DD208821A5 - Verfahren zur herstellung sps-ase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von SPS-ase fuer den Abbau eines hochmolekularen Kohlenhydrats.Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen Enzyms, mit dem auf einfache und wirtschaftliche Weise ein Proteinprodukt hoher Reinheit hergestest. werden kann. Erfindungsgemaess wird ein neuer Mikroorganismus,der zur Bildung von SPS-ase,einer Carbohydrase,befaehigt ist,fuer den Abbau von Soja-SPS zu Abbauprodukten, die sich an Protein in einem waessigen Medium nur in geringem Masse anlagern, in der Weise ausgewaehlt, dass der zu untersuchende Mikroorganismus auf einem Fernmentationsmedium gezuechtet wird,dessen Hauptkohlenstoffquelle SPS ist, das gebildetwordrn ist auf der Basis von pflanzlichem Rohprotein,vorzugsweise entfettetem Sojamehl,als Ausgangsmaterial,woraufhin eineProbe des Fermentationsmediums auf SPS-ase untersucht wird und der fragliche Mikroorganismus als SPS-ase bildender Mikroorganismus angesehen wird, wenn die Analyse auf SPS-ase positiv ist.
Description
Die Erfindung betrifft die Verbesserung eines Enzyms zum Abbau eines hochmolekularen Kohlenhydrate, ein Verfahren zur Auswahl eines Mikroorganismus, der ein solches Enzym bildet und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Enzyms»
Das erfindungsgemäß zur Verfügung gestellte neue Enzym wird angewandt in der Lebensmittelindustrie, beispielsweise bei der Totalverflüssigung von Vegetäbilien, bei der Saft- und Weinindustrie, bei der Zuckergewinnung, bei der Bierherstellung* für die Backwarenherstellung, bei der Alkoholherstellung und für viele weitere Zwecke·
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten pflanzlichen Proteinprodukte (pvp) durch enzymatische Entfernung des Mickstands, ohne das Protein zu lösen und wieder auszufällen, ist in der BE-PS 882 769 beschrieben. Die Reinheit des nach dem bekannten Verfahren erhältlichen pvp ist jedoch nicht zufriedenstellend und sollte daher verbessert werden« In den Beispielen ist eine Reinheit des pvp von ungefähr 85 % angegeben« Selbst wenn es möglich ist, ein pvp mit einer Reinheit von ungefähr 90 % nach dem bekannten Verfahren zu erhalten^ ist dies nur
2SiIPR 1933*086331
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möglich iinter Verwendung bestimmter vorbehandelter Ausgangssubstanzen, z· B. von Sojaproteinkonzentrat. Es wäre günstig, wenn es möglich wäre, eine Reinheit des pvp von ungefähr oder über 90 % mit einem wesentlich breiteren Spektrum an Ausgangsmaterialien zu erhalten, insbesondere aus enthülstem und entfettetem Sojamehl·
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß ein bestimmter Teil des Rückstandzersetzungsproduktes, wie es während der oben angegebenen enzymatischen Behandlung auftritt, d· h. ein wasserlösliches hochmolekulares Kohlenhydrat sich teilweise an das pflanzliche Protein anlagert (bindet), wie später näher erläutert wird. Das führt natürlich zu einer geringeren Reinheit des Proteins« Es hat sich auch gezeigt, daß dieses hochmolekulare Kohlenhydrat die Fähigkeit besitzt, sich an Proteine tierischen Ursprungs anzulagern·
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Enzyms zum Abbau eines hochmolekularen Kohlenhydrats, das die Möglichkeit zur Herstellung eines pvp mit verbesserter Reinheit bietet·
Der Erfindung liegt die Aufgabe ,zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Enzyms zur Verfügung zu stellen·
Das Prinzip der Erfindung kann folgendermaßen beschrieben
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246 17 5 2 .„.
werden, wobei auf Pig« 1 Bezug genommen wird, in der nur Produkte, die als ungelöste Feststoffe vorliegen, angegeben sind, während alle überstehenden Flüssigkeiten (und darin gelösten Stoffe) weggelassen worden sind· Eine Menge Sojamehl wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt, Teil I und Teil II (Spalte a in Fig. 1). Teil I wurde proteolytisch bei einem pH-Wert von ungefähr 8 mit Hilfe von ALCALASE (einem proteolytischen Enzym, das gebildet worden ist von B· licheniformis und von NOVO INDUSTRI A/S auf den Markt gebracht worden ist) abgebaut und dann weiter bei ungefähr pH 8 gewaschen, um die Gesamtmenge an Protein zu entfernen, und der Rückstand wurde von dtr überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und gewaschen (siehe Teil I, Spalten a und b der Fig· 1)· Auf diese Weise wurde ein reiner Rückstand (als Rückstand I bezeichnet) ieoliert (Spalte b in Fig· 1)· Teil II des Sojamehle wurde nicht behandelt·
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Der Rückstand in Teil II wird als Rückstand II bezeichnet (Spalte b in Pig. 1). Jetzt wurden sowohl Rückstand I als auch Teil II mit Hilfe einer handelsüblichen Pectinase abgebaut (siehe Spalten b und c in Pig· 1)·
Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß der ungelöste Teil des Rückstands I wesentlich geringer ist als der ungelöste Teil des Rückstands II auf der Basis der Stickstoff- und Trockensubstanz-Bilanz, siehe Pig· 1, wo die schraffierten Bereiche in Spalte c den unlöslichen nicht-Proteinsubstanzen in der oben angegebenen Stufe entsprechen. Wenn darüber hinaus die überstehende Flüssigkeit des mit Pectinase behandelten Rests I mit einer Sojaprotein-Suspension bei pH 4,5 zusammengebracht wird, wird ein Polysaccharid in der überstehenden Flüssigkeit an das Sojaprotein gebunden« Dieses Polysaccharid in dem Überstand von dem Rest I, das ein Teil des Rest^Abbauproduktes ist und das in Wasser in Abwesenheit von Sojaprotein klar löslich ist, aber beim oder ungefähr beim isoelektrischen Punkt des Sojaproteins, soweit ein solches vorhanden ist, an dieses gebunden wird, wird als SPS (Stolublβ Polysaccharide) bezeichnet (siehe Fig« 1). Das SPS besitzt eine Molekulargewicht sverteilung zwischen 5 x 10 und 4» 9 x '10 · Die Bildung von isoliertem SPS geht aus dem in Fig· 2 angegebenen Schema hervor, das auch einen Teil des in Fig. 1 angegebenen Verfahrens umfaßt. So besteht das Problem darin, ein Enzym au finden, das imstande ist, das SPS in einer solchen Weise abzubauen, daß die SPS-Abbauprodukte
sich nicht an Sojaprotein anlagern bzw. in einem wesentlich geringeren Maß als SPS an Sojaprotein gebunden wird. .' ..' . . ' -. / :-
Obwohl in der Beschreibung speziell Sojaprotein erwähnt wird, ist die Erfindung nicht auf Sojaprotein beschränkt, sondern umfaßt alle Arten von pflanzlichen Proteinen, siehe z.B. die in der BE-PS 882 769, Seite 1, angegebenen Proteine.
.' ι·1 . '
Es hat sich nun erfindungsgemäß gezeigt, daß es dirchliitersuchung ihrer Fähigkeit Soja-SPS abzubauen möglich ist, Mikroorganismen auszuwählen, die imstande sind, eine Verbindung zu bilden, die enzymatische Aktivität besitzt und imstande ist, Soja-SPS abzubauen und die im folgenden kurz als SPS-ase bezeichnet wird.
Die Erfindung betrifft daher in erster Linie eine SPS-ase, eine Carbohydrase (Glycosidase) in geeigneter Form, die imstande ist, Soja-SPS unter entsprechenden Bedingungen zu Produkten abzubauen, die sich in wässrigem Medium in geringerem Maße an Protein anlagern als das Soja-SPS sich vor dem Abbau an das gleiche Protein unter entsprechenden Bedingungen angelagert hätte.
Es hat sich ferner gezeigt, daß diese SPS-ase, die fähig ist, Soja-SPS abzubauen, imstande ist, Polysaccharide, die SPS ähnlich sind und aus Pflanzen (Gemüsen und Früchten) stammen, vollständiger abzubauen als übliche Pectinasen und übliche Cellulasen.
Der oben verwendete Ausdruck "in einer geeigneten Form" ist so zu verstehen, daß er z.B. ein SPS-ase haltiges Mittel ausschließt, das toxische Substanzen enthält odqr daß eine so geringe SPS-ase Aktivität besitzt, : daß mehr als 10 % SPS-ase haltiges Mittel angewandt
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werden müssen, bezogen auf das Gewicht des SPS in dem Substrat bei einer Reaktion, die 24 h bei 50 C beim pH-Optimum der betreffenden SPS-ase durchgeführt wird, um einen Abbau von SPS von praktischer Bedeutung zu erreichen.
Durch vollständige oder teilweise Abtrennung des SPS von dem erhaltenen pflanzlichen Protein wird die Reinheit des erhaltenen pflanzlichen Proteins verbessert im Vergleich mit der Reinheit von pflanzlichem Protein, das nach dem aus der BE-PS 882 769 bekannten Verfahren erhalten worden ist, da dieses pflanzliche Proteinprodukt mit SPS verunreinigt war.
Es ist zur Zeit nicht bekannt, ob die im folgenden beschriebene spezielle SPS-ase ihre enzymatisch^; Aktivi-
15 tat aus einem einzigen Enzym bezieht oder aus einem
Enzymkomplex, umfassend mindestens zwei Enzyme. Einige Untersuchungen scheinen darauf hinzudeuten, daß zumindest zwei Enzyme für die Abbauwirkung der SPS-ase verantwortlich sind, wobei eines dieser Enzyme nur einen geringen Abbau des SPS hervorrufen kann, woraufhin ein oder mehrere Enzyme imstande sind, einen weitergehenden Abbau des SPS zu erreichen. Die" Erfindung soll jedoch durch diese Hypothese nicht eingeschränkt werden.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise eine SPS-ase, die imstande ist, Soja-SPS in einem wässrigen Medium zu Produkten abzubauen, die sich in dem wässrigen Medium weniger stark an pflanzliches Protein anlagern als das Soja-SPS vor dem Abbau. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße SPS-ase imstande, Soja-SPS in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert abzubauen, der nicht mehr als 1,5 von 4,5 abweicht. Die erfindungsgemäße
nach beendetem Abbau
SPS-ase führt zu Abbauprodukten, die sich"^vorzugsweise zu weniger als 50 %, insbesondere weniger als 20 %, bezogen auf das Soja-SPS vor dem Abbau an pflanzliches Protein in wässrigem Medium anlagern. Die erfindungsgemäße SPS-ase führt vorzugsweise zu einem positiven SPS-ase^-Test, wenn sie nach dem später näher erläuterten Verfahren qualitativ und quantitativ bestimmt wird. Die SPS-ase wird vorzugsweise gebildet mit Hilfe eines Mikroorganismus, der zur Gattung Aspergillus, vorzugsweise zur Art Aspergillus niger,gehört. Günstigerweise ist die SPS-ase abgeleitet von Enzymen, die gebildet werden können mit Hilfe von Asp. aculeatus CBS 101.43· Die gleiche SPS-ase kann gebildet werden mit Hilfe von Asp. japonicus IFO 4408. Es hat sich gezeigt, daß Asp. aculeatus CBS 101.43 auch sehr wirksame Remanasen, Cellulasen, Pectinasen und Hemicellulasen bildet. Ferner hat es sich gezeigt, daß nicht jeder zu der Art Aspergillus aculeatus oder Arpergillus japonicus gehörende Stamm eine SPS-ase bildet, die für die Erfindung brauchbar ist» So konnte, wie später in der Beschreibung angegeben ist (Abschnitt 5), gezeigt werden, daß der Stamm Asp. japonicus ATCC 20 236 nicht solche Mengen an SPS-ase bildet, die mit Hilfe der enzymatisehen Bestimmung von SPS-ase, wie sie später beschrieben wird, nachgewiesen werden können. Die erfindungsgemäße SPS-ase ist vorzugsweise immunoelektrophoretisch identisch mit der SPS-ase, die gebildet werden kann von Asp. aculeatus CBS 101.43 und identifizierbar durch Immunoelektrophorese-Überlage-
30 rungsverfahren (siehe Abschnitte 6 und 7)·
Wenn eine SPS-ase mikrobiologisch gebildet wird, wird sie gebildet im Gemisch mit verschiedenen begleitenden Substanzen, insbesondere anderen Enzymen,, Wenn dies er-
— 7 —
24b17b L
wünscht ist,, kann die "betreffende SPS-ase gereinigt werden, z.B. durch chromatographische Trennungsverfahren, wie später näher erläutert ist (Abschnitt 8).
In Agr. Biol. Chem 40 (1), 87 - 92, 1976 ist beschrieben, daß ein Stamm von Asp. japonicus, ATCC 20236 einen Enzymkomplex bildet, der imstande ist, einen speziellen Abbau eines sauren Polysaccharids in Sojasoße, das als APS be-. zeichnet wird, hervorzurufen, von dem ein Teil als APS-I bezeichnet wird. Dieses saure Polysaccharid ist nicht identisch mit SPS, wie später in Abschnitt 3 näher erläutert wird. So sind die HPLC-GeIfiltrations-Chroiaatogramme von SPS und APS deutlich verschieden und darüberhinaus sind die Gelfiltrations-Chromatogramme von APS, das mit Hilfe von handelsüblicher Pectinase,Pectolyase, abgebaut worden ist und von SPS, das mit deren üblichen Pectinase,Pectolyasefbehandelt worden ist, deutlich verschieden. Darüberhinaus geht aus dem Artikel nicht hervor, daß das saure Polysaccharid an das Sojaprotein gebunden ist und daß das abgebaute saure Polysaccharid nicht an das Sojaprotein oder zu einem wesentlich geringeren Grad an das Sojaprotein gebunden ist als das nicht abgebaute saure Polysaecharid. Außerdem konnte gezeigt werden, daß dieser Stamm keine SPS-ase in solchen Mengen bildet, die mit Hilfe der enzymatischeh Bestimmung von SPS-ase, wie sie später näher beschrieben ist, nachgewiesen werden können. Das führte zu einem Vorurteil gegen die Anwendung irgendeines Stammes von Asp. japonicus als SPS-ase-Bildner. Aber überraschenderweise hat es sich erfindungsgemäß gezeigt, daß einige Stämme von Asp. japoriicus SPS-ase-Bildner sind. Die Erfindung betrifft auch das isolierte SPS, das auf der Basis von rohem pflanzlichen Protein als Ausgangsmaterial gebildet worden ist.
I/ J
Bei einem bevorzugten isolierten
SPS ist das pflanzliche rohe Protein
entfettetes Sojamehl. . Die Herstellung des isolierten SPS ist oben mit Bezug auf Fig. 2 beschrieben worden.
Die Erfindung betrifft darüberhinaus ein Verfahren zur Auswahl eines SPS-ase produzierenden Mikroorganismus zur Bildung der erfindungsgemäßen SPS-ase, wobei der zu untersuchende Mikroorganismus auf einem Wachstumsmedium gezüchtet wird, dessen hauptsächliche Kohlenstoff quelle SPS ist, woraufhin eine Probe des Fermentationsmediums auf SPS-ase analysiert wird und der fragliche Mikroorganismus als SPS-ase produzierender Mikroorganismus ausgewählt wird, wenn die Analyse auf
15 SPS-ase positiv ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Bildung von SPS-ase, bei dem ein nach dem oben angewandten Auswahlverfahren für einen SPS-ase bildenden Mikroorganismus auswählbarer Stamm in einem Nährmedium gezüchtet wird. Die Züchtung kann als Submerskultur oder als Oberflächenkultur durchgeführt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise der Stamm Asp. aculeatus CBS 101.43 oder Asp. japonicus IFO 4408 in einem Nährmedium· gezüchtet. Es ist ferner bevorzugt, daß die Züchtung als Submerskultur bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 7, vorzugsweise von 4 bis 6 bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40, vorzugsweise von 25 bis 35 C durchgeführt wird, wobei das Nährmedium Kohlenstoff-und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthält. Günstigerweise enthält das Nährmedium zusätzlich geröstetes Sojamehl. Das Sojamehl
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wird vorzugsweise vor der Verwendung als Komponente des Substrats mit einem proteolytischen Enzym behandelt, vorzugsweise einem solchen, das mikrobiologisch gebildet worden ist, mit Hilfe von Bacillus licheniformis. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß eine Lösung von Pectin aseptisch während der Züchtung zu der Fermentätionsbrühe zugesetzt wird.
Es hat sich gezeigt, daß Asp. aculeatus CBS 101 .43 auch sehr wirksame den Küstand löslich machende Enzyme, Cellulasen, Pectinasen und Hemicellulasen neben der SPS-ase bildet und daß der mit Hilfe von Asp. aculeatus GBS 101.43 gebildete Enzymkomplex außerordentlich gut geeignet ist als Mittel zur Zellwandzerstörung von pflanzlichen Materialien. So kann der von Asp. aculeatus CBS 101.43 gebildete Komplex angewandt werden in der Nahrungsmittel verarbeitenden Industrie zur Behandlung von Frucht- und Gemüsemaische und zur Klärung und Viskositätsverringerung bei der Verarbeitung von Fruchtsaft und Wein mit ausgezeichneten Ergebnissen. Er kann außerdem angewandt werden als Entwässerungsmittel (d.h. Mittel zum Abbau von Polysacchariden und damit zur Freisetzung des in der polymeren Struktur der Polysaccharide gebundenen Wassers (bei der Verarbeitung von Gemüsen). Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer SPS-ase oder ein Verfahren zum Abbau von Polysacchariden, vorzugsweise Pflanzen-Zellwand-Polysacchäriden, mit Hilfe einer Carbohydrase, wobei ein SPS-ase haltiges Mittel nach der Erfindung in einem wässrigen Medium mit einem Substrat für das SPS-ase-Zubereitung zusammen-
30 gebracht wird, .·, '
So hat es sich erfindungsgemäß gezeigt, daß SPS-ase-Zubereituhgen wertvolle Enzymzubereitungen zur teilweisen oder vollständigen Verflüssigung oder Abbau von ver-
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schiedenen Materiaien, vorzugsweise pflanzlichen Materialien, ζ. E. Früchten-und Pflanzen-Abfällen, die Protein, Cellulose, Hemicellulose (z. B. Glucane, Xylan, Galactane und Araban), Gummen, Pectin, Lipide, Inulin, Polyphenole, Stärke und Alginate enthalten, sind und für damit verwandte Zwecke (siehe die später artgegebene Tabelle). Als Beispiele für solche verwandte Zwecke können alle Zwecke erwähnt werden, bei denen heute kommerzielle Pectinasen und Cellulasen angewandt werden. Einige Beispiele sind später angegeben.
Im Zusammenhang mit dem Extraktions-(Isolier)-Verfahren, das z. B. in Beispiel 2 beschrieben ist, wurde festgestellt, daß die SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen Proteinase-frei ist, auf Grund der Tatsache, daß das gewünschte Endprodukt, d. h. das Protein(sonst abgebaut würde. Ähnlich sollte, wenn andere biologische Materialien als Protein aus einem biologischen Rohmaterial extrahiert (isoliert) werden die angewandte SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen frei sein von Enzymen, die diese anderen biologischen Materialien abbauen. Solche modifizierte SPS-ase-Zubereitungen können gebildet werden durch selektive Inaktivierung des unerwünschten Enzyms, darCh Fraktionierung oder andere an sich bekannte Verfahren.
So ist eine bevorzugte Anwendung nach der Erfindung gekennzeichnet durch die Tatsache, daß der Abbau erreicht wird durch Isolierung oder Extraktion eines anderen biologischen Materials als Sojaprotein und verwandte pflanzliche Proteine aus einem biologi-
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sehen Rohmaterial, wobei die SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen frei ist von Enzymen, die im Stande sind, das biologische Material abzubauen.
So hat es sich erfindungsgemäß gezeigt, daß die modifizierten SPS-ase- Zubereitungen (modifiziert in dem Sinne, daß. sie im wesentlichen frei sind von Enzymen, die im Stande sind, das zu extrahierende oder zu isolierende biologische Material abzubauen) wertvolle Enzymzubereitungen darstellen zur Extraktion (Isolierung) von speziellen biologischen Materialien z. B. Stärke, Lipiden, Geschmacksstoffen, Farbstoffen und Säften aus biologischen Rohmaterialien. Verschiedene Beispiele hierfür sind später angegeben.
; .: Y . ' . ' - . ' '.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß eines oder mehrere der Reaktionsprodukte (unbeachtlich, ob es erwünschte Endprodukte oder Nebenprodukte sind)gleichzeitig mit oder nach der Enzymbehandlung weiterbehandelt werden.
Hierdurch wird eine flexiblere und besser anpaßbare Arbeitsweise ermöglicht. Diese weitere Behandlung ist vorzugsweise eine alkoholische Fermentation, wenn eines der Reaktionsprodukte ein fermentierbarer Zucker ist. Hierdurch erhält man ein billiges Verfahren zur Herstellung von Alkohol.
Um das Wesen der Erfindung näher zu erläutern, wird auf die folgenden Abschnitte 1 bis 10 Bezug genommen, die jeweils Details im Zusammenhang mit der Erfindung beschreiben:
1. Herstellung von SPS.
2. Charakterisierung von SPS, insbesondere Molekulargewichtsverteilung.
:' ·. ' "- '' :': . : · ;. '. . .-. - 12 -
24 617 5 2
Λ O —
3. Nachweis, daß SPS und APS unterschiedliche Verbindungen sind.
4. Auswahl von SPS-ase bildenden Mikroorganismen.
-: ·;:. . ' . ; ' '.:'':.l
5. Charakterisierung einiger SPS-ase bildender Mikroorganismen.
6. Allgemeine Beschreibung der Überlagerungstechnik 10 bei derlmmunoelektrophorese.
7. Immunoelektrophoretische Charakterisierung von SPS-ase mit polyspezifischem Antikörper und Überlagerung.
8. Reinigung einer. SPS-as.e-Zubereitung.·
9. Abhängigkeit der SPS-ase-Aktivität von pH-Wert und Temperatur sowie Stabilität der SPS-ase.
10.. Enzymatische Aktivitätsbestimmungen.
