oxid). Die
Elektroden 4, 5 können mehrere Aufgaben erfüllen. Sie
dienen einerseits als Messelektroden zur Überwachung der Besetzung der Öffnung(en) 2 mit Zellen 1 vor
der Elektroporation und zur Kontrolle des Verlaufs der Membranpermeabilisierung
und des Ausheilens der Zellmembranen nach Pulsapplikation durch
kontinuierliche Impedanzmessungen und anderseits als Porationselektroden
zur Applikation elektrischer Feldpulse. Die transparenten Elektroden 4, 5 ermöglichen
eine optische Kontrolle der Anordnung der Zellen auf dem Trägerelement 3 und
des Verlaufs der Elektroporation. Die optische Kontrolle erfolgt vorzugsweise
mit einem über
der Messkammer 10 angeordneten Mikroskop unter Verwendung
von Fluoreszenzfarbstoffen.
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Weitere
Einzelheiten der erfindungsgemäßen Porationsvorrichtung
sind in 2 schematisch dargestellt. Die
Messkammer 10 ist in einem Behältnis 13 gebildet,
das einen zylindrischen Innenraum 14, ein Flüssigkeitsleitungssystem 15 und
elektrische Anschlussleitungen 16 aufweist. Das Behältnis besteht
vorzugsweise aus transparentem Kunststoff, z. B. PMMA. Der Innenraum 14 ist
durch das Trägerelement 3 in
das obere und untere Kompartiment 11, 12 unterteilt.
Das Trägerelement 3 erstreckt
sich als planare Wand über
den Querschnitt der Messkammer 10. Es ist an den Innenwänden des
Behältnisses 13 befestigt
oder vorzugsweise (wie dargestellt) in das Behältnis 13 eingehängt. Hierzu
wird ein zylinderförmiger
Gewebekultureinsatz 6 (z. B. Hersteller: Nunc, 25 mm Durchmesser)
verwendet, an den als Trägerelement 3 ein
Polycarbonatfilter (Porengröße z. B.
8 μm) befestigt
ist. Die Elektrode 4 des oberen Kompartimentes 11 wird
vorzugsweise ebenfalls in das Behältnis 13 eingehängt oder
an dessen oberen Rand lösbar
befestigt. Als Elektrode 4 ist bspw. ein Edelstahldrahtgeflecht
mit einer Maschenweite von ca. 50 μm an einer Halterung 7 vorgesehen.
Die untere Elektrode 5 ist auf dem Boden des Behältnisses 13 angeordnet
und wird ebenfalls durch ein Edelstahldrahtgeflecht gebildet. Der
senkrechte Abstand der planar aufgespannten Netzelektroden 4, 5 beträgt z. B.
1 mm. Über
das Flüssigkeitsleitungssystem 15 ist
die Messkammer 10 mit einer schematisch illustrierten Druckeinrichtung
verbunden. Mit der Druckeinrichtung 20 wird auf eine in
der Messkammer 10 befindliche Flüssigkeit ein geringfügiger Unterdruck
ausgeübt.
Vorteilhafterweise genügt
ein Unterdruck von einigen cm Wassersäule (z. B. 30 mbar) gegenüber dem
Umgebungsdruck.
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Die
Elektroden 4, 5 sind mit einer Mess- und Steuereinrichtung 30 verbunden.
Die Einrichtung 30 enthält
einen Pulsgenerator 31 und ein Impedanzmessgerät 32,
die wahlweise abwechselnd oder gleichzeitig über eine Schalteinrichtung 33 mit
den Elektroden 4, 5 verbunden werden. Als Pulsgenerator 31 wird
bspw. ein Multiporator (Hersteller: Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland)
verwendet, der mit einer Mikroprozessor-Einheit gesteuert wird.
Der Multiporator erzeugt exponentiell abfallende Feldpulse mit Amplituden
bis 1.2 kV und Zeitkonstanten im Bereich von 15 bis 500 μs. Mit der
Mikroprozessor-Einheit können
die Pulsbedingungen mit hoher Reproduzierbarkeit unabhängig von
eventuellen Variationen in der Ionenzusammensetzung des Pulsmediums
(der Suspension in der Messkammer) oder Änderungen in der Leitfähigkeit
des Mediums eingestellt werden, wie sie durch Ionenflüsse aus
dem Cytosol oder durch Zelllyse während der Pulsapplikation auftreten
können.
