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JPS59186924A - ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 - Google Patents

ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤

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Publication number
JPS59186924A
JPS59186924A JP58061923A JP6192383A JPS59186924A JP S59186924 A JPS59186924 A JP S59186924A JP 58061923 A JP58061923 A JP 58061923A JP 6192383 A JP6192383 A JP 6192383A JP S59186924 A JPS59186924 A JP S59186924A
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Japan
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human immunoglobulin
antitumor
antitumor agent
substance
tumor
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JP58061923A
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Koichi Niimura
浩一 新村
Masahiko Fujii
藤井　雅彦
Takami Fujii
藤井　孝美
Kenichi Matsunaga
謙一 松永
Yoshiharu Oguchi
小口　義春
Chikao Yoshikumi
吉汲　親雄
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Kureha Corp
Original Assignee
Kureha Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤に関する。
近年、免疫化学の発展にともない、多くの腫瘍関連抗原
が発見され、それに対して選択的に結合する腫瘍特異抗
体が開発されてきた。さらに、これらの腫瘍特異抗体に
抗腫瘍性物質を結合させ、腫瘍部位へのみ薬剤を集中移
行させようという試みがなされている。ここで腫瘍特異
抗体は、腫瘍細胞あるいは腫瘍関連抗原を家兎、馬、羊
等に免疫する手法を用いて作製し、動物血清から免役グ
ロブリン画分を得て使用している。最近では、腫瘍細胞
あるいは腫瘍関連抗原をマウスに免疫した後、抗体産生
細胞を取り出し、Ｎ５−１等のマウスミエローマ細胞と
細胞融合させることＫよりモノクローンの抗腫瘍抗体細
胞を得て、そこがら抗腫瘍抗体を取り出している。
これらの試みは、抗腫瘍抗体単独あるいはある種の細胞
毒性物質を抗腫瘍抗体に結合させた形で行なわれている
が、実用化には至っていない。その理由は、上記の抗腫
瘍抗体は、異種動物に免疫して作製している為に、人に
対しては異種蛋白となるからである。つ捷り異種動物か
ら得られる抗体をヒトに投与した場合、２回目以後の投
与ではアナフィシキシ−等の血清病をさけることが出来
ない為に、　　１回しか使用出来ないからであり、これ
は最大の欠点であった。これを解決するには、同種抗体
を用いることが必要であり、ヒトリンパ球を用いたモノ
クローナル抗体は理想であるが、まだ研究途上である。
そこで、これらの欠点を改嵜し、実用性に関する事項を
解決するには、同種抗体の中からａｍ細胞に集まる抗体
を検索する必要があった。そこで、本発明者らは、鋭意
種々の抗体の１２８）標識物の生体内分布の検討を行な
った。その結果、一般自然抗体が＠癌部位に到遅し、し
かも長く残留することを艶出した。それら免疫グロブリ
