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DE10049937A1 - Niedermolekulare Inhibitoren von Serinproteasen mit Polyhydroxyalkyl- und Polyhydroxycycloalkylresten - Google Patents

Niedermolekulare Inhibitoren von Serinproteasen mit Polyhydroxyalkyl- und Polyhydroxycycloalkylresten

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DE10049937A1
DE10049937A1 DE10049937A DE10049937A DE10049937A1 DE 10049937 A1 DE10049937 A1 DE 10049937A1 DE 10049937 A DE10049937 A DE 10049937A DE 10049937 A DE10049937 A DE 10049937A DE 10049937 A1 DE10049937 A1 DE 10049937A1
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DE
Germany
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alkyl
equal
cooh
bond
cycloalkyl
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Withdrawn
Application number
DE10049937A
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English (en)
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Dieter Herr
Helmut Mack
Werner Seitz
Wilfried Hornberger
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Abbott GmbH and Co KG
Original Assignee
Knoll GmbH
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Publication date
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Amidine und Guanidine, ihre Herstellung und ihre Verwendung als kompetitive Inhibitoren von Trypsin-ähnlichen Serinproteasen, besonders Thrombin und der Komplementproteasen C1s und C1r. DOLLAR A Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen als aktive Bestandteile enthalten, sowie die Verwendung der Verbindungen als Thrombininhibitoren, Antikoagulantien, Komplementinhibitoren und als antiinflammatorische Agenzien. Charakteristisch für die neuen Verbindungen ist die Verknüpfung eines Serinproteaseinhibitors, mit Amidin- oder Guanidinfunktion, mit einem Alkylrest mit zwei oder mehreren Hydroxylfunktionen, wobei sich dieser Alkylrest von Zuckerderivaten ableitet. Dabei können auch mehrere Zuckerbausteine oder von Zuckern abgeleitete Bausteine miteinander verknüpft sein. Dieses Prinzip der Kupplung mit Zuckerderivaten führt zu oral aktiven Verbindungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Amidine und Guanidine, ihre Herstellung und ihre Verwendung als kompetitive Inhibitoren von Trypsin-ähnlichen Serinproteasen, besonders Thrombin und der Komplementproteasen C1s und C1r.
Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammen­ setzungen, die die Verbindungen als aktive Bestandteile ent­ halten, sowie die Verwendung der Verbindungen als Thrombin­ inhibitoren, Antikoagulantien, Komplementinhibitoren und als antiinflammatorische Agenzien. Charakteristisch für die neuen Verbindungen ist die Verknüpfung eines Serinproteaseinhibitors mit Amidin- oder Guanidinfunktion, mit einem Alkylrest mit zwei oder mehreren Hydroxylfunktionen, wobei sich dieser Alkylrest von Zuckerderivaten ableitet. Dabei können auch mehrere Zucker­ bausteine oder von Zuckern abgeleitete Bausteine miteinander verknüpft sein. Dieses Prinzip der Kupplung mit Zuckerderivaten führt zu oral aktiven Verbindungen.
Als bevorzugte Zuckerderivate kommen alle Arten von reduzierenden Zuckern zum Einsatz, die reduktiv mit einer terminalen Amin­ funktion des Inhibitors umgesetzt werden.
Reduzierende Zucker sind Zucker, die in der Lage sind, Cu (II) ionen in Lösung zu Cu (I) oxid zu reduzieren.
Reduzierende Zucker umfassen:
Alle Aldosen (ob in offenkettiger oder cyclischer Form) (z. B. Triosen oder Tetraosen wie Erythrose, Threose oder Pentosen wie Arabinose, Xylose, Rhamnose, Fucose, Ribose oder Hexosen wie Glucose, Mannose, Galactose, 2-Deoxy-D-Glucose, etc.)
Alle (Hydroxy)Ketosen. Hydroxyketosen enthalten eine HO-CH2-CO- Gruppe. Fructose oder Ribulose sind hierfür Beispiele.
Di- Oligo- und Polysaccharide die ein Hemiacetal enthalten, wie z. B. Lactose, Melibiose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltohexaose oder Celluloseoligomere wie Cellobiose, Cellotriose oder Dextranoligomere oder Pullulanoligomere oder Inulinoligomere etc.
Zuckerderivate und komplexe Oligosacchar ide die ein Hemiacetal enthalten wie z. B. Glucuronsäure, Galacturonsäure, 2-Deoxy- D-Glucose, 2-Deoxy-2-Fluoro-D-Glucose, Glucosamin, N-Acetyl- D-Glucosamin Oligomere von Pektin, Hyaluronsäure.
Als weitere bevorzugte Zuckerderivate sind die Zuckersäuren zu nennen, welche über die Acylfunktion mit einer terminalen Amin­ funktion des Inhibitors umgesetzt werden.
Thrombin gehört zur Gruppe der Serinproteasen und spielt als terminales Enzym in der Blutgerinnungskaskade eine zentrale Rolle. Sowohl die intrinsische als auch die extrinsische Gerinnungskaskade führen über mehrere Verstärkungsstufen zur Ent­ stehung von Thrombin aus Prothrombin. Die thrombinkatalysierte Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin leitet dann die Blutgerinnung und die Aggregation der Thrombozyten ein, die ihrerseits durch die Bindung von Plättchenfaktor 3 und Gerinnungsfaktor XIII sowie eine ganze Reihe von hochaktiven Mediatoren die Thrombinbildung verstärken.
Thrombinbildung und -wirkung sind zentrale Ereignisse bei der Entstehung sowohl von weißen, arteriellen als auch von roten, venösen Thromben und daher potentiell wirksame Angriffspunkte für Pharmaka. Thrombininhibitoren sind im Gegensatz zu Heparin in der Lage, unabhängig von Kofaktoren gleichzeitig die Wirkungen von freiem Thrombin als auch an Thrombozyten gebundenes voll­ ständig zu hemmen. Sie können in der Akutphase thromboembolische Ereignisse nach perkutaner transluminaler koronarer Angioplastie (PTCA) und Lyse verhindern und als Antikoagulantien in der extrakorporalen Zirkulation (Herz-Lungen-Maschine, Hämodialyse) dienen. Sie können auch allgemein zur Thromboseprophylaxe, beispielsweise nach chirurgischen Eingriffen dienen.
Inhibitoren des Thrombins eignen sich zur Therapie und Prophylaxe von
  • - Krankheiten, deren Pathomechanismus direkt oder indirekt auf der proteolytischen Wirkung von Thrombin beruht,
  • - Krankheiten, deren Pathomechanismus auf der thrombin­ abhängigen Aktivierung von Rezeptoren und Signaltrans­ duktionen beruht,
  • - Krankheiten, die mit Stimulation oder Inhibition von Gen­ expressionen in Körperzellen einhergehen,
  • - Krankheiten, die auf der mitogenen Wirkung von Thrombin beruhen,
  • - Krankheiten, die auf einer thrombinabhängigen Kontraktili­ täts- und Permeabilitätsveränderung von Epithelzellen beruhen,
  • - thrombinabhängigen, thromboembolischen Ereignissen,
  • - disseminierter intravasaler Koagulation (DIC),
  • - Reokklusion und zur Verkürzung der Reperfusionszeit bei Komedikation mit Thrombolytika,
  • - früher Reokklusion und später Restenosierung nach PTCA,
  • - von thrombinabhängiger Proliferation von Glattmuskelzellen,
  • - der Akkumulation aktiven Thrombins im ZNS,
  • - von Tumorwachstum sowie gegen die Adhäsion und Metastasierung von Tumorzellen.
Es sind eine Reihe von Thrombininhibitoren vom D-Phe-Pro-Arg Typ bekannt, für die in vitro eine gute Thrombinhemmung beschrieben ist: WO 9702284-A, WO 9429336-A1, WO 9857932-A1, WO 9929664-A1, US 5939392-A, WO 200035869-A1, WO 200042059-A1, DE 44 21 052-A1, DE 44 43 390-A1, DE 195 06 610-A1, WO 9625426-A1, DE 195 04 504-A1, DE 196 32 772-A1, DE 196 32 773-A1, WO 9937611-A1, WO 9937668-A1, WO 9523609-A1, US 5705487-A1, WO 9749404-A1, EP-669317-A1, WO 9705108-A1, EP 0 672 658. Allerdings weisen etliche dieser Verbindungen eine geringe orale Wirkung auf.
In WO 9965934 und in Bioorg. Med. Chem. Lett., 9 (14), 2013-2018, 1999 sind Benzamidinderivate vom NAPAP Typ beschrieben, die über einen langen Spacer an Pentasaccaride gekoppelt sind und somit ein duales antithrombotisches Wirkprinzip aufweisen. Es ist allerdings keine orale Wirkung dieser Verbindungen beschrieben.
Die Aktivierung des Komplementsystems führt über eine Kaskade von ca. 30 Proteinen letztlich u. a. zur Lyse von Zellen. Gleichzeitig werden Moleküle freigesetzt, die wie z. B. C5a zu einer Entzündungsreaktion führen können. Unter physiologischen Bedingungen dient das Komplementsystem der Abwehr von Fremd­ körpern, wie z. B. Viren, Pilzen, Bakterien, Krebszellen. Die Aktivierung auf den verschiedenen Wegen verläuft dabei zunächst über Proteasen. Durch Aktivierung werden diese Proteasen in die Lage versetzt, andere Moleküle des Komplementsystems, die wiederum inaktive Proteasen sein können, zu aktivieren. Unter physiologischen Bedingungen ist dieses System - ähnlich wie die Blutgerinnung - unter der Kontrolle von Regulatorproteinen, die einer überschießenden Aktivierung des Komplementsystems entgegen­ wirken. In diesen Fällen ist ein Eingriff, um das Komplement­ system zu inhibieren, nicht vorteilhaft.
In einigen Fällen überreagiert das Komplementsystem jedoch und trägt damit zur Pathophysiologie von Krankheiten bei. In diesen Fällen ist ein therapeutischer Eingriff in das Komplementsystem durch Inhibition bzw. Modulation der überschießenden Reaktion wünschenswert. Inhibition des Komplementsystems ist auf ver­ schiedenen Ebenen im Komplementsystem und durch Inhibition verschiedener Effektoren möglich. In der Literatur finden sich Beispiele für Inhibition der Serinproteasen auf C1-Ebene mit Hilfe des C1-Esterase-Inhibitors ebenso wie Inhibition auf der Ebene der C3- bzw. C5-Konvertasen mit Hilfe von löslichem Komplementrezeptor CR1 (sCR1), Inhibition auf der Ebene von C5 mit Hilfe von Antikörpern, Inhibition auf der Ebene von C5a mit Hilfe von Antikörpern oder Antagonisten. Die verwendeten Werkzeuge zur Erreichung der Inhibition sind in den oben ange­ gebenen Beispielen Proteine. In der vorliegenden Erfindung werden niedermolekulare Substanzen beschrieben, die zur Inhibition des Komplementsystems verwendet werden.
Für die Inhibition des Komplementsystems sind einige Proteasen der verschiedenen Aktivierungswege besonders geeignet. Aus der Klasse der Thrombin-ähnlichen Serinproteasen sind dies die Komplement-Proteasen C1r und C1s im klassischen Weg, Faktor D und Faktor B im alternativen Weg sowie MASP I und MASP II im MBL- Weg. Die Inhibition dieser Proteasen führt dann zu einer Wieder­ herstellung der physiologischen Kontrolle des Komplementsystems in den oben angegebenen Krankheiten bzw. pathophysiologischen Zuständen führen.
Generell ist bei jeder entzündlichen Erkrankung, die mit Ein­ wanderung von neutrophilen Blutzellen einhergeht, mit einer Aktivierung des Komplementsystems zu rechnen. Es wird daher erwartet, daß bei allen diesen Erkrankungen durch Inhibition von Teilen des Komplementsystems eine Verbesserung des patho­ physiologischen Status erreicht wird.
Die Aktivierung von Komplement ist verbunden mit den folgenden Krankheiten bzw. pathophysiologischen Zuständen
  • - Reperfusionsschäden nach Ischämien; Ischämische Zustände treten ein während z. B. Operationen unter Zuhilfenahme von Herz-Lungenmaschinen; Operationen, in denen Blutgefäße generell zur Vermeidung großer Blutungen abgeklemmt werden; Myokardinfarkt; thromboembolischer Hirnschlag; Lungen­ thrombosen etc.;
  • - Hyperakute Organabstoßung; speziell bei Xenotransplanta­ tionen;
  • - Organversagen wie z. B. multiples Organversagen oder ARDS (adult respiratory distress syndromea);
  • - Krankheiten, die auf Trauma (Schädeltrauma) oder Polytrauma beruhen, wie z. B. Thermotrauma (Verbrennungen) und "thermal injury";
  • - Anaphylaktischer Schock;
  • - Sepsis; "vascular leak syndrom": bei Sepsis und nach Behand­ lung mit biologischen Agenzien, wie Interleukin 2 bzw. nach Transplantation;
  • - Alzheimer Krankheit sowie andere entzündliche neurologische Krankheiten wie Myastenia graevis, multiple Sklerose, zerebraler Lupus, Guillain-Barre Syndrome; Meningitiden; Encaphilitiden;
  • - Systemischer Lupus erythematosus (SLE);
  • - Rheumatoide Arthritis und andere entzündliche Krankheiten des rheumatoiden Krankheitskreises, wie z. B. Behcet's Syndrom; Juvenile rheumatoide Arthritis;
  • - Nierenentzündungen unterschiedlicher Genese, wie z. B. Glomerulonephritis, Lupus nephriti;
  • - Pankreatitis;
  • - Asthma; chronische Bronchitis;
  • - Komplikationen während Dialyse bei Nierenversagen;
  • - Vasculitis; Thyroiditis;
  • - Ulcerative Colitis sowie andere entzündliche Erkrankungen des Magen-Darmtraktes;
  • - Autoimmunerkrankungen;
  • - Hemmung des Komplementsystems z. B. mit den hier aufgeführten C1s-Inhibitoren kann die Nebenwirkungen von Medikamenten, die auf Aktivierung des Komplementsystems beruhen, lindern und resultierende Hypersensitivitätsreaktionen herabsetzen.