Als Impedanzmessgerät 32 wird
vorzugsweise ein Impedanz-Analyzer (z. B. HP 4191A, Hersteller:
Hewlett Packard, USA) verwendet, mit dem die Impedanz in einem Frequenzbereich von
100 Hz bis 13 MHz gemessen werden kann.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung ist die Schalteinrichtung 33 als Umschalter gebildet,
mit dem entweder der Pulsgenerator 31 oder das Impedanzmessgerät 32 mit
den Elektroden 4, 5 verbunden wird. Anwendungsabhängig kann
jedoch auch eine dauerhafte elektrische Verbindung des Impedanzmessgerätes 32 mit
den Elektroden 4, 5 vorgesehen sein, wobei die
Schalteinrichtung 33 lediglich der Betätigung des Pulsgenerators 31 und
der Ausübung
der Feldpulse auf die adsorbierten Zellen 1 dient. Bei
dieser Gestaltung kann die Impedanzmessung auch während der
Behandlung der Zellen fortgesetzt werden.
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Die
Umsetzung der Erfindung ist nicht auf die beispielhaft angegebenen
Teile der Einrichtung 30 beschränkt. Als Pulsgenerator kann
auch ein anderer Generator verwendet werden, der in an sich bekannter
Weise die zur jeweiligen Behandlung der Zellen erforderlichen Pulse
liefert. Als Impedanzmessgerät kann
jede Messeinrichtung, z. B. auf der Basis einer Messbrücke, verwendet
werden, die eine vollständige
Messung des Wechselstromwiderstandes ermöglicht.
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Eine
erfindungsgemäße Vorrichtung
zur Behandlung biologischer Zellen kann abweichend von 2 auch
durch ein Behältnis
gebildet werden, in dem eine Vielzahl von Messkammern vorgesehen sind.
Jede Messkammer ist analog zu 2 aufgebaut.
Die Druck- und Pulsansteuerung der Messkammern kann gemeinsam oder
einzeln vorgesehen sein.
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Zur
Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Messkammer 10 mit einem Pulsmedium befüllt. Das
Pulsmedium ist z. B. eine Salzlösung
mit anwendungsabhängig
eingestellter Leitfähigkeit.
Vorteilhafterweise kann erfindungsgemäß ein isoosmolares Pulsmedium
verwendet werden, in dem die elektrische Be handlung der Zellen besonders
schonend erfolgt. Anschließend
wird von oben eine Suspension der zu behandelnden Zellen einpipettiert.
Dies kann vorteilhafterweise durch die obere Elektrode erfolgen.
Wenn die Messkammer 10 gemäß einer bevorzugten Gestaltung
nach oben offen ist, kann die Zufuhr der Zellsuspension mit jeder
an sich bekannten Pipettiereinrichtung erfolgen. Alternativ können die
Zellen in einem Vorverfahren auf dem Trägerelement 3 gewachsen
sein. Anschließend
wird mit der Druckeinrichtung 20 der Unterdruck angelegt, so
dass mit der Suspension die Zellen 1 auf das Trägerelement 3 gezogen
und dort an den Öffnungen 2 fixiert
werden. Unter der Wirkung des Unterdruckes werden die Zellen 1 geringfügig in die
Poren 2 hineingezogen (siehe 1). 3 zeigt
ein Trägerelement 3.
Das Trägerelement 3 besitzt
bspw. eine Dichte von 108 Öffnungen
(oder Poren) pro cm2.
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Anschließend erfolgt
eine Impedanzmessung zur Ermittlung des Bedeckungsgrades des Trägerelementes 3 mit
Zellen, die elektrische Behandlung der Zellen durch Porationspulse
und die Impedanzmessung zur Beobachtung des Ausheilens der permeabilisierten
Zellmembranen. Diese Verfahrensschritte werden im Folgenden unter
Bezug auf ein Anwendungsbeispiel illustriert.
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Anwendungsbeispiel
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Zellen
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Die
Maus-Myelom-Zelllinie Sp2 wurde im RMPI 1640 Complete Growth Medium
(CGM) mit 10 % FCS (Fetal Calf Serum, PAA, Linz, Österreich)
bei 37°C
unter 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden durch dreimalige Subkultivierung
pro Woche in der exponentiellen Wachstumsphase gehalten. Vor Beginn
der Elektropermeabilisierung wurden die Zellen ein- bis zweimal
mit Pulsmedium gewaschen und 10 min vor Pulsapplikation im Pulsmedium
resuspendiert. Der mittlere Zelldurchmesser wurde durch elektronische
Größenbestimmung
mittels CASY (Schärfe Systems,
Reutlingen, Deutschland) mit ca. 14 μm bestimmt.