ンに抗腫瘍性物質を結合させて、これを担癌個体に投与
すれば薬剤は腫瘍部位に長く留り、抗腫瘍効果を示すこ
とを知って、本発明を完成した。ヒト免疫グロブリン結
合抗腫瘍剤は、異柵動物由来抗１＊ｍ抗体に比べて頻回
投与が可能になったという点又唾瘍部位に長くとどまる
点で最大の特色と利点を有している。したがって本発明
は、実用性の高いヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤を含
有する新しいタイプの薬剤を提供するものである。本発
明は、クロラムジチル、メルフアラン、ＡＯＮＵ、シク
ロホスファミドなどのアルキル化剤、マイトマイシンＣ
１塩酸ドキンルビシン、塩酸ダウノルビシン、プレオマ
イシン、アクチノマイシンＤ１ネオカルチノスタチンな
どの抗生物質、シタラビン、８−アザグアニン、５−フ
ルオロウラシル、メントレキセート、アミノプテリンナ
トリウム、ロイヶリン、５−フルオロウラシルなどの代
謝拮抗剤からなる群に属する細胞毒性の高い抗腫瘍性物
質を、極めて穏和な条件下で、ヒト免疫グロブリンに結
合させた新規な化合物に基づく抗腫瘍剤であり、抗腫瘍
効果にすぐれながら、細胞毒性は原料の１つである抗腫
瘍性物質にくらべて格段に低い抗腫瘍剤を提供すること
を目的とする。以下に本発明の詳細な説明する。
近年、種々の抗腫瘍剤が広く使用されており、ある程度
の効果をあげている。これらの抗腫瘍剤として、クロラ
ムグチル、メルフアラン、ＡＵＮＵ。
シクロホスファミド、シタラビン、８−アザグアニン、
５−フルオロウラシル、メソトレキセート、アミノプテ
リンナトリウム、マイトマイシンＣ１塩酸ドキソルビシ
ン、プレオマイシン、ダウノルビシン、アクチノマイシ
ンＤ１ザルコマイシンのごときものが使用されているが
、これらの物質は、それ自体側れも高い細胞毒性を有し
ていて、投与した後に、白血球減少、脱毛、冑腸障害等
の副作用を呈することが知られておシ、その為に、これ
らの薬剤の使用に限度があるのが実情である。
まだ従来から、腫瘍細胞あるいは腫瘍関連抗原に対する
抗体を夷造または単離して、これをその腫瘍の治療に用
いる試みがなされているが、望ましい抗腫瘍効果Ｕ得ら
れていない。さらに、最近、抗腫瘍抗体に抗腫瘍性物質
を化学的に結合させて得られる新規な物質による抗腫瘍
効果を期待することが提案されているが、上記物質を得
るための化学反応の条件が過酷すぎるために１十分な成
果は得られていない。また、これらの実験で用いられる
抗体は、異種動物の抗体を使用していたために、血清病
等の副作用をさけることは出来なかった。
そこで本発明者らは、異種動物から得られる抗腫瘍抗体
をアフィニティークロマトで精製を行なうという方法を
発明したし特願昭５３−１６１３８８、昭５４−１４２
１５２、昭５４−１４２１５３）。この方法を用いれば
高度に抗体を精製することが可能であるが、頻回投与を
行なうという点で問題が残っている。
そこで各種の抗体を用いて腫瘍到達性を鋭意検討したと
ζろ、自然抗体が高濃度で、腫瘍部位に移行し、その滞
留時間も他の臓器よりも長いことが判明した。この事実
に基づいて、クロラムグチル、メルフアラン、ＡＯＮＵ
、　　シクロホスファミｒ。
シタラビン、８−アザグアニン、５−フルオロウラシル
、メントレキセート、アミノプテリンナトリウム、マイ
トマイシンＣ１塩酸ドキソルビクンプレオマイシン、ダ
ウノルビシン、アクチノマイシンＤ、ザルコマイシンを
ヒト免疫グロブリンに結合せしめたところ好ましい抗ｍ
瘍効来が得られることが判明した。ざらにこの組合せの
中でもメルフアランとそのエステル類は合成的に容易に
得られる抗腫瘍剤であり、安定性も篩いことから、ヒト
免疫グロブリンとメルフアラン及びそのエステルとの結
合体が最も好捷しい。自然抗体はヒト免疫グロブリン（
Ｉｇ）及びその低分子抗体（Ｆ（ａｂ’）２）を包含す
る。
ヒト免疫グロブリンと抗腫瘍性物質の結合は次の方法に
より製造される。
抗腫瘍性物質を水性溶媒に溶解せしめる、水性溶媒は酸
性水溶液、アルカリ性水浴液中性水浴液、リン酸緩衝液
ホウ酸ナトリウム等である。これに結合剤、例えばカル
ゼジイミド、デキストラン、グルタルアルデヒド、ジエ
