DE3806423C2 - Verfahren zur Herstellung von Pectin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Pectin aus einer Pflanze, welche Pectin als einen Bestandteil enthält. Bei dem Verfahren wird ein zum Genus Bacillus wie nachstehend definiert gehörender Mikroorganismus verwen­ det. Pectin ist ein industriell nützliches Polysaccharid, welches als Rohmaterial für Nahrungsmittel, Arzneimittel oder für Kos­ metika verwendet wird und welches in großen Mengen in höheren Pflanzen enthalten ist.

In der Vergangenheit erfolgte die Herstellung von Pectin durch Extraktion in der Wärme eines Pflanzengewebes, das Pectin als seinen Bestandteil enthielt, in Anwesenheit eines chelatbildenden Mittels, einer Säure oder einer ähnlichen Verbindung. Bei diesem Verfahren treten jedoch bei der Isolierung des Pectins Schwierigkeiten auf. Außerdem treten bei der Vorrichtung, die bei der Behand­ lung der Rückstände verwendet wird, verschiedene Probleme auf.

Zur Beseitigung der obigen Schwierigkeiten wurden Mikro­ organismen entdeckt, die ein Enzym produzieren, das Pectin aus Pflanzengeweben freisetzt, die Pectin als Bestandteil enthalten. Es wurden weiterhin Verfahren zur Freisetzung von Pectin gefunden, gemäß denen man die oben erwähnten Pflanzengewebe dem Einfluß derartiger Mikroorganismen oder der Kulturbrühe bzw. des Züchtungsmediums oder vor­ behandeltem Material von diesen unterwarf und das Pectin gewonnen hat (US-PS 4 686 187 und JP-OS 46157/1980). Je­ doch sind die Protopectinasen, nämlich die pectinfrei­ setzenden Enzyme, die von den Mikroorganismen, welche bei diesen Verfahren verwendet wird, gebildet werden, alle Enzyme, die nicht nur aus den Pflanzengeweben Pectin freisetzen, sondern die auch eine gewisse Zersetzung des einmal freigesetzten Pectins verursachen (vgl. A Japanese journal "Fermentation & Industries" Bd. 37/1979, S. 928 bis 938). Das heißt, sie besitzen alle die Wirkung, das freigesetzte Pectin zu zersetzen (Polygalacturonaseakti­ vität), wie auch die Wirkung, Pectin freizusetzen (Proto­ pectinaseaktivität). Es tauchten somit die Probleme auf, daß parallel mit der Freisetzung des Pectins eine Zer­ setzung des freigesetzten Pectins stattfindet und daß so die Qualität des erhaltenen Pectins schlecht ist, bedingt durch die Zersetzung, wenn die Enzymreaktion vollständig durchgeführt wird, um die Ausbeute an Pectin zu erhöhen.

Die Anmelderin hat als Ergebnis von vielen Forschungsar­ beiten, die zur Lösung der oben erwähnten Schwierigkeiten durchgeführt wurden, eine Gruppe von Mikroorganismen ge­ funden, die ein Enzym produzieren, welche auf eine Pflanze, die als einen Bestandteil Pectin enthalten, einwirken und das Pectin freisetzen, jedoch das freigesetzte Pectin nicht wesentlich zersetzen. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Pectin, das da­ durch gekennzeichnet ist, daß man Pflanzengewebe, welches Pectinsubstanzen enthält, dem Einfluß eines Mikroorganis­ mus, der zum Genus Bacillus, ausgewählt aus der Gruppe

• 1) Bacillus subtilis IFO 3108, 3134, 3336, 3513, 12112, 12113, 12210, 13719, 13721, 14117 und 14140,
• 2) Bacillus amyloliquefaciens IFO 14141,
• 3) Bacillus cereus IFO 3002 und 3132,
• 4) Bacillus circulans IFO 13632,
• 5) Bacillus coagulans IFO 12583,
• 6) Bacillus firmus IFO 3330,
• 7) Bacillus licheniformis IFO 14206,
• 8) Bacillus pumilus IFO 12087 und
• 9) Bacillus macerans IFO 3490

gehört und eine Pectin-Freisetzungsaktivität für Pflanzengewebe, aber keine Pectin-Zersetzungsaktivität besitzt, oder einer Kulturbrühe davon oder weiterbehandeltem Ma­ terial davon unter Freisetzung des Pectins aus dem Pflan­ zengewebe unterwirft und das Pectin gewinnt.