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Pulsmedien
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Als
Pulsmedium wurde ein Phosphatpuffer mit 1,15 mM K2HPO4/KH2PO4-Puffer,
pH 7,2 verwendet. Als Leitsalz wurde KCl in einer Konzentration von
10 bzw. 30 mM hinzugesetzt. Die Osmolarität wurde durch Zugabe von Inosit
auf 290 mOsm eingestellt, um eine isoosmolare Lösung zu erhalten.
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Impedanzmessung
vor der Elektroporation
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4A zeigt Impedanzspektren der mit Pulsmedium
gefüllten
Messkammer mit und ohne Zugabe einer Zellsuspension. Die Messkammer
wurde mit einem niedrigleitenden, isoosmolaren Pulsmedium (1,25
mS/cm, 290 mOsm, pH 7,4) befüllt
und die Impedanz wurde über
den Frequenzbereich von 100 Hz bis 2,5 MHz bestimmt (offene Symbole).
Die Impedanz bleibt über
einen großen
Frequenzbereich (1 kHz–1
MHz) relativ konstant bei einem Wert von ca. 20 Ω. Bei geringeren Frequenzen
(< 1 kHz) ist eine
deutliche Zunahme der Impedanz mit sinkender Frequenz zu beobachten,
welche auf Elektrodenpolarisationsprozesse zurückgeführt wird. Nach Zugabe von 106 Sp2-Zellen und anschließendes Einbetten der Zellen
in die Poren 2 mittels des extern angelegten Unterdruckes
(ca. 30 mbar) zeigte sich eine deutliche Erhöhung der Impedanz (geschlossene
Symbole). Der Unterdruck bleibt während der folgenden Impedanzmessungen
erhalten. Die Erhöhung
der Impedanz bei Aufbringung der Zellen auf das Trägerelement 3 entspricht
der an sich bekannten Erhöhung des
Wechselstromwiderstandes zwischen den Elektroden durch eine Unterbrechung
der Elektrolytverbindung zwischen den Kompartimenten und den mit Zellen
besetzten Poren.
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Die
Erfinder haben festgestellt, dass die Impedanzerhöhung von
der Messfrequenz abhängt. Gemäß einer
besonders vorteilhaften Gestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist daher vor der eigentlichen Behandlung ein Vorversuch vorgesehen, bei
dem zell typspezifisch die optimale Messfrequenz ermittelt wird,
für die
die Impedanzerhöhung
bei Belegung der Poren mit Zellen besonders stark ist. Dementsprechend
werden die nachfolgen Messungen bei der vorab ermittelten optimalen
Messfrequenz durchgeführt.
Es kann auch vorgesehen sein, dass das Impedanzmessgerät auf eine
vorbestimmte Messfrequenz eingestellt wird, die als optimaler Wert aus
Tabellenwerten oder dergleichen ermittelt wird.
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Beim
dargestellten Beispiel wurden die nachfolgenden Messungen bei einer
Frequenz von 10 kHz durchgeführt,
da hier die Differenz zwischen besetzter und unbesetzter Filtermembran
und somit die Empfindlichkeit am größten war (Pfeil in 4A). Der deutliche Anstieg der Impedanz
im Frequenzbereich von 103–105 Hz ist auf die Besetzung der Mikroporen
mit Zellen zurückzuführen, die
ihrerseits isolierende Eigenschaften (in diesem Frequenzbereich) besitzen
und die Porenöffnungen
verschließen,
so dass der Wechselstromwiderstand der gesamten Anordnung zunimmt.
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4B zeigt den zeitlichen Verlauf der Besetzung
des Trägerelementes 3 mit
Zellen 1. Die Kammer wurde mit dem Pulsmedium befüllt und
die Impedanz bei 10 kHz gemessen (Z0 ≈ 19 Ω). Nach
75 s (siehe Pfeil) wurden 106 Zellen zugegeben
und in die Porenöffnungen
eingebettet (siehe 4A). Nach diesem
Zeitpunkt ist ein kontinuierlicher Anstieg der Impedanz zu beobachten,
der nach ca. 6 min in eine Sättigung übergeht
(Ze ≈ 28 Ω). Diese
Erhöhung
der Impedanz ist auf eine zunehmende Besetzung der Poren mit Zellen
zurückzuführen, die
bei Ze ein Maximum erreicht. Der durch die
Besetzung der Mikroporen mit Zellen verursachte Impedanzanstieg
wird mit ΔZc bezeichnet.