Abschnitt 1
Herstellung von SPS
Wie oben erwähnt, kann das Ausgangsmaterial für die Herstellung von SPS 3a jarüdcstand (Bestandteile außer Protein) sein. Daher wird in erster Linie die Herstel-30 lung von Sojarückstand beschrieben.
Sojarückstand ist die Protein-freie Kohlenhydrat-Fraktion (die in der Praxis kleine Mengen an Lignin und Mineralien enthalten kann) in entfettetem und ent-
- 13 -
246 175 2 ,ι,- 6162612
hülstem Sojamehl· Diese Kohlenhydratfraktion ist unlöslich in einem wäßrigen Medium bei pH 4,5 und kann auf folgende Weise hergestellt werden, wobei auf das Fließschema 1 verwiesen wird?
Entfettetes Sojamehl wird in entionisiertem Wasser von 50 0C in einem Gewichtsverhältnis Sojamehl zu Wasser = 1 : 5 in einem Tank mit einem pH-Stat unter Temperaturregelung suspendiert 9 der pH-Wert wird mit 4n NaOH (I) auf 8,0 eingestellt· Jetzt wird mit Hilfe von Alkalase 0,6 L (einem proteolytischen Enzym auf der Basis von B· licheniformis mit einer Aktivität von 0,6 Anson-Einheiten/g^ bestimmt nach dem Anson-Verfahren, beschrieben in Novo Enzyme Information IB ETr· 058 e-GB), eine Hydrolyse unter konstantem pH-Wert durchgeführt, wobei das Verhältnis Enzym : Substrat 4 % der Menge an Protein in dem Sojamehl (II) beträgt· Nach einer Hydrolysezeit von 1 h wird die Aufschlämmung abzentrifugiert (III) und gewaschen (IV), wobei diese Maßnahmen zweimal wiederholt werden (V, VI, VII)· Die so erhaltene Aufschlämmung wird ein weiteres Mal 1 h mit Alkalse 0,6 L hydrolysiert (VIII, IX), ähnlich wie obenangegeben· Dann wird die Aufschlämmung abzentrifugiert (X) und zweimal gewaschen (XI, XII, XII, XIV), und die nach der letzten Waschstufe erhaltene Aufschlämmung (6) sprühgetrocknet (XV)· Das so erhaltene sprühgetrocknete Pulver ist der Sojarückstand, der als Ausgangsmaterial zur Herstellung von SPS dient·
SPS ist die wasserlösliche Polysaccarid-Fraktion, die erhalten wird durch übliche Behandlung des oben angegebenen Sojarückstandes mit Pectinase· Das SPS wird auf folgende Weise mit Hilfe der im folgenden angegebenen 14 Reaktionsstufen erhalten« Hierbei wird auf das Fließschema 2 Bezug genommen·
/ C 1 7 C- O 61626 12
4 b I/ 5. 2 -14-
1« Der Gehalt an trockenen Bestandteilen in dem oben erwähnten Sojarückstand wird bestimmt und der Sojarückstand mit Wasser auf einen Gehalt von 2 % Peststoffe verdünnt und in einem Tank mit Temperaturregelung auf 50 0C fehalten.
2. Der pH-Wert wird mit 6n NaOH auf 4,50 eingestellt·
3. Peetinex Super cone· L wird in einer Menge von 200 g/kg Feststoffe zugegeben (eine handeleübliche Pectinase mit einer Pectinase-Aktivität von 750 000 MOU, bestimmt nach dem Prospekt "Determination of the Pectinase unite on Apple Juice (MOU)" vom 12. 6. 1981). Ee wird ferner Celluclast 200 L in einer Menge von 20 g/kg Trockensubstanz zugegeben (eine handelsübliche Cellulaee, beschrieben in dem Prospekt NOVO Enzyme, Informationsblatt B 153 e-GB 1000, Juli 1981).
4. Der Tankinhalt wird 24 Stunden unter Rühren auf 50 0C gehalten*
5· Die Enzyme werden durch Erhöhung des pH-Werts auf 9,0 mit 4n NaOH inaktiviert. Daa Reaktionsgemisch wird 30 min stehengelassen und der pH-Wert dann wieder mit 6n HCl auf 4»5 eingestellt.
6· Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert und sowohl das Zentrifuget (überstehende Flüssigkeit) als auch der Rückstand (Schlamm) gesammelt»
2U175 2 -ι5- 6162612
7. Das Zehtrifugat aus Stufe 6 wird zur Untersuchung über eine Filterpresse filtriert (das Filter wurde vor der Filtration mit Wasser gewaschen)·
8. Das FiItrat wird ultrafiltriert, diafiltriert und nochmals ultrafiltriert über eine Membran mit einem Trenhwert von 30 000, wobei die folgenden Parameter angewandt werden:
1. Ultrafiltration auf eine Volumenkonzentration von 6.
2. Diafiltration, bis der Prozentsatz an Trockensubstanz in dem Permeat 0 beträgt (0 ° Brix).
3· Ultrafiltration auf ungefähr15 % Feststoffgehalt in dem Konzentrat·
Die Temperatur beträgt 50 0C, der pH-Wert 4,5 und der mittlere Druck 3 bar·
9. Das ultrafiltrierte Konzentrat wird auf 5 0C gekühlt und ein gleicheβ Volumen 9& %iges Ethanol zugegeben«
10. Der Niederschlag wird mit Hilfe einer Zentrifuge gesammelt·
11· Der Niederschlag wird zweimal mit 50 % (Vol/Vol)
Ethanol in H«0 gewaschen, entsprechend dem Volumen [ des Zentrifugats aus Stufe 10, d· h· es werden zwei Zentrifugierstufen durchgeführt.
D 17 ί)
— ID -
12. Der gewaschene Niederschlag wird erneut in Wasser gelöst, mit einem Volumen entsprechend dem Volumen des ultrafiltrierten Konzentrats der Stufe 9.
13. Die Flüssigkeit der Stufe 12 wird zur Untersur chung über ein Glasfilter filtriert.
1.4. Das klare Filtrat, enthaltend reines SPS, wird lyophilisiert.
- 17 -
— -» W · I ^J
Fließschema Γ Entfettetes Sojamehl H3O NaC)H auf pH
= S
J Hydrolysegemisch
Alcalase O, 6 LJ Hydrolyse χ h VX)r dem Austragen
pH-Stat (pH = 8, T = 50°C)
(E/S = 4 4n NaOH
II
1. zentrifugation
III
Zentrifugati
j Auf schlärrroung
1. ^feaäisiuf e .:
IV
' Zentrifugation
ν.
Abfall
Zentrifugat
Abfall
| H-O | 2.. Wasche | V | > Aufschlänraunq 2 | VII | VIII | Zentr i — | |
| ·*· > | stufe | VI | Auf schlämniunc | / . ' \ | fnaat ' ^ \ | ||
| Hycrolysegeinisch | Hydrolyse 1 h vor dem Austragen :. . - pH-.&tat (pH = 8.0, | Abfall ? 3 | |||||
| T = 50 C) | |||||||
| .Neues | |||||||
| H-O'« | 3 . Zentrifugation | ||||||
| NaOK auf pH -^S ' | |||||||
| ÄiraTa^e O 6 ί. . | . IX | ||||||
| 4N NaOK | |||||||
4. 'Zentrifugation
.Zentrirr fugat
H-O
Jl. VJasch- ~A · stufe
Aufschlärrnnung
XI
- " Z entrif ugat ion
XII
Zentrifugat
H-O J ?.. Wasph-
Abfall
Auf ρ ch la mrau jig
XIII
. Zentrifugation
XIV
Zentrifugat ·
Aufschlämmung
Sprühtrocknen
XV
| 1000 | g Pectinex Super cone. | f | sprühgetrockne- L 5 kg ter Rückstand | ' | 1» 2.f 3, 4, 5 |
| 100 σ Cellucl | ast 250 S ' | Abbau rait und Cellulase 500C; pH = 4T5? | s | Pectinase t = 24 h | |
| 24 7 1 H-,0 | ν | ||||
| · j. | .- · / |
| Zentrifugation | . Auf schläraiaijnc· | Check- Filtration | . | überstehende | 241 I^ | zentrifugation | Zentrifugat ^ | Ausfällung | Protein-Auf £ | Lyöphilisierung | |
| 3b kg | Ultrafiltration, Diafiltra tion, ultrafiltration (GR 60P) (19 - 26°C) | Permeat · | 2x',WasChen I 2 χ Zentrifugat ^ | ichlämrrvung v | > | ||||||
| : Flüsbiakeit | (Abfall) | ||||||||||
| / | (Abfall) | Ausfällung | |||||||||
| 18 1 Η_0 . | Ausfällung | erneutes Lösen | |||||||||
| S 1 50% C_H-OH . | |||||||||||
| Check" Filtration | |||||||||||
| > | |||||||||||
| 2 1 Η_0 ν | |||||||||||
310 g lyophilisiertes SPS
λ , r a nc ο 61 626 12
2Λ 6 17 5 2 -19-
Abschnitt 2!
Charakterisierung von SPS und besonders Molekulargewi cht sve rteilung
Durch Gel^Chromatographie mit Hilfe einer HPLC-Vorrichtung (Waters Pumpe Model 6000, Waters Daten Modul 730 und Waters Refraktometer R 401) wurde die Molekulargewichtsverteilung des SPS, dessen Herstellung wie in der Beschreibung angegeben durchgeführt wurde, bestimmt (Pig· 4)· Mit Hilfe der gleichen Methode wurde auch die Molekulargewichtsverteilung der mit Hilfe von SPS-ase erhaltenen Abbauprodukte von SPS bestimmt (Pig· 5)· Außerdem wurde mit Hilfe der gleichen Methode der Anlagerungseffekt zwischen Sojaprotein und SPS (Pig· 6) und das NichtVorhandensein des Anlagerungseffekts zwischen Sojaprotein und SPS, das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Mittels abgebaut worden war (Pig 7), gezeigt.
Die Eich-Kurve (der Logarithmus des Molekulargewichts gegen R^,wobei der R^-Wert für Glucose willkürlich als 1 definiert ist und der R^-Wert für ein spezielles Dextran als die Retentionszeit für dieses Dextran, dividiert durch die Retentionszeit für Glucose, definiert ist) wurde konstruiert mit Hilfe verschiedener Standard-Dextrane mit bekanntem Molekulargewicht (T 4, T 10, T 40, T 70, T 110, T 500). Der R^-Wert für das Maximum jedes Dextran-Peaks wurde festgestellt und das entspre
chende Molekulargewicht berechnet als V®w · ^n* wobei das Gewichtsmittel des Molekulargewichts und SL das Zahlenmittel für das Molekulargewicht ist. Als Eluens für dieses Ghromatographieverfahren wurde 0,1m lialO~-Lösung angewandt· Die für die Chromatographie angewandten Säulen
246 17 5 2
61 626 12 - 20 -
waren 60 cm PW 5000 und anschließend 60 cm PW 3000. Auf diese Weise wurde die Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und dem Rp-Wert für die oben angegebenen Dextrane aufgestellt, siehe Pig· 3·
Auf der Basis der Pig· 4 kann berechnet werden, daß SPS eine Molekulargewichtsverteilung besitzt, die zu einem Wert von M__ von ungefähr 5,4 x 10 -und einem Wert für von ungefähr 4,2 χ 10* führt# Aus dieser Figur geht auch hervor, daß das Chromatogramm zwei deutlich Peaks bei Retentionszeiten von 34,5 min (6 ^,entsprechend einem Molekulargewicht von ungefähr 5 x 10 und eine Rietentionszeit von 47»12 min (67 %), entsprechend eißem MoIekulargewicht von rund 4,9 x 1Ov zeigt· Aus die se jr Kurve geht hervor, daß zwischen diesen beiden Peaks eine Schulter existiert, bei einer Re ten tionszeit von 41,2!> min (27 %)t entsprechend einem Molekulargewicht von Ji,8 χ 10 ·
Nach dem Abbau des SPS mit SPS-ase wurde das Hydrolysegemisch durch eine Membran filtriert und das Piltrat chromatographiert· Es zeigte sich, daß ungefähr 55 % des SPS zu Mono-, Di- und Trisacchariden abgebaut waren, d und daß die verbleibenden 45 % zu einem Polymer abgebaut worden waren mit drei Peaks mit den folgenden Molekulargewichten: 5 χ 104, 10* "und 4,4 χ 103, siehe Pig· 5.
Um den Anlagerungs- bzw. Bindungseffekt zwischen Sojaprotein und SPS zu zeigen und die wesentliche Verringerung des Anlagerungseffekts zwischen Sojaprotein und SPS, das mit Hilfe einer SPS-ase abgebaut worden war, wurden die folgenden Versuche durchgeführt s.
3 % SPS in 0,10m Acetatpuffer bei pH 4,5 wurden zu
2Λ617 5 2-
einer Aufschlämmung von Sojaisolat (Purina 35 500) gegeben, um eine Suspension mit einem Verhältnis Isolat zu SPS von 10 : 1 zu erhalten. Diese Suspension wurde 18 h auf einem Schüttelbad bei 500C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Suspension zentrifugiert und die klare überstehende Flüssigkeit durch HPLC, wie oben beschrieben, analysiert. Aus einem Vergleich der Fig. 6 mit Fig. 4 geht hervor, daß das SPS vollständig an das Sojaisolat adsorbiert ist.
io . .· . '. ; ;;.;. ν- . . ' ; .. : . ; ; ' ' ' ·.
Das gleiche Verfahren, wie in dem vorhergehenden Absatz angegeben, wurde mit einer 3 prozentigen SPS-Lösung durchgeführt, die mit einer SPS-ase hydrolysiert worden war, die gebildet worden war von CBS 101.43 (Fig 7).
Ein Vergleich zwischen Fig. 7 und Fig. 5 zeigt, daß keine Verbindung in dem hydrolysieren SPS mit einem Molekulargewicht unter etwa 10 an das Sojaisolat adsorbiert war* Die Hydrolyse verringert die quantitative Anlagerung auf etwa 10 bis 15 %, bezogen auf die Anlage-
20 rung von SPS an Sojaprotein.
Die NMR-Analyse des SPS, dessen Herstellung wie in der Beschreibung angegeben, durchgeführt wurde, zeigt die folgende ungefähre Zusammensetzung des SPS. .25/ · ; ... .
1) dC -Galcturonsäure in einer Menge von etwa 45 %, wobei ungefähr 40 % der Gesamtmenge deroC-Galacturonsäure als Methylester vorliegen.
30 2) Rhamnopyranose in einer Menge von ungefähr 20 %.
3) Galactopypyranose in einer Menge von ungefähr 15 % und
35 4) ^-Xylopyranose in einer Menge von ungefähr 20 %.
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2A6 17 5 2
Die Bestandteile scheinen in einer Struktur vorzuliegen, umfassend eine Rhamnogalacturon-Hauptkette und Seitenketten aus Xylose und Galactose.
Eine vollständige saure Hydrolyse von SPS (8h in 1 η HpSO, ) und anschließende Analyse durch Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigte, daß auch kleinere Mengen der Monosaccharide Fucose und Arabinose in dem ; Jiydrolysierten SPS vorhanden waren.
:'. ; Die HPLC-!-Analyse des SPS, das durch den SPS-ase-Enzymkomplex, der von CBS 101.43 gebildet war, abgebaut worden war, zeigte eine starke Reduktion des Molekulargewichts. In Übereinstimmung damit, zeigtt das NMR-Spektrum des wie oben angegeben abgebauten SPS, daß der Hauptteil der Estergruppen verschwunden war, und daß auch der Gehalt an Xylose und Galactose in dem höhermolekularen Material abgenommen hatte. Das NMR-Spektrum des Teils des SPS-Abbauproduktes, der durch Zugabe von einem Volumen Ethanol zu einem Volumen SPS-Abbauprodukt ausfällt, ist ähnlich dem NMR-Spektrum des SPS mit den oben erwähnten Modifikationen bezüglich der Estergruppen und des Gehalts an Xylose und Galactose.
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Abschnitt 3
Dokumentation der Tatsache, daß SPS und APS unterschiedliche Verbindungen sind.
APS wurde hergestellt wie in Agr. Biol. Chem., Bd.36,Nr.4 S. 544 - 550 (1972).
Dieses Polysaccharid und SPS wurden jetzt mit unter-schiedlichen Enzymen hydrolysiert, woraufhin das Abbaugemisch durch Gelchromatographie mit Hilfe einer HPLC-Ausrüstuhg untersucht wurde, wie in Abschnitt 2 "Charakterisierung von SPS, insbesondere Molekulargewichtsverteilung" angegeben.
. . ' ' :"'.;- . ' ' :; '·.'. '.. .-.':':.: Im einzelnen wurden die Hydrolysen durchgeführt durch Behandlung von 25 ml Lösung von entweder 2 % APS oder 2 % SPS in 0,1 m Acetatpuffer, pH 4,5 mit 10 mg KRF 68 oder 30 mg Pectolyase. KRF 68 ist eine SPS-ase-Zubereitung, deren Herstellung in Beispiel 1 beschrieben wird· Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.
| Polysac-· | Enzym | HPLC Gel | - Polvsaccharid | licht abgebaut |
| charid. | Pectolyase | Chromatogramm | , abgebaut | |
| APS | KRF 68 | Fig. 8 | X | |
| hJPS | Pectolyase | Fig. 9 | X | X |
| SPS | KRF 68 | Fig. 10 | ||
| SPS | Fig. 5 | χ | ||
- 24 -
246 17 5 2
Abschnitt 4 ί
Auswahl von SPS-ase bildenden Mikroorganismen.
Der zu untersuchende Mikroorganismus wird auf einem Agar-Schräge-Substrat mit einem Mittel inkubiert, das das Wachstum des Mikroorganismus ermöglicht. Nach einem anfänglichen Wachstum auf dem Agar-Schrägen-Substrat, wird der Mikroorganismus in ein flüssiges Hauptsubstrat überführt, in dem die Hauptkohlenstoffquelle SPS (hergestellt wie angegeben) ist, in dem die Stickstoffquelle N0,~, NH^+, Harnstoff, freie Aminosäuren, Proteine oder andere stickstoffhaltige Verbindungen ist und das darüberhinaus ein Gemisch von essentiellen Salzen und Vitaminen, vorzugsweise in Form von Hefeextrakt enthält« Die Zusammensetzung des Hauptsubstrats hängt ab von der Art des Mikroorganismus, wobei der wichtigste Faktor der ist, daß das Hauptsubstrat im Stande sein sollte, das Wachstum und den Metabolismus des Mikroorganismus zu unterstützen. Wenn das Wachsturn eine entsprechende Zeitlang in der Größenordnung von 1 bis 7 Tagen stattgefunden hat, je nach der Wachstumsgeschwindigkeit des betreffenden Mikroorganismus, wird eine Probe der Fermentationsbrühe auf SPS-ase nach der enzymatischen SPS-ase-Bestimmung, wie sie in dieser Beschreibung angegeben ist, analysiert oder nach irgend einer anderen SPS-ase-Bestimmung, die "maßgeschneidert" ist, für andere spezifische Verwendungen der SPS-ase als die Verwendung als Bestandteil eines Mittels zum Abbau von Sojarückstand.
Um ein empfindlicheres Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität zu erreichen, sollte die Temperatur auf 400C verringert und die Inkubationszeit auf
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20 h erhöht werden während der Bestimmung der SPS-ase-Aktiyitat, wobei Antibiotika zu dem Substrat zugesetzt -werden sollten, um eine Infektion zu vermeiden.
Bei Befolgung dieses Testverfahrens können andere SPS-ase-bildende Mikroorganismen gefunden werden, die sowohl zu der Art Aspergillus als auch zu anderen Arten gehören.
.'. Abschnitt 3 . ' . : : ' '. : . .
io . .. .'' \'': : : .·. : ' ;' ." . · '\ : ' '
Charakterisierung einiger SPS-ase bildender Mikroorganismen |. '/I ..'- ' . ' ' . .' ..'
Nach der hier angegebenen Suchmethode nach SPS-ase-bildenden Mikroorganismen hat es sich gezeigt, daß die im oberen Teil der folgenden Tabelle angegebenen Mikroorganismen SPS-ase-Bildner sind. Die Tabelle enthält auch einen Stamm,der zur Art Asp. japonicus gehört, jedoch kein SPS-ase-ßildner ist.
| SPS-ase Bildner | .nein.«'. | Art | Asp. •.japö- nicus | Asp. acule- atus | Identifi- zierungs- Nuiraner | Hinterlegungs- Nummer | Hinterlegungs- Jahr |
| .ja | χ | X | X | A 805 A 1443 A 1384 | CBS 101.43; P^M l"3«fH IFO 4408; o?M. 23*6 ATCC 2023 6; DSM 2.JV-5" | 1943 1950 1969 | |
| χ χ |
246 17 5 2
Eine Kurz-Identifizierung der oben angegebenen Stämme findet sich in den folgenden Katalogen:
List of Cultures 1978 Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande
Institute for Fermentation Osaka, List of Cultures, 1972, 5. Auflage, 17 - 85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-kU, Osaka 532, Japan
;; ; ;, ;.; . . ' .. - '.." . - ' /. :: The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14. Auflage 1980, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.
15 Alle oben angegebenen Stämme entsprechen gut der taxo nomisehen Beschreibung der Arten Asp. Japonicus und Asp. aculeatus, wie sie angegeben sind in The genus Aspergillus of Raper and Fennell, 1965 (siehe besonders S. 327 - 330).
'20 · . ν i-';:' : ' '. '. .· ' ..· .·; .' ' . ; Abschnitt 6
Allgemeine Beschreibung des Überlagerungsverfahrens bei der Immunoelektrophorese.
Es wurde ein als Agar-Uberlagerungs-Technik (top-agar overlay;technique) bezeichnetes Verfahren zur Identifizierung von einzelnen Bestandteilen eines Enzymkomplexes durch Kreuz-Immunoelektrophorese mit einem
30 poly-spezifischen Antikörper gegen alle Enzymkomponenten in dem Enzymkomplex entwickelt. Das Verfahren beruht auf der Tatsache, daß Enzyme nach der spezifischen Enzym^-Antikörper-Bindung noch aktiv sind oder anders gesagt, daß die aktiven Enzymstellen nicht iden-
35 tisch sind mit den Stellen der Enzym-Antikörper-Bindung.
