CZ256482A3 - Medicaments suitable particularly for treating melanoma and process for preparing thereof - Google Patents

Description

Léčiva vhodná zejména pro léčení faelac-oáů- a ί q b- j »j ion přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká léčiv vhodných zejména pro léčení melano· mů a způsobu přípravy jejich aktivní složky.

Dosavadní stav techniky

Je příprava protirakovinných konjugovaných produktů, získaných spojením řetězce A ricinu kovalentní vazbou s proteinovou látkou, jako je některá protilátka, imunoglobulin nebo část imunoglobulinu, která je schopna selektivně rozpoznat antigen adsorbovaný na pcvrchu nosičových buněk, které se mají zasáhnout, jako jsou například rakovinné buňky. Hlavní vlastností těchto konjugovaných produktů je, že/specifickými cytotoxickými činidly cílových buněk, na něž jsou zaměřeny.

Foužití protilátek namířených proti odlišným antigenům rakovinných buněk již umožnilo získat konjugované produkty, vyznačující se výraznou specifičností vůči cílovým buňkám. Charakterizace antigenů sdružených s rakovinnými buňkami a získání monoklonálních protilátek namířených proti těmto antigenům umožňují vytvářet konjugované produkty, vyznačující se zvýšenou specifičností vůči nosičovým buňkám těchto antigenů.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jscu tedy léčiva vhodná zejména pro léčení melanomů, které se vyznačují tím, že obsahují aktivní složku tvořenou molekulami, v nichž je řetězec A ricinu spojen kovalentní vazbou disulfidického typu s lidskou antimelanomovou protilátkou, schopnou selektivně rozpoznat antigen sdružený s rakovinnými buňkami.

Aktivní složka léčiv podle vynálezu je uměle připravený konjugovaný produkt, získaný spojením řetězce A ricinu s lidskou antimelanomovou protilátkou.

Aktivní složku lze znázornit obecným vzorcem

RA - 3 - 3 - AC , ve kterém RA znamená řetězec A ricinu a

AC znamená lidkou protimelanomovou protilátku.

Fředmětem vynálezu je rovněž způsob pří.pravy aktivní složky léčiv podle vynálezu. Tato příprava se podle vynálezu provádí tak, že se uvedou ve styk řetězec A ricinu nesoucí volnou skupinu SH a znázorněný vzorcem RASH s protilátkou AC, do níž byla uměle vpravena skupina JH v aktivované formě, zejména v podobě smíšeného di sulfidu s vhodným, síru obsahujícím organickým zbytkem, čímž byl získán její derivát obecného vzorce

AC - S - S - X , ve kterém X znamená aktivační zbytek.

Přípravu konjugovaného produktu je možno znázornit tímto schémat em:

SA-SH + AC-S-S-X ---> RA-S-S-AC + XSH , kde RA a AC mají výše uvedený význam a X znamená aktivační zbytek

Postup, jak připravit řetězec A ricinu v čistém stavu, je popsán v patentovém spise US 4 34.0 5 35, odpovídajícím francouzským patentovým spisům FR 78 27 838 a 79 24 855, Příprava monoklonálních protilátek, namířených proti lidským melanomům, je popsána ve vědecké literatuře (viz zejména pojednání v časopisu Proceedings of the National Academy of Sciences, 77, (4), str. 2183 až 2187, 1980).

E vytvoření konjugcvaných produktů je třeba, aby každý z proteinů, které se mají spojit, obsahoval alespoň jeden atom síry, který je sám od sebe schopen toho, aby vytvořil pořadovanou disulfidickou vazbu, nebo se k tomu uměle přiměje.

řetězec A ricinu obsahuje samozřejmě jediný atom síry, kt rý umožňuje požadované spojení. Je to ston síry v thiclovů skupině cysteirového zbytku obsaženého v řetězci A, kterýžto atom síry zalistuje spojení tohoto řetězce s řetězcem 3 v kompletním tóninu.

V antimelanomové protilátce nejsou obsaženy ani volná thiůlová skupina, ani jiné atomy síry, který by mohlo být použito pro spojení. Bude tedy nutné zavést uměle do molekuly imunoglobulinu alespoň jeden atom síry, kterého by bylo možno v dalším použít pro vytvoření disulfidické vazby s alespoň jednou molekulou řetězce I ricinu.