Die Mikroorganismen wurden unter den angegebenen Nummern beim Institute for Fermentation, Osaka, hinterlegt.

Von diesen Mikroorganismen sind Bacillus subtilis IFO 12113 und Bacillus subtilis IFO 13719 besonders bevorzugt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können Pectine mit hohem Molekulargewicht aus Pflanzengeweben, welche Pectin als ihren Bestandteil enthalten, auf einfache Weise und in guter Ausbeute freigesetzt werden.

Anhand der beigefügten Zeichnungen wird die Erfindung er­ läutert.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, in der im Verlauf der Zeit die Menge an freigesetztem Pectin und die Pectin- Zersetzung dargestellt sind. Protopectin und Pectin wer­ den mit einem Kulturüberstand, welcher Protopectinase ent­ hält, gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung behandelt. Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, wo im Verlauf der Zeit die Menge an freigesetztem Pectin und das Molekulargewicht des freigesetzten Pectins dargestellt sind Protopectin wird der Einwirkung eines Kulturüber­ stands, welcher Protopectinasen enthält, als ein Beispiel gemäß der vorliegenden Erfindung unterworfen.

Für die Isolierung von Pectin aus Pflanzengewebe gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können die obigen Mikroor­ ganismen direkt zum Inokulieren des Pflanzengewebes ver­ wendet werden, wobei das Pflanzengewebe bei statischen Bedingungen, Rühr- oder Schüttelbedingungen nach an sich bekannten Verfahren behandelt und gezüchtet wird. Man kann auch eine Kulturbrühe bzw. ein Züchtungsmedium (diese Aus­ drücke werden synonym verwendet), welches durch Züchtung der obigen Mikroorganismen erhalten wird, oder weiterbe­ handeltes Material davon in Kontakt mit dem Pflanzengewebe bringen.

Medien, die zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet werden, das heißt für die Impfkultur bzw. für die Impfzüch­ tung, sind nicht besonders beschränkt, und man kann irgend­ ein Medium verwenden, welches die verschiedenen Nährstoffe enthält, die normalerweise bei der bekannten Züchtung der Mikroorganismen des Genus Bacillus verwendet werden. Die üblichen Medien können geeigneterweise Pepton, Casein­ hydrolysat, Hefeextrakt und Glucose und, je nach Bedarf, anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Kalium­ salze etc., enthalten. Als Impfkulturmedium können auch bestimmte Arten von Pflanzengeweben ohne die Zugabe von irgendwelchen Nährstoffen, aber nach der Hitzesterilisie­ rung verwendet werden. Die Schale oder die Segmentbedeckung von Zitrusfrüchten ist ein besonders bevorzugtes Medium.

Die Züchtungsbedingungen für die Mikroorganismen in den oben erwähnten Medien werden auf geeignete Weise ausge­ wählt, so daß die gebildete Menge des gewünschten Enzyms maximiert ist. Normale Bedingungen sind 20 bis 37°C wäh­ rend 10 bis 50 Stunden. Die Züchtung kann unter Schütteln, Stehen oder Rühren und Belüftung oder in festem Zustand bzw. im Haltezustand durchgeführt werden. Bei einer sol­ chen Züchtung wächst Mycelium, und die Enzyme werden aus dem Mycelium heraus gebildet. Die Kulturbrühe kann als solche oder in Form von weiterbehandeltem Material, wie als Konzentrat oder als Lösung des gereinigten Enzyms, verwendet werden. Das Konzentrat kann erhalten werden, indem man die Kulturbrühe, die gegebenenfalls filtriert wird, einer Behandlung bei milden Bedingungen, beispiels­ weise Verdampfung bei niedriger Temperatur und niedrigem Druck und einer Konzentrierung mittels einer Ultrafiltra­ tionsmembran, unterwirft. Das gereinigte Enzym kann aus der Brühe durch Filtration der Brühe, Konzentrierung des Filtrats und Durchführung wiederholter fraktionierter Präzipitationen durch Zugabe von Ammoniumsulfat oder durch Filtration der Brühe und Säulenchromatographie des Filtrats an CM-Sephadex und Sephadex-G-75-Gelfiltration erhalten werden.

Man nimmt an, daß der Mechanismus, der bei der vorliegen­ den Erfindung wirkt, der ist, in welchem ein Enzym, wel­ ches aus den oben erwähnten Mikroorganismen gebildet wird, in das Pflanzengewebe eindringt, auf die Pectinsubstan­ zen, insbesondere des wasserunlöslichen Protopectins, unter Bildung eines wasserlöslichen Pectins einwirkt und das wasserlösliche Pectin aus dem Pflanzengewebe freisetzt.