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Der
sigmoidale Verlauf gemäß 4B entspricht dem Zeitverlauf der Besetzung
der Poren 2 mit Zellen 1. Unmittelbar nach Zugabe
der Zellen befinden sich nur relativ wenige Zellen in direkter Umgebung
der Poren und können
diese verschließen,
so dass zu nächst
nur ein geringerer Anstieg der Impedanz zu beobachten ist. Durch
den anliegenden Unterdruck werden mit zunehmender Dauer immer mehr
Zellen, die sich ursprünglich
in entfernteren Bereichen befanden, an die Poren hinbewegt und verschließen diese,
was sich in einem schnellen Anstieg des Widerstandes zeigt. Ist
schließlich
die Membran maximal mit Zellen belegt, erreicht die Impedanz einen
Sättigungswert
(Ze). Die Differenz ΔZc zwischen diesem
Endwert Ze und dem Startwert Zo (Kammer ohne
Zellen) wird durch die Zugabe der Zellen erzielt und ist somit ein
exakt bestimmbares Maß für die Besetzung
der Membran mit Zellen, d. h. für
den Bedeckungsgrad des Trägerelementes.
Der Bedeckungsgrad entspricht dem Anteil der Poren, die mit Zellen besetzt
sind. Bei maximaler Bedeckung beträgt der Bedeckungsgrad 1.
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Es
wird darauf hingewiesen, dass die erfindungsgemäß ermittelte Wechselstrom-Impedanz
allgemein eine komplexe Größe ist.
Der in den Figuren illustrierte Absolutwert der Impedanz enthält sowohl Amplituden-
als auch Phaseninformationen. Entsprechend ist er als physikalische
Messgröße von herkömmlich gemessenen
Strom-Spannungs-Verhältnissen
zu unterscheiden.
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Anwendungsabhängig ist
bei Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
vorgesehen, den Bedeckungsgrad des Trägerelementes 3 durch Ermittlung
der Gesamtkinetik, die in 4B dargestellt
ist, oder durch Messung einer aktuellen Impedanz und Berechnung
der aktuellen Bedeckung aus diesem Impedanzwert und Vergleichswerten
vorgesehen. Aus dem Bedeckungsgrad und geometrischen Parametern
des verwendeten Trägerelementes
kann die Zahl der nachfolgend durch Elektroporation behandelten
Zellen ermittelt werden.
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Impedanzmessung
während
oder nach der Elektroporation
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In
den 5A und 5B sind
die Impedanzmessungen während
und nach der Elektroporation illustriert. Im linken Teil von 5A ist die Impedanzerhöhung durch die in 4B illustrierte Besetzung der Poren gezeigt,
Nachdem die maximale Besetzung der Poren erreicht war, wurde die
Impedanzmessung kurzfristig unterbrochen und mit dem Pulsgenerator 31 (siehe 2)
ein Puls von 1 kV/cm Feldstärke
und 40 μs
Pulsdauer appliziert (siehe Pfeil). Die Impedanzmessung wurde fortgesetzt
und es konnte zunächst
eine deutliche Abnahme des Widerstandes unmittelbar nach Pulsapplikation
beobachtet werden. Dies lässt
sich durch den Verlust der isolierenden Eigenschaften der Zellen,
der durch den pulsinduzierten Durchbruch der Zellmembranen hervorgerufen
wird, erklären.