Protilátka, substituovaná aktivovaným atomem síry, se získá ze samotné protilátky substituováním pomoci reakčního činidla, které samo obsahuje aktivovaný atom síry, podle schématu:

-λ í'kel 7

AC+X-R-3-3-X -> AC-R-S-S-X , kde

AC znamená protilátku, znamená skupinu umožňující kovalentní spojení reakčního činidla s proteinem,

R znamená skupinu, na niž mohou být současně vázány subst tuenty X a -S-S-X,

X znamená aktivační zbytek.

Funkční skupinou X je skupina, která je schopna se vázat kovalentní vazbou s kteroukoliv ze skupin, vázaných na boční řetězce aminokyselin tvořících protein, který se má substiiiovat. Z těchto js^u obzvláště vhodné koncové aminoskupiny lysylových zbytků obsažených v proteinu. V tomto případě může X zejména znamenat;

karboxyíovou skupinu, která se může vázat na aminoskupiny proteinu v- přítomnosti činidla, jako je karbodiimid, zejména jeho vodorozpustný derivát, jako je l-ethyL-3-(3-diethylaminopropyl)karbodiimid, chlorid karboxylové kyseliny, který je schopen reagovat přímo s aminoskupinami, čímž je acetyluje, aktivovaný” ester, jako je ortho nebo para nitro- nebo dinitrofenylester, nebo též ester N-hydroxysukcinimidu, který reaguje přímo s aminoskupinami, čímž je acyluje, vnitřní anhydrid karboxylové dikyseliny, jako je například anhydrid kyseliny jantarové, který reaguje samovolně s aminoskupinami za vzniku amidových vazeb, ^NH imidoesterová skupina -C _e kde

XOE¹

B^x znamená alkylový zbytek reagující s aminoskupinami proteinu podle reakčního schématu HĚT, prot - NH₂ + prot - NH - C - 3 +R-TH ,

X znamená funkční skupina, schopnou reagovat s volným thiolovým zbytkem, zejména může X znamenat 2-pyridylový nebo 4-pyridjlový zbytek, popřípadě 3ubstituoaný alespoň jednou alkylovou nebo karboxylcvou skupinou nebo halogenem.

X může rovněž znamenat fenylovouskupinu, výfodně substituovanou alespoň jednou nitroskupinou nebo karboxylovou skupinou. X může též znamenat alkoxykarbonylovou skupinu, jako je například methoxykarbonylová skupina.

Zbytek 3 znamená jakýkoliv zbytek, schopný současně vázat substituenty Ί a -3-3-X. Je nutno jej volit £

-/tak, aby neobsahoval skupiny, které by mohly rušivě zasahovat při následných reakcích s použitými reakčními činidly a se syntetizovanými produkty. Zejména může symbol R znamenat skupinu kde n znamená L až 10, a rovněž skupinu vzorce

R - CH l

CH. R* znamená vodík nebo ákylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku a

R^ znamená skupinu, inertní vůči následně použitým reakčním činidlům, jakou je karbamátový zbytek

- NH - G - OR⁵ kde

R znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v přímém nebo rozvětveném řetězci, zejména pak terč. butylovou skupinu.

Reakce sloučeniny obecného vzorce X-R-S-3-Xs iminoglobulinem se provádí v homogenní kapalné fázi, nejčastěji ve vodě nebo v pufrovaném roztoku.

¢Jestliže to vyžaduje rozpustnost reakčních složek, je možné přid at do reakčního prostředí organické rozpouštědlo mísící se s vodou, v objemovém množství až 20 %, jako je například ✓ alkohol a zejména terč.butanol.

Reakce se provádí při teplotě místnosti po dobu v rozmezí od několika hodin do 24 hodin. Po skončení reakce se pomocí dialýzy odstraní produkty o nízké molekulové hmotnosti a zejména nadbytek reakčních složek. Tento postup umožňuje zavést, vztaženo na 1 mol proteinu, 1 až 5 substitučních skupin, jestliže proteinem je iminuglobulin typu G, a 1 až 15 substitučních skupin, jestliže proteinem je imunoglobulin typu M.

Při použití takovýchto sloučenin se spojení s řetězcem A ricinu dosáhne tím, že se ve vodném roztoku uvedou ve styk oba proteiny při teplotě nepřesahující 30° C a ponechají spolu po dobu trvající několik hodin až 1 den. Získaný roztok se dialyzuje, aby se odstranily produkty o nízké molekulové hmotnosti; pak se vzniklý sdružený produkt může přečistit známými postupy.

Vynález je blíže objasněn dále uvedeným příkladem, aniž by jím byl omezen.