Das aus den Pflanzengeweben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren freigesetzte Pectin kann nach an sich bekann­ ten Verfahren isoliert werden. Beispielsweise kann die Lösung, die, wie oben erwähnt wurde, behandelt wurde, zur Entfernung von Verunreinigungen bzw. festen Stoffen filtriert werden, und das Filtrat kann man dem 3fachen seines Volumens mit einem mit Wasser mischbaren organi­ schen Lösungsmittel, beispielsweise Ethanol, zur Ausfällung des Pectins vermischt werden. Das Pectin wird gesammelt bzw. isoliert, mit einem Lösungsmittel, das ähnlich wie die obigen organischen Lösungsmittel ist, beispielsweise Ethanol, gewaschen und getrocknet, wobei man Pectin hoher Reinheit erhält. Das so erhaltene Pectin besitzt ein Molekulargewicht von mehr als ca. 110.000, unabhängig von der Art des für seine Isolierung verwendeten Mikro­ organismus, und es unterscheidet sich von dem, welches nach den konventionellen chemischen Methoden erhalten wird, da es eine niedrigere Molekulargewichtsverteilung besitzt und dem Naturpectin sehr ähnelt. Das Pectin ist für die Verwendung als Nahrungsmittel oder Arzneimittel geeignet, da es nicht mit chemischen Substanzen verunreinigt ist. Die Eigenschaften der erhaltenen Pectine variieren mehr oder weniger, abhängig von der Art der verwendeten Roh­ materialien.

Obgleich die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Her­ stellung von Pectin hoher Reinheit auf einfache Weise und in hoher Ausbeute aus Pflanzengeweben unter Verwendung von Mikroorganismen des Genus Bacillus, wie oben definiert, betrifft, kann das charakteristische erfindungsge­ mäße Verfahren ebenfalls zur Entfernung von Pectin aus Pflanzengeweben oder für die Herstellung eines Extraktes aus einer Pflanze, welche Pectin enthält, verwendet wer­ den.

Die bei der erfindungsgemäßen Behandlung verwendeten Pflanzengewebe sind bevorzugt solche, die mit niedrigem Preis verfügbar sind und einen Pectingehalt, der so hoch wie möglich ist, besitzen, obgleich dies keine besondere Beschränkung sein soll. Beispiele sind Zitrusfrüchte, wie Zitrus unshiu, Zitrus natsu-daidai, Zitrone, Grapefruit, Navel-Orangen, Orangen oder ähnliche. Als Rohmaterial können irgendwelche Schalen und Segmentbedeckungen die­ ser Zitrusfrüchte verwendet werden. Es ist nämlich mög­ lich, den Rückstand zu verwenden, der beim Auspressen der Zitrusfrüchte unter Herstellung von Fruchtsaft ver­ bleibt. Ein derartiger Rückstand ist billig, und selbst­ verständlich bedeutet seine Verwendung die Ausnutzung eines Abfallproduktes. Außer den oben erwähnten können ebenfalls die Schalen von früchtetragenden Gemüsesorten, wie Beetepulpe, Wassermelone, Melonen etc., und die Stämme bzw. Stengel von Gemüsen, wie Karotten, Burdock, d. h. eine Pflanze des Genus Arctium, insbesondere A. lappa, Rettich etc., bevorzugt als Rohmaterial verwendet werden.

Erfindungsgemäß kann das Enzym, welches in dem Mikroorga­ nismus enthalten ist, auf das Pflanzengewebe, das Pectin als seinen Bestandteil enthält, in der Kulturbrühe eines solchen Mikroorganismus oder in einem weiterbehandelten Material einer solchen Kulturbrühe einwirken und es zer­ setzt Pectin nicht wesentlich und unterscheidet sich von den bekannten pectinfreisetzenden Enzymen, welche Pectin selbst zersetzen. Somit ist es möglich, daß das Enzym auf das Pflanzengewebe vollständig einwirkt, Pectin voll­ ständig freisetzt und daß Pectine mit hohem Molekularge­ wicht in hoher Ausbeute erhalten werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

In einem Medium (pH 6,5), welches lösliche Stärke (0,5%), entfettetes Sojabohnenpulver (5%), (NH₄)₂PO₄ (1%), CaCl₂·2H₂O (0,01%) und Hefeextrakt (0,01%) enthält, wird jeder der in Tabelle 1 angegebenen Stämme unter Schütteln bei 37°C während 40 Stunden gezüchtet. Der Überstand, den man durch Entfernung des Myceliums erhält, kann als Enzym­ quelle mit einem Protopectin, welches aus der Schale und Segmentbedeckung der Zitrone (entsprechend dem Verfahren in Agric. Biol. Chem., Bd. 46/1982, S. 667) hergestellt worden ist, als Substrat bei 37°C unter Pectin-Freisetzung einwirken, und dann wird die Protopectinaseaktivität be­ stimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 auf­ geführt.