246 17 5 2-28-
Die Enzym-Aritikörper-Komplexe werden als deutliche Bögen während der Elektrophorese in dem Gel präzipitiert. Die Gelplatte wird mit löslichem SPS in Agar bedeckt. Nach 20 h langem Erwärmen auf 45°C in einer Atmosphäre mit einer relativen Feuchtigkeit von 100 % erscheint der Bogen mit SPS-ase-Aktivität als klare Zone in der SPS-Deckschicht nach Ausfällung mit einem Gemisch aus gleichen Volumina Ethanol und Aceton bei Betrachtung gegen einen schwarzen Hintergrund. Bögen, die keine SPS-ase-Aktivität besitzen, bleiben unsichtbar.
Abschnitt 7
Immunoelektrophoretische Charakterisierung von SPS-ase mit polyspezifischen Antikörpern und Überlagerung.
Kaninchen wurden mit dem SPS-ase haltigen Ehzymkomplex immunisiert, der erhalten worden war durch Fermentation von Aspergilluns aculeatüs CBS 101.43 wie in Beispiel 1 angegeben (KiIF 68) und der . polyspezifische Antikörper wurde in an sich bekannter Weise gewonnen. Mit Hilfe dieses polyspezifischen Antikörpers wurde eine Kreuz-Immunoelektrophorese des Enzymkomplexes, der durch Fermentation von Asp. aculeatüs CBS 101.43, wie in Beispiel 1 angegeben (KRF 68) erhalten worden war, durchgeführt, wie von N. H. Axelsen et al., in "A Manual of Quantitative Immuncoelectrophoresis", 6. Auflage 1977 beschrieben. Es wird auf Fig. 11 verwiesen, die die den unterschiedlichen von dem Mikroorganismus gebildeten Proteinen entsprechenden Bögen zeigt. Mit Hilfe des oben beschriebenen Agar-Überlagerungs- bzw. Überschichtungsverfahrens hat'es sich gezeigt, daß die schraffierten Bereiche der SPS-ase entsprechen.
Wenn die oben angegebene Hypothese, daß die SPS-ase
- 29 -
24 6 17 5 2 -
61 626 12
29 W-. .-- .. . ' - .., . ; '-.
aus zumindest zwei Enzymen besteht, richtig ist, ist der schraffierte Bereich der Bereich, in dem alle Enzyme, die für die SPS-ase-Aktivität verantwortlich sind, vorliegen· Wenn diese Enzyme bei anderen Arbeitsweisen nach der Erfindung durch Immunoelektrophorese auf solche Weise getrennt werden sollen, daß sie keinen gemeinsamen Bereich bedecken, kann ein Teil der SPS-ase-Aktivität noch identifiziert werden durch Immunoelektrophorese mit einer Überschichtung sowohl mit SPS als auch einer kommerziellen Pectinase.
Abschnitt 8
Reinigung einer SPS-ase-Zubereitung
Die Reinigung der SPS-ase-Zubereitung KRP 92 (siehe Beispiel 1) wurde durch Ionenaustausch durchgeführt· Der Puffer war 50 mM Iris (Tris-hydroxymethylaminomethan), der mit HCl auf pH 7,0 eingestellt war· Die Säule war eine Κ-5/30-Säule· Das Ionenaustauschermaterial war DEAE-Trisacryl (300 ml)· Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 100 ml/h.
15 g der SPS-ase-Zubereitung KRP 92 wurden in 450 ml HpO bei 6 0G gelöst und alle weiteren angegebenen Verfahrensstufen zwischen 6 und 10 0C durchgeführt· Der pH-Wert wurde mit 1 m Tris auf 7,0 eingestellt. Die Säule wurde mit dem Puffer äquilibriert und dann die SPS-ase-Probe auf die Säule aufgegeben· Die optische Dichte (ODoqq) und die Leitfähigkeit wurden an dem Eluat gemessen (siehe Pig· 12)· Die Fraktion 1 war das Eluat, das nicht an das Ionenaustauschermaterial gebunden war. Dann wurde die Säule mit 2000 ml Puffer
0/C17C 1 61626 12
246 1 7 5 2 -3°-
gewaschen, wobei man die Fraktion 2 erhielt· Dann wurde ein 0-500 mM NaCl Gradient gebildet, wobei die Fraktionen 3 bis 9 erhalten wurden. Alle 9 Fraktionen wurden auf 200 ml eingeengt und gegen Wasser bis zu einer Leitfähigkeit von 2 mSi dialysiert. Dann wurden die 9 Fraktionen gefriergetrocknet. Nur die Fraktionen 1 und 2 zeigten SPS-ase-Aktivität.
Die Fraktion 1 wurde weiter durch Gelfiltration gereinigt. 1,5 g der Fraktion 1 wurden in 10 ml 50 mM Hatriumacetat, pH 4,5 (500 mM KCl) gelöst. Die Säule war eine 2,5 x 100-cm-Säule. Das Füllmaterial für die Gelfiltration war Sephacryl S-200. Die Durshflußgeschwindigkeit betrug 30 ml/h. Die Fraktionen, die Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 70 000 und 100 000 enthielten, geeicht mit Globular Proteinen, enthielten einen Enzymkomplex, der als Faktor G bezeichnet wird und der bei Untersuchung nach dem qualitativen Agar-Test SPS nicht abbauen kann. SPS wird Jedoch nach dem qualitativen Agar-Test abgebaut, wenn der Faktor G mit einer Pectinase vermischt wird. Es hat sich gezeigt, daß der Faktor G imstande ist, Galactose, Fucose und einen Teil der Galacturonsäure von SPS abzuspalten, aber das Hauptabbauprodukt ist entsprechend der HPLC-Analyse noch ein hochmolekulares Produkt, das SPS sehr ähnlich ist.
Abschnitt 9,
Abhängigkeit der Aktivität von pH-Wert und Temperatur sowie Stabilität einer SPS-ase
Fig. 13 zeigt die pH-Wert-Abhängigkeit der Aktivität der SPS-ase-Zubereitung KRF 68· Von pH 2,7 bis pH 3,5
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wurde ein Ameisensäure-Puffer angewandt und von pH 3,7 bis 5,5 ein Acetat-Puffer.
Fig. 14 zeigt die Abhängigkeit der Aktivität von der Temperatur der SPS-ase-Zubereitung KRF 68.
Fig. 15;zeigt die Temperatur-Stabilität der SPS-ase- Zubereitung KRF 68.
- 32 -
24.6.!7:5- 2
Abschnitt 10
Bestimmung der Enzyrn-Aktivität.
Die unten angegebene Tabelle ist eine Zusammenfassung der verschiedenen-.Enzym-Aktivitäts-Bestimmungen mit Bezug auf
die Erfindung. - - - -.:. .
| r | Kurzbe schreibung der Aktivität | Definition der Aktivitäteinheit und Beschreibung der Bestimmung der Enzym-Aktivität | In der Be schreibung später erläutert | Literatur Nr. |
| Enzym | SPS-ase | Allgemein zugänglich | '-!·' ' X - .' ' | |
| SPS-ase | SRU | • . ' ·' . !' .- " ' '· | 1 | |
| Rückstand -lösend | £RUM-120 | .. x | X | |
| Protease | HUT | |||
| Cellulase | Gx | 2 | ||
| Pectinase | PU | * | 3 | |
| Hemicel- Jlulase | PGE | X | 4 . | |
| UPTE | X | 5 | ||
| PEE | X | • | 6 | |
| VHCU | X | 7 | ||
| X | ||||
Die in obiger Tabelle angegebene Literatur wird der folgenden Tabelle näher erläutert.
2Λ6 17 5 2
| Identifizierung der Literaturstelle | erhältlieh von | Schwei-; ζerische Ferr.ent AG, Ba sel, Swit zerland | Buchhandel | |
| Litera tür Nr | Analyseforskrift AF 154/4 of 1981-12-01 | NOVO INDUS- TRI h/S, Novo Alle, 2880 Bag- svsrd, Denmark | ||
| 1 | Analytical Biochemistry 84, 522 - 532 (1973) | X | X | |
| 2 | Analytical method AF 149/6-GB.of 1981-05-25 . | |||
| 3 | Determination of Pecti- nase Activity with Ci trus Pectin (PU) of 23.3.1976 | X | X | |
| 4 | Viskosimetrische PoIy- galacturonase-Bestim- mung (PGE) of 10.11.77 | X | ||
| 5 | Bestimmung der Pectin- transeliminase (UPTE/ g) of 24.Sept.1975 | χ | ||
| Determination of the Pectinesterase acti vity (undated) with Initials WJA/GW | X | |||
| 7 | Analytical method AF 156/1-GB | |||
Besonders in Bezug auf die Bestimmung der Cellulose-Aktivität ist zu bemerken, daß die Analyse durchgeführt wurde, wie in AF 149/6-GB angegeben, und daß das Prinzip der Bestimmung erläutert ist in Analytical Biochemistry.
O/ C 17 C 0 6162612
7 k BI 7 5 2 -34-
Bestimmung der Enzymaktivität von SPS-ase
Die Bestimmung der Enzymaktivität von SPS-ase wurde in zwei Stufen durchgeführt, d* h· einem qualitativen Agarplatten-Test und einer quantitativen Bestimmung der SPS-ase-Aktivität, die auf der Messung der Gesamtmenge an freigesetzten Zuckern beruht· Wenn der qualitative Agarplatten-Test negativ ist, ist die SPS-ase-Aktivität Null, ungeachtet des Werts, der bei der quantitativen Bestimmung der SPS-ase-Aktivität erhalten wird· Wenn der qualitative Agarplatten-Test positiv ist, ist die SPS-ase-Aktivität gleich dem Wert, der bei der quantitativen Bestimmung der SPS-ase-Aktivität erhalten wird·
I· Qualitativer Agarplatten-Test
Eine SPS-Agarplatte wurde folgendermaßen hergestellt: Es wurde ein Puffer B hergestellt durch Einstellen von 0,3m Essigsäure auf einen pH-Wert von 4»5 mit Hilfe von 1n NaOH. 1 g SPS wird in 20 ml B gelöst· 1 g Agarose (HSB Litex) wird mit 80 ml B vermischt und unter RUhren zum Siedepunkt erhitzt. Wenn sich die Agarose gelöst hat, wird die SPS-Lösung langsam zugegeben· Die erhaltene 1 %ige SPS-Agarose-Iösung wird in ein Wasserbad von 60 0C gestellt· Die Platten werden jetzt durch Ausgießen von 15 ml der 1 jSigen SPS-Agarose-Losung auf eine waagerecht liegende Glasplatte von 10 χ 10 cm hergestellt· Dann werden neun Löcher im Abstand von 2,5 cm in die verfestigte Schicht der SPS-Agarose gestanzt· In jede Vertiefung werden 10/Ul einer 1 $Lgen Lösung des auf die SPS-ase-Aktivität zu untersuchenden Enzymproteins gegeben« Die Platte wird 16 h
246175 2
61 626 12
35 -
bei 50 0CJund einer relativen Feuchtigkeit von 100 % inkubieri;· Jetzt wird noch nicht abgebautes SPS mit Hilfe einer Lösung von gleichen Volumina Ethanol und Aceton ausgefällt. Der SPS-ase-Agarplatten-Test ist positiv für eine Probe in einer bestimmten Vertiefung, wenn eine klare ringförmige Zone um diese Vertiefung entsteht· ./ ;; .' . .' / \ · : '. . :. "v ;.',
II· Test zur quantitativen Bestimmung der SPS-ase-Aktivität
Der Zweck dieses Versuches liegt in der Bestimmung der Enzymaktivität, die imstande ist, SPS in einem solchen Maß abzubauen, daß die Abbauprodukte eine stark verringerte oder keine Adsorption oder Bindungsaffinität an Sojaprotein zeigen· Versuche haben gezeigt, daß der Teil der SPS-Abbauprodukte, der durch ein Gemisch gleicher Volumina Wasser und Ethanol nicht ausgefällt wird, keine Adsorptions- oder Bindungsaffinität gegenüber Sojaprotein besitzt·
Die SPS-ase-Bestimmung beruht auf der Hydrolyse von SPS unter Standardbedingungen und anschließende Ausfällung des Teils des SPS, der nicht hydrolysiert worden ist, mit Ethanol· Nach der Ausfüllung wird der Gehalt an nicht ausgefällten Kohlenhydraten bestimmt durch quantitative Analyse auf den Gesamtzuckergehalt·
Die Standardbedingungen sind:
24 b 1 / t> L -36-
Temperatur: 50°C
pH: ' :"':- ; .· .; -/4,'5· >:.··=:: -:.. :" ,' /. " ' . Reaktionszeit:yergleich 210 min nur mit Substrat, . anschließend 2 min mit zugesetztem ' ..·.' ' '·, ,: /Enzym',;-y,- ·' ' ...· -v'-";'.-.,. ' r '. .
Hauptwert 212 min.
Die Vorrichtung umfaßt:
Thermostatisch geregeltes Rüttel-Wasserbad von 500C Magnetruhrer Zentrifuge
Eis-Wasser-Bad
Die Reagenzien umfassen:
Puffer: 0,6 m Essigsäure in entmirieralisiertem
Wasser (a) 15 1,0 m NaOH (b)
Substrat: Der pH-Wert von 50 ml a wird mit b auf
4,5 eingestellt, dann werden 4,0 g SPS zugegeben und nach Lösung des SPS wird der pH-Wert wieder auf 4,5 eingestellt und das Volumen mit entionisiertem Was-
? .. . ser auf 100 ml gebracht.
Abbruch-Reagenz:Absolutes Ethanol.
Eine SPS-^ase-Einheit (SAE oder SPSU) ist definiert als die SPS-ase-Aktivität, die unter den oben angegebenen Standardbedingungen eine Menge an in 50 %-igem Ethanol löslichen Kohlenhydrat, entsprechend 1 /uMol Galactose pro Minute freigesetzt.
Selbst wenn der Anfangsteil der Enzym-Standardkurve gerade ist, ist festzustellen, daß er den (0·0) Punkt
- 37 -
24617 5 2 -37-
nicht schneidet· Abschnitt TO b
Enzymatische Bestimmung der den Rückstand lösenden Aktivität , ausgedrückt als SRtJM 120
Bei dem Verfahren zur Bestimmung der Hydrolyseaktivität wird der unlösliche Anteil an entfettetem deproteinisiertem und enthülltem Sojamehl unter Standardbedingungen hydrolysiert· Die Enzymreaktion wird mit dem Abbruchreagens angebrochen und der unlösliche Anteil abfiltriert· Die Menge an gelösten Polysacchariden wird spektrophotometrisch bestimmt nach Säurehydrolyse· '";' .-: ' . ;'- ...... . ν ^;^'· ' ''..
Entsprechend dem Verfahren werden Carbohydrasen mit Endo- sowie Exoaktivitat bestimmt·
Das Substrat für diese Enzymbestimmung ist identisch mit dem für das SRU-Verfahren beschriebenen Rückstandsubstrat· Das Substrat wird als 3 %ige Lösung in dem unten erwähnten Oitratpuffer gelöst;
0,1 η Citrat-Phosphat-Puffer pH 4f5
5,24 g Citronensäure 1-Hydrat (Merck Art 244) 8,12 g Dinatriumhydrogenphosphat 2-Hydrat (Merck Art 6580)
ad 11 entmineralisiertes Wasser pH 4,5 ±0,05 14 Tage stabil·
H U I / O / - 38 -
Das Abbruchreagenz besitzt die folgende Zusammensetzung:
100 ml 0,5 η NaOH
200 ml 96 % Ethanol
Bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahren.
| Temperatur | 500C |
| pH | 4,5 |
| Reaktionszeil | 120 min |
| 5 min | |
| ;, Probe | |
| Blindprobe | |
| Definition der Einheit |
Eine Sojarückstand-lösende-Einheit (SRUM) 120 (M für manuell) ist die Menge Enzym, die unter den angegebenen Reaktionsbedingungen pro Minute gelöste (solubilisierte) Polysaccharide entsprechend 1 /uMol Galactose freisetzt.
Abschnitt 10c
Enzymatische Bestimmung der proteolytischen Aktivität.
Verfahren zur Bestimmung von Proteinase in saurem Medium.
Das Verfahren beruht auf dem Abbau (Digestion) von denaturiertem Hämoglobin durch das Enzym bei 400C, pH 3,2 innerhalb von 30 min. Das nicht abgebaute Hämoglobiji wird mit 14 #-iger Trichloressigsäure (Gew./Vol.) ausgefällt.
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246 17
Alle Erizympröben werden hergestellt durch Lösen in 0,1 m Acetat-Pufferj pH 3,2.
Das Hämoglobinsubstrat wird hergestellt unter Verwendung von 5,0glyophilisiertem Rinder-Hämoglobin-Pulver konserviert mit 1 % Thiomersalat und 100 ml entmirieralisiertem Wasser und 10 min gerührt, wobei der pH-Wert anschließend mit 0,33 η HCl auf 1,7 eingestellt . wird...Λ .: . ; ' ::::"'-, ' .' :.. .· ~": V . . '. ''
Nach weiterem 10 min langem Rühren wird der pH-Wert mit 1 η NaOH auf 3,2 eingestellt. Das Volumen dieser Lösung wird mit 0,2 m Acetatpuffer auf 200 ml erhöht. Dieses Hämoglobin-Substrat muß im Kühlschrank aufbewahrt werden, wo es sich 5 Tage hält.
Das Hämoglobin-Substrat wird auf Raumtemperatur gebracht. Zum Zeitpunkt Null werden 5 ml Substrat in ein Reagenzröhrchen gegeben, das 1 ml Enzym enthält. Nach 1 s langem Schütteln wird das Röhrchen 30 min in ein Wasserbad von 4O0C gegeben. Nach genau 30 min werden 5 ml 14 %-ige Trichloressigsäure in das Reaktionsröhrchen gegeben, das dann geschüttelt und 40 min auf Raumtemperatur gebracht wird.
Für die Blindprobe wird das Hämoglobin-Substrat auf Raumtemperatur gebracht. Zum Zeitpunkt Null werden 5 ml des Substrats in ein Reagenzröhrchen, enthaltend 1 ml Enzym, gegeben. Nach 1 s langem Schütteln wird das Röhrchen 5 n»in in ein Wasserbad von 400C gestellt. Nach genau 5 min werden 5 ml 14 % Trichloressigsäure in das Reagenzglas gegeben, das dann geschüttelt und 40 min auf Raumtemperatur gebracht
30 wird.
- 40 -
SJ I f J C -40-
Nach 40 min werden die Blindproben und die Proben geschüttelt, ein- oder zweimal durch Berzelius-Filter Nr. 0 filtriert und in ein Spektrophotometer gegeben. Die Probe wird gegenüber der Blindprobe bei 275 nm abgelesen, während das Spektrophotometer gegen Wasser eingestellt ist.
Da die Absorption von Tyrosin bei 275 nm ein bekannter Faktor ist, ist es nicht notwendig, eine Tyrosin-Standardkurve zu bilden, soweit es nicht erforderlieh ist, das Beckman-Spektrophotometer zu überprüfen.
1 HUT ist die Enzymmenge, die in 1 min ein Hydrolysat bildet, das in der Absorption bei 275 nm einer Lösung von 1,10 /Ug/ml Tyrosin in 0,006 η HCl entspricht. Dieser Absorptionswert beträgt 0,0084. Die Reaktion sollte bei 400C und pH 3,2 30 min lang ablaufen.
HUT = Probe-Blindprobe χ Vol. in ml
0,0084 Reaktionszeit in min
HUT = χ Λ± = (p_B) χ ^ ^
0,0084 30
(P-B) χ 43,65
HUT/g Enzym =
Die Untersuchung der Abhängigkeit der Proteasestabilität in KRF 68 vom pH-Wert durch die HUT-Analyse mit pH-Werten von 2,0 bis 8,0 zeigte, daß die Stabilität
- 41 -
6 17 5 2;
der Protease oberhalb pH 8,0 sehr gering war, siehe Pig. 16.
Zur näheren Erläuterung der Erfindung wird auf die folgenden Beispiele 1 bis 8 verwiesen, wobei Beispiel 1 die Herstellung von SPS-ase erläutert und die Beispiele 2 bis 8 die Anwendung der SPS-ase auf ein Soja-Ausgangsmaterial erläutern, um ein gereinigtes pflanzliches Protein zu erhalten. Andere Anwendungen der SPS-ase sind in dem Abschnitt zwischen Beispiel 8 und der Zusammenfassung der Figuren angegeben.
Es wurden einige Fermentationen mit den hier angegebenen Stämmen von Asp« aculeatus und Asp. Japonicus im Labormaßstab durchgeführt. Hierbei erhielt man Mittel, enthaltend SPS-ase, entsprechend dem hier angegebenen SPS-ase-Test. Da jedoch verhältnismäßig große Mengen an SPS-ase erforderlich sind, um Anwendungsversuche durchzufuhren, wurden ähnliche Versuche im Pilotmaßstab durchgeführt, siehe das folgende Beispiel 1.
B e i s pi el 1
Herstellung von SPS-ase in einer Pilotanlage
Eine SPS-ase wurde durch Submers-Fermentation von Aspergillus aculeatus GBS 101*43 hergestellt.
In einem Fernbach-Kolben wurde ein Agar-Substrat der folgenden Zusammenstellung hergestellt:
Pepton Difco 6g
Aminolin Ortana 4g
Glucose 1g
Hefeextrakt Difco 3g
248175 2
Fleischextrakt Difco 1,5g
KH2PO^ Merck 20 g
Malzextrakt Evers 20 g
entmineralisiertes H2O ad 1000 ml
Der pH-Wert wurde zwischen 5,3 und 5,35 eingestellt. Dann wurden 40 g Agar (Difco) zugegeben und das Gemisch 20 min im Autoklaven bei 12O0C behandelt. Das Substrat wird als E-Agar bezeichnet.