(Z> -7 •K. I

O řO ·

Příklad provedení vynálezů

O o □ c

ΓΓΚ

LO u>

' Tm r— O

Konjugovaný produkt, získaný z lidské protimelanomové protilátky (protilátka namířená proti antigenů P 97), substituované aktivovanou disulfidickou skupinou, a z řetězce A ricinu

a) Lidská antiuelanomová protilátka (anti P 97)

Tato protilátka se získá postupem popsaným v časopise Froceedings of National Acaďemy of Sciences, 1S80, 77 (4), str.

2183 až 2187; v tomto pojednání jsou rovněž uvedeny její charakteristické vlastnosti.

Podrobí se konečnému čištění dialýzou proti pufru PBS (10 mmolů fosforečnanu, 140 mmolů chloridu sodného, pH 7,4).

Monoklonální protilátka F 97 selektivně rozpozná antigeny P 97 přítomné na buňkách melanorau.

b) Řetězec A ricinu

Řetězec A ricinu se připraví a přečistí postupem, popsaným v dřívějších přihláškách (francouzský patent č. 78/27836 a přídavný patent č. 79/24655), kde jsou rovněž popsány jeho charakteristické vlastnosti.

c) Aktivovaná lidská antimelanomová protilátka

K 0,5 ml roztoku, obsahujícího v 1 ml terč. butanolu 20 mg kyseliny 3-(2-pyridyldisulfanyi)propionové, /

I

/ ae přidá 0,2 ml roztoku, obsahujícího 60 mg/ml 1-ethy1-3-(3dimethylaminopropyl)karbodiimidu, a směs se ponechá 3 minuty při teplotě místnosti.

X

Pak se 30 ^ul takto získaného roztoku přidá k 1,66 ml roztoku antimelanomové protilátky o koncentraci 2,4 mg/ml v pufrovaném roztoku PBS. Roztok se nechá v inkubac při teplotě 30° C po dobu 20 hodin.

Pak se roztok po 3 dny nepřetržitě dialyziije proti 21 litru pufrovaného roztoku PBS při teplotě 4° C.

Tím se získají 4 mg aktivované protilátky o koncentraci 2,3 mg/ml.

Spektrofotometrickým stanovením ·. pyridin-2-thiontx- při 343 nm, uvolněného výměnou za redukovaný glutathion, se zjistí, že se získala protilátka, obsahující 2,6 aktivačních skupin na 1 mol protilátky.

d) Sdružený produkt

K 1,3 ml roztoku aktivované protilátky v pufrovaném roztoku PBS (koncentrace 2,3 mg/ml, tj. 3 mg aktivované protilátky) se přidá 0,52 ml roztoku řetězce A ricinu v tomtéž pufrovaném roztoku (koncentrace 5,8 mg/ml) a reakce se nechá probíhat 20 hodin při teplotě 25° C.

χ><

- 10 > /Tj ω c ί ” Ή <

-- ’ ' · ο — Ό ΐ ' ΓΠκ

Ο

NJ· ο

ο

-χ

LO to

Po uplynutí této doby se~reakčιτί saěs~TÍh'mBžftagrgf u je na koloně gelu Sephadex G ICC. V každé frakci se stanoví koncentrace protilátky spektrofotometricky při 280 nm a koncentrace řetězce A podle jeho schopnosti inhibovat proteosyntézu měřenou na acelulární soustavě, identické frakce obsahující konjugovaný produkt se spojí a tím se získá přibližně 1 mg konjugovaného produktu o koncentraci 0,2 mg/ml, t.j. účinné látky obecného vzorce

RA - 3 - 3 - AC , kde RA znamená řetězec A ricinu a AC znamená lidskou antinelanomovou protilátku.

Z. provedených analytických stanovení vyplývá, že roztok obsahuje 50 y.ug/ml biologicky aktivního řetězce A, čili přibližně 1,4 molu řetězce A na 1 mol protilátky.

Z cytofluorometričky provedené zkoušky kromě toho vyplývá, že použitá antimelanomová protilátka, příslušná aktivovaná protilátka a konjugovaný produkt této protilátky s řetězcem A ricinu se vyznačují velmi blízkými fluorescenčními histogramy, z nichž lze usuzovat, že protilátka nedozná žádné výraznější změny během aktivační reakce a sdružovací reakce, jimž byla podrobena, a zejména, že zůstává schopna - dokonce obsažena v konjugovaném produktu - rozpoznat antigen ? S7, proti němuž je namířena.