Die Protopectinaseaktivität wurde gemäß dem in Agric. Biol. Chem., Bd. 46/1982, S. 667, beschriebenen Verfahren be­ stimmt, und die Aktivität, welche Pectin entsprechend 1 µMol Galacturonsäure pro ml in einer vorgegebenen Reak­ tionszeit freisetzt, wurde als 1 Einheit Protopectinase bestimmt.

Aus den Ergebnissen der Tabelle 1 ist offensichtlich, daß die nachstehenden Mikroorganismen, die zum Genus Bacillus gehören, eine Pectin-Freisetzungsaktivität aufweisen.

Tabelle 1

Protopectinaseaktivitäten verschiedener zum Genus Bacillus gehörender Mikroorganismen

Als nächstes ließ man den oben erwähnten Überstand auf Protopectin und Pectin einwirken, und der Zeitverlauf wurde untersucht.

(i) Protopectin

Eine Acetat-Pufferlösung (pH 5,0), welche den Kultur­ überstand mit Protopectinaseaktivität von 15 Einheiten enthält, wurde mit 1 ml wäßriger Lösung, welche 20 mg des oben erwähnten Protopectins enthält, bei 37°C umge­ setzt, und die Menge an Pectin, die im Verlauf der Zeit freigesetzt wurde, wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

(ii) Pectin

Eine Acetat-Pufferlösung (pH 5,0), welche den glei­ chen Überstand, wie oben bei (i) erwähnt, enthält, wurde mit einer 0,5%igen wäßrigen Lösung von Pectin, hergestellt aus Zitrone (ein Produkt von Wako Pure Chemical Co., Ltd.), bei 37°C umgesetzt. Der Zeitverlauf der Pectin-Zersetzungs­ aktivität wird bestimmt, und er ist in Fig. 1 darge­ stellt. Die Pectin-Zersetzungsaktivität wurde nach dem Verfahren, wie es in Agric. Biol. Chem., Bd. 46/1982, S. 667, beschrieben wird, bestimmt.

Aus den Ergebnissen der Fig. 1 ist offensichtlich, daß die Protopectinase, die in dem oben erwähnten Überstand enthalten ist, eine Pectin-Freisetzungsaktivität, jedoch keine Pectin-Zersetzungsaktivität, aufweist.

Außerdem wurde bestätigt, daß jede Protopectinase, die auf den in Tabelle 1 angegebenen Mikroorganismen gebildet wird, keine Pectin-Zersetzungsaktivität aufweist.

Beispiel 2

In einem Medium (pH 6,5), welches lösliche Stärke (0,5%), (NH₄)₂PO₄ (1%), CaCl₂·2H₂O (0,01%) und Hefeextrakt (0,01%) enthält, werden Bacillus subtilis IFO 12113 und Bacillus subtilis IFO 13719 bei 30°C während 24 Stunden gezüchtet. 100 ml des Kulturfiltrats werden mit 2,5 g getrockneten Zitrus-unshiu-Schalen vermischt und bei 60°C während 24 Stunden reagieren gelassen. Der nach der Filtration er­ haltene Überstand wurde mit dem 3fachen seines Volumens an Ethylalkohol vermischt, und das gebildete Pectin wurde gesammelt und getrocknet. Die Ausbeuten und Eigenschaften der so erhaltenen Pectinproben sind in Tabelle 2 angege­ ben. Pectine mit hohem Molekulargewicht werden durch die vollständige Umsetzung bei einer so hohen Temperatur, wie oben beschrieben, erhalten.