Der Stamm CBS 101.43 wurde auf einer E-Agar-Schräge (370C) gezüchtet. Die Sporen von der Schräge wurden in sterilisierter Magermilch suspendiert und die Suspension in Gläsern lyophilisiert. Der Inhalt einer Ampulle mit lyophilisiertem Inhalt wurde in den Fernbach-Kolben gegeben. Der Kolben wurde dann 13 Tage bei 300C inkubiert.
Es wurde ein Substrat mit der folgenden Zusammensetzung in einem 500 1 Impf-Fermenter hergestellt.
CaCO, 1,2 kg
Glucose 7,2 kg
20 Rofec (Maiswasser-Feststoffe) 3,6 kg
Sojabohnenöl 1,2kg
Leitungswasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von ungefähr 240 1 zugegeben. Der pH-Wert wurde vor der Zugabe von CaCO, auf ungefähr 5,5 eingestellt. Das Substrat wurde in dem Impf-Fermenter 1h bei 1210C sterilisiert. Das Endvolumen vor der Beimpfung betrug ungefähr 300 1.
Die Sporensuspension aus dem Fernbach-Kolben wurde in
246175 2
den Impf-Fermentor überführt. Die Bedingungen der Impf-Fermentation waren:
Fermentortyp: üblicher belüfteter und gerührter Fermenter mit einem Verhältnis Höhe : Durchmesser von ungefähr · ' . ^: ' ' .-2.3. 'r ' ν · ' . " .' -." ' ;
Rühren: 300 UpM (zwei Turbinen-Propellerrührer) ;
Belüftung: 300 Normal Liter Luft pro Minute Temperatur: 30 bis 310C
Druck: 1,5 bar (0,5 ato) Zeit: etwa 28 h
Ungefähr 28 h nach der Beimpfung wurden 150 1 aus dem Impf-Fermenter in den Hauptfermenter überführt.
15 In einem 2 500 1 Hauptfermentor wurde ein Substrat der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Geröstetes Sojamehl 90 kg KH2Pp^ . 20 kg
Pluronic 150 ^
Leitungswasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 900 1 zugegeben· Das geröstete Sojamehl wurde in Wasser suspendiert. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 8,0 eingestellt und die Temperatur auf 500C erhöht. Daraufhin wurden etwa 925 Anson-Einheiten Alcalase 0,6 L zu der Suspension gegeben. Das Gemisch wurde 4 h bei 500C und pH 8,0 (Na2CO, Zugabe) ohne Belüftung unter Normaldruck (null ato) und Rühren mit 100 UpM gehalten. Anschließend wurden die restlichen Bestandteile des Substrats zugegeben und der pH-Wert mit Phosphorsäure auf ungefähr 6,0 eingestellt. Das Substrat wurde in dem Hauptfermenter 1,5 h
- 44 -
2 k 6 ι 7 5 2 - 44 -
bei 123 °0 sterilisiert. Das Endvolumen vor der Beimpfung betrug ungefähr 1080 1·
Dann wurden 150 1 Impfkultür zugesetzt· Die Permentationsbedingungen waren:
Permentertyp: Üblicher belüfteter und gerührter Permen-
ter mit einem Verhältnis Höhe : Durchmesser von ungefähr 2,7 I
Rühren: 250 UpM (zwei Turbinen-Propellerrührer)
Belüftung: 1200 Normal Liter Luft pro Minute Temperatur: 30 0C Druck: 1,5 bar (0,5 ato) Zeit: etwa 151 h
Zwischen ungefähr 24 und ungefähr 116 h der Fermentation wurde eine Pectinlösung aseptisch zu dem Hauptfermenter mit konstanter Geschwindigkeit von ungefähr 8 l/h zugeführt· Die Pectinlösung der folgenden Zusammensetzung wurde in einem 500 1 Dosierungstank hergestellt:
| Pectin genu ' | 22 | kg |
| Phosphorsäure, | ||
| konz« | 6 | kg |
| Pluronic | 50 | ml |
x' Genu pectin (Citrus-Typ HP)
Leitungswasser wurde auf ein Gesamtvolumen von etwa 325 1 zugegeben· Das Substrat wurde in dem Dosierungstank 1h bei 121 0C sterilisiert. Das Bndvolumen
246 17 5 2-45-
vor dem Beginn der Dosierung bzw. Zugabe betrug ungefähr 360 1* Nach Auslauf dieser Menge wurde ein zweiter ähnlicher Ansatz hergestellt. Das Gesamtvolumen an Pectinlösung für eine Fermentation betrug ungefähr 725 1.
Nach ungefähr 151 h langer Fermentation wurde die Fermentation abgebrochen. Die ungefähr 1850 1 Kulturbrühe wurden auf ungefähr 5° C gekühlt uj dem folgenden Verfahren gewonnen.
wurden auf ungefähr 5 C gekühlt und die Enzyme nach
Die KuItürbrühe wurde mit Hilfe eines Vakuum-Trommelfilters (Dorr Oliver), das mit Filterhilfe (Hy-flosuper-cel Diatomeenerde) beschichtet war, filtriert. Das Filtrat wurde durch Eindampfen auf ungefähr 15 96 des Volumens der KuItürbrühe eingeengt. Das Konzentrat wurde über eine Seitz-Filterfolie (Type supra 100) mit 0,25 % Hy-flo-super-cel als Filterhilfe filtriert (in der folgenden Tabelle als Filtration I bezeichnet). Das Filtrat wurde mit 561 g (NH^)2SO^/1 bei pH 5,5 ausgefällt und 4 % Hy-flo-super-cel Diatomeenerde als Filterhilfe zugegeben. Der Niederschlag und die Filterhilfe wurden durch Filtration über ein Rahmenfilter getrennt. Der Filterkuchen wurde in Wasser gelöst und unlösliche Bestandteile über ein Rahmenfilter abfiltriert. Das Filtrat wurde (check) filtriert,über eine Seitz-Filterfolie (type supra 100) mit 0,25 % Hy-flo-super-cel als Filterhilfe (in der folgenden Tabelle als Filtration II bezeichnet). Das Filtrat wurde über eine Ultrafiltrationsvorrichtung diafiltriert. Nach der Diafiltration wurde die Flüssigkeit auf einen Feststoffgehalt von 12,7 # eingeengt (in der folgenden Tabelle als Feststoff gehalt im Konzentrat bezeichnet).
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24617
Eine fakultative Basenbehandlung zur teilweisen Entfernung der Proteaseaktivität kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Im Fall, daß die Basenbehandlung angewandt wird, wird sie lh bei einem pH-Wert von 9,2 durchgeführt, woraufhin der pH-Wert auf 5,0 eingestellt wird.
Jetzt wird die Flüssigkeit (check) filtriert und zum Zwecke der Keimverminderung filtriert und das FiI-trat über eine Gefriertrockenvorrichtung von Stokes gefriergetrocknet.
Es wurden vier Fermentationsansätze in der unten angegebenen Weise durchgeführt, wobei der für die Fermentation angewandte Stamm die Durchführung der fakultativen Basenbehandlung und andere Parameter verändert Vurde wie in der folgenden Tabelle an
gegeben .
| Basen- Behandlung . | nein | Code Nr. | Konzentration (%) der Fiisrhilfe bei | fällung | Filtra tion H | Fest stoff- gehalt im Kon zen trat | Anmerkungen | |
| Mikro organismus | ja | X | KRF 68 | Fil tra tion I | 5 | 0,2 | 28 | |
| CBS 101.43 | X | KRF 74 | 0,5 | 4 | 0,4 | 7,5 | ||
| ATCC 20236 | X | KRF 83 | 2,0 | 5 | 0,25 | 12,4 | X) | |
| IPO 4408 | KRF 92 | I3O | 4 ..; | 0,25 | 12,7 | |||
| CBS 101.43 | X | 0,25 |
Nach der Filtration zur Keimverringerung wird das Konzentrat
im Verhältnis 1 : 2,3 eingeengt. Ein kleinerer Teil des eingeengten Filtrats wurde sprühgetrocknet und der verbleibende Rest wurde gefriergetrocknet.
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24617 5 2-
Um die Proteaseaktivität weiter zu verringern, wurden einige der oben angegebenen Zubereitungen wie unten angegeben behandelt, wobei nur eine der drei Alternativen A, B und C durchgeführt wurdeο
A. 100 g SPS-ase-Zubereitung werden in 1 1 entionisiertem Wasser unter Rühren bei 100C - 20C gelöst. Der pH-Wert wird mit 4 η NaOH auf 9,1 eingestellt. Diese Basenbehandlung wird 1h lang durchgeführt. Der pH-Wert wird dann mit Eisessig auf 4,5 eingestellt und das Gemisch gegen eiskaltes entionisiertes Wasser bis zu einer Leitfähigkeit von 3 mSi dialysiert. Dann wird (das Produkt) gefroren und lyophilisiert.
. " * ' .
B. 500 g SPS-ase-Zubereitung werden in 4 1 entionisiertem Wasser unter Rühren beil O0C - 2°C gelöst. Der pH-Wert wird mit 4 η NaOH auf 9,1 eingestellt. Diese Basenbehandlung wird 1 h lang durchgeführt. Der pH-Wert wird mit Eisessig auf 5,0 eingestellt. Das erhaltene Material wird lyophilisiert.
C. 50 g SPS-ase-Zubereitung werden in 400 ml entionisiertem Wasser unter Rühren bei 100C - 2°C gelöst. Der pH-Wert wird mit 4 η NaOH auf 9,1 eingestellt. Diese Basenbehandlung wird 1 h lang durchgeführt. Dann wird der pH-Wert mit Eisessig auf 5,7 verringert. Das erhaltene Material wird lyophilisiert.
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246 17 5 2
| Als Ausgangssubstanz für die Basen-Be handlung angewandte SPS-ase-Zubereiturig | Basen- Behandlung | B | C | Code-Nr. |
| KRF 68 | A | KRF 68 BII | ||
| KRF 68 | X | X | KRF 68 BIII | |
| KRF 92 j | X | KRF 92 BI | ||
Die oben angegebenen Zubereitungen werden in der folgenden Tabelle durch ihre Enzymaktivitäten nach der Erfindung charakterisiert.
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| Enzym- Aktivität je g | Platten-Test | SRU . | KRF 68 | 350 | KRF 68 BII | KRF 68 BIII | KRF 74 | 0 | KRF 83 | KRF 92 | KRF 92 BI |
| SAE | Quantitative r Test | SRUM120 | + | 737 | . + ' ;' | ' 142 | |||||
| HUT pH 3,2 | 2125 | 301 | 34 9 | 578 | 168 | 476 | 430 | ||||
| Cx | 67000 | 507 | 481 | 1630 | 683 | 626 | 757 | ||||
| PU | 8000 | 1560 | 1720 | 1320 | 753 | 1640 | 1030 | ||||
| PGE | 10300000 | 105 | 339 | 840000 | 128 UO | 5960 | 397 | ||||
| ÖPTE | • 119400 | 8044 | 9396 | 4100 | 8040 | 5700 | 3092 | ||||
| PEE | 78100 | 9000000 | 8800000 | 15130 | 7500000 | 8400000 | 7600000 | ||||
| VHOJ | 840 | 72000 | 77700 | 370 | 64600 | 60000 | 68800 | ||||
| 1600000 | 83700 | 76900 | 65000 | 327000 | 44000 | 62400 | |||||
| 910 | 770 | 690 | 1000 | 790 | |||||||
| 1100000 | 1000000 | 2200000 | 1100000 | 742000 |
246 175 2 —B e i s p j e 1 2 (Anwendungs-Beispiel)
Dieses Beispiel beschreibt die Bildung eines ρ·ν·ρ. aus einem enthülsten und entfetteten Sojamehl "Sojamel 13"· Der Peststoffgehalt dieses Mehls betrug 94,0 %, und der Gehalt an (N σ 6,25) auf Peststoffbasis betrug 58,7 %· Das Sojamehl wurde mit der SPS-ase-Zubereitung KRP 68 BII (Beispiel 1) auf die folgende Weise behandelt: -
85,2 g des Sojamehls wurden in 664,8 g Wasser suspendiert und unter Rühren bei 50 0C gehalten und der pH-Wert mit Hilfe von 7,5 ml 6 η HCl auf 4,5 eingestellt· 50 g einer Lösung, enthaltend 4,00 g der erwähnten SPS-ase-Zubereitung, wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch dann 240 min bei 50 0C gerührt· Das Gemisch wurde dann in einer Laborzentrifuge (Beckmann Model J-6B) 15 min bei 3000 χ g zentrifugiert· Die überstehende Flüssigkeit wurde gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Peststoffgehalt untersucht. Die feste Phase wurde dann mit einem Volumen Wasser entsprechend der bei der ersten Zentrifugetion erhaltenen Menge an /überstehender Flüssigkeit gewaschen· Diese Operation wurde zweimal durchgeführt* Die feste Phase wurde dann gefriergetrocknet, gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Peststoffgehalt untersucht. Die bei dem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus Tabelle 2·1 hervor: . '"' -: : . ; -
246 17 5 2
Tabelle 2.1 Ergebnisse
| Komponente | ilenge g | N χ 6,25 (%) | Feststoffe (%) | Ausbeute. an Prcteia (%) | Ausbeute an Feststoffen. (%) |
| Sojamehl SPS-ase-. . . .-Zubereitung-.· | 85,2 4,00 | 55,2 75,6 | 94,0 | 100% 6,4% | 100% |
| 1. Zentrifugati p-v.p. yr | 666 44,5 | 1,50 87,5 | 5,04 95,7 | 21,2% 82,7% | 42,0% 53;2% |
So erhielt man ein p<,vop. mit einer Proteinreinheit, d.h. Nx 6,25, bezogen auf die Feststoffe, von 91,4 % und mit einer Gesamtausbeute an Protein von 83 %,'.
B e i sp ie I 3 (Anwendungsbeispiel)
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um die Proteinausbeuten, die Nährstoffqualität und einige funktioneile Eigenschaften von Sojaproteinprodukten zu vergleichen, die nach den folgenden drei Verfahren hergestellt worden waren«
A. Übliche isoelektrische Ausfällung zur Herstellung von Sojaprotein-Isolat.
B. Übliches isoelektrisches Waschverfahren zur Herstellung von Sojaprotein-Konzentrat.
C· Isoelektrisches Waschverfahren nach der Erfindung, umfassend ein den Rückstand lösendes Enzym zur Bildung von p.v.ps
- 52 -
λ,λΠγ - 61 626 12
24 6 1 7.5 2 -52-
Um einen wirklichen Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens (C) mit den üblichen Verfahren für Sojaprotein (A und B) zu erhalten, wurde das gleiche Ausgangsmaterial in allen drei Fällen angewandt· Die Versuche wurden auch so durchgeführt, daß entsprechende 5?emperatüren und Behandlungszeiten in allen drei Fällen angewandt wurden· lediglich die pH-Werte waren unterschiedlich aufgrund der fundamentalen Unterschiede zwischen den drei Versuchen·
A· Übliche isoelektrische Ausfällung zur Herstellung von Sojaprotein-Isolat
425»8 g Sojamehl wurden in 3574f2 g Leitungswasser bei 50 0C extrahiert4 der pH-Wert wurde mit 20,1 g 4n NaOH auf 8,0 eingestellt· Nach 1stündigem Rühren wurde die Aufschlämmung bei 3000 χ g 15 min unter Verwendung von 41-1-Bechern in einer Laborzentrifuge (Beckmann Model J-6B) zentrifugiert· Das Zentrifugat I und der Niederschlag I wurden gewogen« Der Niederschlag I wurde wie- ; der mit Wasser auf ein Gesamtgewicht von 4000 g extrahiert· Die Temperatur wurde auf 50 0C gehalten, der pH-Wert mit 4n NaOH auf 8 eingestellt und die Aufschlämmung 1 h gerührt· Das Gemisch wurde zentrifugiert und das Zentrifugat II und der Niederschlag II wie oben gewogen· Von den Zentrifugaten I und II und dem Niederschlag II wurden Proben entnommen nach Kjeldahl und auf den Feststoffgehalt untersucht· Anschließend wurden die Zentrifugate I und II vermischt und auf 50 0C gehalten· Das Protein wurde dann isoelektrisch bei pH 4,5 mit Hilfe von 45 g 6n HOl ausgefällt· Nach 1stündigem Rühren bei 50 0C wurde das Protein durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3OOO χ g gewonnen· Das Zentrifugat IHwurde gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den·-Feststoff-
24617
gehalt analysiert. Die feste Phase III wurde gewogen und mit Wasser in einer Menge entsprechend dem Gewicht des Zentrifugats I gewaschen. Der Waschvorgang wurde durchgeführt durch 1 stündiges Rühren bei 500C. Das gewaschene Protein wurde durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3000 χ g gewonnen. Das Zentrifugat IV und die feste Phase IV wurden gewogen» Das Zentrifugat IV wurde nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die feste Phase wurde in 1550 g Wasser von 5O0C suspendiert und der pH-Wert mit 17 g 4 η NaOH auf 6,5 eingestellt. Das Gemisch wurde 1 h gerührt und der pH-Wert, soweit erforderlich, wieder auf 6,5 eingestellte Schließlich wurde das Produkt gefriergetrocknet, gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den
Feststoffgehalt analysiert. Die Berechnungen der Men- ; genbilanz sind in Tabelle 3.1 angegeben. ;
-Tabelle 3.1 -
£<t,.U I / J
Tabelle 3.1 Berechnung der Mengenbilanz bei der üblichen
isoelektrischen Ausfällung zur Herstellung von Sojaprotein-Isolat.
| Operationen und ! Fraktionen | r | Menge der Fraiction g | Protein %(Nx6;25) | Feststof fe .·(%) | Ausbeute an Protein (%) | usbeute an feststoffen (%) |
| E>rtxaktion: Sajarnehl Kasser 4 .hNaOH | 425,8 3574,2 20.1 | 55,2 0 0 | 94,0 0 16,0 | 100,0 0 | 10OnO 0 0,8 | |
| 1. Zentrifugatipn: X | 4020.1 | 5,9 | 10,0 | 100,9 | 100,4 | |
| Zentrifugat I, Niederschlag- I | 3141,0 805,0 | 4,4 | 6,9 | 58,8 | 54,1 | |
| 805,0 3195,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Re-Extraktion: Niederschlag I- i Wasser | 3104.0 820,0- | 0,5 9,1 | 17,2 | 6,6 .31,7 | 35,2 | |
| 2. Zentrifuge tion: ^entrifugat II Niederschlag II | 6245,0 45,0 | . 0 | 21,3 | 0 | 27i4 | |
| Vermischen und Ansäuern Zentrifugate I,+ II 6 ri HG | 6290^0 5650,0 308,0 | 0,3 | # ' ' | 26,8 | ||
| 3. ZJentrifugation: Σ. Zentrifugat m Niederschlag _ IH | I ; 308,0 3141,0 | _ . -i 0 | 0 | I 0 | 0 | |
| Waschen ' Nieäe rschläg IiI . Wasser | 3449,0 3113.0 29110 | 0,04 | 0T15 | 0,5 | 1J2 | |
| 4."' Zentrif ugation: 2Γ 'Zentrifugat IV Niederschlag IV | 291,0 1550 0 17,0 | ' 0 0 | 0 16,0 | 0 0 | 0 0,7 | |
| Neutralisation: ; Nie derschlag JS ! ,Wasser 4 .η NaOH | 128,0 | 93,8 | 96?3 | 51,1 | I 30,8 | |
| TiDckne η*. Pulver |
- 55 -
2U175 2
B. Isoelektrisches Waschverfahren zur Herstellung von So-japrotein-Konzentrat
".' ' .·. . '. .' j
425,6 g Sojamehl wurden in 3574 g Wasser von 50 0C gewaschen. Der pH-Wert wurde mit 44,8 g 6n HCl auf 4,5 eingestellt» Das Waschen wurde 4 h unter Rtihren durchgeführt· Die Aufschlämmung wurde dann 15 min in einer Laborzentrifuge (Beckmann Model J-6B) bei 3000 χ g zentrifugiert, wobei 41-1-Becher verwendet wurden· Das .Zentrifuget I wurde gewogen und nach Kjeldahl auf .Bf sowie auf den Peststoffgehalt analysiert· Die feste Phase I wurde gewogen und erneut mit Wasser bis zu einem Gesamtgewicht von 4000 g gewaschen· Der pH-Wert wurde wieder mit 1,7 g 6n HCl auf 4,5 eingestellt und die Aufschlämmung 30 min bei 50 0C gerührt· Die Masse wurde zentrifugiert, und das Zentrifuget II und die Feststoffe; II wurden wie oben gewogen* Die feste Phase II wurde er-j neut in 1575 g HgO bei 50 0C suspendiert und der pH-Wert mit 34,5 g 4n NaOH auf 6,5 eingestellt. Das Gemisch wurdjs 1 h bei 50 0C gerührt und der pH-Wert, soweit notwendig, wieder auf 6,5 eingestellt. Schließlich wurde das Proteinprodukt gefriergetrocknet, gewogen und nach Kjeldahl auf Έ sowie auf den Peststoffgehalt analysiert. Die Mengenbilanz ist in Tabelle 3*2 angegeben·
Tabelle 3·2 Berechnung der Mengenbilanz beim isoelektrischen Waschen zur Herstellung von Sojaprotein-Konzentrat
| Operationen und Fraktionen | Menge der Fraktion g | Protein % (Nx6,25) | Fest stoffe % | Ausbeute an Protein % | Ausbeute an Feststoffen *:- |
| Waschen Sojamehl Wasser 6n HCl | 425,8 3574,0 44,8 | 55,2 0 | 94,0 0 21,3 | 100,0 0 0 | 100,0 0 2,4 |
| 1· Zentrifugation:Σ Zentrifugat I Peststoffe I | 4044,6 3150,6 846,0 | 0,6 | 3,2 | 8,0 | 25,2 |
| erneutes Waschen Feststoffe I Waschen 6n HCl | 846,0 3154,0 1,7 | 0 P | " mm . 0 21,3 | 0 0 | 0 0,1 |
| 2· 2entrifugation:£? Zentrifugat II Feststoffe II | 4001,7 3130,0 863,0 | 0,1 | 0,4 | 1,3 | 3,2 |
| Neutralisation: Feststoffe II Wasser 4n NaOH | 863,0 1575,0 34,5 | 0 0 | 0 ' " : 16,0 | ' " o 0 | -: o" 1,4 |
| Trocknens Pulver | 281,0 | 72,5 | 98,4 | 86,7 | 69,1 |
2Λ617
61 626 12
C. Isoelektrisches Waschverfahren unter Verwendung eines den Rückstand lösenden Enzyms zur Bildung von p,v„p,
425,8 g Sojamehl wurden in 3524,2 g Wasser bei 50 0C gewaschen, der pH-Wert wurde mit Hilfe von 43,7 g 6n HCl auf 4,5 eingestellt· 24 g der SPS-ase-Zubereitung KKF 68 BIII (Beispiel 1) wurden in 26 g Wasser gelöst und zu dem Waschgemisch zugegeben» Der
24 617 5 2
- 57 -
Waschvorgang wurde dann 4 h unter Rühren durchgeführt. Anschließend wurde die Reinigung, wie bei B beschrieben, durchgeführt, wobei die Mengen an 6 η HCl, 4 η NaOH und Wasser zum erneuten Suspendieren die einzifpi Parameter mit abweichenden (unterschiedlichen) Werten sind. Die Mengenbilanz ist in Tabelle 3.3 angegebene
Berechnung der Mengenbilanz bei dem isoelektrischen Waschen einschließlich des den Rückstand lösenden Enzyms zur Herstellung von p.v.p.