Dementsprechend ist eine Behandlung der oben erwähnten Krank­ heiten bzw. pathophysiologischen Zustände mit Komplement­ inhibitoren wünschenswert, insbesondere die Behandlung mit niedermolekularen Inhibitoren.
FUT und FUT-Derivate sind Amidinophenolester bzw. Amidino­ naphtholester und beschrieben als Komplementinhibitoren (z. B. Immunology (1983), 49 (4), 685-91).
Wünschenswert sind Inhibitoren, die C1s und/oder C1r hemmen, aber nicht Faktor D inhibieren. Bevorzugt soll nicht gehemmt werden: Lyseenzyme wie z. B. t-PA, Plasmin.
Besonders bevorzugt sind Substanzen, die Thrombin oder C1s und C1r effektiv hemmen.
Pharmakolgische Beispiele Beispiel A Thrombinzeit
Reagenzien:
Thrombin Reagenz (Kat. Nr. 126 594, Boehringer, Mannheim, Deutschland)
Präparation von Citrat-Plasma:
9 Teile von venösem humanem Blut der V. cephalica werden mit einem Teil Natriumcitrat Lösung (0,11 mol/l) gemischt. Anschließend abzentrifugiert. Das Plasma kann bei -20°C gelagert werden.
Experimentelles Verfahren:
50 µl Testsubstanz Lösung und 50 µl Citrat-Plasma werden für 2 Minuten bei 37°C inkubiert (CL8, ball type, Bender & Hobein, München, FRG). Anschließend wird 100 µl Thrombin Reagenz (37°C) zugegeben. Die Zeit bis zur Bildung des Fibrinklumpen wird bestimmt. Die EC100
-Werte geben die Konzentration an, bei der es zu einer Verdoppelung der Thrombin-Zeit kommt.
Beispiel B Chromogener Test für Thrombin Inhibitoren
Reagenzien:
Humanes Plasma Thrombin (Nr. T-8885, Sigma, Deisen­ hofen, Deutschland)
Substrat: H-D-Phe-Pip-Arg-pNA2HCl (S-2238, Chromo­ genix, Mölndahl, Schweden)
Puffer: Tris 50 mmol/l, NaCl 154 mmol/l, pH 8.0
Experimentelle Durchführung:
Der chromogene Test kann in Mikrotiterplatten durch­ geführt werden. 10 µl Substanz Lösung in DMSO werden zu 250 µl Puffer mit Thrombin (finale Konzentration 0.1 NIH-Units/ml) gegeben und 5 Minuten bei 20 bis 28°C inkubiert. Der Test wird durch Zugabe von 50 µl Substrat Lösung in Puffer (finale Konzentration 100 µmol/l) gestartet, bei 28°C inkubiert und nach 5 Minuten durch Zugabe von 50 µl Zitronensäure (35%) gestoppt. Die Absorption wird bei 405/630 nm gemessen.
Beispiel C Plättchenaggregation im Plättchen-reichen Plasma
Reagenzien:
Humanes Plasma Thrombin (Nr. T-8885, Sigma, Deisenhofen, Deutschland)
Herstellung des citratreichen Plättchen-reichen Plasma:
Venöses Blut aus der Vena cephalica von gesunden medikamentenfreien Testpersonen wird gesammelt. Das Blut wird 9 zu 1 mit 0,13 molarem Trinatriumcitrat gemischt.
Plättchen-reiches Plasma (PRP) wird durch Zentri­ fugation bei 250 × g (10 Minuten bei Raumtemperatur) hergestellt. Plättchen-armea Plasma (PPP) wird durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 3600 × g her­ gestellt. PRP und PPP können für 3 Stunden bei Raum­ temperatur in verschlossenen PE-Gefäßen aufgehoben werden. Die Plättchen-Konzentration wird mit einem Zellzähler gemessen und sollte zwischen 2,5 bis 2,8.108
/ml liegen.
Experimentelles Verfahren:
Die Plättchen-Aggregation wird turbitrimetrisch bei 37°C gemessen (PAP 4, Biodata Corporation, Horsham, PA, USA). Bevor Thrombin zugegeben wird, werden 215,6 µl PRP für 3 Minuten mit 2,2 µl Testsubstanz inkubiert und anschließend 2 Minuten bei 1000 rpm ge­ rührt. Bei einer finalen Konzentration von 0,15 NIH- Units/ml führen 2,2 µl Thrombinlösung zum maximalen Agrregationseffekt bei 37°C/1000 rpm. Der inhibierte Effekt der Testsubstanzen wird bestimmt, indem die Aggregationsrate (Steigung) von Thrombin ohne Substanz mit der Rate von Thrombin mit Testsubstanz bei verschiedenen Konzentrationen verglichen wird.
Beispiel D Farbsubstrattest für die C1r-Inhibition
Reagentien:
C1r aus Humanplasma, aktiviert, Zweikettenform (Reinheit: ca. 95% nach SDS-Gel). Keine Fremd­ proteasenaktivität nachweisbar.
Substrat: Cbz-Gly-Arg-S-Bzl Produktnr.: WBASO12, (Fa. PolyPeptide, D-38304 Wolfenbüttel, Deutsch­ land)
Farbeagenz: DTNB (5,5'dinitrobis 2-nitrobenzoic acid) (No. 43760, Fluka, CH-9470 Buchs, Schweiz) Puffer: 150 mM Tris/HCl pH = 7,50
Testdurchführung:
Der Farbsubstrattest zur Bestimmung der C1s- Aktivität wird in 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt.
10 µl der Inhibitorlösung in 20%igem DMSO (DMSO verdünnt mit 15 mmolar Tris/HCl pH = 7,50) gelangen zu 140 µl Testpuffer, welcher C1s mit einer Endkonzentration von 0,013 U/ml enthält und DTNB mit mit einer Endkonzentration von 0,27 mM/l. Inkubiert wird 10 Minuten bei 20 bis 25°C.
Gestartet wird der Test durch Zugabe von 50 µl einer 1,5 mmolaren Substratlösung in 30%igem DMSO (Endkonzentration 0,375 mmol/l).
Nach 30 Minuten Inkubationszeit bei 20 bis 25°C wird die Extinktion jedes Wells bei 405 nm in einem Zwei-Strahl-Mikrotiterplattenphotometer gegen einen Leerwert (ohne Enzym) gemessen.
Meßkriterium:
IC50
: Benötigte Inhibitorkonzentration, um die amidolytische C1r-Aktivität auf 50% herab­ zusetzen.
Statistische Auswertung:
Die Abhängigkeit der Extinktion von der Inhibitorkonzentration dient als Berechnungs­ grundlage.
Beispiel E Material und Methoden Farbsubstrattest für die C1s-Inhibition
Reagentien:
C1s aus Humanplasma, aktiviert, Zweikettenform (Reinheit: ca. 95% nach SDS-Gel). Keine Fremd­ proteasenaktivität nachweisbar.
Substrat: Cbz-Gly-Arg-S-Bzl Produktnr.: WBASO12, (Fa. PolyPeptide, D-38304 Wolfenbüttel, Deutsch­ land)
Farbeagenz: DTNB (5,5'dinitrobis 2-nitrobenzoic acid) (No. 43760, Fluka, CH-9470 Buchs, Schweiz) Puffer: 150 mM Tris/HCl pH = 7,50
Testdurchführung:
Der Farbsubstrattest zur Bestimmung der C1s- Aktivität wird in 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt.
10 µl der Inhibitorlösung in 20%igem DMSO (DMSO verdünnt mit 15 mmolar Tris/HCl pH = 7,50) gelangen zu 140 µl Testpuffer, welcher C1s mit einer Endkonzentration von 0,013 U/ml enthält und DTNB mit einer Endkonzentration von 0,27 mM/l. Inkubiert wird 10 Minuten bei 20 bis 25°C. Gestartet wird der Test durch Zugabe von 50 µl einer 1,5 mmolaren Substratlösung in 30%igem DMSO (Endkonzentration 0,375 mmol/l). Nach 30 Minuten Inkubationszeit bei 20 bis 25°C wird die Extinktion jedes Wells bei 405 nm in einem Zwei-Strahl-Mikrotiterplattenphotometer gegen einen Leerwert (ohne Enzym) gemessen.
Meßkriterium:
IC50
: Benötigte Inhibitorkonzentration, um die amidolytische C1s-Aktivität auf 50% herab­ zusetzen.
Statistische Auswertung:
Die Abhängigkeit der Extinktion von der Inhibitorkonzentration dient als Berechnungs­ grundlage.
Beispiel F Nachweis der Inhibition von Komplement auf dem klassischen Weg durch hämolytischen Test
Für das Messen von potentiellen Komplement-Inhibitoren wird in Anlehnung an diagnostische Tests ein Test zur Messung des klassischen Weges benutzt (Literatur: Complement, A practical Approach; Oxford University Press; 1997; S. 20 ff). Hierzu wird als Quelle für Komplement Humanserum verwendet. Ein gleichartig aufgebauter Test wird jedoch auch mit verschiedenen Seren anderer Spezies in analoger Weise durchgeführt. Als Indikator­ system werden Erythrozyten von Schafen verwendet. Die antikörper­ abhängige Lyse dieser Zellen und das dadurch ausgetretene Hämo­ globin sind ein Maß für die Komplementaktivität.
Reagenzien, Biochemikalien
Stammlösungen
VBS-Stammlösung:
2,875 g/l Veronal; 1,875 g/l Na-Veronal; 42,5 g/l NaCl
Ca/Mg-Starnmlösung:
0,15 M Ca++, 1 M Mg++
EDTA-Stammlösung:
0,1 M pH 7,5
Puffer
GVBS-Puffer:
VBS-Stammlösung 1 : 5 mit Fin Aqua verdünnen;
1 g/L Gelatine mit etwas Puffer heiß Auflösen
GVBS++ Puffer:
Ca/Mg-Stammlösung 1 : 1000 in GVBS-Puffer verdünnen
GVBS/EDTA-Puffer:
EDTA-Stammlösung 1 : 10 in GVBS-Puffer verdünnen
Biogene Komponenten
  • - Schafserythrozyten (SRBC): Hammelblut wurde 1 + 1 (v/v) mit Alsevers-Lösung gemischt, durch Glaswolle filtriert und mit 1/10 Volumen EDTA-Stammlösung +1 Spatelspitze Penicillin versetzt. Humanserum: Nach Abzentrifugieren der geronnenen Anteile bei 4°C wurde der Überstand in Aliquots bei -70°C gelagert. Alle Messungen wurden mit einer Charge durch­ geführt. Es ergaben sich keine wesentlichen Abweichungen gegenüber Serum anderer Probanden.
Vorgehen 1. Sensibilisierung der Erythrozyten
  • - SRBC wurden dreimal mit GVBS-Puffer gewaschen. Anschließend wurde die Zellzahl auf 5,00E+08 Zellen/ml in GVBS/EDTA-Puffer eingestellt. Ambozeptor wurde in einer Verdünnung von 1 : 600 zugegeben und durch Inkubation über 30 Min bei 37°C unter Bewegung die SRBC mit Anti­ körper sensibilisiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit GVBS-Puffer bei 4°C gewaschen, anschließend in GVBS++ Puffer aufgenommen und auf eine Zellzahl von 5 × 108 eingestellt.
2. Lyseansatz
  • - Inhibitoren wurden in verschiedenen Konzentrationen mit Humanserum oder Serum anderer Spezies in passender Ver­ dünnung (z. B. 1 : 80 für Humanserum; passend ist eine Ver­ dünnung, bei der ca. 80% der maximalen Lyse, die durch Serum erzielt werden kann, erreicht ist.) in GVBS++ für 10 Min bei 37°C in einem Volumen von 100 µl vorinkubiert. Anschließend wurden 50 µl sensibilisierte SRBC in GVBS++ zugegeben. Nach Inkubation von 1 Stunde bei 37°C unter Bewegung wurden die SRBC abzentrifugiert (5 Minuten; 2500 Upm 4°C). 130 µl des zellfreien Überstandes wurden in eine 96-well-Platte überführt. Die Auswertung erfolgte durch Messung bei 540 nm gegen GVBS++-Puffer.
Zur Auswertung werden die Absorptionswerte bei 540 nm benutzt.
(1): Background; Zellen ohne Serum
(3): 100% Lyse; Zellen mit Serum
(x): gemessene Werte mit Testsubstanzen
Berechnung
Beispiel G Test von Inhibitoren auf Inhibition der Protease Faktor D
Faktor D übt im alternativen Weg des Komplementsystems eine zentrale Funktion aus. Aufgrund der geringen Plasmakonzentration von Faktor D stellt der enzymatische Schritt der Spaltung von Faktor B durch Faktor D den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in dem alternativen Weg der Komplementaktivierung dar. Auf Grund der limitierenden Rolle, die dieses Enzym im alternativen Weg spielt, ist Faktor D ein Target für die Inhibition des Komplementsystems.