Konjugovaný produkt, připravený způsobem podle vynálezu, jak byl popsán v uvedeném příkladu, se podrobí zkouškám dokazujícím jeho biologické vlastnosti- a zejména jeho protirakovinné účinky.

-ťá -

1) Inhibice proteosyntézy

Základní biologickou vlastností řetězce A ricinu je, že inhibuje buněčnou proteosyntézu narušením ribosomové subjednotky 6C o.

Použije se zde buněčného mocelu. Při tomto testu se měří účinek zkoumaných látek na vpravení ^^G-leucinu do kultury rakovinných buněk.

Použité buňky patří k buněčnému kmeni M 1477, pocházejícímu z humánního melanomu s antigenem P 57.Tyto buňky se ρσ trypsinami ponechají předběžně inkubované alespoň 24 hodiny, aby byla umožněna regenerace popřípadě narušených povrchových antigenů. Po přidání zkoumané látky se provede opětovná inkubace. Po skončení inkubace se přikročí k měření stupně začlenění ^^C-leucinu do takto zpracovaných buněk.

Toto měření se provádí postupem, upraveným z metody popsané v časopisu Journal of Bio^ogical Chemistry

1574, 245 (11), str. 3557 e 62, používající označeného 14

G-leucinu pro určení stupně proteosyntézy. Určení začleněné radioaktivity se^de provádí na celých buňkách isolovaných odfiltrováním.

Ua základě získaných údajů je možno narýsovat křivky, udávající závislost účinku na množství, kde na

A^

- yi ose úseček X je vynesena koncentrace zkoumaných látek a v Ί A ose pořadnic Y stupen začlenění G-leucinu, vyjádřený v procentech začlenění kontrolních buněk v nepřítomnosti zkoumané látky.

Takto je možno pro každou zkoumanou látku určit koncentraci, kt~rá inhibuje 50 % začlenění ^l4C-leucinu, čiliinhibiční koncentraci 50” (Cl 50).

Výsledky, získané se sdruženým produktem připraveným v předcházejícím příkladu (ITHM), jsou znázorněny na obr. 1. Na tomto diagramu jsou rovněž znázorněny křivky, získané s ricinem (S), řetězcem A ricinu (AR)a sdruženým produktem z řetězce A ricinu a protilátky ántidinitrofenylový zbytek (DN?) (D3 10), kterýžto sdružený produkt se nevyznačuje žádnou afinitou k testovaným buňkám.

Na základě tohoto diagramu (obr. 1) je možno konstatovat, že zkoumaný sdružený produkt (ITHM) se vyznačuje silnou cytctoxickou aktivitou (Cl 50*5 x 10~' M), při!li žně 400kxát účinnější, než j® aktivita řetězce A ricinu.

Mimochodem, sdružený produkt ©ntí-dinitrofenylový zb.ytek (D3 10) nom účin=»k na buňky M 1477 ani při nojvyšší testované koncentraci (10~⁶ M). Naproti tomu se týž sdružený produkt Do 10 projevuje jako cytotoxický — O s ínhibiční koncentrací Cl 50 přibližně 1C ^J M, jestliže se uvede ve styk s týmiž buňkami M 1477, na něž byly předem uměle navázány dinitrofenylové zbytky. Tyto dva posledně uvedené výsledky ukazují specifický charakter cytotoxické aktivity sdruženého produktu ITHM.

2) Inhibice tvorby kolonií

Buňky z melanomcvé kultury M 1477 se oddělí od svého podkladu Versenovým roztokem (pufrovaný roztok PB3 obsahující kyselinu ethylendiamintetraoctovou) nebo trypsinisací. ^yto buňky se naočkují v množství 2 x 10^ buněk na 1 Petriho misku o průměru 5 cm do kultivačního prostředí, sestávajícího z prostředí RPMI 1640 (Mérieux) s přídavkem 2 mM glutaminu, z hydrouhličitanu sodného v množství 2 g/1, z 15 % inaktivovaného séra z telecího zárodku (áeromsd) a z antibiotik (penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B).

Po 24 hodinách se na buňky působí zkoumaným sdruženým produktem v různé koncentraci.

Pro porovnání se provede stejná řada pokusů jednak s ricinem, jednak s řetězcem A ricinu a konečně i s nespecifickým sdruženým produktem tohoto buněčného kmene (sdružený produkt z řetězce A ricinu a z protilátky anti-dinitráfenylový zbytek (D3 10)).