| Operationen und Fraktionen | I | Menge der Fraktion g | Protein %(N χ 6.25, | 2 3 | Feststof fe | ,3 | Ausbeute an Proteir ,(%,) ' | Ausbeute an Fest- ' stoffen(%) |
| Waschen: -Sojamehl Wasser 6 η HCl SPS-ase.: KKF 68 BHI | I | 425,8 354O72 43,7 24,0 | 55 T 0 0 75, | r | 94 0 21 96 | '6 | 100,0 0 0 7)7 | 10O1O 0 2,3 5,8 |
| 1. Zentrifugation: Σ. Zentrifugat Feststoff? I | H II | 4043,7 3420,0 620,0 | 5 | f° | 24,7 | 44;4 | ||
| Erneutes Waschen Feststoffe Wasser 6 η HCl | II | 620 0 3380,0 1,3 | 0 0 | 2 | 0 21 | ,7» | 0 0 | 0 O1I |
| 2. Zantrifugation: X Zjentrifugafc. Feststoffe | 4001.3 3400Jo | o, | 0 | y | 5,1 | |||
| Neutralisation: Feststoffe Wasser 4 η NaOH | 577T0 1700^0 25,3 | 0· 0 | 32) | 0 16 | 0 0 | 0 IfO | ||
| Trocknen: Pulver | 211,0 | 87I | 96 | 78;2 | 51,1 | |||
1) Analyse, des Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Koläing, Denmark
2) Analyse" des Qvist's Laboratorium, Marseiis Boulevard 169, DK-8000, Aärhus C, Denmark
246175 2 -
Die Aminosäurezusammensetzungen der drei Proteinprodukte wurden bestimmt siehe Tabelle 3.4. Der Gesamtgehalt an essentiellen Aminosäuren, die chemische Bewertung und der Index der essentiellen Aminosäuren (EAAI) wurde berechnet nach dem FAO Bezugsmuster von
Der Gehalt an Trypsininhibitor der drei Produkte wurde bestimmt mit Hilfe des in A.O.C.S. Tentative Method Ba 12 - 75 (A.O.C.S. ist eine Abkürzung für American Oil Chemists* Society) beschriebenen Verfahrens. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.5 angegeben, die auch die Ausbeuten und das Verhältnis Protein zu Feststoffen der drei Produkte zeigt.
- Tabellen 3e4 und 3.5 -
| U 6 17 | 5 2 | - 59 - | der drei Protein-Produkte I | 12,4 | aas1> | B. Sojaprotein- | aas1} | i, B und C. | (p.v.p | in | - |
| Tabelle 3.4 | A. So japroteinr· | 4,62 | . | Isolat | aas | .) | - | ||||
| Isolat | 2I7 3 | . — | g/16 gN | D | - | ||||||
| g/16 g N | 6,07 | - | — | - | |||||||
| Amino säure | Zusammensetzung der Aminosäure und Nähr | • | 4,13 | : . - - | nn3 | .,-.— ; | C. Sojaprote | - | > 100 | ||
| bewertung | 3,54 | - | 4,69 | I solat | - | VlOO | |||||
| Nicht-essentiell | 2,83 | - * | 18,2..'. " | g/1 6 g N | - | >100 | |||||
| Aspartxnsaure " | 8,09 | - | 5,19 | - | - | >ιοο·) >100 i | |||||
| Serin . | - | 4,26 | 11T9 | 1 e 59,5J | |||||||
| Glutaminsäure | 4,87 | — | 4,27 | '.' '- ' · ; | 4,81 | >100 | |||||
| Prolin | 7r80 | 2,78 | 17I7 | 94 T3 | |||||||
| Glycin | 6,24 | >100 | 7,57 | >100 | 4,76 | >100 | |||||
| Alanin | 5,47 3,38 | > 100 | >ioo | 4,33 | 21 | ||||||
| Histidin | 1,29 1,08 | >100 | 4,97 | >100 | 4,55 | 5% | |||||
| Arginin | 3,10 | >100 ) >>100 >iooj | 7,98 | aoo) |>100 >100) | 2,50 | 3% | |||||
| Essentiell | lT06 | 64.5] >56.4 49.IJ | 6;09 | 66,Ol ' ?6Q,2 5570j | 7T°4 | ||||||
| Isoleucin | 4,90 | >100 | 5735 O DD JrOO | >100 | |||||||
| Leucine' | 38, | 75.7 | 1,32 1;21 | 97;9 | 5,19 | ||||||
| Lysin | • 5S | >100 | 3,60 | >100 | 8,09 | ||||||
| Phenylalanin Tyrosin ' | 86, | 36 | 1,37 | 41,31 | 5,57 | ||||||
| Cystin Methionin | 4% | 5r23 | 60,2% | 5T17 4r44 | |||||||
| Threonin | 7% | 90,2% | 1,44 1,31 | ||||||||
| Tryptophan | 3,97 | ||||||||||
| Valin | 1T32 | ||||||||||
| %Gesamt-,Gehalt . der essentiellen Aminosäure | 5r57 | ||||||||||
| Chemische Bewertung | 425 | ||||||||||
| EAAI .- | 65; | ||||||||||
| 91. |
aas = Bewertung der Aminosäure, bezogen auf das FAO-Bezugsmuster (1957)
2A6175 2
-- 60 -
Tabelle 3.5 Verfährens-Charakteristika und Trypsin-Inhi-
bitor-Gehalt der drei Protein-Produkte A, B und C.
| Protein in den Fest stoffen | A. Sojaprotein -Isolat | B. Sojaprotein -Konzentrat | C. Sojaprotein- I solat (p.v.p.) | |
| Verf ahrens- Charakte- ristika | Protein - Ausbeute | 97,4 % | 73,7 % | . 90,0 % |
| Trypsin-Inhibitor TUI/g Produkt | 51;1 % | 86,7 % | 78,2 % | |
| Tül/g protein | 34 000 | 21 000 | 19 000 | |
| 36 250 | 28 970 : | 21 810 | ||
| '- ... | ||||
Der Index der Stickstofflöslichkeit (NSI) wurde in einer 1 %-igen Proteindispersion bei pH 7,0 in 0,2 m NaCl-Lösung bzw. in destilliertem Wasser bestimmt« Nach 45 min langem Rühren mit einem Magnetrührer wurde die Suspension 30 min mit 4000 χ g zentrifugiert und die überstehende Lösung auf Stickstoff untersucht. Die Stickstofflöslichkeit wurde berechnet als (lösliches N ^/Gesamt N %). Die Ergebnisse dieser Berechnung für die drei Produkte sind in Tabelle 3.6 angegeben.
- 61 -
24617
- 61 -
Die Emulgierfähigkeit wurde dreimal an jedem Produkt durch eine leicht modifizierte Swift-Titration bestimmt. 4,0 g (N χ 6,25) des Produktes wurden in 250 ml 0,5 m NaCl mit einem Sorval Omnimixer bei niederer Geschwindigkeit vermischt. 50 ml der Suspension wurden in ein Mischglas gegeben und 50 ml Sojabohnenöl zugesetzt. Anschließend wurde das gesamte Gemisch gewogen. Das Öl-Wasser-Gemisch wurde dann mit 10 000 UpM homogenisiert, wobei das Glas in einem Eisbad stand. Eine zusätzliche Menge Sojabohnenöl wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,3 ml/s zugegeben, bis die Emulsion zusammenfiel. Die Gesamtmenge an Öl, die vor dem "Endpunkt" zugesetzt wurde, wurde durch Wiegen festgestellt. i
Die Emulgierfähigkeit wurde berechnet als ml öl pro Gramm Protein (N χ 6,25). Die Dichte des Öls wurde mit 0,9 g/ ml angenommen.
Die Mittelwerte der Bestimmungen der Emulgierfähigkeit der drei Produkte sind in Tabelle 3·6 angegeben.
Die Aufschlagbarkeit wurde in einer 3 %-igen Proteinlösung bei pH 6,5 bestimmt. 250 ml der wässrigen Dispersion der Proteinproben wurden mit Geschwindigkeit III 4 min in einem Hobart-Mischer (Modell N-50),der mit einem Drahtquirl versehen war, aufgeschlagen. Die Aufschlagbarkeit bzw. Ausdehnung beim Aufschlagen wurde berechnet nach der Formel
V-250 Ausdehnung beim Aufschlagen = 250 χ 100 %,
in der V das Endvolumen des aufgeschlagenen Produktes in ml bedeutet.
246 17 5 2
-62 -
V wurde gemessen durch erneutes Füllen des Mischerglases mit Wasser. Es vrurden Doppelversuche für jede der drei Proben durchgeführt. Die erhaltenen Mittelwerte!
' ' ' · ' ·'' '. j
sind in Tabelle 3.6 angegeben, j
' . . ..-'. ' ' ' . ' . ι Die Schaumstabilitat wurde als Verhältnis zwischen djer
Menge Schaum, die nach 3 minütigem Ablaufen verblietj und der ursprünglichen Schaummenge bestimmt. 1 g des nach dem oben angegebenen Verfahren geschäumten bzw. aufgeschlagenen Produktes wurde in einen Kunststoffzylinder (Durchmesser 7 cm, Höhe 9 cm) mit einem Drahtnetz mit einer Maschenweite von 1 χ 1 mm gegeben. Der Zylinder wurde auf einen Trichter auf einem Glaszylinder gegeben und das Gewicht (B) der abgelaufenen Flüssigkeit in dem Glaszylinder bestimmt. Die Schaumstabi-
15 lität FS ist definiert durch die Gleichung
FS = A T B x 100 %.
Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind in Tabelle3.6 angegeben.
in dieser Beschreibung definiert als die Brookfield-Viskosität gemessen mit Hilfe von T-Spindeln in einem Brookfield Helipath-Ständer. Die Gele wurden hergestellt durch Wärmebehandlung von 12 %-igen Proteinsuspensionen in 0,5 m NaCl. Die Wärmebehandlung wurde in geschlossenen Dosen mit einem Durchmesser von 7»3 cm und einer Höhe von 5 cm, die in ein Wasserbad gestellt wurden, das auf 80 und 1000C
durchgeführt
gehalten wurde, jeweils innerhalb von 30 miny Sie Dosen wurden gekühlt und bevor sie geöffnet und (der Inhalt) gemessen wurde ,thermostatisch auf 200C einge-
- 63 -
24 617 5 2
- 63 -
stellt. Die Ergebnisse der Messungen sind In Tabelle : 3.6 angegeben.
Tabelle 3.6 Funktionelle Eigenschaften der, drei Protein-Produkte. : : :
| Funktion | A. Sojaprotein- I. sola t | B. Sojaprotein- Konzentrat | C. Sojaprotei Isolat (p.v.p. |
| % KSI in 0;2 m NaCl % NSI in Wasser | 39,5 53,9 | 2073 25 yi | 25,6 28 j 6 |
| Emuigier-Fähig- keit: ml Öl /g (Nx 6;25) | 218 | 182 | : 354 |
| Auf schlagbarkeit /.(% ) | 120 | 120 | 340 ^, |
| Schaumstabilität (%) | 50 | 20 | |
| Gel -Festigkeit(dPa.s) 80°C (0;5m NaCl) iO0°C (0,5 m NaCl) | 1,7x 103 2,Ox 104 | 1,2 χ TO4 4 4,0x10 | 3T3x 102 1,3 χ 104 |
B e i spiel 4 ( Anwendungsbeispiel)
Ein p.v.p. wurde hergestellt nach dem in Beispiel 3c beschriebenen Verfahren mit der Ausnahme, daß die Gellulase-Aktivität teilweise von Trichoderma reseei stammte Die im Handel erhältliche Cellulasezuberei-
2Λ6 17 5 2
- 64 -
tung CELLUCLAST
wurde iait einer Base bei niederer Temperatur auf die
folgende Weise behandelt. Der pH-Wert einer 10 %-igen
NaOH auf Celluclast-Lösung in Wasser wurde mit-v9,2 eihge-
stellt und die so erhaltene Lösung auf 5°C gekühlt. Nach 1h bei diesem pH-Wert und dieser Temperatur wurde der pH erneut mit 20 %-iger Essigsäure auf 4,7 eingestellte Die Lösung wurde über Nacht bei 50C gehalten und dann steril filtriert. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet. 4 g des gefriergetrockneten Produktes zusammen mit der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 BIII (Beispiel 1) zugegeben. Die beiden Enzyme wurden in 172 g Wasser vor der Zugabe zu dem Wasch-Gemisch gelöst. Die Bestimmung der Mengenbilanz ist in Tabelle 4.1 an^
15 gegeben.
' :.. ' .. I
Der Versuch zeigt, daß diese spezielle SPS-ase-Zubereitung schon eine wirksame Cellulase enthält, da der Zusatz von Celluclast das Verhältnis Protein : Feststoffen nicht beeinflußt. Andere SPS-ase-Zubereitungen können jedoch weniger Cellulase enthalten, z.B. KRF 92, siehe die Tabelle unmittelbar vor Beispiel 2.
-Tabelle 4.1 -
24 6 175 2
- 65 -
Tabelle 4.1 Berechnung der Mengenbilanz beim isoelektrischen Waschen einschl. der . SPS-ase-Zubereitung und Celluclast ^ zur Herstellung
';. '. .'... . ' .' VOn p, V.'.p. . : .- . · ; '.:' .,.;; . ../ .'
| Operationen und | Menge der | Protein | Feststoffe· | usbeute an' | Ausbeute |
| Fraktionen | Fraktion | (%) | ( %). | Protein | : an feststoff er |
| g- | (Nx 6,25) | ( %) | (%) | ||
| Waschen | |||||
| Sojamehl | 425,8 | 55,2 | 94 T0 | iOOyO | lOOjO |
| Wasser | 3546,2 | 0 | .0 | 0 | ο |
| 43,1 | 0 | 217 3 | 0 | 2I3 | |
| 6 η HCl | 24?0 | 75,3 | 96 | 7>7 | 5,8 |
| SPS-ase: KRF-68-B-III | 4,0 | 43; 6 | 96 | 0,7 | 1,0 |
| CELLUCLAST | 4043,1 | - | - . | ; - | - |
| Zentrifugat Σ | 3382,0 | 5;5 | 27T3 | 46;5 | |
| Zentrifugat I | 661,0 | : - | I . - | ||
| Feststoffe I | m | ||||
| erneutes Waschen: | 661,0 | — | - .'. | - ' | |
| Feststoffe I | 3339,0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Wasser | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 6 η HCl | 4000,0 | ||||
| 2. Zentrifugation: Σ | 3414,0 | 0,2 | 0T? | 2.9 | 6,0 |
| Zentrifugat II | 582,0 | - . | -. | ||
| Feststoffe II | |||||
| Neutralisation: | 582,0 | - | - | — | — |
| Feststoffe Il | 1691,0 | 0 | ο | 0 | 0 |
| Wasser | 25,3 | 0 | 167O | 0 | 1,0 |
| 4 η NaOH | |||||
| Trocknen: | 206 r0 | 88,8 | 98,9 | 77 ? 8 | 50;9 |
| Pulver |
2Λ6175 2
- 66 -
B e i s ρ i e 1 5 (Anwendungsbeispiel)
Ein p.v.p, wurde nach dem in Beispiel 3c beschriebenen Verfahren hergestellt mit der Ausnahme, daß alle Mengen um den Faktor 5 kleiner waren und daß das iReaktionsgemisch vor dem Zentrifugieren auf ungefähr 50C gekühlt wurde. Auf der Grundlage der Analyseergebnisse im Zusammenhang mit den Zentrifugaten wurde eine theoretische Ausbeute an Protein erhalten, wie aus Tabelle 5.1 hervorgeht.
Tabelle 5.1 Bei der Herstellung von p.v.p. erhaltene theoretische : Protein-Ausbeute. '
| Fraktionen | Menge | Protein - (N χ 6.25) ; (%) | Äasbeute an Protein (%) | 'Beispiel 3 C | Protein,% |
| Sojamehl SPS-ase ;KPP-68 B-III | 85,2 4,8 | 55,2 75r3 | ; loo | Protein (N χ 6.25) % | 100 ')'. |
| 1. Zentrifugat 2.. Zentrifugat p.v.p. | 639 595 | 0?99 0r13 8?r2a | 13,5 - 1V6 92, 6b | 55,2 75,3 | 24^7 2'9b 80,lb |
| V 0T2 87 ;1 |
Durchschnitt von 87,5 (Bioteknisk Institut) und 86,9 (Qvist's Laboratorium); entsprechend Feststoffen von 97,6 und 98,0 %.
Berechnet als Gesamtmenge von Protein - Proteinverlust in den Zentrifugaten.
246175 2 -«-
Bei s ρ i e 1 6 (Anwendungsbeispiel) Nachweis der Proteinbindung von SPS
40 g (N χ 6,25) aus einem im Handel erhältlichen Sojapro tein-Isolat - wurden in 680 g Wasser gelöst. Das Gemisch wurde im Wasserbad auf 50°C erwärmt und der pH-Wert mit 6 η HCl auf 4,5 eingestellt. 90 g dieses Gemisches wurden in 5/250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und 10 g wässrige Lösungen, enthaltend 0, 0,2, 0,4, 0,8 bzw. 1,6 g des wie vorher ι in der Beschreibung angegeben hergestellten SPS wurden zugegeben. Die Kolben wurden dann 240 min mit einem Magnetrührer im Wasserbad bei 500C gerührt. !
Anschließend wurden die Aufschlämmungen mit 3000 χ g \ 15 min zentrifugiert und die Zentrifugate I nach ' Kjeldahl auf N sowie auf Feststoffe analysiert. Die festen Phasen wurden in Wasser von Raumtemperatur ge-j waschen und dann neu zentrifugiert. Dieses Verfahren j wurde wiederholt. Dann wurden die Feststoffe in 50 mli Wasser dispergiert und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 6 η NaOH auf 6,50 eingestellt. Die neutralisierten Produkte wurden gefriergetrocknet und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Bezogen auf die in Tabelle 6.1 angegebene Analyse wurden das gewonnene Protein und der Prozentsatz an SPS, der an das Protein gebunden war, mit Hilfe der in Zusammenhang mit Tabelle 6.2 angegebenen Formeln berechnet.
Dieses Beispiel zeigt, daß das SPS fest an das Protein gebunden ist, so daß das Verhältnis Protein !Feststoffen mit zunehmendem Gehalt an SPS abnimmt. Ein SPS-Gehalt/ entsprechend ungefähr 0,4 g in 10 g Wasser,
- 68 -
24617 5 2
- 68 -
zugegeben zu 5 g Protein-Isolat, ist das in dem Sojamehl vorhandene Verhältnis Protein : SPS.
Die prozentuale Bindung von SPS ist ein berechneter Wert. Die prozentuale Bindung von SPS nimmt aufgrund der Sättigung des Proteins in Beziehung auf SPS bei geringen Verhältnissen Protein : SPS ab.
- Tabelle 6.1 -
2Λ617 5 2
- 69 -
Tabelle 6.1 Messungen nach Beispiel 6
| Verhältnis Protein/SPS | zentrifugate I | % DM | trockner Niederschlag | % Nx6;25 | % DM | o N χ 6.25 |
| 25 12,5 6,25 3,125 | % N | 0.62 ' 0,49 0,4 5 0,45 0.61 | % N | 82 \s . 83,8 I 81,3 78.8 73,8 | 93,1 97T3 97 j 9 98 ;1 97;9 | . DM |
| ' Ό,Ό68 0,045 0; 038 0,031 0,026 | 13,2 13,4 13,0 12}6 | 88 f 6 B6,1 - 83,0 80,3 75,3 |
Tabelle 6.2 Protein-Gewinnung und prozentuale Bindung von SPS
| Verhältnis Protein/SPS | % Protein-Gewinnung | 2) % Bindung von SPS |
| OO 25 | 91,5 94,4 | 0 77 |
| 12,5 | 95,3 | 90 |
| 6,25 | 96;1 | 70. |
| 3;125 | 96 j 8 | 60 |
1) % Protein-Rückgewinnung =fi - NC 1x6.2.51
• NC 1 = % N in Zentrifugat I "·5*.
^ wobei
2)
% Bindung von SPS =
Rückin-^Gewi
5x (% Protein-^Gewinnunq) (% ^-
Rück-
5 χ (% Protein-'vlewinnunq . (%
Γ 5/Menge
SP Sj
*(% P/H) Verhältnis Protein/Feststoff im trockenen Niederschlag und
gilt für den Niederschlag ohne Zusatz von SPS
24817
- 70 -
Bei ep le 1
J. (Anwendungsbeispiel)
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines p.v.p. unter Verwendung der SPS-ase-Zubereitung KRF 92 BI in einer Menge von 5 %, bezogen auf die Feststoffe. Die Art der Herstellung entsprach genau derjenigen von Beispiel 3c mit der Ausnahme, daß alle Mengen um den Faktor 5 verringert wurden. Das p.v.p. wurde,wie in Beispiel 2 beschrieben, analysiert. Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus Tabelle 7.1 hervor.