Das käufliche Substrat Z-Lys-SBzl.HCl wird von dem Enzym Faktor D umgesetzt (Literatur: Kam, C. M. et al., J. Biol. Chem. 262, 3444-3451, 1987). Die Detektion des gespaltenen Substrates erfolgt durch Umsatz mit Ellmann's Reagenz. Das entstandene Produkt wird spektrophotometrisch detektiert. Die Reaktion kann online verfolgt werden. Hierdurch sind enzymkinetische Messungen möglich.
Material
Puffer
50 mM Tris
150 mM NaCl
0,01% Triton - X - 100
pH 7,6
Stocklösungen
Substrat:
20 mM (8,46 mg/ml = 16,92 µl
(50 mg/ml) + 83,1 µl H2
O)
Ellmann's Reagent:
10 mM (3,963 mg/ml) in DMF
Faktor D:
0,1 mg/ml
Proben (Inhibitoren):
10-2
M in DMSO
Durchführung
Ansätze:
Leerwert:
140 µl Puffer + 4,5 µl Substrat
(0,6 mM) + 4,5 µl Ellmann's (0,3 mM)
Positiv-Kontrolle:
140 µl Puffer + 4,5 µl Substrat
(0,6 mM) + 4,5 µl Ellmann's (0,3 mM)
+ 5 µl Faktor D
Proben-Messung:
140 µl Puffer + 4,5 µl Substrat (0,6 mM)
+ 4,5 µl Ellmann's (0,3 mM)
+ 1,5 µl Proben (10-4
M) + 5 µl Faktor D
Die Ansätze werden in Mikrotiterplatten zusammenpipettiert. Nach dem Mischen von Puffer, Substrat und Ellmann's (evtl. Inhibitor) wird die Enzymreaktion durch Zugabe von jeweils 5 µl Faktor D gestartet. Inkubation findet bei Raumtemperatur für 60 min. statt.
Messung
Messen bei 405 nm für 1 Stunde in 3 Minuten Abstand
Auswertung
Das Ergebnis wird graphisch aufgetragen. Die Änderung der Absorption pro Minute (Delta OD pro Minute; Steigung) ist für den Vergleich von Inhibitoren relevant, da sich hieraus Ki-Werte von Inhibitoren ermitteln lassen.
Als wirksamer Inhibitor wurde in diesem Test der Serin­ protease-Inhibitor FUT-175; Futhan; Fa. Torii; Japan mit­ geführt.
Beispiel H
Nachweis der Inhibition von Komplement auf dem alternativen Weg durch hämolytischen Test (Literatur: Complement, A practical Approach; Oxford University Presss; 1997, S. 20 ff.)
Der Test wird in Anlehnung an klinische Tests durchgeführt. Durch zusätzliche Aktivierung mittels z. B. Zymosan oder Cobra Venom Faktor kann der Test modifiziert werden.
Material
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)-tetracetic acid
Humanserum wurde entweder bei verschiedenen Lieferanten (z. B. Sigma) gekauft oder in der Ambulanz der BASF Süd von Probanden gewonnen.
Meerschweinchenblut wurde gewonnen und 2 : 8 in Citratlösung ver­ dünnt. Es wurden mehrere Chargen ohne offensichtliche Unter­ schiede verwendet.
Stammlösungen
VBS-Stammlösung:
2,875 g/l Veronal
1,875 g/l Na-Veronal
42,5 g/l NaCl
GVBS:
VBS Stammlösung 1 : 5 mit Wasser (Finn Aqua) verdünnen
+ 0,1% Gelatine
erhitzen bis Gelatine gelöst und abkühlen
100 mM EGTA:
38,04 mg EGTA in 500 ml Finn Aqua und mit 10 M NaOH langsam auf pH 7,5 bis gelöst, dann auf 1 l auffüllen
Mg - EGTA:
5 ml 100 mM EGTA
3,5 ml 100 mM MgCl2
10,4 ml GVBS
31,1 ml 5% Glucoselösung
Saline:
0,9% NaCl in Wasser (Finn Aqua)
GTB:
0,15 mM CaCl2
141 mM NaCl
0,5 mM MgCl2
.6 H2
O
10 mM Tris
0,1% Gelatine
pH 7,2-7,3
Vorgehen
1. Zellpräparation:
Die Erythrozyten aus dem Meerschweinchenblut wurden mehrfach durch Zentrifugieren (5 Minuten; 1000 Upm) mit GTB gewaschen, bis der Überstand klar war. Die Zellzahl wurde auf 2.109 Zellen/ml eingestellt.
2. Durchführung:
Die einzelnen Ansätze wurden 30 Minuten bei 37°C unter Bewegung inkubiert. Anschließend wurde mit je 480 µl eiskalter Saline (physikalischer Kochsalzlösung) abge­ stoppt und die Zellen 5 Minuten mit 5000 Upm abzentrifugiert. 200 µl des Überstandes wurden bei 405 nm gemessen durch Überführen in eine Mikrotiterplatte und Auswertung in einem Mikrotiterplattenphotometer.
Pipettierschema (Mengenangaben in µl)
Auswertung
Zur Auswertung werden die OD-Werte benutzt.
(1): Background; Zellen ohne Serum
(3): 100% Lyse + Faktor D; Zellen mit Serum
(x): gemessene Werte mit Testsubstanzen
Berechnung
Beispiel I Pharmakokinetik und Gerinnungsparameter in Ratten
Die Testsubstanzen werden unmittelbar vor der Verabreichung an wache Sprague Dawley Ratten in isotonischer Salzlösung gelöst. Die Applikationsvolumina betragen 1 ml/kg für die intravenöse Bolus-Injektion in die Schwanzvene und 10 ml/kg für die orale Verabreichung, die per Schlundsonde erfolgt. Blutabnahmen er­ folgen wenn nicht anders erwähnt 1 h nach oraler Applikation von 21,5 mg.kg-1 oder intravenöser Applikation von 1,0 mg.kg-1 der Testsubstanz oder des entsprechenden Vehikels (Kontrolle). Fünf Minuten vor Blutabnahme werden die Tiere durch i.p. Applikation von 25%iger Urethanlösung (Dosis 1 g.kg-1 i.p.) in physiologischer Kochsalzlösung narkotisiert. Die A. carotis wird präpariert und katheterisiert Blutproben (2 ml) in Citrat- Röhrchen (1,5 Teile Citrat plus 8,5 Teile Blut) genommen. Direkt nach der Probennahme wird die Ecarinzeit (ECT = ecarin clotting time) im Vollblut bestimmt. Nach der Präparation des Plasmas durch Zentrifugation werden die Plasma-Thrombinzeit und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT = activated partial thromboplastin time) mit Hilfe eines Koagulometers bestimmt.
Gerinnungs-Parameter
Ecarinzeit (ECT = ecarin clotting time): 100 µl Citratblut werden für 2 min bei 37°C in einem Koagulometer inkubiert (CL 8, Kugel- Typ, Bender & Hobein, München, BRD). Nach der Zugabe von 100 µl vorgewärmtem (37°C) Ecarin-Reagenz (Pentapharm) wird die Zeit bis zur Bildung eines Fibrin-Clots bestimmt.
Aktivierte Thromboplastinzeit (APTT = activated thromboplastin time): 50 µl Citratplasma und 50 µl des PTT-Reagenzes (Pathrombin, Behring) werden gemischt und für 2 min bei 37°C in einem Koagulo­ meter inkubiert (CL 8, Kugel-Typ, Bender & Hobein, München, BRD). Nach der Zugabe von 50 µl vorgewärmtem (37°C) Calciumchlorid wird die Zeit bis zur Bildung eines Fibrin-Clots bestimmt.
Thrombinzeit (TT): 100 µl citratbehandeltes Plasma wird für 2 min bei 37°C in einem Koagulometer inkubiert (CL 8, Kugel-Typ, Bender & Hobein, München, BRD). Nach der Zugabe: von 100 µl vorgewärmtem (37°C) Thrombin-Reagenz (Boehringer Mannheim) wurde die Zeit bis zur Bildung eines Fibrin-Clots bestimmt.
Beispiel J Pharmakokinetik und Gerinnungsparameter in Hunden
Die Testsubstanzen werden unmittelbar vor der Verabreichung an wache Mischlingshunde in isotonischer Salzlösung gelöst. Die Applikationsvolumina betragen 0,1 ml/kg für die intravenöse Bolus-Injektion und 1 ml/kg für die orale Verabreichung, die per Schlundsonde erfolgt. Vor sowie 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300 und 360 min (bei Bedarf nach 420, 480 min und 24 h) nach intravenöser Applikation von 1,0 mg/kg bzw. vor sowie 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 480 min und 24 h nach oraler Gabe von 4,64 mg/kg werden Proben venösen Blutes (2 ml) in Citrat-Röhrchen genommen. Direkt nach der Probennahme wird die Ecarinzeit (ECT = ecarin clotting time) im Ganzblut bestimmt. Nach der Präparation des Plasmas durch Zentrifugation werden die Plasma-Thrombinzeit und die aktivierte partielle Thromboplastin­ zeit (APTT = activated thromboplastin time) mit Hilfe eines Koagulometer bestimmt.
Zusätzlich werden die anti-F IIa-Aktivität (ATU/ml) und die Konzentration der Substanz durch ihre anti-F IIa-Aktivität im Plasma mittels chromogenem (S-2238) Thrombin-Assay bestimmt, wobei Eichkurven mit r-Hirudin und der Testsubstanz eingesetzt wurden.
Die Plasmakonzentration der Testsubstanz ist Grundlage zur Berechnung der pharmakokinetischen Parameter: Zeit der maximalen Plasmakonzentration (T max), maximale Plasmakonzentration; Plasma-Halbwertzeit, t0.5; Fläche unter der Kurve (AUC); resorbierter Teil der Testsubstanz (F).
Gerinnungs-Parameter
Ecarinzeit (ECT = ecarin clotting time): 100 µl citratbehandeltes Blut werden für 2 min bei 37°C in einem Koagulometer inkubiert (CL 8, Kugel-Typ, Bender & Hobein, München, BRD). Nach der Zugabe von 100 µl vorgewärmtem (37°C) Ecarin-Reagenz (Pentapharm) wird die Zeit bis zur Bildung eines Fibrin-Clots bestimmt.
Aktivierte Thromboplastinzeit (APTT = acaivated thromboplastin time): 50 µl citratbehandeltes Plasma und 50 µl des PTT-Reagenzes (Pathrombin, Behring) werden gemischt und für 2 min bei 37°C in einem Koagulometer inkubiert (CL 8, Kugel-Typ, Bender & Hobein, München, BRD). Nach der Zugabe von 50 µl vorgewärmtem (37°C) Calciumchlorid wird die Zeit bis zur Bildung eines Fibrin-Clots bestimmt.
Thrombinzeit (TT): 100 µl citratbehandeltes Plasma wird für 2 min bei 37°C in einem Koagulometer inkubiert (CL 8, Kugel-Typ, Bender & Hobein, München, BRD). Nach der Zugabe von 100 µl vorgewärmtem (37°C) Thrombin-Reagenz (Boehringer Mannheim) wurde die Zeit bis zur Bildung eines Fibrin-Clots bestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft peptidische und peptidomi­ metische Substanzen, deren Herstellung und deren Verwendung als Thrombin- oder Komplementinhibitoren. Insbesondere handelt es sich um Substanzen mit einem Amidinrest als endständiger Gruppe einerseits und um einen Polyhydroxyalkyl- oder Polyhydroxcyclo­ alkylrest - welcher aus mehreren Einheiten bestehen kann - als zweiter endständiger Gruppierung andererseits.
Die Erfindung betrifft die Verwendung dieser neuen Substanzen zur Herstellung von Thrombininhibitoren, Komplementinhibitoren, spezifisch von Inhibitoren von C1s und C1r.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von chemisch stabilen Substanzen der allgemeinen Formel I, deren Tautomeren, pharmakologisch verträglichen Salzen und Prodrugs zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch teilweise oder vollständige Inhibition, insbesondere selektive Inhibition von Thrombin oder von C1s und/oder C1r gelindert oder geheilt werden.
Formel I hat die allgemeine Struktur
A-B-D-E-G-K-L (I).