Somit besteht mit der erfindungsgemäßen Elektroporationsvorrichtung
die Möglichkeit,
den elektrischen Membrandurchbruch mittels Impedanzmessung im Sekundenbereich quantitativ
zu erfassen. Die Impedanz nahm im weiteren Verlauf, einer exponentiellen
Kinetik folgend, wieder kontinuierlich zu, bis nach ca. 2 min der
ursprüngliche
Wert wieder nahezu erreicht wurde. Diese Resealing- oder Ausheilkinetik
kann mit einer exponentiellen Sättigung
erster Ordnung beschrieben werden, so dass die maximale pulsinduzierte
Impedanzänderung ΔZPuls über
eine Extrapolation relativ exakt bestimmt werden kann. Der Anstieg
der Impedanz auf nahezu den Wert vor Pulsapplikation spiegelt das
Resealing der Zellen wieder, d. h. in dieser Zeit heilen die Membranstörungen der
Zelle aus und sie weist wieder isolierende Eigenschaften auf, was sich
im Anstieg des Widerstandes zeigt. Des Weiteren kann aus dem Impedanzverlauf
auch der Anteil von ggf. irreversibel permeabilisierten, d. h. toten
Zellen ermittelt werden. Durch die kombinierte Impedanz- und Puls-Anordnung
ist es also möglich,
den gesamten Verlauf der Elektropermeabilisierung quantitativ in
einer einzigen Kammer über
einen relativ langen Zeitraum zu messen. Die Impedanzkinetiken oder
zumindest einzelnen Impedanzwerte, die mit Referenzwerten in Bezug
gesetzt werden, charakterisieren das Ausheilen der Zellen.
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5B zeigt den Einfluss der Feldstärke auf die
pulsinduzierte Impedanzänderung:
es wurden Elektroporationsexperimente mit Pulsdauern von 40 μs und Feldstärken von
0,3 bis 2,2 kV/cm in Pulsmedien unterschiedlicher Ionenzusammensetzung
(10 mM KCl (1,25 mS/cm; offene Symbole) bzw. 30 mM KCl (3,5 mS/cm;
geschlossene Symbole)) durchgeführt
und ausgewertet (siehe oben). Die so ermittelten Werte für die pulsinduzierte
Impedanzänderung ΔZPuls wurden auf die jeweilige Impedanz des
mit Zellen besetzten Membranfilters ΔZc normiert.
Aufgetragen sind die Mittelwerte dieser normierten pulsinduzierten
Impedanzänderungen
(± Standardfehler)
aus jeweils 3 bis 5 Experimenten. Es ist eine Zunahme der Werte
mit steigender Feldstärke
zu beobachten, die auf eine zunehmende Anzahl permeabilisierter Zellen
zurückzuführen ist.
Die Elektropermeabilisierung in höherleitenden Medien (geschlossene
Symbole) zeigt einen ähnlichen
Verlauf wie die in schwächerleitenden
Medien (offene Symbole).
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5B zeigt einen besonderen Vorteil der Erfindung.
Bereits bei Feldstärken,
die unter den theoretisch berechneten und in der Literatur genannten Feldstärken für frei suspendierte
Zellen liegen, zeigen sich deutliche Effekte des elektrischen Feldpulses.
Die Gründe
für diese
Herabsetzung der kritischen Feldstärke liegen einerseits in einer „Aufkonzentrierung" des elektrischen
Feldes im Bereich der Filterporen und andererseits in einer zusätzlichen, durch
den hydrostatischen Unterdruck bedingten, mechanischen Vorbelastung
der Zellmembran in Feldrichtung. Sowohl der mechanische Stress als auch
die elektromechanische Deformationskraft beeinflussen die Permeabilisierung
von Zellen stark.
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In
erfindungsgemäßen Elektroporationsvorrichtung
kann auch in isoosmolaren Medien höherer Leitfähigkeit effizient permeabilisiert
werden. Dies zeigt der Vergleich der beiden Pulsmedien in 5B. Wie bereits erwähnt, begünstigen hochleitende, isoosmolare
Medien die Überlebensfähigkeit
elektropermeabilisierter Zellen. Somit ist mit dieser Anordnung eine
effiziente Elektro permeabilisierung bei gleichzeitiger hoher Vitalität sogar
in isoosmolaren, salzreichen Medien möglich.
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Weitere Bearbeitungsschritte
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Nach
Auswertung des Behandlungsergebnisses kann sich erfindungsgemäß eine weitere
elektrische Behandlung mit einem veränderten Pulsmedium oder eine
Kultivierung der behandelten Zellen anschließen. Ein besonderer Vorteil
des modularen Aufbaus der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin,
dass das Trägerelement
aus der Messkammer entnommen und in eine Kultivierungseinrichtung überführt werden
kann. In der Kultivierungseinrichtung werden die behandelten Zellen
kultiviert. Die Kultivierung kann auch in der Messkammer selbst
erfolgen.
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Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten
Merkmale der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung
der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung
sein.