チルマロンイミデート、イソシアナート、ポリグルタミ
ン酸よシ選択されたものを加え、更にヒト免疫グロブリ
ン（Ｆ（ａｂ’）＊も含む）を加え反応させる。反応温
度は一３０℃乃至５０℃、好ましくは０℃乃至３０℃で
あシ、反出時間は１分乃至４８時間、好ましくは１０分
乃至２５時間である９反応物を塩析、沈澱、再結晶、溶
出、カラム分別等の手段により製精し、結合体を得る。
本発明のヒト免疫グロブリンと抗腫癌性物質との結合体
（以下、本物質と略称する）の咄乳動物に対する急性毒
性をマウスに４０００■／匂の投与量で静脈注射して調
べたが、１週間の観察では死亡が認められなかった。
さらに、ヒト免疫グロブリンをペプシン（Ｎｉｓｏｎｏ
ｆｆＳｃｉｅｎｃｅ　１３２１？７０（１９７０））％
　プラスミン（ＳｇｏｕｒｉｓＶｏｘ　Ｓａｎｇ　１８
７１（１９６７）　）、サーモライシン（特願昭５Ｏ−
１９８７１）、ノぐパイン、トリプシン、キモトリジシ
ンで酵素水解して得られる低分子抗体についても、抗腫
瘍剤を結合せしめて検討を行なった。これらの物質例え
ばＦ（ａｂ’）１でも毒性は４０００■／Ｋｔ以上であ
った。
したがって、本物質は、毒性が極めて低く、頻回投与も
可能でさらに各梅の人癌に対して有効である。例えば、
急性白血病、悪性リンパ腫、熱押、肉腫悪性繊毛上皮腫
、急性骨髄性白血病、メラノーマ、急性リンノソ性白血
病、骨髄癌等に有効である。本物質を抗腫瘍剤として用
いる場合の製剤化法、および投与の方法としては、抗腫
゛瘍剤に関する公知の方法を適用し得る。投与方法とし
ては、経口、注射または直腸投与があげられる。投与形
態としては、粉末、顆粒、錠剤、または注射剤、座薬の
いずれであってもよい。特に錠剤あるいは注射による投
与か好ましい。注射薬の製剤には、生理的食塩水、滅菌
水、リンゲル液等の水溶性溶剤、非水浴性溶剤き張化剤
、無痛化剤、安定剤、防腐剤、懸濁化剤、緩衝剤、乳化
剤等を任意に用いうる。
その−例を示すと、本物質１ｆとマンニトール５ｆを蒸
留水に俗解して５０−として常法で除菌した後、それを
注射用小瓶に分けたり、又はそのまま凍結乾燥して注射
剤とする。そして本則は、使用に際し、生理的食塩水で
稀釈して注射液とする。本物質は製剤化中一般に０．０
１〜９０％、好ましくは０．１〜６０％含有することが
出来る。
本物質の投与量は主として症状に左右されるが成人１人
１日当り０．１ｆ〜１０ｔ１好ましくは１〜６ｆである
。
本発明によると、ヒト免疫グロブリンおよび酵素処理ヒ
ト免役グロゾＩＪ　’７の向呻瘍性ならびに、抗腫瘍性
物質の抗腫瘍性は失なわれることなく上記化合物に保た
れているので、本物質は、投与されると効率よく目的と
する腫席部位に到達し、長期間残存し、抗腫鵬効果を発
揮する。
本発明は、必ずしも抗体を抗腫瘍抗体から選ばなくても
すむために工業的には大変有利であると言える。
以下に、本発明を実施例によって史に詳細に忰＃＃に説
明する。
実施例１ ヒト免疫グロブリンの分布 実用性のある抗体はいかなる抗体であるかを検索する為
に、抗８−１８０ウサギ免疫グロブリン、正常ＩＯＲマ
ウス免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリンの生体内分布
を調べる為に各物質に１２６■−標識を行なった。
すなわち、Ｗ、　Ｈ，ＨｕｒｔｅｒらＢｉｏｃｈｅｍ、
　Ｊ、　８９１１４（１９６３）の方法に従って免疫グ
ロブリンのタンＡり質部分にＨ１ｌ■−標識を行なった
。方法はいずれも同様であるので一例をあける。マイト
マイシンＯ結合抗５−ｔｓｏ抗体を５ｗ１Ｉ／Ｎｔの濃
度になる様に０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に
溶かした。その０．５−をスビック管に入れ、そこに０
．２５ｍ０ｉのＮ８１２６　Ｉを加える。さらに０．０
５Ｍのリン酸緩衝液２００μＩ！に溶かした０、７■の
クロラミンＴを加えて０℃で１５分反応させた。続いて
０．０５Ｍのリン酸緩衛液に溶かしたピロ亜硫酸ナトリ
ウム（１，７５〜）とに工（ｔｏｗ）を加えて反応を停
止した。