Po dalších 24 hodinách se kultivační prostředí odstraní a nahradí týmž čerstvým prostředím, neobsahujícím jakoukoliv cytotoxickou látku.

Po uplynutí 10 až 15 dnů se po zbarvení roztokem krystalové violeti určí počet vzniklých kolonií pomocí automatického počítače kolonií (systém Artek 880).

Tato metoda umožňje stanovit dokonce jen 10 životaschopných buněk v jedné misce, jak je to možno ověřit podle kontrolních kultur. Bylo též prokázáno, že tvorba kolonií je přísně úměrná počáteční koncentraci buněk, alespoň v rozmezí od 10 do 10 buněk v 1 ml.

Získané výsledky jsou znázorněny na obr. 2, na němž je v logaritmickém měřítku na ose Ί vynesen počet kolonií v 1 misce a na ose X koncentrace produkt··. Pokusy byly provedeny s ricinem (R), řetězcem A ricinu (AR) a se sdruženým produktem (ITHM) vyrobeným způsobem podle vynálezu.

Sdružený produkt ΙΊΗΜ se vyznačuje vysokou aktivitou, protože poslední buňka melanomu je usmrcena při koncentraci sdruženého produktu přibližně 2 x 10^_y m.

Tato koncentrace je zcela srovnatelná s koncentrací ricinu (1 x 10 M), zatímco u řetězce A ricinu je třeba použít koncentrace 10 ⁰ M, aby bylo dosaženo téhož účinku.

Je nutno zdůraznit, že sdružený produkt D3 10 nejeví žádnou aktivitu ani při koncentraci 2 x ÍO^{-8 M} což je nejvyšší koncentrace, při níž byl testován.

Závefy z tžchto pokusů zcela potvrzují závěry, získané při pokusech s inhibicí proteosyntézy.

Sdružené produkty, připravené způsobem podle vynáleag, se vyznačují výrazně specifickým účinkem vůči buněčným kmenům humánního melanomu. Je jich proto možno použít v humánním lékařství pro léčení melanomů a popříě pádě dalších chorob, rakovinných či nikoliv, které jsou citlivé vůči použitým protilátkám.

Tyto sdružené produkty se upravují pro použití v injekcích. Lze jich použít buň samotných nebo ve spojitosti s jinými léčebnými prostředky pro danné rakovinné onemocnění a zejména ve spojitosti s jinými imúnedepresivními léky, aby se zpomalila a zmírnila přirozená imunitní reakce pacienta vůči bílkovině cizí jeho organismu, kterou představuje sdružený produkt.

Při snaze po odstranění veškerých rakovinných buněk se léčení bude muset provádět s dostatečně velkou dávkou sdruženého produktu, a dobu, po kterou se léčení bude muset provádět, bude nutno stanovit případ od případu podle stavu pacienta a povahy onemocnění, jež se má léčit.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1) Léčiva vhodná zejména pro léčení melanomů, vyznačující se tím, že obsahují aktivní látku, kterou je molekula, v níž řetězec A ricinu je spojen kovalentní vazbou disulfidického typu s lidskou antimelanomovou protilátkou.
2. 2) Léčiva podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou kondicionována jáe- k* injekční aplikaci.
3. 3) Způsob přípravy aktivní látky léčiva podle nároku 1, vyznačující se tím, že se nechá reagovat řetězec A ricinu, znázorněný vzorcem RASH, s derivátem protilátky AC obeného vzorce

   AC - S - S - X , ve kterém X znamená aktivační zbytek.
4. 4) Způsob podle nároku 3, vyznačující se t í m , že se nechá reagovat řetězec A ricinu, znázorněný vzorcem RASH, s derivátem protilátky AC obecného vzorce

   AC - S - S - X ve kterém X znamená skupinu schopnou reagovat s volným thiolovým zbytkem, zejména popřípadě substituovanou 2-pyridylovou nebo 4pyridylovou skupinu, fenylovou skupinu nebo alkoxykarbonylovou skupinu.

   ? o .

   rn - ' 'i- ^: , i

   i -c m *

   Vzorce pro anotaci (I, II, III)

   RA - 3 - 3 - AC (I) —RA-—z-gamnoá .řet čzoc ric-inu a AC znaziuiú u lil Alku.

   R' .''T.J

   Λ - Ο1Ί (II)

   AC - 3 - 3 (III)

   X znsffonň T\-.t ; υ,ιΓ.ιι I zbyr,