A steht für H, CH3, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA2 H, NH2, NH-COCH3, F, NHCHO
RA3 H, CH2OH
RA4 H, CH3, COOH
i A = 1-20
j A = 0, 1, 2
k A = 2, 3
l A = 0, 1
m A = 0, 1, 2
n A = 0, 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können;
B steht für
A-B kann stehen für
oder für einen Neuraminsäurerest oder N-Acetylneuraminsäure­ rest, welche über die Carboxylfunktion gebunden sind,
RB1 gleich H, CH2OH, C1-4-Alkyl
RB2 gleich H, NH2, NH-COCH3, F, NHCHO
RB3 gleich H, C1-4-Alkyl, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH, F, NH-COCH3, CONH2
RB4 gleich H, C1-4-Alkyl, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetal­ bildung auftreten kann
RB5 gleich H, C1-4-Alkyl, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH
k B = 0, 1
l B 0, 1, 2, 3 (l B ≠ 0, für A = RB1 = RB3 = H, m B = k B = 0, und D eine Bindung)
m B = 0, 1, 2, 3, 4
n B = 0, 1, 2, 3
RB6 gleich C1-4-alkyl, Phenyl, Benzyl
BB7 gleich H, C1-4-alkyl, Phenyl, Benzyl
D steht für eine Bindung oder für
mit RD1 gleich H, C1-4-Alkyl
RD2 gleich Bindung oder C1-4-Alkyl
RD3 gleich
mit l D = 1, 2, 3, 4, 5, 6
und RD5 gleich H, C1-4-Alkyl, Cl
RD6 gleich H, CH3
wobei an die unter RD3 genannten Ringsysteme ein weiterer aromatischer oder aliphatischer Ring ankondensiert sein kann
RD4 gleich Bindung, C1-4-Alkyl, CO, SO2, -CH2-CO
E steht für
mit
k E = 0, 1, 2;
l E = 0, 1, 2;
m E 0, 1, 2, 3;
n E = 0, 1, 2;
p E = 0, 1, 2;
RE1 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl (ins­ besondere Phenyl oder Naphthyl), Heteroaryl (insbesondere Pyridyl, Thienyl, Imidazolyl, Indolyl), C3-8-Cycloalkyl mit ankondensiertem Phenylring, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl, F, Cl, Br tragen können;
RE1 bedeutet weiterhin RE4OCO-CH2- (RE4 gleich H, C1-12-Alkyl, C1-3-Alkylaryl);
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl (ins­ besondere Phenyl oder Naphthyl), Heteroaryl (insbesondere Pyridyl, Furyl, Thienyl, Imidazolyl, Indolyl), Tetra­ hydropyranyl, Tetrahydrothiopyranyl, Diphenylmethyl, Dicyclohexylmethyl, C3-8-Cycloalkyl mit ankondensiertem Phenylring, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl, F, Cl, Br, tragen können, CH(CH3)OH, CH(CF3)2;
RE3 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl (ins­ besondere Phenyl oder Naphthyl), Heteroaryl (insbesondere Pyridyl, Thienyl, Imidazolyl, Indolyl), C3-8-Cycloalkyl mit ankondensiertem Phenylring, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl, F, Cl, Br tragen können;
die unter RE1 und RE2 genannten Gruppen können über eine Bindung miteinander verknüpft sein; auch die unter RE2 und RE3 genannten Gruppen können über eine Bindung mit­ einander verbunden sein;
RE2 steht weiterhin für CORE5 (RE5 gleich OH, O-C1-6-Alkyl, OC1-3-Alkylaryl), CONRE6RE7 (mit RE6 bzw. RE7 gleich H, C1-6-Alkyl, C0-3-Alkylaryl), NRE6RE7;
E kann auch stehen für D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Orn, D-His, D-Dab, D-Dap, D-Arg;
G bedeutet
mit l G = 2, 3, 4 und 5, wobei eine CH2-Gruppe des Rings durch O, S, NH, NC1-3-Alkyl, CHOH, CHOC1-3-Alkyl, C(C1-3-Alkyl)2, CH(C1-3-Alkyl), CHF, CHCl, CF2 ersetzt sein kann;
mit
m G = 0, 1, 2;
n G = 0,1,2;
p G = 1, 2, 3, 4;
RG1 H, C1-C6-Alkyl, Aryl;
RG2 H, C1-C6-Alkyl, Aryl;
RG1 und RG2 können zusammen auch eine -CH=CH-CH=CH-Kette bilden;
weiterhin steht G für
mit
q G 0, 1, 2;
r G 0, 1, 2;
RG3 H, C1-C6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl;
RG4 H, C1-C6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl (insbesondere Phenyl, Naphthyl);
K bedeutet
NH-(CH2)n K-QK mit
n K = 0, 1, 2, 3;
QK gleich C2-6-Alkyl, wobei bis zu zwei CH2-Gruppen durch O oder S ersetzt sein können;
QK gleich
mit
RK1 gleich H, C1-3-Alkyl, OH, O-C1-3-Alkyl, F, Cl, Br;
RK2 gleich H, C1-3-Alkyl, O-C1-3-Alkyl, F, Cl, Br;
XK gleich O, S, NH, N-C1-6-Alkyl;
YK gleich
ZK gleich
UK gleich
VK gleich
WK gleich CH- oder N-, wobei im letzteren Fall L keine Guanidingruppe sein darf;
n K = 0, 1, 2;
p K = 0, 1, 2;
q K = 1, 2;
mit
RL1 gleich H, OH, O-C1-6-Alkyl, O-(CH2)0-3-Phenyl, CO-C1-6-Alkyl, CO2-C1-6-Alkyl, CO2-C1-3-Alkylaryl.
Bevorzugt sind dabei folgende Verbindungen
A-B-D-E-G-K-L (I).
A steht für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA4 H, CH3, COOH
i A = 1-6
j A = 0, 1, 2
k A = 2, 3
m A = 0, 1, 2
n A = 0, 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können;
B steht für
A-B kann stehen für
RB1 gleich H, CH2OH
RB2 gleich H, NH2, NH-COCH3, F
RB3 gleich H, CH3, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH
RB4 gleich H, C1-4-Alkyl, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetal­ bildung auftreten kann
RB5 gleich H, CH3, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH
k B = 0, 1
l B = 0, 1, 2, 3 (l B ≠ 0, für A = RB1 = RB3 = H, m B = k B = 0, und D eine Bindung)
m B = 0, 1, 2, 3
n B = 0, 1, 2, 3
RB6 gleich C1-4-alkyl, Phenyl, Benzyl
BB7 gleich H, C1-4-alkyl, Phenyl, Benzyl
D steht für eine Bindung oder für
mit RD1 gleich H, C1-4-Alkyl
RD2 gleich Bindung oder C1-4-Alkyl,
RD3 gleich
RD4 gleich Bindung, C1-4-Alkyl, CO, SO2, -CH2-CO
E steht für
mit
k E = 0, 1, 2;
m E = 0, 1, 2, 3;
RE1 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, wobei die vor­ genannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl tragen können;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl (ins­ besondere Phenyl oder Naphthyl), Heteroaryl (insbesondere Pyridyl, Furyl, Thienyl), Tetrahydropyranyl, Diphenyl­ methyl, Dicyclohexylmethyl, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl, F, Cl, Br, tragen können, CH(CF3)2;
RE3 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl;
RE2 steht weiterhin für CORE5 (RE5 gleich OH, O-C1-6-Alkyl, OC1-3-Alkylaryl), CONRE6RE7 (mit RE6 bzw. RE7 gleich H, C1-6-Alkyl, C0-3-Alkylaryl), NRE6RE7;
E kann auch stehen für D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Orn, D-His, D-Dab, D-Dap, D-Arg;
G bedeutet
mit l G = 2, 3 und 4, wobei eine CH2-Gruppe des Rings durch O, S, NH, NC1-3-Alkyl, CHOH, CHOC1-3-Alkyl ersetzt sein kann;
mit
m G = 0, 1, 2;
n G = 0, 1;
K bedeutet
NH-(CH2)n K-QK mit
n K = 1, 2;
QK gleich
mit
RK1 gleich H, C1-3-Alkyl, OH, O-C1-3-Alkyl, F, Cl, Br;
RK2 gleich H, C1-3-Alkyl, O-C1-3-Alkyl, F, Cl, Br;
XK gleich O, S, NH, N-C1-6-Alkyl;
YK gleich
ZK gleich
UK gleich
mit
RL1 gleich H, OH, O-C1-6-Alkyl, CO2-C1-6-Alkyl.
Als Thrombininhibitoren bevorzugt sind die Verbindungen der Formel
A-B-D-E-G-K-L (I).
A steht für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA4 H, COOH
i A = 1-6
j A = 0, 1
k A = 2, 3
n A = 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können.
B steht für
RB3 gleich H, CH3, COOH
RB4 gleich H, CH3, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetalbildung auftreten kann
k B = 0, 1
l B = 1, 2, 3
m B = 1, 2, 3
n B = 1, 2, 3
D steht für eine Bindung
E steht für
mit
m E = 0, 1;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Phenyl, Diphenyl­ methyl, Dicyclohexylmethyl, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-4-Alkyl, OH, O-CH3, F, Cl tragen können
G bedeutet
mit l G = 2, 3 und 4, wobei eine CH2-Gruppe des Rings durch O, S, NH, NC1-3-Alkyl ersetzt sein kann;
mit
n G = 0, 1;
K bedeutet
NH-CH2-QK mit
QK gleich
mit
RK1 gleich H, CH3, OH, O-CH3, F, Cl;
XK gleich O, S, NH, N-CH3;
YK gleich
ZK gleich
mit
RL1 gleich H, OH, CO2-C1-6-Alkyl.
Als Komplementinhibitoren bevorzugt sind die Verbindungen der Formel
A-B-D-E-G-K-L (I).
A steht für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA4 H, COOH
i A = 1-6
j A = 0, 1
k A = 2, 3
n A = 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder Verschieden sein können.
B steht für
A-B kann stehen für
RB3 gleich H, CH3, COOH
RB4 gleich H, CH3, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetalbildung auftreten kann
k B = 0, 1
l B = 1, 2, 3
m B = 0, 1, 2, 3
n B = 1, 2, 3
RB6 gleich C1-4-alkyl, Phenyl, Benzyl
BB7 gleich H, C1-4-alkyl, Phenyl, Benzyl
D steht für
mit RD1 gleich H, C1-4-Alkyl
RD2 gleich Bindung oder C1-4-Alkyl,
RD3 gleich
RD6 gleich H, CH3
RD4 gleich Bindung, C1-4-Alkyl, CO, SO2, -CH2-CO,
E steht für
mit
m E = 0, 1;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, wobei die vor­ genannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-4-Alkyl, OH, O-CH3, F, Cl tragen können
G bedeutet
mit l G = 2, 3 und 4, wobei eine CH2-Gruppe des Rings durch O, S, NH, NC1-3-Alkyl ersetzt sein kann;
mit
n G = 0, 1;
K bedeutet
NH-CH2-QK mit
QK gleich
mit
RK1 gleich H, CH3, OH, O-CH3, F, Cl;
XK gleich O, S, NH, N-CH3;
YK gleich
ZK gleich
mit
RL1 gleich H, OH, CO2-C1-6-Alkyl.
Als Thrombininhibitoren besonders bevorzugt sind die Verbindungen der Formel
A-B-D-E-G-K-L (I).
A steht für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit i A = 1-6
j A = 0, 1
n A = 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können.
B steht für
l B = 1, 2, 3
m B = 1, 2
D steht für eine Bindung
E steht für
mit
m E = 0,1;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Phenyl, Diphenyl­ methyl, Dicyclohexylmethyl;
wobei der E Baustein vorzugsweise D-Konfiguration aufweist;
G bedeutet
wobei der G Bautein vorzugsweise L-Konfiguration aufweist:
K bedeutet
NH-CH2-QK mit
QK gleich
mit
RL1 gleich H, OH, CO2-C1-6-Alkyl.
Als Komplementinhibitoren besonders bevorzugt sind die Verbindungen der Formel
A-B-D-E-G-K-L (I).
A steht für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA4 H, COOH
i A = 1-6
j A = 0, 1
k A = 2, 3
n A = 1, 2 wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können.
B steht für
A-B steht für
RB3 gleich H, CH3, COOH
RB4 gleich H, CH3, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetalbildung auftreten kann
k B = 0, 1
l B = 1, 2, 3
m B = 0, 1, 2, 3
n B = 1, 2, 3
RB6 gleich C1-4-alkyl, Phenyl, Benzyl
BB7 gleich H, C1-4-alkyl, Phenyl, Benzyl
D steht für
mit RD1 gleich H
RD2 gleich Bindung oder C1-4-Alkyl,
RD3 gleich
RD4 gleich Bindung, C1-4-Alkyl, CO, SO2, -CH2-CO,
E steht für
mit
m E = 0, 1;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, wobei die vor­ genannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe F, Cl tragen können
G bedeutet
mit l G = 2
mit
n G = 0;
K bedeutet
NH-CH2-QK mit
QK gleich
mit
XK gleich S;
YK gleich =CH-, =N-;
ZK gleich =CH-, =N-;
mit
RL1 gleich H, OH.
Bevorzugte A-B-Bausteine sind:
Der Begriff C1-X-Alkyl umfaßt alle geradkettigen und verzweigten Alkylketten mit einem bis X-Kohlenstoffatomen.
Der Begriff C3-8-Cycloalkyl steht für carbocyclische gesättigte Reste mit 3- bis 8-Kohlenstoffatomen.
Der Begriff Aryl steht für carbocyclische Aromaten mit 6 bis 14 C-Atomen, insbesondere für Phenyl, 1-Naphthyl, 2-Naphthyl.
Der Begriff Heteroaryl steht für Fünf- und Sechsring-Aromaten mit mindestens einem Heteroatom N, O oder S, insbesondere für Pyridyl, Thienyl, Furyl, Thiazolyl, Imidazolyl; dabei können auch zwei aromatische Ringe kondensiert sein, wie z. B. Indol, N-C1-3-Alkylindol, Benzothiophen, Benzothiazol, Benzimidazol, Chinolin, Isochinolin.
Der Begriff Cx-y-Alkylaryl steht für carbocyclische Aromaten, die über eine Alkylgruppe mit X, x+1, . . . y-1 oder y C-Atomen mit dem Gerüst verknüpft sind.