反応液をＳ　ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５（φ２．２ｃ
ｒｎＸ　４０ｃｙ＋＋）カラムを用いて、未反応の放射
性ヨード及び試薬を除去した。このようにして１１５ニ
一標識マイトマイシン結合抗８−１８０ウサギ免疫グロ
ブリンを得た。以下同様にして１２５　工標識正常Ｉ（
３Ｒマウス免疫グロブリン、１１５　■標識ヒト免疫グ
ロブリンを得た。これらを用いて生体内分布の検討を行
なった。
すなわち、Ｓ−１８０担癌Ｉ０１’Ｌマウス（＃植後２
週間）を用いて、静脈内に投与し、２４時間後と１４４
時間後に動物をと殺して、解剖し、血液８−１８０腫瘍
部位、肝臓、腎臓、ひ臓、消化器等の各臓器を取り出し
てウェル型のγ−カウンターでカウントを行ない、投与
薬剤の各組織重量当りの到達薬剤量という形で分布を以
下のように表示した（表−１）。
さらに１４４時間後における各臓器に残存する量の合計
に対する各臓器における量の率を残存率として表わすと
下表−２のようになる。
これらの結果は腫瘍抗原を異種動物に免疫して得られる
異種抗体が優れた到達率を示すことを表わしている。し
かし、同種の自然抗体も特異抗体に比べて腫傷到達率は
１１５〜１／１０と落ちるが、他の臓器に比べると腫瘍
部位での残存率が高いということがここに判明した。こ
のことから自然抗体がキャリヤーとして天川性の高い抗
体であることを知るに到った。
実施例２ ヒト免疫グロブリンの調整 ヒト正常人血清１０００−に対し１０００ｍの０．００
５Ｍ　ＩＪン酸緩衡食塩水（以下、ＰＢＳと略）を加え
て希釈する。この希釈血清に２０００−の飽和硫安水溶
液（ｐＨ７，２）をかくはんしながら徐々に加える。
４℃で６０分放置すると塩析物が析出沈澱してくるので
８０００　ｒ、　ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離を行ない
沈澱を集める。この沈澱をＰＢＳに洛かし、全量を１０
０（ｌｄとする。これに対し攪拌しながら、徐々に飽和
硫安の２５０−を加え２０％飽和とする。
溶液が白濁し、沈澱を生ずる場合はフィブリノーゲンで
あるので遠心除去を行なう。この上清に飽和硫安の２５
０−を加え３３％飽和とする。６０分放置した後８００
０　ｒ、　ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離を行ない沈澱を
集める。この沈澱を１０００−のＰＢＳに溶解した後５
００ｍの飽和硫安を加える。６０分攪拌後８０ＧＯｒ、
ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離を行ない沈澱を集める。得
られた沈澱を３００ｄのＰＢＳに溶かして、ＰＢＳに対
して透析を行ない硫安を除いた。さらに透析終了後、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースカラム（直径５　ｃｙｎＸ　５０　
ｃｍ　）を用いて、０，００５ＭｐＨ８，０です通りす
るフラクションを集めた。す通の両分を蒸留水に対して
透析して脱塩の後、凍結乾燥してヒト免疫グロブリン１
２．５　ｆを得た。
実施例３ 正常人由来ヒト免疫グロブリンとマイトマイシン０塩酸
ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、プレオマイシン
、アクチノマイシン、ザルコマイシンの各々とを反応せ
しめて、ヒト免疫グロブリン結合抗生物質を合成した。
以下に合成例を述べる。
ａ−ｔ　　マイトマイシンＣの結合 １、Ｏｆのヒト免疫グロブリンを１００−の蒸留水に溶
解する。そこに１１１．３■のマイトマイシンＣを溶解
させる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５．５に調整し
つつ、４℃で２６２．６ηの１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノゾロビル）−カルボシイミド塩酸塩を刃口
えて下記の時間反応させ、酢酸−酢酸すｌ−ＩＪウム緩
衝液（ｐＨ５，５）５−の添加で反応を停止させた。次
いで、反応液を限外ろ過器を用いてｓｏｗＫ濃縮脱塩を