Beispiel 3

In einem Medium, das das gleiche Kulturmedium ist wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, jedoch Dextrin anstelle der löslichen Stärke enthält, wird Bacillus subtilis IFO 12113 bei 30°C während 40 Stunden gezüchtet. Das Kultur­ filtrat wird als Enzymlösung in 40 Einheiten zu 50 ml ei­ ner Lösung (pH 5,0) zugegeben, die 1 g Protopectin verschie­ dener Ursprünge enthält, wie es in Tabelle 3 angegeben wird. Die Reaktion kann bei 37°C während 1 Stunde ablau­ fen. Die dabei freigesetzten Mengen an Pectin sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Aktivität von Protopectinase-B* auf verschiedenen Protopectinen

Beispiel 4

In einem Medium, welches das gleiche Kulturmedium ist, wie es im Beispiel 1 verwendet wurde, jedoch 0,5% Pepton anstelle des Ammoniumphosphats enthält, wird Bacillus subtilis IFO 12113 bei 30°C während 36 Stunden gezüchtet. Das Kulturfiltrat wird als Enzymlösung zu 100 ml einer Lösung (pH 5,0) zugegeben, die 10 g Protopectin, herge­ stellt aus Zitrone, enthält. Die Reaktion kann bei 37°C ablaufen, und die Menge und das Molekulargewicht des frei­ gesetzten Pectins werden periodisch bestimmt. Die Ergeb­ nisse sind in Fig. 2 dargestellt.

Aus den Ergebnissen der Fig. 2 ist offensichtlich, daß das freigesetzte Pectin nicht zersetzt wird.

Danach wird die durch Bacillus subtilis IFO 12113 gebilde­ te Protopectinase gereinigt, und ihre Eigenschaften werden bestimmt.

Reinigungsverfahren

Der Stamm wird in dem Medium von Beispiel 1 bei 37°C wäh­ rend 20 Stunden gezüchtet, und das Kulturfiltrat (20 l) wird auf 2 l konzentriert. Das Konzentrat wird gegenüber 20 mM Acetat-Puffer dialysiert und dann auf eine CM-Sepha­ dex-C-50-Säule (5×46 cm), die mit dem gleichen Puffer equilibriert ist, aufgebracht. Das Enzym wird mit NaCl- (0 bis 500mM)-Konzentrationsgradienten eluiert. Die Enzym­ lösung kann durch eine DEAE-Toyopearl-650-Säule (2,1×15 cm) hindurchlaufen, und die Lösung, die durch die Säule hindurchläuft, wird gesammelt. Die Lösung wird dann auf 4 ml konzentriert und der Chromatographie mit einer Toyo­ pearl-HW-55S-Säule (2,5×75 cm) unterworfen. Die Proto­ pectinasefraktionen werden gesammelt und konzentriert und nach der Zugabe von pulverförmigem Ammoniumsulfat in einem Eisschrank während 1 Woche stehengelassen, wobei man 42 mg Nadeln erhält. Das so erhaltene Enzym ist eine neue Protopectinase, die als "Protopectinase-B" bezeich­ net wird.

Die Eigenschaften der Enzym-Protopectinase-B sind in Ta­ belle 4 angegeben, und die Ergebnisse der Aminosäureanalyse der Enzym-Protopectinase-B sind in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 4 Eigenschaften von Protopectinase-B

Molekulargewicht (kDa)
durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese	29,0
durch Gelfiltration	28,0
durch Ultrazentrifugation	28,0
Sedimentationskonstante (S₂₀, w)	s 3,045
Isoelektrischer Punkt	9,4
Extinktionskoeffizient (1%ige wäßrige Lösung, 280 nm)	15,1
optimaler pH	7,0-8,0 (37°C)
	4,5-5,5 (60°C)
optimale Temperatur (°C)	37-60°C
Inhibitor	Ba, Ca, Ni
Kristallform	Nadeln

Die Verfahren für die Bestimmung der Eigenschaften der Protopectinase-B und die Verfahren der Aminosäureanalyse für Protopectinase-B sind die folgenden:

Molekulargewicht:
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(das Verfahren von Weber & Osborn, welches in J. Biol. Chem., Bd. 244/1969, S. 4406, beschrieben wird, wurde verwendet),

Gelfiltration
(die Bedingungen sind die gleichen wie für die Gel­ filtration bei der Reinigung der Enzyme, wie oben beschrieben. Als Standardproteine werden Cytochrom C. lysozym, α-Chymotrypsinogen A, Ovalbumin und Rinder­ serumalbumin verwendet),

Ultrazentrifugation
(es wird das Yphantis-Verfahren, welches in Bio­ chemistry, Bd. 3/1964, S. 297, beschrieben wird, verwendet),

Sedimentationskonstante
(das Enzym wird in 20mM Acetat-Puffer von pH 6,0, wel­ cher 100 mM NaCl enthält, unter Bildung einer Enzym­ lösung, welche 5 mg Enzym pro ml enthält, gelöst, und die Analyse erfolgt durch Zentrifugation mit einer analytischen Ultrazentrifuge Hitachi-Modell 232 bei 60.000 Upm),

Isoelektrischer Punkt
Der optimale pH und die optimale Temperatur werden ent­ sprechend dem Verfahren von Beispiel 1 bestimmt.