Die Verbindungen der Formel I können als solche oder in Form ihrer Salze mit physiologisch verträglichen Säuren vorliegen. Beispiele für solche Säuren sind: Salzsäure, Zitronensäure, Wein­ säure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Hydroxy­ bernsteinsäure, Schwefelsäure, Glutarsäure, Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure und Acetylglycin.
Die neuen Verbindungen der Formel I sind kompetitive Inhibitoren des Thrombins oder des Komplementsystems, besonders von C1s, sowie weiter von C1r.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in üblicher Weise oral oder parenteral (subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, rektal) verabfolgt werden. Die Applikation kann auch mit Dämpfen oder Sprays durch den Nasen-Rachenraum erfolgen.
Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand und Gewicht des Patienten sowie von der Applikationsart ab. In der Regel beträgt die täg­ liche Wirkstoffdosis pro Person zwischen etwa 10 und 2000 mg bei oraler Gabe und zwischen etwa 1 und 200 mg bei parenteraler Gabe. Diese Dosis kann in 2 bis 4 Einzeldosen oder einmalig am Tag als Depotform gegeben werden.
Die Verbindungen können in den gebräuchlichen galenischen Applikationsformen fest oder flüssig angewendet werden, z. B. als Tabletten, Filmtabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Dragees, Suppositorien, Lösungen, Salben, Cremes oder Sprays. Diese werden in üblicher Weise hergestellt. Die Wirkstoffe können dabei mit den üblichen galenischen Hilfsmitteln wie Tablettenbindern, Füll­ stoffen, Konservierungsmitteln, Tablettensprengmitteln, Fließ­ reguliermitteln, Weichmachern, Netzmitteln, Dispergiermitteln, Emulgatoren, Lösungsmitteln, Retardierungsmitteln, Antioxidantien und/oder Treibgasen verarbeitet werden (vgl. H. Sucker et al.: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978). Die so erhaltenen Applikationsformen enthalten den Wirkstoff normalerweise in einer Menge von 0,1 bis 99 Gew.-%.
Unter Prodrugs werden Verbindungen verstanden, die in vivo (z. B. first pass Metabolisums) in die pharmakologisch aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel I umgesetzt werden.
Ist bei den Verbindungen der Formel I RL1 ungleich Wasserstoff, so handelt es sich bei diesen Substanzen um Prodrugs, aus denen unter in vivo Bedingungen die freien Amidin-/Guanidinverbindungen entstehen. Sind in den Verbindungen der Formel I Esterfunktionen enthalten, so können diese Verbindungen in vivo als Prodrugs wirken, aus welchen die entsprechenden Carbonsäuren entstehen.
Außer den in den Beispielen genannten Substanzen sind folgende Verbindungen ganz besonders bevorzugt und können gemäß den genannten Herstellungsvorschriften hergestellt werden:
Abkürzungsliste
Abu: 2-Aminobuttersäure
AIBN: Azobisisobutyronitril
Ac: Acetyl
Acpc: 1-Aminocyclopentan-1-carbonsäure
Achc: 1-Aminocyclohexan-1-carbonsäure
Aib: 2-Aminoisobuttersäure
Ala: Alanin
b-Ala: b-Alanin (3-Aminopropionsäure)
am: Amidino
amb: amidinobenzyl
4-amb: 4-amidinobenzyl (p-amidinobenzyl)
Arg: Arginin
Asp: Asparaginsäure
Aze: Azetidin-2-carbonsäure
Bn: Benzyl
Boc: tert.Butyloxycarbonyl
Bu: Butyl
Cbz: Benzyloxycarbonyl
Cha: Cyclohexylalanin
Chea: Cycloheptylalanin
Cheg: Cycloheptylglycin
Chg: Cyclohexylglycin
Cpa: Cyclopentylalanin
Cpg: Cyclopentylglycin
d: Dublett
Dab: 2,4-diaminobuttersäure
Dap: 2,3-diaminopropionsäure
DC: Dünnschichtchromatographie
DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
Dcha: Dicyclohexylamin
DCM: Dichlormethan
Dhi-1-COOH: 2,3-Dihydro-1H-isoindol-1-carbonsäure
DMF: Dimethylformamid
DIPEA: Diisopropylethylamin
EDC: N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid
Et: Ethyl
Eq: Äquivalente
Gly: Glycin
Glu: Glutaminsäure
fur: Furan
guan: Guanidino
ham: Hydroxyamidino
HCha: Homocyclohexylalanin, 2-Amino-4-cyclohexylbuttersäure
His: Histidin
HOBT: Hydroxybenzotriazol
HOSucc: Hydroxysuccinimid
HPLC: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Hyp: Hydroxyprolin
Ind-2-COOH: Indolin-2-carbonsäure
iPr: iso-Propyl
Leu: Leucin
Lsg: Lösung
Lys: Lysin
m: Multiplett
Me: Methyl
MPLC: Mitteldruckflüssigkeitschromatographie
MTBE: Methyl-tert.-butyl-ether
NBS: N-Bromsuccinimid
Nva: Norvalin
Ohi-2-COOH: Octahydroindol-2-carbonsäure
Ohii-1-COOH: Octahydroisoindol-1-carbonsäure
Orn: Ornithin
Oxaz: Oxazol
p-amb: p-amidinobenzyl
Ph: Phenyl
Phe: Phenylalanin
Phg: Phenylglycin
Pic: Pipecolinsäure
pico: picolyl
PPA: Propylphosphonsäureanhydrid
Pro: Prolin
Py: Pyridin
Pyr: 3,4-Dehydroprolin
q: Quartett
RT: Raumtemperatur
RP-18 Reversed Phase C-18
s: Singulett
Sar: Sarkosin (N-Methylglycin)
sb: Singulett breit
t: Triplett
t: tertiär
tBu: tertiär-Butyl
tert: tertiär
TBAB: Tetrabutylammoniumbromid
TEA: Trietylamin
TFA: Trifluoressigsäure
TFFA: Trifluoressigsäureanhydrid
thiaz: Thiazol
Thz-2-COOH: 1,3-Thiazolidin-2-carbonsäure
Thz-4-COOH: 1,3-Thiazolidin-4-carbonsäure
thioph: Thiophen
1-Tic: 1-Tetrahydroisochinolincarbonsäure
3-Tic: 3-Tetrahydroisochinolincarbonsäure
TOTU: O-(Cyan-ethoxycarbonylmethylen)-amino-]- N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
Z: Benzyloxycarbonyl
Experimenteller Teil
Die Verbindungen der Formel I lassen sich entsprechend Schemata I und II darstellen.
Die Bausteine A-B, D, E, G und K werden vorzugsweise separat aufgebaut und in geeignet geschützter Form eingesetzt (siehe Schema I, Verwendung jeweils orthogonaler, mit der angewandten Synthesemethode kompatibler Schutzgruppen (P oder P*).
Schema I
Schema I beschreibt den linearen Aufbau des Moleküls I durch Schutzgruppenabspaltung von P-K-L* (L* gleich CONH2, CSNH2, CN, C(=NH)NH-COOR*; R* gleich Schutzgruppe oder polymerer Träger mit Spacer (Festphasensynthese)), Kupplung des Amins H-K-L* mit der N-geschützten Aminosäure P-G-OH zu P-G-K-L*, Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe zu H-G-K-L*, Kupplung mit der N-geschützten Aminosäure P-E-OH zu P-E-G-K-L*, erneute Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe zu H-E-G-K-L* und gegebenenfalls erneute Kupplung mit dem N-geschützten Baustein P-D-U (U = Abgangs­ gruppe zu P-D-E-G-K-L*, falls das Endprodukt einen D Baustein aufweist.
Ist L* auf dieser Synthesestufe eine Amid-, Thioamid- oder Nitil­ funktion, so wird diese - je nach angestrebtem Endprodukt - in die entsprechende Amidin- oder Hydroxyamidinfunktion überführt. Amidinsynthesen für die Benzamidin-, Picolylamidin-, Thienyl­ amidin-, Furylamidin- und Thiazolylamidin-Verbindungen des Strukturtyps I ausgehend von den entsprechenden Carbonsäure­ amiden, Nitrilen, Carbonsäurethioamiden und Hydroxyamidinen sind in einer Reihe von Patentanmeldungen beschrieben (s. z. B. WO 95/35309, WO 96/178860, WO 96/24609, WO 96/25426, WO 98/06741, WO 98/09950.
Nach Abspaltung der Schutzgruppe P zu H-(D)-E-G-K-L* (L* gleich C(=NH)NH, C(=NOH)NH oder (=NH)NH-COOR*; R* gleich Schutzgruppe oder polymerer Träger mit Spacer (Festphasensynthese) erfolgt die Kupplung mit dem gegebenenfalls geschützten (P)-A-B-U Baustein (U = Abgangsgruppe) oder eine reduktive Alkylierung mit (P)-A-B'-U (U = Aldehyd, Keton) zu (P)-A.-B-(D)-E-G-K-L*.
Anschließend werden eventuell noch vorhandene Schutzgruppen abgespalten. Ist L* gleich C(=NH)NH-Spacer-polymerer Träger, so werden diese Verbindungen im letzten Schritt vom polymeren Träger abgespalten und somit die Wirksubstanz freigesetzt.
Schema II
Schema II beschreibt einen alternativen Weg zur Darstellung der Verbindungen I durch eine konvergente Synthese. Die entsprechend geschützten Bausteine P-D-E-OH und H-G-K-L* werden miteinander gekuppelt, das entstandene Zwischenprodukt P-D-E-G-K-L* in P-D-E-G-K-L* (L* gleich C(=NH)NH, C(=NOH)NH oder (=NH)NH-COOR*; R* gleich Schutzgruppe oder polymerer Träger mit Spacer (Fest­ phasensynthese) überführt, die N-terminale Schutzgruppe abge­ spalten und das entstandene Produkt H-D-E-G-K-L* gemäß Schema I zum Endprodukt umgesetzt.
Als N-terminale Schutzgruppen werden Boc, Cbz oder Fmoc ein­ gesetzt, C-terminale Schutzgruppen sind Methyl, tert.-Butyl und Benzylester. Amidinschutzgruppen sind vorzugsweise BOC, Cbz und davon abgeleitete Gruppen für die Festphasensynthese. Enthalten die Zwischenprodukte olefinische Doppelbindungen so sind Schutz­ gruppen, die hydrogenolytisch abgespalten werden, ungeeignet.
Die erforderlichen Kupplungsreaktionen sowie die üblichen Reaktionen der Schutzgruppeneinführung und -abspaltung werden nach Standardbedingungen der Peptidchemie durchgeführt (siehe M. Bodanszky, A. Bodanszky "The Practice of Peptide Synthesis", 2. Auflage, Springer Verlag Heidelberg, 1994).
Boc-Schutzgruppen werden mittels Dioxan/HCl oder TFA/DCM, Cbz- Schutzgruppen hydrogenolytisch oder mit HF, Fmoc- Schutzgruppen mit Piperidin abgespalten. Die Verseifung von Esterfunktionen erfolgt mit LiOH in einem alkoholischen Lösungsmittel oder in Dioxan/Wasser. t-Butylester werden mit TFA oder Dioxan/HCl gespalten.
Die Reaktionen wurden mittels DC kontrolliert, wobei üblicher­ weise folgende Laufmittel benutzt wurden:
A. DCM/MeOH 95 : 5
B. DCM/MeOH 9 : 1
C. DCM/MeOH 8 : 2
D. DCM/MeOH/50%ig HOAc 40 : 10 : 5
E. DCM/MeOH/50%ig HOAc 35 : 15 : 5
Sofern säulenchromatographische Trennungen erwähnt werden, waren dies Trennungen über Kieselgel, für die die oben genannten Lauf­ mittel verwendet wurden.
Reversed phase HPLC Trennungen wurden mit Acetonitril/Wasser und HOAc Puffer durchgeführt.
Die Ausgangsverbindungen lassen sich nach folgenden Methoden herstellen:
A-B Bausteine
Die als A-B Bausteine eingesetzten Verbindungen sind größten­ teils kommerziell erhältliche Zuckerderivate. Soweit diese Verbindungen mehrere funktionelle Gruppen aufweisen werden an den notwendigen Stellen Schutzgruppen eingeführt. Gegebenenfalls werden funktionelle Gruppen in Reaktiv- oder Abgangsgruppen umgewandelt (z. B. Cabonsäuren in Aktivester, gemischte Anhydride, etc.), um eine entsprechende chemische Verknüpfung mit den anderen Bausteinen zu ermöglichen. Die Aldehyd- oder Ketofunktion der Zuckerderivate kann direkt für die reduktive Alkylierung mit dem endständigen N- Atom des D bzw. E Bausteines eingesetzt werden.
Die Synthese der D-Bausteine wird wie folgt durchgeführt:
Die eingesetzten D-Bausteine 4-Aminocyclohexancarbonsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Aminomethyl-benzoesäure, 4-Aminomethyl- phenylessigsäure und 4-Amino-phenylessigsäure sind käuflich zu erwerben.
Die Synthese der E-Bausteine wurde wie folgt durchgeführt:
Die als E-Bausteine eingesetzten Verbindungen Glycin, (D) bzw. (L)-Alanin, (D) bzw (L)-Valin, (D)-Phenylalanin, (D)-Cyclohexyl­ alanin, (D)-Cycloheptylglycin, D-Diphenylalanin, etc. sind ent­ weder als freie Aminosäuren, als Boc-geschützte Verbindungen oder als entsprechende Methylester käuflich zu erwerben.