行なった。１０−の濃縮液ヲセファデックスＧ−２５（
ファルマシア・ジャＡン社）を充填した直径５倒、高さ
９０ｃｍのカラムを通して、反応液中の高分子量物質及
び低分子量物質を完全に分離した。浴出液を超遠心分離
で４０，０００　ｆＸ　６０分遠心分離して得られた上
滑液を０℃で凍結乾燥して製品たる本物質を得た。
ヒト免疫グロブリンに対する各反応時間におけるマイト
マイシ／Ｃの結合量を３６０ｎｍの紫外線吸収を用いて
測定した結果は、表−３に示すごとくであった。
表−３ −２ 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１．Ｏｆと塩酸
ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、プレオマイシン
およびアクチノマイシンＤのそれぞれと反応せしめて約
８００１ｖの本物質を得た。塩酸ドキソルビシンのヒト
免疫グロブリン（■）尚りの結合量は反応時間６０分、
２４時間で夫々４．８μ？　、　９．５μ？であった。
実施例４ 正常人由来ヒト免疫グロブリン−とクロラムブチル、メ
ルフアラン（フェニルアラニンマスタード）ＡＯＮＵ　
、ウラムスチン、シクロホスファミド、メルフアランメ
チルエステルの各々と反応せしめて、了ミド結合による
それぞれの化合物を合成した。
以下その合成例を述べる。
４−１　　メルフアランの結合 １、Ｏｖのヒト免疫グロブリンを１００ｍ１の蒸留水に
溶解する。そこに１ｏｏ１Ｈｉのメルフアランを懸濁さ
せる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５．５　Ｋ調節し
つつ、４℃で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボシイミド塩酸塩を加えて２４時間反
応させ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衡液（ｐＨ５，５）５
−の添加で反応を停止させた。
次いで反応液を限外ろ過器を用いてｌＯ−に濃縮脱塩を
行なった。１０ｒｎｔの濃縮液をセファデックスＧ−２
５（ファルマシアージャ／（’ン社）全充填した直径５
画、高さ９０ｃｍのカラムを通して反応液中の高分子量
物質及び低分子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠
心分離で４０，０００ｆＸ６０分遠心分離して得られた
上清液を０℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。こ
の物質中のタン／ぐり含量はアルブミンを標準とした一
鋼−フォリン法により、アルキル化活性はＥｐｓｔｅｉ
ｎの方法（ＥｉｐｇｔｅｉｎＪ、　Ａｎａｌ、　Ｏｈｅ
ｍ　２７１４２３（１９５５））でそれぞれ測定した。
この結果ヒト免疫グロブリンに対してメルフアランが６
μ？結合していることがわかった。
−２ 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１．Ｏｆとクロ
ラムブチル、ＡＯＮＵ、ウラムスチンのそれぞれと反応
せしめて約９００１１１ｇの本物質を得た。ヒト免疫グ
ロブリンｃ■）当シのクロラムブチルの結合量は反応時
間６０分、２４時間で夫々５．１μ？。
１１．７μ２であった。
４−３　メルフアランメチルエステルの結合１、Ｏｆの
ヒト免疫グロブリンｉ　Ｚｏｏｍの蒸留水に溶解する。
そこに１００岬のメルフアラン、メチルエステル塩酸塩
を溶解させる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５６５に
調節しつつ、４℃で１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルＩジイミｒ塩酸塩を加えて２４時
間反応させ酢酸−酢酸ナトＩＪウム緩衡液（ｐＨ５，５
）５−の添加で反応を停止させた。次いで反応液を限外
ろ過器を用いて、１０ｍ１Ｋｒｌｋ縮脱塩を行なった。
ｌＯ−の濃縮液ヲゼファテ０ツクスＧ−２５（ファルマ
シアＵジャＡン社）を充填した直径５の、高さ９０ｃＩ