Tabelle 7.1 in Beispiel 7 erhaltene Ergebnisse
| Bestandteile · | Menge :,.:s ; | (Nx 6;25) (*) | Feststoffe (%) ' | Ausbeutean Protein, ' ( % ). | Ausbeute an Feststoffen (%) |
| Sojamehl Enzym-zubereitung | 85 T2 4,0 | SS12 71,2 | 94,0 | 100 6I1 | 100 |
| 1 . zentrifu.gat 2 . - Zen-tr-if-ugat .pvV.-p.'V/ | 632· £73 39} 8 | 1,88 O130 85T6b 84|4b | 5V44 0,80 Ö8jlb | 25,3 4,3 71,9 | 43,0 6,7 48,8 |
a Analyse des· Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding Analyse des Qvist's Laboratorium, Marseiis Boulevard 169, DK-8000
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Bei s ρ I el 8 (knwendungsbeispiel)
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung einer Vorbehandlung von Sojamehl durch DampfStrahlbehandlung vor der Herstellung von p.v.p.
5 Vorbehandlung
Eine Aufschlämmung von Sojamehl in Wasser, bestehend aus 10 kg Sojamehl (Sojamel 13 hergestellt von Aarhus Oliefabrik A/S) auf 100 kg wurde durch eine Dampfdüse (Typ Hydroheater B-300) gepumpt und mit Dampf von 8 bar in einer solchen Menge und mit einer solchen Strömungsgeschwindigkeit vermischt, daß eine Endtemperatur von 1500C 25 s in einem rohrförmigen Druckreaktor aufrechterhalten werden konnte. Anschließend wurde der Druck in einerEntspannungskammer (ein Zyklon) aufgehoben und von hier wurde die Aufschlämmung durch einen Plattenwärmeraustauscher geleitet und auf ungefähr 50°C gekühlt. Die abgekühlte Aufschlämmung konnte direkt zur Herstellung von p.v.p. nach der Erfindung verwendet werden aber in diesem Falle wurde die Aufschlämmung mit einer Eintrittstemperatur von 200°C
und einer Austrittstemperatur von 900C sprühgetrocknet. , Es zeigte sich, daß das vorbehandelte Produkt einen Feststoffgehalt von 96,5 % und einen Proteingehalt von 56,9 % (N χ 6,25) besaß.
. ι . .;·
25 Herstellung von p.v.p«
Die Herstellung wurde auf die folgende Weise durchgeführt:
70 g Feststoffe des mit Dampf behandelten und getrockneten Sojamehls wurden in 560 g Wasser suspendiert und
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bei 5O0G gerührt und der pH-Wert mit Hilfe von 6,5 ml 6 η HCl auf 4,50 eingestellt. 6 χ 90 g dieser Suspension wurden in 6 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und auf einem Wasserbad von 500C mit Hilfe von Magnetrührern gerührt. Zu jedem Kolben wurden 10 g einer Lösung, enthaltend 0, 0,025, 0,050, 0,10, 0,20 bzw. 0,40 g SPS-ase-Zubereitung KRF 68 BIII gegeben. Die Reaktionsgemische wurden dann 240 min bei 500C gerührt. Dann wurde das Gemisch 15 min bei 3000 χ g zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde dann nach Kjeldahl auf N analysiert und die feste Phase mit gleichen Volumina Wasser gewaschen und zentrifugiert. Dieses'Verfahren wurde zweimal durchgeführt. Die feste Phase wurde dann gefriergetrocknet und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert«
Ein ähnlicher Versuch wurde mit einem nicht behandelten Sojamehl •^ S©3-a»e3r-43-ä«a^H^«4Mi^^ als Ausgangsmaterial durchgeführt. In diesem Fall waren die Verhältnisse Enzym : Substrat 0, 1, 2, 3, 4 bzw. 8 %.
Bezogen auf den Proteingehalt der überstehenden Flüssigkeiten kann der Prozentgehalt an gewonnenem Protein berechnet werden. Die Ausbeute an Protein beruht auf der Annahme, daß das Enzymprodukt nach der Reaktion 100 % gelöst ist. Die folgende Tabelle zeigt die bei beiden Versuchen erhaltenen Ergebnisse.
-Tabelle 8.1 -
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Tabelle 8.1
Verhältnis Protein-ausbeute und Protein der Feststoffe des aus dampfbehandeltem oder rohem Sojamehl hergestellten pvv.p.
| Dampfbehandeltes Sojamehl -.· '·..· | Protein der Feststoffe % | " nicht behandeltes Sojamehl | Protein def Feststoffe.. % | |
| E/S % | ,Protein Feststoffe' % | 76,5 86,6 88,7 89;7 91,7 92.2. | Protein Feststoffe % | 73,9 86,2 88,1 89,5 90,9 |
| 0 0,25 0,50 2,0 3,0 4,0 8,0 | .92 V9. 90,1 89,3 88^1 86,6' .'.· 84,7 | 9O7 7 87,1 85,7 84,3 82,6 76,2 |
Im Zusammenhang mit entweder den Extraktions- (Isolierungs-) Verfahren für andere Materialien als Proteine oder mit den Verflüssigungsverfahren und damit verwandten Verfahren wird auf das allgemeine Verfahrensschema für die Anwendung, wie in dem Fließschema 3 angegeben, verwiesen.
Das Substrat kann ein oder mehrere Kohlenhydrate in einem Ausgangsmaterial sein oder es kann das gesamte
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246 17 5 2 Ausgangsmaterial sein.
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Dieses Substrat kann einer chemischen oder physikalischen Vorbehandlung, wie später beispielhaft erläutert, ζ.Β. einer Säure-oder Alkalibehandlung, Einweichen, Benetzen und/oder Kochen mit oder ohne Dampf unterworfen worden sein.
Das Ausgangsmaterial kann eingeweicht (mazerisiert), gehackt, naß gemahlen und/oder homogenisiert sein (alle diese Behandlungen werden in Fließschema 3 als Homogenisierung bezeichnet), wobei Wasser und andere Additive während dieser Stufe zugesetzt oder nicht zugesetzt werden können. Die Homogenisierung kann mit unterschiedlicher Wirkung durchgeführt werden, z.B. bei unterschiedlichen Drücken, die nur ein Bruchteil des für den speziellen Homogenisator angegebenen Maximal-Druckes ausmachen. Unterschiedliche Zusätze bzw. Additive können vor oder während der Homogenisierung zugegeben werden, wie in dem Fließschema 3 durch b>|, bg...· b angegeben.
Das Reaktionsverfahren einschließlich der SPS-ase-Herstellung wird unter speziellen Bedingungen, z.B. von Temperatur, Druck, Zeit, pH und Enzymmenge durchgeführt. Auch sind Empfehlungen bezüglich des angewandten Reaktors (z.B. für ansatzweises Arbeiten oder Kolbenströmungsreaktoren) und das Rühren, soweit erforderlich, angegeben. Eine Reihe von Additiven kann für unterschiedliche Ausgangsmaterialien angegeben werden wie durch c,j, C£ ... c in Fließschema 3 angegeben.
Auch die Trennverfahren können mit unterschiedlichen
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Wirkungen durchgeführt werden. Bei vielen Verfahren wird die Abtrennung weggelassen oder erleichtert, z.B. wenn das Ausgangsmaterial vollständig flüssig (verflüssigt) ist. Unterschiedliche Trennvorrichtungen können angewandt werden (z.B. Zentrifugen, Filter, Ultrafiltrationsvorrichtungen, Hydrozyklon«, Eindicker, Siebe oder einfache Dekantiervorrichtungen).
Die Trennungswirkung ist definiert als das Verhältnis zwischen dem absoluten Feststoff (sludge)-Gehalt in der festenPhase und dem absoluten Feststoff (sludge)-Gehalt des Reaktionsgemisches.
Die erhaltenen festen oder flüssigen Phasen können weiterbehandelt werden, z.Bo eingeengt, getrocknet, mit Lösungsmittel extrahiert, um bestimmte Komponenten wie Fett odor Öl zu entfernen, fermentiert zur BiItdung von Biomasse, Alkohol oder anderen Produkten (Enzymen, Antibiotika oder anderen wertvollen Bestandteilen).
Die erhaltenen Produkte können auch zur wiederholten Behandlung entsprechend dem Verfahrensschema zurückgeführt werden»
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F Ii eßschema III
Substrat
| 2 | ν. |
| η | 7 Λ |
| 1 | |
| λ | |
SPS-ase
Vorbehandlung
Homogenisierung
Reaktion
Homogenisierung
Trennung
ν
flüssig Horn
= Ό - 100%)
(spezielle Reaktons-Bedingungen)
Sep
.= ' 0 - 100%)
Feststoffe
Weitere Behandlung (siehe Text) oner erneute Verwendung-als Substrat
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Im folgenden sind einige Beispiele für die Anwendung von SPS-ase-Zubereitungen angegeben und eine Übersicht dieser Anwendungen geht aus der folgenden Liste hervor. . · .· . · '. ... .;' :'. . ' ''
Auch in der beiliegenden Tabelle I sind verschiedene Charakteristika zusammen mit dem Fließschema 3 zusammengefaßt.
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Aufstellung von Anwendungsmöglichkeiten von SPS-ase-Zubereitungen
| Art der SPS-ase- Zubereitung | Voll stän dige Ver- flüssi- „ gung oder ähnl. Behand lung | Be- zugs- Nr. | Extraktion von Stärke aus Mais, Weizen und Kartoffeln Extraktion von Lipiden aus pflanz lichen Materialien Extraktion von ätherischen Ölen aus pflanzlichen Materialien Extraktion von natürlichen Farb stoffen aus pflanzlichen Materialien Extraktionen von Kautschuk von dem Guayul-Busch |
| SPS-ase- Zubereitung, die im wesent lichen frei ist von einer öder mehreren stören den Enzymaktivi täten | Bear- bei- tungs- hil- f en | A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 | Herstellung eines Milchersatz-Stof fes für Haustiere Herstellung von verzuckerte Stärke enthaltenden Rohmaterialien Vollständige Verflüssigung von Bir nen und anderen Früchten Herstellung von Saft durch Behand lung von Früchten und Gemüsen Behandlung im Zusammenhang mit der Extraktion oder dem Pressen von Zuckerrohr oder Zuckerrüben Herstellung von Sojamilch Behandlung zur Erhöhung der gewinn baren Menge an löslichen Kaffee bestandteilen |
| nicht modi- fi- zier- te SPS- ase- Zu- be- | Ba 1 Ba 2 Ba 3 Ba 4 Ba 5 Ba 6 Ba 7 | Verhinderung und/oder Abbau von"Schlei- ern" in Apfelsaft Verwendung zur Klärung von Weißwein Herstellung von ISSPH oder anderen pflanzlichen Protein-Hydrolysaten Maische-Enzym in der Brauerei Enzym-Zusatz bei der Bierfermentation und/oder Lagerung Mittel zur Entfernung der Mandel- häutchen | |
| rei- tun- gen | Bb 1 Bb 2 Bb 3 Bb 4 Bb 5 Bb 6 | ||
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| Art der | Andere | Be- | Abbau von unterschiedlichen Abfall |
| SPS-ase- | Anwen | zugs- | produkten |
| Zubereitung | dungs- arten | Nr. | Verzuckerung und gleichzeitige Fer mentation |
| Bc 1 | Abbau'von Cellulose | ||
| Verwendung als Backhilfe | |||
| nicht modi- f i- | Bc 2 | Verbesserung der Alkoholausbeute und | |
| zier- | Bc 3 | Ausbeute an Biomasse bei der Fer | |
| te SPS- | Bc 4 | mentation von Sulfitlauge von | |
| ase- | Bc 5 | der Papierherstellung | |
| Zu- | Entwässerung von biologischen Schlämmen | ||
| be- | Silage-Hilfe | ||
| rei- | |||
| tun- qen | Bc 6 | ||
| Bc 7 | |||
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| Sub strat .··. | Zusätze | bi | cl | Tabelle I : | 21 Homo genisie rung »2 Horn* | 0 | Trennung ^Sep% | flüssige Phase | *- | weitere Behandlungen | I ί | Vereinigte Phase (keine Trennung) | |
| ,Lit. | Mais | Wasser | NaOH oder HCl | 1' Homo genisie rung *l Horn* | 10-30 | - | 30-50 | (enthält ' Keime ) ' Waschen, Ölgeuinnupg | Kristal lisation | feste phase | |||
| a i | Mais-r( keime | Wasser so2 | - | NaOH oder . HCl | 20-50 | 0 | - | 100 | - | - | Wasch- / Vorgang | ; - | |
| A I | Sojamehl (entfet tet) ' | - | - | HCl | 0 | - | 0 | Pasteurisierung Konzentrierung Sprühtrocknung | |||||
| Ba 1 | süße Kartof feln | Wasser | Terma- myl | NaOH oder HCl | 0 | 0 | ; - | Hefe für Alkohol- Fermentation, Destillation | |||||
| Ba 2 | Zucker rüben < | Wasser | — | NaOH oder HCl | - | 100 | - | ||||||
| Ba 5 | Soja quark od. Sojanüh- rück- | W asser | - | HCl | 10% | 0 | He f e f üi- : Alkohol- Fermentation,; Destillation | ||||||
| Bc 1 | Wasser | 10% |
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A 1. Extraktion von Stärke aus Mais, Weizen und Kartoffeln.
Die Extraktion von Stärke aus Mais, Weizen, Kartoffeln und anderen stärkehaltigen Pflanzen wird in einer 5 oder mehreren Stufen durchgeführt: Einweichen, Naß-Mahlen und Trennen. Die Anwendung einer SPS-ase-Zubereitung mit im wesentlichen keiner amylolytischen Aktivität führt zu den folgenden Vorteilen, wobei Mais als Beispiel angewandt wird:
1. Die Stärkefreisetzung wird innerhalb einer kürzeren Einweichzeit erleichtert,
2. Der Wasserverbrauch kann verringert werden,
3» Die Freisetzung von Maiskeimen wird erleichtert ohne Freisetzung von Maiskeimöl,
4. Das Protein kann in höherer Reinheit erhalten werden,
5. Die Gewinnung von Maiswasser wird erleichtert. A 2. Extraktion von Lipiden aus Pflanzenmaterial,
Da die Lipide in pflanzlichen Materialien innerhalb der Zellen eingeschlossen und üblicherweise an Proteine gebunden sind, können Lipide in wässriger Phase durch Behandlung mit einer SPS-ase-Zubereitung extrahiert werden, die im wesentlichen frei ist von Lipasen. So wird Maiskeimöl üblicherweise isoliert durch Extraktion der getrockneten Maiskeime mit Hexan. Der Trockenvorgang ist jedoch überflüssig, wenn die nassen Maiskeime mit einer SPS-ase-Zube-
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reitung der oben angegebenen Art behandelt werden. Ähn lich kann die Extraktion von Olivenöl in wässriger Phase verbessert werden, wenn das für die enzymatische Behandlung angewandte Enzym eine SPS-ase-Zubereitung der 5 oben angegebenen Art ist, siehe z.B. Food, Pharmaceutical and Bioengineering, Nr. 172, Bd. 74, S. 93-94. Auch die wässrige Extraktion von z.B. Sojaöl, Rapsöl und Sonnenblumenöl kann auf ähnliche Weise verbessert werden.
10 A 3. Extraktion von ätherischen ölen aus pflanzlichen Materialien.
Wenn pflanzliche Materialien, die ätherische Öle enthalten, mit einer wässrigen Lösung einer SPS-ase-Zube- reitung behandelt werden, die* im wesentlichen frei ist von Enzymaktivität, die imstande ist, die ätherischen Öle abzubauen oder auf andere Weise zu verändern, werden die ätherischen Öle in hohen Ausbeuten zu sehr geringen Kosten extrahiert.
A4. Extraktion von natürlichen Farbstoffen aus pflanzlichem Material.
ν Wenn pflanzliche Materialien, enthaltend Farbstoffe
z.B. rote Rüben, die den roten Farbstoff Betanin enthalten oder der Farbstoff in Preiselbeeren mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, die im wesent-
25 liehen frei ist von Enzymaktivitäten, die imstande sind, die Farbstoffe abzubauen oder auf andere Weise zu verändern, werden die Farbstoffe in hohen Ausbeuten zu niedrigen Kosten gewonnen.
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A 5· Extraktion von Gummi aus dem Guayul-Busch
Ein anderes Beispiel für ein Substrat für eine SPS->ase-Zubereitung, die im wesentlichen frei ist von Enzymaktivität, die imstande ist, Rohgummi abzubauen, ist das Zellwandmaterial von Wurzeln und Zweigen des Guayul-Busches·
Ba 1· Herstellung eines Milchaustauschstoffes für Haustiere, vorzugsweise Austauschstoffe für Kälbermilch
Durch vollständige Verflüssigung von Sojabohnen, Sonnenblumensamen, Baumwollsamen, Pababohnen oder Pelderbsen kann ein Kälbermilch-Austauschstoff hergestellt werden, der in kaltem Wasser bei einem pH-Wert von etwa 4,5 löslich ist* Bei Verwendung von stärkehaltigen Rohmaterialien wie Pababohnen oder Pelderbsen muß eine Stärkeverflüssigung mit Hilfe einer «C-Amylose vor, nach oder gleichzeitig mit einer Behandlung mit einer SPS-ase durchgeführt werden, die schließlich die Wicht stärke-Polysaccharide in dem Strukturmaterial der Zellwände verflüssigt· Ein detailliertes Beispiel unter Verwendung von Pababohnen ist unten angegeben, und bezüglich der Sojabohnen wird auf Tabelle I verwiesen· Die Vorbehandlung der Sojabohnen kann vorzugsweise ein Dampfstrahlkochen sein, das das Löslichmachen des Rückstandes verbessert·
15 kg Pababohnenmehl wurden in 35 1
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Wasser suspendiert. 75 g Termamyl 60 L und 18 g CaCl2 wurden zugegeben. Die Suspension wurde unter Rühren in einem Dampfmantelkessel auf 95°C erwärmt. Die , Suspension wurde dann 60 min bei dieser Temperatur behandelt. Anschließend wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt und das Produkt auf 500C gekühlt,, 300 g der SPS-ase--Zubereitung KRF 68 wurden in 1 1 Wasser gelöst und zugegeben. Die Reaktion wurde 440 min lang durchgeführt. Wenn 10 g Fungamyl 800 L mit zugesetzt wurden, wurde die Stärkefraktion im wesentlichen in Disaccharid (Maltose) umgewandelte Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 2 min bei 900C pasteurisiert. Ein Anteil des Produktes wurde dann gefriergetrocknet und für Stabilitätsuntersüchungen verwendet. Die Probe wurde dann in einer Menge von 10 %Feststoff (Trockensubstanz) gelöst und die Lösung des Produktes blieb tagelang ohne Sedimentation stabil.
Geschmolzenes Fett oder öl kann leicht in dem Produkt emulgiert werden, wobei ein Endprodukt erhalten werden kann, das Kuhmilch sehr ähnlich ist. Eine Emulsion, enthaltend 3»5 g öl (Sojabohnenöl) konnte auch tagelang ohne Sedimentation stabil gehalten werden.
Sojamehl (Sojamel 13) wurde 25 s , wie in Beispiel 8 beschrieben, bei 15O0C mit einem Dampfstrahl behandelt. Das so behandelte Sojamehl wurde sprühgetrocknet und für weitere Untersuchungen/wie im Folgenden beschrieben, angewandt.
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A :
50 g des mit Wasserdampf behandelten Sojamehls wurden mit 450 g Wasser vermischt und der pH-Wert mit 4,1 ml 6n HCl auf 4,5 eingestellt. Das Gemisch wurde dann im Wasserbad auf 450C erwärmt und 0,250 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 zu dem erwärmten Gemisch zugegeben, das dann 5 h unter Rühren reagierte. Anschließend wurde das Gemisch 2 min auf 800C erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren. Eine 100 ml Probe wurde bei Raumtemperatür 15 min mit 3000 χ g zentrifugierte Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einem Ionenaustauscher behandelt und auch die Kohlenhydratzusammensetzung durch HPLC analysiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde auch auf den Stickstoffgehalt nach Kjeldahl analysiert und der Feststoffgehalt und der Stickstofflöslichkeitsindex (NSI) und der Feststofflöslichkeitsindex (DSI) berechnet, siehe Ergebnisse in Tabelle Ba I. 100 ml des Reaktionsgemisches, das auf 200C gekühlt worden war, wurden in ein kalibriertes 100 ml Glas gegeben und 2 Tage bei 4°C gehalten. Die Dispersionsstabilität (%) wurde gemessen durch Ablesen des Volumens der erhaltenen Dispersionen (Tabelle Ba II) nach 1 und 2 Tagen.
Zu 200 ml des Reaktionsgemisches (bei 200C) wurden 8 g Sojabohnenöl gegeben. Es wurde eine Emulsion hergestellt durch 2 min langes Vermischen in einem Waring Blender. Die Emulsionsstabilität {%) wurde, wie oben, nach 1 und 2 Tagen gemessen.
Es wurde eine Reaktion wie oben durchgeführt, in diesem Falle wurden jedoch 1,00 g der SPS-ase-Zubereitung
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angewandt. Es wurden die gleichen Arten von Analysen und Stabilitätsmessungen, wie in Absatz A beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabellen Ba I und Ba II angegeben.
Aus der chemischen Analyse der überstehenden Flüssigkeiten geht hervor, daß die Werte für NSI {%) und DSI (%) bei dem Versuch B höher sind als bei dem Versuch A. Die Stabilitätstests, die an den Reäktionsgemischen durchgeführt wurden, zeigen jedoch einen besseren Wert für die Proben A. Dies liegt möglicherweise an der größeren Länge der Peptidkette der Proteine in dem Reaktionsgemisch bei geringerer Enzymmenge.