Die Darstellung von Cycloheptylglycin und Cyclopentylglycin erfolgte durch Umsetzung von Cycloheptanon bzw. Cyclopentanon mit Isonitrilessigsäureethylester entsprechend bekannter Vorschriften (H.-J. Prätorius, J. Flossdorf, M. Kula, Chem. Ber. 1985, 108, 3079 oder U. Schöllkopf und R. Meyer, Liebigs Ann. CHem. 1977, 1174). Die Darstellung von D-Dicyclohexylalanin erfolgte durch Hydrierung entsprechend T. J. Tucker et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3687-3693.
Die genannten Aminosäuren wurden nach allgemein bekannten Verfahren je nach Bedarf entweder N oder C-terminal mit einer Schutzgruppe versehen.
Die Synthese der G-Bausteine wurde wie folgt durchgeführt:
Die als G-Bausteine eingesetzten Verbindungen (L)-Prolin, (L)-Pipecolinsäure, (L)-4,4-Difluorprolin, (L)-3-Methylprolin, (L)-5-Methylprolin, (L)-3,4-Dehydroproprolin, (L)-Octahydroindol- 2-carbonsäure, (L)-Thiazolidin-4-carbonsäure und (L)-Azetidin­ carbonsäure sind entweder als freie Aminosäuren, als Boc-ge­ schützte Verbindungen oder als entsprechende Methylester käuflich zu erwerben (-)-Thiazolidin-2-carbonsäuremethylester wurde nach R. L. Johnson, E. E, Smissman, J. Med. CHem. 21, 165 (1978) dargestellt.
Die Synthese der K-Bausteine wurde wie folgt durchgeführt:
p-Cyanobenzylamin
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 95/35309 beschrieben, durchgeführt.
3-(6-Cyano)-picolylamin
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 96/25426 bzw. WO 96/24609 beschrieben, durchgeführt.
5-Aminomethyl-2-cyanothiophen
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 95/23609 beschrieben, durchgeführt.
5-Aminomethyl-3-cyanothiophen
Die Darstellung dieses Bausteins erfolgte ausgehend von 2-Formyl-4-cyano-thiophen analog zu 2-Formyl-5-cyano-thiophen (WO 95/23609).
2-Aminomethyl-thiazol-4-thiocarboxamid
Die Darstellung erfolgte entsprechend G. Videnov, D. Kaier, C. Kempter und G. Jung Angew. Chemie (1996) 108, 1604, wobei die dort beschriebene N-Boc-geschützte Verbindung mit etherischer Salzsäure in Methylenchlorid entschützt wurde.
5-Aminomethyl-2-cyanofuran
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 96/17860 beschrieben, durchgeführt.
5-Aminomethyl-3-cyanofuran
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 96/17860 beschrieben, durchgeführt.
5-Aminomethyl-3-methylthiophen-2-carbonitril
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 99/37668 beschrieben, durchgeführt.
5-Aminomethyl-3-chlorthiophen-2-carbonitril
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 99/37668 beschrieben, durchgeführt.
5-Aminomethyl-4-methylthiophen-3-thiocarboxamid
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 99/37668 beschrieben, durchgeführt.
5-Aminomethyl-4-chlorthiophen-3-thiocarboxamid
Die Darstellung dieses Bausteins wurde wie in WO 99/37668 beschrieben, durchgeführt.
2-Aminomethyl-4-cyanothiazol a) Boc-2-aminomethyl-thiazol 4-carboxamid
Zu einer Lösung von Boc-Glycinthioamid (370 g, 1,94 Mol) in 3,9 Liter Ethanol wurde bei 10°C Brombrenztraubensäureethyl­ ester (386 g, 1,98 Mol) zugetropft und dann für 5 h bei 20 bis 25°C gerührt. Anschließend gab man 299 ml einer 25%igen wäßrigen Ammoniaklösung hinzu.
Von 940 ml dieses Gemisches (entspricht 19,9% des Gesamt­ volumens) wurden 380 ml Ethanol abdestilliert, weitere 908 ml einer 25%igen wäßrigen Ammoniaklösung hinzugefügt und 110 h bei 20 bis 25°C gerührt. Man kühlte auf 0°C, filtrierte den Feststoff ab, wusch zweimal mit Wasser und trocknete ihn. Man erhielt 60,1 g des BOC-geschützten Thiazolcarbonsäureamids mit einer HPLC-Reinheit von 97,9 Fl.-%, das entsprach einer Ausbeute über diese zwei Stufen von 60,5%.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 8,16 (s, 1H, Ar-H), 7,86 (t, breit, 1H, NH), 7,71 und 7,59 (2× s, breit, je 1H, NH2), 4,42 (d, 2H, CH2), 1,41 (s, 9H, tert. Butyl)
b) 2-Aminomethyl-4-cyano-thiazol hydrochlorid
Boc-2-aminomethyl-thiazol 4-carboxamid (75,0 g, 0,29 Mol) wurden in 524 ml Methylenchlorid suspendiert und bei -5 bis 0°C mit Triethylamin (78,9 g, 0,78 Mol) und 79,5 g (0,38 Mol) Trifluoressigsäureanhydrid versetzt. Man rührte 1 h nach, ließ die Mischung auf 20 bis 25°C erwärmen, gab 1190 ml Was­ ser hinzu und trennte die Phasen. Zur organischen Phase gab man 160 ml 5 bis 6 N isopröpanolische Salzsäure, erwärmte für 3 h zum Sieden, ließ bei 20 bis 25°C über Nacht nachrühren, kühlte für 2,5 h auf -5 bis 0°C ab und filtrierte den Fest­ stoff. Dieser wurde mit Methylenchlorid gewaschen und ge­ trocknet. Man erhielt 48,1 g 2-Aminomethyl-4-cyano-thiazol mit einer HPLC-Reinheit von 99,4 Fl.-%, das entspricht einer Ausbeute über diese zwei Stufen von 94,3%.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 8,98 (s, breit, 2H, NH2), 8,95 (s, 1H, Ar-H), 4,50 (s, 2H, CH2)
5-Aminomethyl-3-amidino-thiophen-Bishydrochlorid
Die Synthese dieser V 18534 00070 552 001000280000000200012000285911842300040 0002010049937 00004 18415erbindung erfolgte ausgehend von 5-Amino­ methyl-3-cyanothiophen durch Umsetzung mit (Boc)20 zu 5-t-Butyl­ oxycarbonyl-aminomethyl-3-cyanothiophen, Umwandlung der Nitril­ funktion in das entsprechende Thioamid durch Addition von Schwefelwasserstoff, Methylierung der Thioamidfunktion mit Methyliodid, Umsetzung mit Ammoniumacetat zum entsprechenden Amidin und anschließende Schutzgruppenabspaltung mit Salzsäure in Isopropanol zum 5-Aminomethyl-3-amidino-thiophen-Bishydro­ chlorid.
Bausteine für die Festphasensynthese 3-Amidino-5-[N-1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)ethyl]- aminomethylthiophen-hydrochlorid
3-Amidino-5-aminomethylthiophenbishydrochlorid (1,3 g, 5,7 mmol) wurde in DMF (15 ml) vorgelegt und mit N,N-Diisopropylethylamin (0,884 g, 6,84 mmol) versetzt. Nach 5 min Rühren bei Raum­ temperatur wurden 2-Acetyldimedon (1,25 g, 6,84 mmol) und Ortho­ ameisensäuretrimethylester (3,02 g, 28,49 mmol) zugegeben. Nach 2,5 h Rühren bei Raumtemperatur wurde das DMF im Hochvakuum ent­ fernt und der Rückstand mit DCM (5 ml) und Petrolether (20 ml) ausgerührt. Das Lösungsmittel wurde vom leicht gelblichen Produkt abdekantiert und der Feststoff im Vakuum bei 40°C getrocknet. Ausbeute: 1,84 g (5,2 mmol, 91%).
1H-NMR (400 MHz, [D6]DMSO, 25 W, TMS): δ = 0,97 (s, 6H); 2,30 (s, 4H); 2,60 (s, 4H); 4,96 (d, J = 7 Hz, 2H); 7,63 (s, 1H); 8,60 (s, 1H); 9,07 (sbr, 2H); 9,37 (sbr, 1H).
Bausteinsynthesen H-G-K-CN
Die Darstellung des H-G-K-CN Bausteins ist exemplarisch für Prolyl-4-cyanobenzylamid in WO 95/35309, für 3,4-Dehydroprolyl- 4-cyanobenzylamid in WO 98/06740 und für 3,4-Dehydroprolyl-5- (2-cyano)-thienylmethylamid in WO 98/06741 beschrieben.
Analog erfolgte die Darstellung von 3,4-Dehydroprolyl-5- (3-cyano)-thienylmethylamid durch Kupplung von Boc-3,4-Dehydro­ prolin mit 5-Aminomethyl-3-cyano-thiophen hydrochlorid und anschließender Schutzgruppenabspaltung.
Die Darstellung von 3,4-Dehydroprolyl-[2-(4-cyano)-thiazol­ methyl]amid hydrochlorid erfolgte durch Kupplung von Boc-3,4-Dehydroprolin mit 2-Aminomethyl-4-cyano-thiazol hydrochlorid und anschließender Schutzgruppenabspaltung.
H-E-G-K-C(=NOH)NH2
Die Darstellung des H-E-G-K-C(=NOH)NH2 Bausteins ist exemplarisch für H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz beschrieben.
a) (Boc)-(D)-cyclohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl-[2-(4-cyano)- thiazolyl]methylamid
(Boc)-(D)-Cha-OH (21,3 g, 271,4 mmol und H-Pyr-NH-CH2-2- (4-CN)-thiaz-hydrochlorid (21,3 g, 270,7 mmol) wurden in Dichlormethan (750 mL) suspendiert und mit Ethyldiisopropyl­ amin (50,84 g, 67,3 ml, 393,4 mmol) versetzt, wobei eine klare, leicht rötliche Lösung entstand. Das Reaktionsgemisch wurde auf ca. 10°C abgekühlt und tropfenweise mit einer 50%igen Lösung von Propanphosphonsäureanhydrid in Essig­ säureethylester (78,6 mL, 102,3 mmol) versetzt. Nach Rühren über Nacht bei RT wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Wasser aufgenommen, 30 min zur Hydrolyse von überschüssigem Propanphosphonsäureanhydrid gerührt, anschließend die saure Lösung 3× mit Essigester und 1× mit Dichlormethan extrahiert, die organischen Phasen mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum einrotiert. Beide Rückstände wurden vereinigt, in Dichlormethan gelöst und mit n-Pentan gefällt. Nach Wieder­ holen dieser Prozedur wurden 33,4 g (Boc)-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2- 2-(4-CN)-thiaz (Ausbeute 87%) als weißer Feststoff erhalten.
b) (Boc)-(D)-cyclohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl-[2-(4-hydrox­ amidino)-thiazolyl]methylamid
(Boc)-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-CN)-thiaz (26,3 g, 53,9 mmol) wurden in Methanol (390 ml) gelöst, mit Hydroxylamin-hydro­ chlorid (9,37 g, 134,8 mmol) versetzt und zu dieser Suspension langsam unter Kühlung (Wasserbad) Diisopropyl­ ethylamin (69,7 g, 91,7 ml, 539,4 mmol) getropft. Nach 3 h Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung im Vakuum einrotiert, in Essigester 7 Wasser aufgenommen, die wäßrige Phase mit 2 N-Salzsäure auf pH 3 eingestellt, 3× mit Essig­ ester und 1× mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasne wurde mehrfach mit Wasser gewaschen, über Magnesium­ sulfat getrocknet und im Vakuum einrotiert. Beide Rückstände wurden vereint und mit n-Pentan ausgerührt, wobei 26,8 g (Boc)-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz (Ausbeute 95%) als weißer Feststoff erhalten wurden.
c) (D)-cyclohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl-[2-(4-hydroxamidino)- thiazolyl]methylamid
(Boc)-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz (5,0 g, 9,6 mmol) wurden in einem Gemisch aus Isopropanol (50 ml) und Dichlor­ methan (50 ml) gelöst, mit HCl in Dioxan (4M Lösung, 24 ml, 96 mmol) versetzt und 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Da noch Ausgangsmaterial vorhanden war wurde nochmals HCl in Dioxan (4M Lösung, 12 ml, 48 mmol) zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum einrotiert, mehrfach mit Ether und Dichlormethan codestilliert um anhaftende Salzsäure zu entfernen. Der Rückstand wurde in wenig Methanol gelöst und mit viel Ether ausgefällt. Es wurden 4,3 g H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)- thiaz Hydrochlorid (Ausbeute 98%) erhalten.