ｎのカラムを通して反応液中の高分子量物質及び低分子
量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０，
０００ｔＸ６０分遠心分離して得られた上清液を０℃で
凍結乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリ
ン■あたヤの結合量は１０μ？であつた。
実施例５ 正常人白米ヒト免疫グロブリンとシタラビン、８−アザ
グアニン、５−フルオロウラシル、メントレキ毎−トお
よびアミノプテリンナトリウムの各々と反応せしめて、
アミド結合によるそれぞれの化合物を合成した。以下に
その合成例を述べる。
５−１　メントレキセートの、結合 １、Ｏｆのヒト免疫グロブリンを１００ｍ１の蒸留水に
溶解す木。そこに１５１．３Ｗｑのメソトレキセートを
溶解させる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５．５に調
節しつつ、４℃で１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノゾロビル）−カル昶ジイミｒ塩酸塩を加えて下記の時
間反応させ、酢酸−酢酸す）　＋７ウム緩暫液（ｐＨ５
’、５）５−の添加で反応を停止させた。次いで反応液
を限外ろ過器を用いて１〇−に濃縮し脱塩を行なった。
１０−の濃縮液をセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア・ジャパン社）を充填した直径５備、高さ９０ｙｎの
カラムを通して反応液中の高分子量物質及び低分子量物
質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０．００
Ｏｆ×６０分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結
乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリンに
対するメントレキセートの結合端を３０５ｎｍの吸収を
用いて測定した結果は■タン、Ｒり当り８．３μ？であ
った。
−２ 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１．Ｏｆと７タ
ラビン、８−アザグアニン、５−フルオロウラシル、了
ミノプテリンナトリウムのそれぞれと反応せしめて約９
１０岬の結合化合物・を得た。ヒト免疫グロブリンη当
りのシタラビン結合量は反応６０分、２４時間で夫々４
．７’／Ｊｌ　、　８．３μｔであった。
実施例６ ヒト免疫グロブリンの１ｆを１００−の０．Ｉ　Ｎ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）に溶解させる。酵素と
蛋白質との比率を１／１００　（重量／重量）としてペ
プシンを加え、３７℃で１６時間消化を行なう。その液
に固体のトリス塩酸塩を加えてｐＨ８，０として反応を
停止させる。反応液を限外ろ過器によシ濃縮して１０ｔ
ｎｔとする。直径５ｃ１ｎで高さ９０譚のカラムにセフ
ァデックスＧ−１５０を充填し、そこに濃縮液の５ゴを
チャージし、ｐＨ７のＰＢ８で溶出する。３つのピーク
に分離するが第１番目の−一りをＦ（ａｂ’）１として
集める。この画分を透析チューブにつめて脱塩し凍結乾
燥を行ないヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）１を得た。
実施例？ −１ ヒト免疫グロブリンＦ’（ａｂ’）１の５００１１ｑを
５０−の蒸留水に溶解する。そこに５５．６■のマイト
マイシンＣを溶解させる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨ
を５．５に幽整しつつ４℃で１３１．３’ｆの１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミド塩酸塩を加えて下記の時間反応させ、酢酸−酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨｓ、５）ｓ−の添加で反応を停止