Aus der durch HPLC gemessenen Kohlenhydratzusammensetzung geht hervor, daß hauptsächlich Mono- und Disaccharide gebildet worden sind. So sind Oligosaccharidef von denen bekannt ist, daß sie für Diarrhöe und Flatulenz verantwortlich sind, wenn sie Kälbern in zu großen Mengen verabreicht werden, nur in geringen Mengen vorhanden.
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Tabelle Ba I Chemische Eigenschaften der überstehenden Flüssigkeit
| Ver^ suche | Verhältnis von Enzymmenge zu Substrat % (Gsw./Gew. ) | N.SI, % '* (bei pH = .·· 4,5). | DSI, % ** (bei pH =' 4,5) | HPLC-Ergebnisse (Zusammensetzung der neutralen Zucker) |
| A | E/S = 0r5% | .39j 9 | 62,4 | DP1 + DP0 : 79,7% DP* z : 714% DP^ : 12,2% DP^+ : 871% |
| B | E/S = 2;0% | 57.0 | 67.1 | DP1 + DP9 : 84,4% DP^ ^ : 6 1% DP^ : 3 7% DP4+ : 5)7% |
* NSI = Stickstofflöslichkeits-Index ** DSI = Feststofflöslichkeits-Index
Tabelle Ba II Stabilitäts-Tests der Reaktionsmischungen
| Ver suche | Verhältnis von Enzym menge zu Substrat % (Gew./Gew.) | Stabilität-Tests | Dispersion 2. Tag | • mit Öl | Emulsion 2. Tag |
| A | E/S = 0,5% | ohne 01.. | 63% | Emulsion 1. Tag | 87% |
| B | E/S = 2;0% | Dispersion 1. Tag | 35% | 100% | 71% |
| 80% | 85% | ||||
| 66% |
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Ba 2· Herstellung von verzuckerte Stärke enthaltenden Rohmaterialien
Im Zusammenhang mit der Verzuckerung von Cassava und süßen Kartoffeln und anderen stärkehaltigen pflanzlichen Materialien führt die Zugabe einer SPS-ase-Zubereitung zur lösung von Viskositätsproblemen· Bei Verwendung einer SPS-ase-Zubereitung ist es möglich, Stärkesuspensionen mit einem Peststoffgehalt von 25 bis 30 % herzustellen, und nach der Verzuckerung kann die Maische fermentiert werden, wodurch ein billiges Ethanol erhalten werden kann·
B e is ρ ie 1 Ba 2*1
Auf der Basis von frischen und gerösteten süßen Kartoffeln (japanischen) wurde eine Maische mit einem Peststoffgehalt von 24 % hergestellt* Der Stärkegehalt der süßen Kartoffeln betrug ungefähr 70 % des Peststoffgehaltes. Eine Vorverflüssigung mit Hilfe der bakteriellen Amylase von Termamyl ^ 60 L in einer Dosis von 0,5 kg/t Stärke wurde durchgeführt durch Erhitzen der Maische auf 90 0C. Die Maische wurde dann 30 min bei 90 0C gehalten· Die Viskosität \^ des Reaktionsgemisches wurde dann mit Hilfe einer Haake-Spindel bei 90 0C gemessen·
Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 55 0C gekühlt und der pH-Wert mit 2n HpSO- auf 5»0 eingestellt· Dann wurde eine Verzuckerung eingeleitet durch Zugabe der Glucoamylase SAN 150 (Handelsname) in einer Dosis von 1,75 l/t Stärke· Das Verzuckerungsgemisch wurde dann in drei Teile A, B und C aufgeteilt, die 15 min, wie unten angegeben, mit Enzym behandelt wurden, bevor die Viskosität gemessen wurde«
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A: Dieser Teil diente zum Vergleich. Die Viskosität '.'Ti ρ wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III.
B: Die Tricoderma viride-Cellulase von Celluclast ^> 200 N wurde in einer Dosis von 1 kg/t Feststoffe von süßen Kartoffeln zugegeben. Die Viskosität <ΎΙ -ζ wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III.
C: Die SPS-ase-Zubereitung KRF 68 wurde in einer Menge von 0,25kg/t Feststoffe der süßen Kartoffeln zugegebene Die Viskosität Ί\^ wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III.
| Reaktions- | Viskosität | Viskosität | 55°C | mPa. s |
| Gemisch | bei 900C | bei. | 2190 | mPa. s |
| vorverflüssigte süße' Kartoffeln | 1^1 = 770 mPa.s | 2190 | mPa. s | |
| '.. V A | - | 1970 | mPa. s | |
| B | - | 73 = | 950 | |
| C | — |
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die Viskosität des Reaktionsgemisches wesentlich verringert werden kann durch die SPS-ase in einer geringen Menge, verglichen mit dem Celluclast^und SAN 150.
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Ba 3β Gesamtverflüssigung von Birnen und anderen Früch- · ν . '/. ten. ·. \ . ' . '.'
Wenn ganze Birnen, die mechanisch zerstoßen worden sind, anschließend mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, findet eine vollständige Verflüssigung statt und nach Entfernung von kleineren Mengen Feststoffen wird ein klarer Birnensaft erhalten. Ein ähnliches Verfahren kann auf andere ähnliche Früchte, z.B0 Äpfel, angewandt werden.
10 Be i s piVl Ba 3.1
Frische Äpfel wurden mit Hilfe einer Bucher-Zentralmühle grob gemahlen. Die Apfelmaische wurde dann in einem Kessel mit Heizmantel 5 min bei 900C pasteurisiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die vermaischten Äpfel wurden dann auf einer Fryma-Mühle mit Korundstein gemahlen, bis die Maische glatt war. Die Maische wurde
ο o
dann erneut 10 min bei 80 C pasteurisiert und auf 50 C
gekühlt. '
Jetzt wurden Enzymreaktionen 30 min bei 500C mit einem Contraves-Rheomat 15 durchgeführt, wobei Rühren und , Viskositätsmessungen (im Zusammenhang mit einer prozentualen Abie sung auf dem Rheometer bei Geschwindigkeit 13) gleichzeitig durchgeführt wurden. Nach vollständiger Enzym-Reaktion wurden 100 g Proben abgezogen und in einem kalibrierten Rohr 15 min bei 3000 χ g zentrifugiert. Hierbei wurde der Prozentsatz an Saft und der Prozentsatz an Abscheidungen bzw. Feststoffen gemessen. Der pH-Wert und der Prozentsatz an Refraktometer-Feststoffen als °Brix wurden ebenfalls gemessen. Tabelle Ba IV zeigt einen Vergleich zwischen der Wirkung von SPS-ase,der Kombination von Celluclast und SPS-ase und der Kombina-
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tion von Celluclast und Pectinex. Die SPS-ase-^Zubereitung KRF 68 wurde angewandt.
Tabelle Ba I'V Ergebnisse der Gesamt-Verflüssigungsversuche mit Apfel-Maische bei 500C, 30 min
| SPS-ase g/hl Mai sche | Celluclast^ 200 1 g/hl Maische | Pectinex^-'3x g/hl | End- Viskosität (*) | Zentrifugation | % Fest- ·. stoffe | Saft | Brix |
| 0 25 50 50 0 0 | 0 0 ο 50 50 50 | 0 0 ο ο 200 2000 | 100 · 19 15 4.8 3.8 9-5 4.0 | % Saft | 41 19 21 .17 17 17 18 | pH | >17, 10^5 ;.ioV7 10 8 12f5 12^ |
| 59 81 79 83 83 83 82 | 3,8 3J5 3J5 3J5 V 3)2 3J1 |
Ba 4. Herstellung von Saft durch Behandlung von Früchten und Gemüsen.
Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen gut geeignet sind zur Herstellung von Saft durch Behandlung
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von verschiedenen Früchten, Beeren und Gemüsen, z.B.
Johannisbeeren Karotten, Erbsen, Tomaten, Äpfeln, Birnen, Schwarze ν Bohnen und Kohl. Hierbei wird eine bessere Ausbeute an Saft sowie eine bessere Extraktion von Färb- und Geschmacksstoffen erreicht, verglichen mit der handelsüblichen Pectinase-undCellulase-- Zubereitung.
Es wird auf Beispiel Ba 3<>1 verwiesen, bei dem die SPS-ase-Zubereitung verglichen worden ist mit den im Handel erhältlichen üblichen Cellulase-und Pectinaseprodukten Celluclast ^200 L und Pectinex ® 3x. Aus der Tabelle geht hervor, daß die Ausbeute an Saft leicht verbessert werden kann, wenn so wenig wie 50 g/hl SPS-ase verwendet werden, verglichen mit 2000 g/hl Pectinex ^, beide
zusammen mit 50 g/hl Celluclast ^H Auch war die Viskosität etwas geringer. So scheint es, daß die SPS-ase ungefähr 40 mal wirksamer ist als Pectinex.
Ba 5. Behandlung im Zusammenhang mit der Extraktion oder dem Pressen von Zuckerrohr oder Zuckerrüben.
Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist, die Ausbeute im Zusammenhang mit einfachen Extraktionsverfahren zu verbessern, wenn die SPS-ase-Zubereitung angewandt wird zur Behandlung von Zuckerrohr oder Zuckerrüben vor und/oder während der Extraktion oder dem Pressen.
Auch kann der Rückstand (Bagasse) mit der SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, wodurch er teilweise in fermentierbare Zucker umgewandelt wird, die als Ausgangsmaterial zur Ethanolfermentation verwendet werden können.
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10 kg Rückstand von Zuckerrüben (Pulpe), der erhalten worden war durch kontinuierliche Gegenstromextraktion in einem DDS-Diffuser bei Nakskov Sugar Factory, wurden zweimal in einer Fryma-Mühle (Typ MZ-110) vermählen. Während des MahlVorganges wurde Prozeßwasser zugegeben.
300 g Anteile der Pulpe wurden jetzt 18h bei 45°C mit Enzym behandelt unter Verwendung der in Tabelle Ba V angegebenen Mengen. Das trockene Enzymprodukt (KRF 68) wurde zu der Pulpe zugegeben, die während der ersten Stunde mit einem Stab gerührt wurde. Daraufhin war die Pulpe so weit verflüssigt, daß die restliche Zeit erfolgreich magnetisch gerührt werden konnte. Am Ende der Reaktion wurde der pH-Wert gemessen (während des Beginns der Reaktion wurde keine pH-Korrektur vorgenommen) und das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, bis eine klare überstehende Flüssigkeit erhalten wurde. Die Bestimmung des Feststoffgehalts wurde an Reaktionsgemischen und an den überstehenden Flüssigkeiten vorgenommen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde der Prozentsatz an gelösten Feststoffen berechnet. Korrekturen für den Gehalt an löslichen Feststoffen des Enzymproduktes wurden bei allen Berechnungen vorgenommen·
Die überstehenden Flüssigkeiten 2, 3 und 4 wurden durch Ionenaustauscher behandelt und durch HPCL auf die Kohlenhydratzusammensetzung untersucht.
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Tabelle Ba V Ergebnisse bei der enzymatischen Verflüssigung von Rüben-Pulpe
| Ver such Nr. | Verhältnis der Enzym- menge zu. Feststoffen E/s' % | End-Messungen . | % Fest- ' stoffe | überstehende Flüssigkeit | % gelöste Feststoffe |
| . 1 | 0 | Reaktionsmischung | 4 518 | % Fest stoffe' | 0,0 |
| 2 | 0,35 | pH (Endwert) | 3,85 | 0^0 | 66;9 |
| 3 | 0y56 | 3,81 | 2 j 58 | 66;2 | |
| 4 | -.1^02 | 3,6 | 3.86 | 2,56 | 70,4 |
| 5 | I1 58 | : 3J5 | 3I17 | 2;73 | .. 73)4 |
| 6 | 3 y 10.' | ν | ,' 3I23 | 2,34 | 76;4 |
| "7 / . | -7y52 : | . 3I3 | . 2,6 6 | 2,49 | 80,5 |
| "- . :" '... ' 3I4 | 2,18 ' | ||||
| :' 3T4.- ' |
Reaktionsbedingungen: M =3 00 g
S =.4.18% Feststoffe E/S wie oben angegeben pH nicht eingestellt T = 450C t = 18
246 17
Tabelle Ba VI HPLC-Werte
| Zucker-Art (Neutral) | Versuch Nr. | 3 | 4 | 43,6 | 23,7 | 25,3 | nicht gemessen |
| . Hochmolekular (DP4+) ; , | 2 | % neutrale Zucker ; | 4,6 | - | |||
| Disaccharide | 20,4 | 32I2 ." | 27^8 | ||||
| Glucose · | : 5I0 | 7J3 | |||||
| Galactose | ,' 26I4- | 33,2 | |||||
| Fructose/Arabinοse | |||||||
| Galacturonsäure |
Alle entsprechend der obigen Tabelle Ba VI entstandenen Zucker konnten zu Alkohol fermentiert oder für andere Zwecke verwendet werden.
- 95 -
2Λ6 17 5 2
95 -
Ba 6. Herstellung von Sojamilch»
Sojamilch kann leicht durch vollständige Verflüssigung von gemahlenen Sojabohnen und anschließende Homogenisierung des erhaltenen Gemisches hergestellt werden. Sojamilch wird häufig hergestellt durch Einweichen von Sojabohnen in siedendes Wasser, Mahlen der eingeweichten Bohnen und Extraktion mit Wasser und anschließende Trennung des unlöslichen Rückstandes, z.B. von Proteinen und Polysacchariden. Um die Ausbeute an Sojamilch zu verbessern, können diese unlöslichen Rückstände durch Umsetzung mit der SPS-ase verflüssigt werden.
B e i s pi e 1 Ba 6.1
Das Sojamilchverfahren wird durch die folgende Reihe von Enzymreaktionen erläutert, wobei Berechnungen des Protein-Löslichkeitsindex (PSI, %) und des Feststoff--Löslichkeitsindex (DSI, %), die nach Abtrennung bei pH 7 erhaltenen Ausbeuten zeigen (siehe Tabelle Ba VII). Die Enzymreaktionen wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Substrat:
Menge des Reaktionsgemisches:
Menge des Substrats:
Temperatur:
pH: Reaktionszeit:
Reaktionszeit:
Enzym:
Enzymmenge:
Vollfettes Sojamehl (Dansk Sojakagefabrik A/S) 220 g 20 g 50°C
4,5 (6n HCl) Reihe A 1 h Reihe B 0,5 -6h SPS-ase (KRF 68) Reihe A: E/S-Verhältnis (Gew./Gew.) 0 - 8,0 Reihe B: E/S-Verhältnis (Gew./Gew.) 1,0
- 96 -
24617 5 2
-96 -
Nach der Reaktion wurde der pH-Wert mit Hilfe von 4n NaOH auf 7 eingestellt und die Trennung durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3000 χ g durchgeführt.
Ba 7. Behandlung zur Erhöhung der zurückgewinnbaren Menge an löslichen Kaffeebestandteilen.
Es hat sich gezeigt, daß die Behandlung von Kaffeebohnen bei unterschiedlichen Stufen während der Herstellung von Instantkaffee zu einer erhöhten Ausbeute an löslichen Kaffeebestandteilen führt. So können z.B. verbrauchte Kaffeerückstände (Kaffeesatz) oder grüne Bohnen enzymatisch mit günstigen Ergebnissen behandelt werden.
-97 -
Tabelle Ba VII Berechnung · der Mengen-Bilanz im Zusammenhang mit dem enzymatischen
Sojamilch-Verfahren. - : ' '
| Reihen | Reaktions zeit h | Enzym - menge E/S % | Reaktionsmischung | % Fest stoffe | überstehende Flüssigkeit | % Feststoffe | Löslichkeits-Indices | DSI % |
| Λ | 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 | 0 0,5 1,0 2;0 4,0 8,0. | % Protein | 8,70 8,74 8,78 8,86 9 j 03 . 9,37 | % Protein | 5,72 6,28 6,43 7 j 18 7,69 8,08 | PSI % | 63,7 70,0 71,4 79,5 8379 85.0 |
| B | 0,5 1,0 2,0 4,0 6 y 0 | l;0 1,0 1T0-.- 1,0 1,0 | 3,65 3,68 3,71 3,78 3^92 4,19 | 8.78 8,78 8,78 8,78 8,78 | 1,87 2,41 2,48 2,98 3,36 3,76 | 6,41 6,60 6 1 91 7,29 7,69 | 49,6 63,7 65,1 I 77,5 . .84.j6 88,5 | 71,1 73 T 4 77,1 81,7 86,5 |
| 3,64 3?64 3,63 3,63 3,63 | 2,39 2,56 2,79 3.10 3,39 | 64,0 68,7 75,2 84.0 92 ; 3 |
246 17 5 2
- 98 -
Bb 1. Verhinderung und/oder Abbau des "Schleiers" in Apfeloder Birnensaft.
Nach der Herstellung von Apfelsaft oder Birnensaft und anderen Fruchtsäften, die klar sein sollen und die vorher mit üblichen Pectinase- und Cellulasezubereitungen behandelt worden sind, um die Bildung einer Trübung zu vermeiden, können 'kehleier"auftreten. Es hat sich gezeigt, daß die SPS-ase-Zubereitungen gut geeignet sind zum Abbau derartiger Schleier, die hauptsächlich aus Araban, das an Proteine gebunden ist, bestehen.
Birnensaftkönzentrat, das hergestellt worden war durch enzymatische Verflüssigung von Rückständen von der Herstellung von Birnenkonserven unter Verwendung von Celluclast^und Pectinex ^H wurden beim Stehen wolkig. Der "Schleier" wurde isoliert und mit 0,01 η H2SO^ 24 h hydrolysiert und durch HPLC analysiert. Das Chromatogramm zeigte Arabinose und kleine Mengen an Oligosacchariden.
Durch Inkubation von 0,5 % (Gew./Vol.) dieses Kohlenhydrats in 1 mMol Acetatpuffer, 3 h bei pH 4,5 und 400C mit SPS-ase (KRF 68 und KRF 92 1 : 1) mit einer Enzymkonzentration von 0,05 % (Gew./Vol.) zeigte es sich, daß 84 % der ursprünglichen schleierbildenden Kohlenhydrate (Feststoffe) in Arabinose umgewandelt wurden.
Auch ein verdünntes Birnenkonzentrat (20° Brix) wurde 2 h bei 400C mit einer Enzymmenge von 0,15 % (Gew./ Vol.) der oben erwähnten SPS-ase oder mit 1 % (Gew./ Vol.) eines Handelsproduktes, das als Clarex^be-
246175 1
- 99 -
zeichnet wird, behandelt. Es zeigte sich, daß die SPS- ; relativen
ase imstande war, deriVHPLC-Spitzenbereich eines arabanartigen Schleiers um 86 % zu verringernwährend die entsprechende Verringerung mit Clarex^ (in einer wesentlich höheren Menge als die SPS-ase-Zubereitung) nur 78 % betrug.
Bb 2. Anwendung als Klärmittel für Weißwein«
Es hat sich gezeigt, daß Weißweine, die eine sehr unerwünschte Trübung zeigen, wirksam mit Hilfe von SPS-ase geklärt werden können. Es hat sich gezeigt, daß das Trübung bildende Material hauptsächlich aus Arabinogalactanen besteht, die an Hydroxyprolinreste in einem Zellwand-Strukturprotein gebunden sind.
Bb 3. Herstellung von ISSPH oder anderen pflanzlichen Proteinhydrolysaten.
Vor der Abtrennung des ISSPH (isoelektrisch löslichen Sojaproteinhydrolysats) oder anderer pflanzlicher Proteinhydrolysate aus der Aufschlämmung, wie in der US-PS 4 100 024 oder in Process Biochemistry, Bd. 14, Nr. 7 (1979), S. 6 - 8 und 10-11 beschrieben, kann das Reaktionsgemisch mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden. Hierdurch wird eine leichtere Trennung erzielt.
Bb 4. Maische-Enzym für die Brauereiindustrie.
Bei der Herstellung von Bier beeinflussen Kohlenhydrate der Ausgangsmaterialien z.B. der ß-Glucane von Malz und Gerste die Viskosität und Filtrierbarkeit des Extrakts. Die Zugabe von SPS-ase während des Maischens verringert die Viskosität des Extrakts und verbessert
- 100 -
246 17 5 2
- 100 -
die Filtrierbarkeit und die Ausbeute an Extrakt. Darüberhinaus führt die Zugabe von SPS-ase während des Maischvorganges zu einer Verbesserung der Fermentierbarkeit des Extrakts und des Stickstoffgehalts in dem Extrakt.
B e i s ρ i e 1 Bb 4.1
Im Labor wurden 50 g gemahlene Körner , bestehend aus 50 % Malz und 50 % Gerste mit 275 g Wasser (15 % Feststoffgehalt) nach dem folgenden Maischdiagramm vermaischt: 52°C (60min)/63°C (60 min)/76°C (30 min).
Um die Wirkung der SPS-ase zu zeigen, wurden vier Versuche durchgeführt, siehe die im folgenden angegebene Tabelle, wobei die Enzyme während des Maischvorgangs zügegeben wurden (pH der Maische 5,5 bis 6,0).
| Enzym | keines | CerefIp | SPS-ase (KRF 68) | 1630 FBG | 1630 FBG |
| Aktivität der ß-Gluca- nase/g | 0 . | 200 BGU | OjOS g | 0,18 g | |
| Menge an Enzym per kg Körner | .0 | 1,5 g | 80 FBG | 300 FBG | |
| Gesamtmenge der Enzym-Aktivitäts einheiten per kg Körner . | 0 . | 300 BGU | 160 ml | 170 ml | |
| Filtrationsge schwindigkeit des Extrakts nach 10 min | 120 ml | 135 ml | 1.3 6 raPa.s | 1.30 mPa.s | |
| Viskosität des ExtraktsiO0 Bal ling (25° C) | 1,52 ' mPa.s | 1.36 mPa. s |
- 101 -
246175 2
- 101 -
BGU = ß-Glucanase-Einheiten, bestimmt nach der analytischen Methode AF 70/4-GB
FBG'..= Pilz-ß-Glucanase-Einheiten, bestimmt nach der analytischen Methode AF 70.1/2-GB
Der einzige Unterschied zwischen BGU und FBG ist der pH-Wert, bei dem die Enzymbestimmung durchgeführt wurde: pH 7,5 für BGU und pH 5,0 für FBG.