H-E-G-K-C(=NH)NH2
Die Darstellung des H-E-G-K-C(=NH)NH2 Bausteins ist exemplarisch für H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz beschrieben.
a) (Boc)-(D)-cyclohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl-[2-(4-amidino)- thiazolyl]methylamid
(Boc)-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-CN)-thiaz (27,0 g, 55,4 mmol) und N-Acetyl-L-cystein (9,9 g, 60,9 mmol) wurden in Methanol (270 ml) gelöst, unter Rückfluß erhitzt und dabei 8 h Ammoniak eingeleitet. Da die Reaktion nach DC Kontrolle noch unvoll­ standig war wurde nochmals N-Acetyl-L-cystein (2,0 g, 12,0 mmol) zugesetzt und weitere 8 h unter Rückfluß und Einleiten von Ammoniak erhitzt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung im Vakuum eingeengt, der Rückstand nach­ einander in Ether und in Dichlormethan/Ether 9/l ausgerührt. Das erhaltene Rohprodukt (Boc)-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)- thiaz, welches noch N-Acetyl-L-cystein enthielt, wurde ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe einegesetzt.
b) (D)-cyclohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl-[2-(4-amidino)-thiazo­ lyl]methylamid
(Boc)-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz (Rohprodukt s. oben) wurden in einem Gemisch aus Methanol (20 ml) und Dichlor­ methan (400 ml) gelöst, mit HCl in Dioxan (4M Lösung, 205 ml, 822 mmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Da noch Ausgangsmaterial vorhanden war wurde nochmals HCi in Dioxan zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum einrotiert, mehrfach mit Ether und Dichlormethan codestilliert um anhaftende Salz­ säure zu entfernen. Der Rückstand wurde in Wasser aufge­ nommen, 20× mit Dichlormethan zur Entfernung von N-Acetyl-L- cystein extrahiert und anschließend die wässrige Phase lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde aus Ether ausgerührt, wobei 31,8 g H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz Dihydro­ chlorid (Ausbeute über 2 Stufen: 81%) erhalten wurden.
Die Darstellung des H-E-G-K-C(=NH)NH2 Bausteins H-(D)-Chg-Aze-NH- 4-amb ist in WO 94/29336 Bsp 55 beschrieben. H-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2- 5-(3-am)-thioph wurde analog H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz hergestellt, wobei die Amidinbildung ausgehend von der ent­ sprechenden Nitrilvorstufe BOC-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-CN)-thioph analog WO 9806741 Beispiel 1 über die Zwischenstufen BOC-(D)-Chg- Pyr-NH-CH2-5-(3-CSNH2)-thioph und BOC-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5- (3-C(=NH)S-CH3)-thioph erfolgte.
Beispiel 1 (D)-Arabino-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz xCH3COOH
H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz Dihydrochlorid (2,0 g, 4,19 mmol) wurde in Methanol (30 ml) gelöst, mit D(-)-Arabinose (0,63 g, 4,19 mmol) und Molsieb (4 Å) versetzt, 1 h bei Raum­ temperatur gerührt und anschließend portionsweise Natriumcyano­ borhydrid zugegeben, wobei eine leichte Gasentwicklung auftrat. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Molsieb abgesaugt, das Filtrat im Vakuum eingeengt und der Rückstand in Aceton ausgerührt. Das abgesaugte Rohprodukt wurde mittels MPLC (RP 18-Säule, Acetonitril/Wasser/Essigsäure) gereinigt und anschließend lyophilisiert, wobei 840 mg (D)-Arabino-(D)-Cha-Pyr- NH-CH2-2-(4-am)-thiaz xCH3COOH als weißer Feststoff (Ausbeute 34%) erhalten wurden.
ESI-MS: M+H+: 539
Beispiel 2 (L)-Arabino-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz xCH3COOH
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von L-(+)-Arabinose dargestellt.
ESI-MS: M+H+: 539
Beispiel 3 (D)-Erythro-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz xCH3COOH
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von D-(+)-Erythrose dargestellt.
ESI-MS: M+H+: 509
Beispiel 4 (L)-Erythro-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz xCH3COOH
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von L-(+)-Erythrose dargestellt.
ESI-MS: M+H+: 509
Beispiel 5 (D)-Glycer-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz xCH3COOH
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von D-(+)-Glycerinaldehyd dargestellt.
ESI-MS: M+H+: 479
Beispiel 6 (L)-Glycer-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz xCH3COOH
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von L-(+)-Glycerinaldehyd dargestellt.
ESI-MS: M+H+: 479
Beispiel 7 (L)-Rhamno-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz x HCl
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von L Rhamnose dargestellt.
L-Rhamnose (0,82 g, 5 mMol) wurde in Wasser (20 ml) bei Raum­ temperatur gelöst und H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz Dihydrochlorid (2,4 g, 5 mMol) eingerührt. Die klare Lösung wurde nach 20 min viskos. Es erfolgte eine portionsweise Zugabe einer äquimolaren Menge an Natriumcyanoborhydrid über 4 h, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel, welcher sich durch Zugabe von Ethanol (2 ml) auflöste. Mit 5 ml 1 M HCl wurde auf pH 3 ein­ gestellt und 3 mal mit je 300 ml Aceton gefällt. Abzentrifugieren des Feststoffes, Auflösen in Wasser (100 ml) und Lyophilisieren ergab 2,6 g (L)-Rhamno-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz x HCl als weißes Pulver.
Beispiel 8 (D)-Melibio-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz x HCl
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 7 ausgehend von D-Melibiose dargestellt.
D-Melibiose (1,8 g, 5 mMol) wurde in Wasser (20 ml) bei RT gelöst und H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz Dihydrochlorid (2,4 g, 5 mMol) eingerührt. Die klare, hellgelbe Lösung wurde nach 20 min viskos. Portionsweise Zugabe einer äquimolaren Menge an Natrium­ cyanoborhydrid über 4 h. Es fiel ein weißer Niederschlag aus, 2 ml Ethanol zugefügt, danach klare Lösung. Mit 5 ml 1 M HCl auf pH 5 eingestellt und 3 mal mit je 300 ml Aceton gefällt. Abzentrifugieren, danach Sediment in 100 ml Wasser aufgenommen und die Lösung lyophilisiert. Ausbeute: 3,2 g (D)-Melibio-(D)- Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-am)-thiaz x HCl.
Beispiel 9 (D)-Gluco-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph x HCl
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 7 ausgehend von D-Glucose dargestellt.
D-Glucose (1,0 g, 5,6 mMol) wurde in 20 ml Wasser bei Raum­ temperatur gelöst und H-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph Dihydrochlorid (3,0 g, 6,5 mMol) eingerührt. Die klare Lösung wurde nach 10 min viskos. Es erfolgte eine portionsweise Zugabe einer äquimolaren Menge an Natriumcyanoborhydrid über 4 h, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel. Nach Abkühlen im Eisbad mit 3 × 5 ml H2O ausgeschüttelt, Sediment in 20 ml H2O aufgenommen und mit ca. 5 ml 0,1 M NaOH auf pH 5,0 eingestellt. 1. Fällung mit 300 ml Aceton. 2. Fällung: Sediment in 30 ml H2O aufgenommen, mit 300 ml Aceton versetzt, Sediment in H2O gelöst und mit 2 ml 1M HCl neutralisiert, Lösung lyophilisiert. Ausbeute: 1,52 g (D)-Gluco-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph x HCl als weißes Pulver.
Beispiel 10 Maltohexao-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph x HCl
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 7 ausgehend von Malto­ hexaose dargestellt.
Maltohexaose (2 g, 2 mMol) wurde in Wasser (20 ml) bei RT gelöst und H-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph Dihydrochlorid (0,92 g, 2 mMol) eingerührt. Die klare Lösung wurde nach 10 min viskos; Portionsweise Zugabe einer äquimolaren Menge an Natriumcyanobor­ hydrid über 4 h; Nach Abkühlen im Eisbad mit dem 8fachen Volumen an Ethanol ausgefällt. Sediment mit 30 l) ml Ethanol nochmals aus­ gefällt, Sediment in Wasser gelöst; Lösung lyophilisiert. Aus­ beute: 2,6 g Maltohexao-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph x HCl.
Beispiel 11 (D)-Cellobio-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph x HCl
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 7 ausgehend von Cellobiose dargestellt.
Cellobiose (2 g, 6 mMol) wurde in Wasser (20 ml) bei 50°C ein­ gerührt und H-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph Dihydrochlorid (2,8 g, 6 mMol) dazugegeben. Die trübe Lösung wurde unter portionsweiser Zugabe einer äquimolaren Menge an Natriumcyano­ borhydrid über 4 h viskos. Ca. 1 h bei 50°C nachgerührt. Zugabe von ca. 10 ml 1 M HCl bis pH 3. Danach 2 mal mit 300 ml Aceton gefällt. Nach Abkühlen im Eisbad Sediment in 60 ml Wasser auf­ genommen und mit 600 ml Aceton nochmals ausgefällt, Sediment in Wasser gelöst; Lösung lyophilisiert. Ausbeute: 4,4 g (D)-Cello­ bio-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph x HCl.
Beispiel 12 (D)-Glucuronic-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 7 ausgehend von D-Glucuronsäure-Na Salz dargestellt.
D-Glucuronsäure-Na × H2O (1,4 g, 6 mMol) wurde in Wasser (20 ml) bei RT gelöst und H-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph Dihydro­ chlorid (2,8 g, 6 mMol) bei RT eingerührt. Die klare Lösung wurde nach 10 min leicht gelb. Portionsweise Zugabe einer äquimolaren Menge von 330 mg Natriumcyanoborhydrid über 4 h. Es entstand ein fester, kompakter Niederschlag. Zugabe von 4 ml 0,1 M NaOH, Überstand abdekantiert und Niederschlag in Aceton aufgerührt. Sediment in 40 ml H2O aufgenommen und 3 ml 1M HCl bis ca. pH 4 zugeben. Verbindung ging in Lösung. Fällung mit 400 ml Aceton. Danach Sediment in Wasser gelöst; Lösung lyophilisiert. Ausbeute: 3,1 g (D)-Glucuronic-(D)-Chg-Pyr-NH-CH2-5-(3-am)-thioph.
Beispiel 13 (D)-Gluco-(D)-Chg-Aze-NH-4-amb x HCl
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 7 ausgehend von D-Glucose dargestellt.
D-Glucose (2,5 g, 14 mMol) wurde in Wasser (40 ml) bei RT gelöst und H-(D)-Chg-Aze-NH-4-amb (WO 94/29336 Bsp 55; 6,8 g; 15,4 mMol) eingerührt. Danach portionsweise Zugabe einer äquimolaren Menge an Natriumcyanoborhydrid über 4 h, anschließend über Nacht ge­ rührt. Es entstand eine schmierige, viskose Emulsion. Zugabe von 50 ml Wasser, danach Zugabe von Ethanol bis Lösung klar wurde. Mit ca. 15 ml 0,1 M HCl auf pH 4,0 eingestellt. 1. Fällung mit 600 ml Aceton. 2. Fällung: Sediment in 50 ml Wasser aufgenommen mit 600 ml Aceton versetzt; Sediment erneut in Wasser gelöst; Lösung lyophilisiert. Ausbeute: 7,8 g (D)-Gluco-(D)-Chg-Aze- NH-4-amb x HCl.
Beispiel 14 Malto-(D)-Chg-Aze-NH-4-amb x HCl
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 7 ausgehend von Maltose dargestellt.
Maltose x H2O (5 g, 14 mMol) wurde in 40 ml Wasser bei RT gelöst und H-(D)-Chg-Aze-NH-4-amb (6,8 g; 15,4 mMol) eingerührt. Danach portionsweise Zugabe einer äquimolaren Menge an Natriumcyanobor­ hydrid über 4 h, zunächst klare, viskose Lösung die langsam in eine schmierige, viskose Emulsion überging. Zugabe von 50 ml Wasser und ca. 15 ml 0,1 M HCl bis pH 4,0. 1. Fällung mit 600 ml Aceton. 2. Fällung: Sediment in 50 ml Wasser aufgenommen und mit 600 ml Aceton versetzt; Sediment erneut in Wasser gelöst und die Lösung lyophilisiert. Ausbeute: 10,1 g Malto-(D)-Chg-Aze-NH-4-amb x HCl.
Beispiel 15 (L)-Erythro-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz xCH3COOH
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von L-(+)-Erythrose und H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz dargestellt.
ESI-MS: M+H+: 525
Beispiel 16 (L)-Arabino-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz xCH3COOH
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von L-(+)-Arabinose und H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz dargestellt.
ESI-MS: M+H+: 555
Beispiel 17 Malto-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz
Diese Verbindung wurde analog Beispiel 1 ausgehend von Maltose und H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz dargestellt. Maltose × H2O (2,2 g, 6 mMol) wurde in 40 ml Wasser und 60 ml Ethanol bei RT gelöst und H-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz (2,8 g, 6,6 mMol) eingerührt. Danach portionsweise Zugabe einer äquimolaren Menge an Natriumcyanoborhydrid über 8 h, stark viskose, klare, bräunliche Lösung. 1. Fällung mit 500 ml Aceton. Sediment in 50 ml Wasser gelöst und mit 0,1 M HCl auf pH 7,5 eingestellt, danach mit 500 ml Aceton gefällt. Sediment in 100 ml Wasser gelöst und Lösung lyophilisiert. Ausbeute: 3,6 g Malto-(D)-Cha-Pyr-NH-CH2-2-(4-ham)-thiaz.