Aminosäureanalyse
Das gereinigte Enzym (18 mg) wird in 6n-Chlorwasser­ stoffsäure gelöst und in einem Rohr eingeschmolzen. Die Zersetzung erfolgte bei 110°C während 30, 48 und 72 Stun­ den, und die Analyse erfolgte mittels einem automatischen Aminosäureanalysegerät Hitachi-Modell LA-5.

Der Wirkungsmechanismus der oben beschriebenen Protopecti­ nase-B auf Protopectin wurde untersucht, und es wurde be­ stätigt, daß das Enzym glycosidische Bindungen an den Endungsstellen von Arabinogalactan, hergestellt aus Soja­ bohnen, spaltet. Die anderen Mikroorganismen, die bei dieser Erfindung verwendet werden, bilden die gleiche Art von Enzymen. Die immunologische Homologie zwischen Proto­ pectinasen, die durch den Mikroorganismen, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gebildet werden, und Protopectinase-B wurde untersucht und ist in Tabelle 6 angegeben. Die immunologischen Tests erfolgten unter Verwendung eines Antiserums, welches in Kaninchen mit ge­ reinigter Protopectinase-B gemäß dem doppelten Immuno- Diffusionsverfahren von Ouchterlony (O. Ouchterlony, Acta Pathol. Microbiol. Scand., Bd. 26, S. 507, 1940) herge­ stellt wurde. Die Enzyme von B. coagulans IFO 12583, B. licheniformis IFO 14206 und B. macerans IFO 3490 bil­ den Präzipitate mit Antiserum von Protopectinase-B, aber diese Enzyme sind nicht identisch mit Protopectinase-B, was aus ihrem Präzipitationsprofil geschlossen wurde, und die anderen ergaben keine Präzipitation.

Die Arabinogalactan-Zersetzungsaktivität wurde wie folgt bestimmt. Ein Reaktionsgemisch, welches 3 ml 1%iges Arabi­ nogalactan, 1 ml Enzymlösung, 0,5 ml von 0,2M Essigsäure/- Natriumacetat-Puffer (pH 6,0) enthält, wird bei 37°C wäh­ rend 30 Minuten inkubiert. Die durch die Einwirkung von Protopectinase-B freigesetzten reduzierenden Zucker wur­ den als Galactose gemäß dem Nelson-Somogyi-Verfahren (M. Somogyi, J. Biol. Chem., Bd. 195, S. 19, 1952) bestimmt.

Tabelle 6

Immunologische Homologie zwischen Protopectinasen, die aus Mikro­ organismen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, gebildet werden, und Protopectinase-B

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Pectin, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzengewebe, welches Pectinsubstanzen enthält, dem Einfluß eines Mikro­ organismus, der zum Genus Bacillus ausgewählt aus der Gruppe

• 1) Bacillus subtilis IFO 3108, 3134, 3336, 3513, 12112, 12113, 12210, 13719, 13721, 14117, und 14140,
• 2) Bacillus amyloliquefaciens IFO 14141,
• 3) Bacillus cereus IFO 3002 und 3132,
• 4) Bacillus circulans IFO 13632,
• 5) Bacillus coagulans IFO 12583,
• 6) Bacillus firmus IFO 3330,
• 7) Bacillus licheniformis IFO 14206,
• 8) Bacillus pumilus IFO 12087 und
• 9) Bacillus macerans IFO 3490

gehört und eine Pectin-Freisetzungsaktivität für Pflanzengewebe, aber keine Pectin-Zersetzungsaktivität besitzt,
oder einer Kulturbrühe davon oder weiterbehandeltem Ma­ terial davon unter Freisetzung des Pectins aus dem Pflan­ zengewebe unterwirft und das Pectin gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Schale oder Segmentbedeckung von Zitrusfrüchten als Pflanzengewebe, das Pectinsubstan­ zen enthält, verwendet wird.