Cereflo ist eine bakterielle ß -Glucanasezubereitung, wie sie beschrieben ist in dem Informationsblatt B 214b-GB 1500 Juli 1981,
B e i sp i e 1 Bb 4.2
Im Labor wurden 50 g gemahlene Körner ,bestehend aus 40 % Malz und 60 % Gerste mit 150 g Wasser (25 % Feststoffgehalt) entsprechend dem folgenden Schema vermaischt; 45°C (60 min-)/630C (90 min)/750C (15 min).
Um die Wirkung der SPS-ase nachzuweisen, wurden drei Versuche durchgeführt, siehe die im folgenden angegebene Tabelle, wobei die Enzyme während des Vermaischens zugegeben wurden (pH-Wert der Maische 5,5 bis 6,0).
- 102 -
2*6 175 2
- 102 -
| Enzym | keines | Ceremix | SPS-ase (KRF Ceremix,wie hergehenden zugegeben | 68) + im vor- Versuch |
| Aktivität der ß- Glucanase/g | - ; | 200 BGU | 1630 FBG | |
| Enzymmenge per kg Körner | - | 1,65 g | 0,033 g | |
| Gesamtmenge der En zym- Aktivitäts-Ein heiten per kg Körner. | 0 | 330 BGU | 50 FBG | |
| Filtrationsgeschwin digkeit des Extrakts nach 30 min | 4 8 ml | 98 ml | 111 ml | |
| Extrakt, oBalling | 18,6 | 19,0 | 19, 5 | |
| Viskosität des Extrakts 10° Balling (25° C) | 1.72 . mPa. έ | 1,37 mPa. s | 1;27 |
Die Definition von BGU und FBG ist wie in Beispiel Bb 4»1 angegeben. In der letzten Spalte der obigen Tabelle ist nur die Menge und Aktivität von SPS-ase angegeben.
Ceremix ist eine bakterielle ß -Glucanasezubereitung, wie sie beschrieben ist in dem Informationsblatt B 216 b-GB 1000 Feb. 1982 erhältlich von NOVO Industri A/S.
Bb 5. Enzymatischer Zusatz zur Anwendung während der Bierfermentation und/oder Lagerung.
SPS-ase kann während der Fermentation von Extrakt oder während der Lagerung von Bier zugesetzt werden, um den Gehalt an ß -Glucanen zu verringern und dadurch die Filtrierbarkeit und Stabilität gegenüber einer Schleier-
- 103 -
ι / j
bildung von Bier zu verbessern. SPS-ase zeigt auch eine Wirkung auf Proteine, die für die beim Kühlen auftretende Trübung verantwortlich sind. ,
Bb 6. Mittel zur leichteren Entfernung von Mandelhäutchen.
Während der mechanischen Entfernung von Mandelhäutchen nach dem Blanchieren von Mandeln, wird ein bestimmter Anteil von Mandelhäutchen nicht entfernt. Es hat sich gezeigt, daß eine Enzymbehandlung der Mandeln zu einer Verringerung des erwähnten Prozentsatzes führt.
Bc 1. Zersetzung unterschiedlicher Abfallprodukte.
Im Zusammenhang mit bestimmten Herstellungsverfahren werden große Mengen kohlenhydrathaitiger Abfallprodukte gebildet. Z.B. ist dies der Fall im Zusammenhang mit der Herstellung von Sojaisolat durch Wasserextraktion und Säureausfällung, Sojamilch und Sojaquark (einer speziellen Art von japanischem Käse). Auch in diesem Zusammenhang kann Abfallpulpe aus z.B. Äpfeln, Birnen oder Zitrusfrüchten erwähnt werden. Es hat sich gezeigt, daß eine SPS-ase-Zubereitung imstande ist, diese kohlenhydrathaltigen Abfallprodukte vollständig zu verflüssigen und fermentierbare Zucker zu bilden, die als Ausgangsmaterial zur Ethanolfermentation verwendet werden können.
25 Beispiel Bc 1.1
Bei der üblichen Herstellung von Sojamilch oder Sojaquark werden Sojabohnen häufig in siedendem Wasser eingeweicht, gemahlen und mit heißem Wasser extrahiert, woraufhin eine Trennung durchgeführt wird. Der Rückstand
- 104 -
246175 2 -.04. 6162612
von dieser Trennung ist das Material, das für diesen Versuch angewandt wird· Die flüssige Phase ist die.'Sojamilch, die weiter zur Herstellung von Sojaquark angewandt werden kann·
10 kg ganze Sojabohnen wurden gleichzeitig mit 70 1 siedendem Wasser in einer Pryma-Mühle Typ MZ 110 vermählen· Die gemahlene Aufschlämmung wurde dann 15 min oberhalb 85 0C gehalten, um die natürlichen Bohnenenzyme zu inaktivieren, die den bekannten Sojabohnenbeigeschmack erzeugen· 5 1 dieser Sojabohnenaufschläininung wurden dann im Labor 15 min mit 3000 χ g zentrifugiert· Die Analyse zeigte, daß der Rückstand 20,45 % bzw. 20,06 % Feststoffe (Doppelbestimmungen, berechnetes Mittel 20,26 %) enthielt· Ss wurde langsam 6n HCl zugegeben und mit einem Spatel in den Rückstand eingearbeitet, bis ein pH-Meter 4,50 zeigte, wenn die Elektrode direkt in die Masse eingetaucht wurde·
In einem 500-ml-Beeher Glas wurden bei 50 0C Enzymreaktionen an 2 χ 200 g der Masse mit zwei verschiedenen Mengen an SPS-ase (KRF 68) durchgeführt, nämlich E/S =0,5 %, bezogen auf die Peststoffe und E/S « 3,0 %, bezogen auf die Feststoffe· Das trockene Enzym wurde zu der Masse zugegeben· Während der ersten 1 bis 2 h wurde mit einem Spatel gerührt, und anschließend war die Menge soweit verflüssigt, daß mit einem Magnetrührer erfolgreich gerührt werden konnte· Die Gesamtreaktionszeit betrug 21 h· Während der Reaktion wurde die Osmolalität mit einem Osmometer gemessen· Die Ergebnisse in !Tabelle Bc I zeigen den Verlauf der Reaktion· Am Ende des Versuchs wurde das Gemisch 15 min bei
617
- 105 -
3000 xg zentrifugiert. An (^Oberfläche der überstehenden Flüssigkeit trat eine Ölschicht auf, deren Volumen bestimmt wurde. Als Bodenschicht trat eine lockere Schlammschicht auf. Die überstehende Flüssigkeit einschließlich des Öls wurde mit einer Pipette entfernt. Das Öl wurde mit der klaren wässrigen Phase durch Homogenisieren zusammengegeben und eine Probe zur Bestimmung des Feststoffgehalts abgezogen. Die in Tabelle Bc I angegebenen Ergebnisse zeigen deutlich, daß dieses Abfallprodukt durch enzymatische Reaktion verflüssigt werden kann und daß rohes öl, wie in Abschnitt A 4 angegeben, erhalten werden kann. Nach Gewinnung des Öls kann der gelöste Rückstand auf verschiedene Weise verwendet werden, z.B. zur Fermentation zu wertvollen Verbindungen oder zum Einengen und Trocknen und anschließende Verwendung als Futtermittel oder Nahrungsmittelprodukt oder nach weiterer Reinigung zur Herstellung wertvoller Produkte.
-106 -
24617 5 2
- 106 -
Tabelle Bc I Bei der Verflüssigung von Sojamilch und Sojaquark erhaltene Ergebnisse.
| Reaktionsbedingungen und Ergebnisse | Versuch A | min | Osmo lalität mOsm | Δ os mola lität mOsm | 20.3 % 18T0% 8-10% 88,6% | Versuch B | Osmo lalität mOsm | Δ Os molali tät mOsra | 20,7% 19,4%. 8 - 10% 93;5% |
| Menge des. Rückstands Menge anSPS-ase (KRF-68) Temperatur. ph .. ; . Reaktion s sit | 200 g Mo g 500C 4^50 21 h | 0 10 40 2?8 1260 | 287 313 3 91 ISl 907 | 0 26 104 m 620 | 200 g 1)20 g 50°C Aj 50 21 h. | 2 82 368 ; 497 601 1145 | 0 86 215 319 863 | ||
| Ergebnisse, gemessen mit dem Osmometer während der Reaktion Δ Osmolalitätist der korrigierte Wert für die Osmolalität der .Mischung bei t = 0 t = 0 | t .;-' min | ||||||||
| Reaktionsmischung Feststoffe überstehende Flüssig keit: Feststoffe überstehende Flüssig keit: Ölgehalt «-Berechnung % Lösliche Feststoffe | o 10 25 45 2?a 1260 |
24617 5 2
- 107 -
Bc 2. Verzuckerung und gleichzeitige Fermentation.
Kohlenhydrathaltige Pflanzenmaterialien, z.B. Knollen, wie Jerusalem-Artischocken, Kartoffeln, süße Kartoffeln, Cassawa oder Pulpe von solchen Knollen, d.h. das nach Entfernung der extrahierten Komponenten verbleibende Material können durch Behandlung mit einer SPS-ase-Zubereitung verzuckert ;und gleichzeitig die erhaltenen fermentierbaren Saccharide zu Ethanol fermentiert wer-' den.' ·.·''·. . ' . ; ; . · .' '.
10 B e i s ρ i el Bc 2.1
Die Herstellung von Ethanol durch Fermentation der abgebauten inulinhaltigen Jerusalem-Artischocken wurde im Labormaßstab durch gleichzeitige Verzuckerung mit SPS-ase und Inulinase und bei vier unterschiedlichen Vorbehandlungen der Jerusalem-Artischocken untersucht.
SPS-ase: Es wurde die SPS-ase-Zubereitung KRF 68 angewandt.
Inulinasei Die Inulinase wurde gebildet durch Fermentation von Asp. ficuum (CBS 55 565). Die Inulinaseaktivität wurde bestimmt, wie auf S.. 99 von Research Disclosure Nr. 21234 (Dezember 1981) S. 456 - 458 angegeben.
Fermentation im Labor: 150 g Anteile der vorbehandelten Maische (später beschrieben) wurden nach Zugabe von 4,5 g Bäckerhefe und 1 ml einer 4 %-igen Lösung von Pluronic als Antischaummittel fermentiert. Die Fermentationskolben waren mit CO0-Fallen,, enthaltend 98 96 Schwefelsäure, versehen und die Fermentation wurde durch Messung des Gewichtsverlustes aufgrund von freigesetztem CO^ verfolgt. Der Kolbeninhalt
- 108 -.
2-4.6 17 5 2 -
108 -
wurde während der bei 30 C durchgeführten Fermentation gerührt. Es wurden für jeden untersuchten Parameter drei Kolben angewandt.
In Tabelle Bc II ist der durch Freisetzung von CO2 auf tretende Gewichtsverlust in Ethanol umgerechnet, angenommen daß 1 Mol freigesetztes CO2 1 Mol C2HcOH, d„h. 1 g CO2 >^ ^l g C2H5OH entspricht.
Vorbehandlung der Artischocken:
Behandlung A: 14,1 kg Artischocken (22,8 % Feststoffgehalt) wurden 20 min bei 1400C und 4 bis
bar gekocht (Henze). Das Gewicht nach dem Kochen betrug 19,0 kg '(-ry 16,9 % Feststoff gehalt). Die Fermentation wurde direkt an der Maische durchgeführt.
Behandlung Bs Gewaschene und in Scheiben geschnittene
Artischocken wurden mit Wasser (1 : 1) vermischt in einem Waring-Mischer. Die
Maische wurde dann 1 4,5 behandelt»
h bei 85C und pH
Behandlung C: Wie B, jedoch ohne Einstellung des pH-Werts.
Behandlung Dj Wie B, aber ohne Wärmebehandlung und ohne pH-Wert-Einstellung«
Ergebnisse:In Tabelle Bc II zeigen die Ergebnisse die Wirkung des Zusatzes von SPS-ase zu der vorbehandelten Maische auf die Ethanolausbeute. Eine deutliche Verbesserung der Ethanolausbeute wurde bei allen vorbehandelten Maischen erzielt, wenn SPS~ase zugesetzt wurde.
_ -IAQ _
246 175 2
- 109 -
Tabelle Bc II Fermentations-Ergebnisse im Zusammenhang mit der gleichzeitigen Fermentation und enzymatischen Verzuckerung von Jerusalem Artischoken,
| Vorbe hand lung | Zugabe von Inulinase zu 1 g Feststoff | SPS-ase E/S % | Verlust anG0 (g) nacn 42 - 44 h Fermenta tion | % entstandenes E thanolim Verhältnis zu Feststoffen |
| A | 1A | 0 0^27 | 7,65 + 0^05 8,07 + 0,08 - | 31,5 33,2 |
| B | 0 0 ·, 4 0 | 4,85 + 0Λ03 5,41 + 0,03 | 29,7 33,1 | |
| C | h5 1T5 !.5 1I5 | 0 0,10 0^20 0,30 0,40 | 5.70 + 0,05 5,97 + 0,01 • 6,13 + 0,06 6,13 + 0,00 6,18+0,05 | 34,8 36,5 · 37T5 37,5 37,8 |
| D | "1I5* 1T5 1,5 1I5 o | 0 0,10 0r20 0,30 0,40 0,40 | 5,77 + 0,02 5,89+0.00 6^04 + O1Il 6,01+0,01 6,02 + 0T03 5748 + 0,02 | 35,3 36,0 36,9 36r7 36.8 33,5 |
246 17 5 2
- 110 -
Bc 3. Abbau von Cellulose.
Es hat sich gezeigt, daß cellulosehaltige Materialien, wie Stroh, z.B. Weizenstroh, Sägespäne, Papier und Lignocellulose in einem größeren Ausmaß mit einer SPS-ase-Zubereitung hydrolysiert werden können als mit üblichen Cellulasen. Das wird durch das folgende Beispiel gezeigt, bei dem ein kristallines Cellulosematerial (AVICEL) mit Hilfe einer üblichen Cellulase Celluclast ^ 200 erzeugt von Trichoderma reesei sowie der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 behandelt worden ist.
Avicel wurde in Wasser suspendiert (20 % Feststoffe), der pH-Wert auf 5 eingestellt und die Temperatur auf 500C gehalten. Nach 24 h langer Reaktion wurde die Aufschlämmung filtriert und der Gehalt an reduzierendem Zucker (mg Glucose/g Avicel) gemessen. Bei Verwendung von Enzymmengen von 5 und 20 % wurden die folgenden Werte für den Cellulosegehalt gefunden:
Tabelle Bc III
| Enzym | E/S % | mg Glucose / g AVICEL |
| Celluclast SPS-ase | 5 5 | 80 200 |
| Celluclast SPS-ase | 20 20 | 100 340 |
- 111 -
24617 5 2
- 111-
Bc 4. Anwendung als Backhilfe.
Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungenausgezeichnet geeignet sind als Backhilfen. So ist es, wenn eine SPS-ase-Zubereitung zu dem trockenen Mehl vor der Herstellung des Teiges zugesetzt wird, möglich, ein Brot mit einer besseren Qualität bezüglich Volumen, Krume und Geschmack zu erhalten. So ist es möglich, ein Brot hoher Qualität aus einem Weizenmehl geringer Qualität herzustellen, wenn eine SPS-ase-Zubereitung als Zusatz verwendet wird.
Bc 5« Verbesserung der Ausbeute an Alkohol und an Biomasse während der Fermentation von Sulphitlauge von der Papierherstellung.
Es hat sich auch gezeigt, daß die Ausbeute an Ethanol verbessert werden kann, wenn Sulphitlauge von der Papierherstellung mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt wird, bevor sie als Kohlenhydratquelle zur Fermentation von Ethanol verwendet wird. Sulphitlauge von der Papierherstellung kann auch angewandt werden zur Herstellung von Biomasse, z.B. Einzelzellprotein durch Fermentation und auch in diesem Falle wird die Ausbeute an Biomasse verbessert, wenn die Sulphitlauge vorher mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt worden ist. Auch können der Abbau aufgrund des Vorhandenseins der SPS-ase-Zubereitung sowie die Fermentation gleichzeitig durchgeführt werden.
Bc 6. Entwässerung von biologischen Schlammprodukten.
Während der üblichen Wasserextraktion von vielen biologischen Materialien aus Pflanzenrohmaterialien entstehen große Volumina an unlöslichem Rückstand^ be-
- 112 -
24 61.7 5 2 -H2-
stehend aus großen Mengen gequollener Polysaccharide . Das ist z.Bo der Fall, wenn Sojamilch, Sojaquark oder Sojaisolat, durch Wasserextraktion von Sojabohnen, entfettetem Sojamehl oder weißen Flocken hergestellt werden. Das strukturell gequollene Polysaccharidmaterial kann dann in geringem Ausmaß mit SPS-ase behandelt werden, wodurch die Netzstruktur des Materials geöffnet wird und nur geringe Mengen Kohlenhydrate gelöst werden. Dadurch wird das Material entwässert und folglieh ein höherer Feststoffgehalt in dem Schlamm erhalten im Vergleich mit einem Produkt, das ohne Enzymbehandlung erhalten wird. So führt das Enzymverfahren zu dem Vorteil eines wesentlich geringeren Energieverbrauchs zur Entfernung von Wasser durch Trocknen und es eröffnet auch die Möglichkeit, ein billigeres trockenes Tierfuttermittel oder massebildendes Mittel für Futterzwecke herzustellen.
Bc 7. Silage-Hilfsmittel.
Es ist bekannt, Enzyme als Silage-Hilfsmittel zuzusetzen, um die Geschwindigkeit des Silierungsprozesses und die Fermentation der Silage zu verbessern. Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen besser sind im Vergleich mit bekannten enzymatischen Silage-Hilfen.
113-
24617
- L13 -
Übersicht über die Figuren, auf die vorher Bezug genommen worden ist.
| Fig. Nr. | Bezieht sich auf | stellt dar |
| 1 | allgemeinen Teil der Beschreibung | Bindungswirkung zwischen SPS und Sojaprotein |
| 2 | allgemeinen Teil der Beschreibung | Fließschema, das-die Herstel lung von SPS beschreibt |
| 3 | Abschnitt 2 | Eichkurve für HPLC-GeI- FiItrations-Chromatographie |
| 4 | Abschnitt 2 | HPLC-Gel-Filtrations-Chcoma- togramm von SPS |
| 5 | Abschnitt 2 | HPLC-Ge1-Filtrations-Chromato- gramm von durch SPS-ase abge bautem SPS |
| 6 | Abschnitt 2 und 3 | HPLC-GeI-Fi1trations-Chromato- gramm der überstehenden Flüs sigkeit von SPS.inkubiert mit Sojaprotein |
| 7 t | Abschnitt 2 | HPLC-Gel-Filtrations-Chroma- togramm der überstehenden Flüssigkeit von abgebautem SPS inkubiert mit Sojaprotein |
| 8 | Abschnitt 3 | HPLC-GeI-Fi1trations-Chroma- togramm von APS, abgebaut durch Pectolyase |
| 9 | Abschnitt 3 | HPLC-Gel-Filtrations-Chroma- togramm von APS # abgebaut "durch SPS-ase |
| 10 | Abschnitt 3 | HPLC-Gel-Filtrations-Chroma- togramrn von SPS, behandelt mit Pectolyase |
24617
- 114 -
| Fig.Nr. | Bezieht sich auf | stellt dar \ |
| 11 | Abschnitt 7 | ImmunoelektrophoretiSche Peaks einschließlich einem SPS-ase Peak, identfiziert durch Über lagerungstechnik |
| 12 | Abschnitt 8 | Ionenaustausch-Chromatogramm einer SPS-ase |
| 13 | Abschnitt 8 | pH-Abhängigkeit der Aktivität eine SPS-ase |
| 14 | Abschnitt 9 | Temperaturabhängigkeit der Aktivität einer SPS-ase |
| : 15 | Abschnitt 9 | Temperaturstabilität einer SPS-ase |
| 16 . | Abschnitt 10 | pH-Stabilität von Protease in einer SPS-ase-Zubereitung |
Claims (6)
1· Verfahren zur Herstellung von SPS-ase, einer Carbohydrase in brauchbarer Form und fähig, unter geeigneten Bedingungen, Soja-SPS zu Produkten abzubauen, die sich an Protein in einem wäßrigen Medium in einem geringeren Ausmaß Ausmaß anlagern, als sich das Soja-SPS vor dem Abbau an das gleiche Protein unter entsprechenden Bedingungen anlagern würde, gekennzeichnet dadurch, daß ein Stamm in einem Nährmedium gezüchtet wird, dessen Hauptkohlenstoff quelle SPS ist, das auf Basis von pflanzlichem Rohpretein, vorzugsweise entfettetem Sojamehl, als Ausgangsriiaterial gebildet worden ist, woraufhin eine Probe des Fermentationsmediums auf SPS-ase untersucht wird und der fragliche Mikroorganismus als SPS-ase bildender Mikroorganismus angesehen wird, wenn die Analyse auf SPS-ase positiv ist·
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Stamm Asp. aculeatus CBS 101*43 oder Asp. japonicus IFO 4408 in einem Nährmedium gezüchtet wird·
3· Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Züchtung als Submerskultur bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 7» vorzugsweise von 4 bis 6, bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40° C, vorzugsweise von 25 bis 350C, durchgeführt wird, und wobei das Nährmedium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3t gekennzeichnet dadurch, daß das Nährmedium Sojamehl enthält.
31 AUG. 1983*1
A 61 626 12
246 175 2
5* Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß das Sojamehl vor der Verwendung als Bestandteil des Substrats mit einem proteolytiechen Enzym behandlet worden ist, vorzugsweise dem proteolytischen Enzym, das mikrobiologisch gebildet worden ist mit Hilfe von Bacillus licheniformis.
6· Verfahren nach Punkt 1 bis 5» gekennzeichnet dadurch, daß eine sterile Lösung von Pectin aseptisch zu der Fermentationsbrühe während der Züchtung zugesetzt wird»
Hierzu SLSeiten Zeichnungen
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