Für folgende Verbindungen wurde die Thrombin-Zeit gemäß Beispiel A bestimmt:

Claims (10)

1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
A-B-D-E-G-K-L (I)
wobei
A für H, CH3, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA2 H, NH2, NH-COCH3, F, NHCHO
RA3 H, CH2OH
RA4 H, CH3, COOH
i A = 1-20
j A = 0, 1, 2
k A = 2, 3
l A = 0,1
m A = 0, 1, 2
n A = 0, 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können;
B für
A-B für
oder für einen Neuraminsäurerest oder N-Acetylneuraminsäure­ rest, welche über die Carboxylfunktion gebunden sind,
RB1 gleich H, CH2OH, C1-4-Alkyl
RB2 gleich H, NH2, NH-COCH3, F, NHCHO
RB3 gleich H, C1-4-Alkyl, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH, F, NH-COCH3, CONH2
RB4 gleich H, C1-4-Alkyl, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetal­ bildung auftreten kann
RB5 gleich H, C1-4-Alkyl, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH
k B = 0, 1
l B = 0, 1, 2, 3 (l B ≠ 0, für A = RB1 = RB3 = H, m B = k B = 0, und D eine Bindung)
m B = 0, 1, 2, 3, 4
n B = 0, 1, 2, 3
RB6 gleich C1-4-alkyl, phenyl, benzyl
BB7 gleich H, C1-4-alkyl, phenyl, benzyl
D für eine Bindung oder für
mit RD1 gleich H, C1-4-Alkyl
RD2 gleich Bindung oder C1-4-Alkyl
RD3 gleich
mit l D = 1, 2, 3, 4, 5, 6
und RD5 gleich H, C1-4-Alkyl, Cl
RD6 gleich H, CH3
wobei an die unter RD3 genannten Ringsysteme ein weiterer aromatischer oder aliphatischer Ring ankondensiert sein kann
RD4 gleich Bindung, C1-4-Alkyl, CO, SO2, -CH2-CO
E für
mit
k E = 0, 1, 2;
l E = 0, 1, 2;
m E = 0, 1, 2, 3;
n E = 0, 1, 2;
p E = 0, 1, 2;
RE1 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, C3-8-Cycloalkyl mit ankondensiertem Phenylring, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl, F, Cl, Br tragen können;
RE1 bedeutet weiterhin RE4OCO-CH2- (RE4 gleich H, C1-12-Alkyl, C1-3-Alkylaryl);
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl, Hetero­ aryl, Indolyl), Tetrahydropyranyl, Tetrahydrothiopyranyl, Diphenylmethyl, Dicyclohexylmethyl, C3-8-Cycloalkyl mit ankondensiertem Phenylring, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl, F, Cl, Br, tragen können, CH(CH3)OH, CH(CF3)2;
RE3 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, C3-8-Cycloalkyl mit ankondensiertem Phenylring, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl, F, Cl, Br tragen können;
die unter RE1 und RE2 genannten Gruppen können über eine Bindung miteinander verknüpft sein; auch die unter RE2 und RE3 genannten Gruppen können über eine Bindung mit­ einander verbunden sein;
RE2 steht weiterhin für CORE5 (RE5 gleich OH, O-C1-6-Alkyl, OC1-3-Alkylaryl), CONRE6RE7 (mit RE6 bzw. RE7 gleich H, C1-6-Alkyl, C0-3-Alkylaryl), NRE6RE7;
E kann auch für D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Orn, D-His, D-Dab, D-Dap, D-Arg;
G für
mit l G = 2, 3, 4 und 5, wobei eine CH2-Gruppe des Rings durch O, S, NH, NC1-3-Alkyl, CHOH, CHOC1-3-Alkyl, C(C1-3-Alkyl)2, CH(C1-3-Alkyl), CHF, CHCl, CF2 ersetzt sein kann;
mit
m G = 0, 1, 2;
n G = 0, 1, 2;
p G = 1, 2, 3, 4;
RG1 H, C1-C6-Alkyl, Aryl;
RG2 H, C1-C6-Alkyl, Aryl;
RG1 und RG2 können zusammen auch eine -CH=CH-CH=CH-Kette bilden;
weiterhin G für
mit
q G 0, 1, 2;
r G 0, 1, 2;
RG3 H, C1-C6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl;
RG4 H, C1-C6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl (insbesondere Phenyl, Naphthyl);
K für
NH-(CH2)n K-QK mit
n K = 0, 1, 2, 3;
QK gleich C2-6-Alkyl, wobei bis zu zwei CH2-Gruppen durch O oder S ersetzt sein können;
QK gleich
mit
RK1 gleich H, C1-3-Alkyl, OH, O-C1-3-Alkyl, F, Cl, Br;
RK2 gleich H, C1-3-Alkyl, O-C1-3-Alkyl, F, Cl, Br;
XK gleich O, S, NH, N-C1-6-Alkyl;
YK gleich
ZK gleich
UK gleich
VK gleich
WK gleich C- oder N-, wobei im letzteren Fall L keine Guanidingruppe sein darf;
n K = 0, 1, 2;
p K = 0, 1, 2;
q K = 1, 2;
L für
mit
RL1 gleich H, OH, O-C1-6-Alkyl, O-(CH2)0-3-Phenyl, CO-C1-6-Alkyl, CO2-C1-6-Alkyl, CO2-C1-3-Alkylaryl,
steht, sowie deren Tautomere, Stereoisomere, Salze mit pharma­ kologisch verträglichen Säuren oder Basen, sowie deren Prodrugs.
2. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
A-B-D-E-G-K-L (I)
wobei
A für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA4 H, CH3, COOH
i A = 1-6
j A = 0, 1, 2
k A = 2, 3
m A = 0, 1, 2
n A = 0, 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können;
B für
A-B für
RB1 gleich H, CH2OH
RB2 gleich H, NH2, NH-COCH3, F
RB3 gleich H, CH3, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH
RB4 gleich H, C1-4-Alkyl, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetal­ bildung auftreten kann
RB5 gleich H, CH3, CH2-O-C1-4-Alkyl, COOH
k B = 0, 1
l B = 0, 1, 2, 3 (l B ≠ 0, für A = RB1 = RB3 = H, m B = k B = 0, und D eine Bindung)
m B = 0, 1, 2, 3
n B = 0, 1, 2, 3
RB6 gleich C1-4-alkyl, phenyl, benzyl
BB7 gleich H, C1-4-alkyl, phenyl, benzyl
D für eine Bindung oder für
mit RD1 gleich H, C1-4-Alkyl
RD2 gleich Bindung oder C1-4-Alkyl,
RD3 gleich
RD4 gleich Bindung, C1-4-Alkyl, CO, SO2, -CH2-CO
E für
mit
k E = 0, 1, 2;
m E = 0, 1, 2, 3;
RE1 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, wobei die vor­ genannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl tragen können;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Tetrahydropyranyl, Diphenylmethyl, Dicyclohexylmethyl, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-6-Alkyl, OH, O-C1-6-Alkyl, F, Cl, Br, tragen können, CH(CF3)2;
RE3 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl;
RE2 steht weiterhin für CORE5 (RE5 gleich OH, O-C1-6-Alkyl, OC1-3-Alkyl aryl), CONRE6RE7 (mit RE6 bzw. RE7 gleich H, C1-6-Alkyl, C0-3-Alkylaryl), NRE6RE7;
E kann auch für D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Orn, D-His, D-Dab, D-Dap, D-Arg;
G für
mit l G = 2, 3 und 4, wobei eine CH2-Gruppe des Rings durch O, S, NH, NC1-3-Alkyl, CHOH, CHOC1-3-Alkyl ersetzt sein kann;
mit
m G = 0, 1, 2;
n G = 0, 1;
K für
NH-(CH2)n K-QK mit
n K = 1, 2;
QK gleich
mit
RK1 gleich H, C1-3-Alkyl, OH, O-C1-3-Alkyl, F, Cl, Br;
RK2 gleich H, C1-3-Alkyl, O-C1-3-Alkyl, F, Cl, Br;
XK gleich O, S, NH, N-C1-6-Alkyl;
YK gleich
ZK gleich
UK gleich
L für
mit
RL1 gleich H, OH, O-C1-6-Alkyl, CO2-C1-6-Alkyl,
steht, sowie deren Tautomere, Stereoisomere, Salze mit pharma­ kologisch verträglichen Säuren oder Basen, sowie deren Prodrugs.
3. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
A-B-D-E-G-K-L (I)
wobei
A für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA4 H, COOH
i A = 1-6
j A = 0, 1
k A 2, 3
n A = 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können.
B für
RB3 gleich H, CH3, COOH
RB4 gleich H, CH3, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetalbildung auftreten kann
k B = 0, 1
l B = 1, 2, 3
m B = 0, 1, 2, 3
n B = 1, 2, 3
D für eine Bindung
E für
mit
m E = 0, 1;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Phenyl, Diphenyl­ methyl, Dicyclohexylmethyl, wobei die vorgenannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-4-Alkyl, OH, O-CH3, F, Cl tragen können
G für
mit l G = 2, 3 und 4, wobei eine CH2-Gruppe des Rings durch O, S, NH, NC1-3-Alkyl ersetzt sein kann;
mit
n G = 0, 1;
K für
NH-CH2-QK mit
QK gleich
mit
RK1 gleich H, CH3, OH, O-CH3, F, Cl;
XK gleich O, S, NH, N-CH3;
YK gleich
ZK gleich
L für
mit
RL1 gleich H, OH, CO2-C1-6-Alkyl,
steht, sowie deren Tautomere, Stereoisomere, Salze mit pharma­ kologisch verträglichen Säuren oder Basen, sowie deren Prodrugs.
4. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
A-B-D-E-G-K-L (I)
wobei
A für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA4 H, COOH
i A = 1-6
j A = 0, 1
k A = 2, 3
n A = 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können.
B für
A-B für
RB3 gleich H, CH3, COOH
RB4 gleich H, CH3, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetalbildung auftreten kann
k B = 0, 1
l B = 1, 2,3
m B = 0, 1, 2, 3
n B = 1, 2, 3
RB6 gleich C1-4-alkyl, phenyl, benzyl
BB7 gleich H, C1-4-alkyl, phenyl, benzyl
D für
mit RD1 gleich H, C1-4-Alkyl
RD2 gleich Bindung oder C1-4-Alkyl,
RD3 gleich
RD6 gleich H, CH3
RD4 gleich Bindung, C1-4-Alkyl, CO, SO2, -CH2-CO,
E für
mit
m E = 0, 1;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, wobei die vor­ genannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe C1-4-Alkyl, OH, O-CH3, F, Cl tragen können
G für
mit l G = 2, 3 und 4, wobei eine CH2-Gruppe des Rings durch O, S, NH, NC1-3-Alkyl ersetzt sein kann;
mit
n G = 0, 1;
K für
NH-CH2-QK mit
QK gleich
mit
RK1 gleich H, CH3, OH, O-CH3, F, Cl;
XK gleich O, S, NH, N-CH3;
YK gleich
ZK gleich
L für
mit
RL1 gleich H, OH, CO2-C1-6-Alkyl,
steht, sowie deren Tautomere, Stereoisomere, Salze mit pharma­ kologisch verträglichen Säuren oder Basen, sowie deren Prodrugs.
5. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
A-B-D-E-G-K-L (I)
wobei
A für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit i A = 1-6
j A = 0, 1
n A = 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können.
B für
l B = 1, 2, 3
m B 1, 2
D für eine Bindung
E für
mit
m E = 0, 1;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, Phenyl, Diphenyl­ methyl, Dicyclohexylmethyl;
wobei der E Baustein vorzugsweise D-Konfiguration aufweist;
G für
wobei der G Baustein vorzugsweise L-Konfiguration aufweist:
K für
NH-CH2-QK mit
QK gleich
L für
mit
RL1 gleich H, OH, CO2-C1-6-Alkyl,
steht, sowie deren Tautomere, Stereoisomere, Salze mit pharma­ kologisch verträglichen Säuren oder Basen, sowie deren Prodrugs.
6. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
A-B-D-E-G-K-L (I)
wobei
A für H, H-(RA1)i A
mit RA1 gleich
mit RA4 H, COOH
i A = 1-6
j A = 0, 1
k A = 2, 3
n A = 1, 2
wobei bei i A größer 1 die Reste RA1 gleich oder verschieden sein können.
B für
A-B für
RB3 gleich H, CH3, COOH
RB4 gleich H, CH3, COOH, CHO, wobei im letzteren Fall intramolekulare Acetalbildung auftreten kann
k B = 0, 1
l B = 1, 2, 3
m B = 0, 1, 2, 3
n B = 1, 2, 3
RB6 gleich C1-4-alkyl, phenyl, benzyl
BB7 gleich H, C1-4-alkyl, phenyl, benzyl
D für
mit RD1 gleich H
RD2 gleich Bindung oder C1-4-Alkyl,
RD3 gleich
RD4 gleich Bindung, C1-4-Alkyl, CO, SO2, -CH2-CO,
E für
mit
m E = 0, 1;
RE2 bedeutet H, C1-6-Alkyl, C3-8-Cycloalkyl, wobei die vor­ genannten Reste bis zu drei gleiche oder verschiedene Substituenten der Gruppe F, Cl tragen können
G für
mit l G = 2
mit
n G = 0;
K für
NH-CH2-QK mit
QK gleich
mit
XK gleich S;
YK gleich =CH-, =N-;
ZK gleich =CH-, =N-;
L für
mit
RL1 gleich H, OH,
steht, sowie deren Tautomere, Stereoisomere, Salze mit pharma­ kologisch verträglichen Säuren oder Basen, sowie deren Prodrugs.
7. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Verwendung von einer oder mehreren Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, die durch Inhibierung von einer oder mehreren Serinproteasen gelindert werden kann.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei für Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 die Serinprotease Thrombin ist.
10. Verwendung nach Anspruch 8, wobei für Verbindungen nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 6 die Serinprotease C1s oder C1r ist.
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