させた。次いで反応液を限外ろ過器を牟 用いて５−にｍｕ液をセファデックスＧ−２５（ファル
マクア・ジャパン社）を充填した直径５ｃｒＲ１尚さ９
０儒のカラムを通して反応液中の高分子量物質及び低分
子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０
，０００ｆＸ６０分遠心分離して得られ九上清液を０℃
で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブ
リンＰ（ａｂ’）２に対する、各反応時間におけるマイ
トマイシンの結合量を３６０ｎｍの紫外線吸収を用いて
測定した結果は表−４に示すごとくであった。
表−４ −２ 上記の操作に準じてヒト免役グロブリンＦ（ａｂ’）２
５００ｑと塩酸Ｐキソルピシン、塩酸ダウノルビシン、
プレオマイシンおよびアクチノマイシンＤのそれぞれと
反応せしめて、約８００■の結合化合物を得た。塩酸Ｐ
キソルビシンのヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ’）＋　
”ｆ当りの結合量は反応時間６０分、２４時間で夫々８
．５μ？　、　１９．６μＶであった。
−３ 上記の操作に準じてヒト免役グロブリンＦ（ａｂ’）１
５００■とクロラムジチル、メルフアラン、ＡＯＮＵ。
ウラムスチン、メルフアランメチルエステル、シクロホ
スファミドの各々と反応せしめて約４００岬の結合化合
物を得た。メルフアランのヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ
’）２η当りの結合ｔｈｔは反応時間９０分、２４時間
で夫々８．１μｆ　、　１７．６μＶであった。
−４ 上記の操作に準じて、ヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ’
）２５００１１ｖとシタラビン、８−アザグアニン、５
−フルオロウラシル、メソトレキセート、アミノプテリ
ンナトリウムのそれぞれと反応せしめて約４００　ｑの
結合化合物を得た。メントレキセートのヒト免疫グロブ
リンＦ（ａｂ’）２η当りの結合量は反応６０分、２４
時間で夫々７．５μり、　１７．３μｆであった。
実施例８ Ｉ（ｊＲマウスを用いて継代培養したマウスザルコーマ
−１８０腫瘍細胞を１０匹からなる群の各ｌ０Ｔｔマウ
スの腋下部の皮下にｔ　ｘ　ｔｏｅ個／匹移植し、移植
の２４時間後から各種抗体、各市販抗腫瘍剤、ヒト免疫
グロブリン、ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２および
各種抗腫瘍性物質との結合物のそれぞれの水溶液を１日
直に１回合１ｉｉ１０回各マウスの腹腔内に注射し、最
後の注射の５日後にマウスを殺して腫瘍を摘出して秤量
し１０匹についての平均値を求めた。この平均腫瘍重量
（ηを、結合物水溶液の代りに生理的食塩水を１０回投
与した対照群マウス１０匹の平均腫瘍型ｔ　（Ｕ）と比
較することＫよって、本発明結合物の腫瘍増殖抑制率７
に示す。表−５はマイトマイシンＣとで合成した結合物
、表−６はプレオマイシンとで合成した化合物、表−７
Ｆｉ塩酸Ｐキソルピシンとで合成した化合物による結果
である。
表−５ 表−６ 表−７ 実施例９ 吉日肉腫に対する抗腫瘍効果 Ｄｏｎｒｙｕラットを用いて継代培養した吉日肉腫腹水
細胞を１０匹からなる群の各Ｄｏｎｒｙｕラットの腹腔
内にＩ　Ｘ　１０’個／匹移植し、移植の２４時間後か
らヒト免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’
）１と各種抗腫瘍剤、それぞれ単独およびヒト免疫グロ
ブリン、ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２と各種抗腫
瘍性物質との結合物のそれぞれの水溶液を１１置に５回
、合計で５回、各々のラットの腹腔内に注射し、試料投
与群の平均生存日数（Ｔ）および対照群の平均生存日数
（０）を求め、処置率（Ｔ１０Ｘ１００）を算出した。
結果を表−８乃至表−１０に示す。
表−８ 表−９ 表−１０ 実施例１０ マウス白血病Ｐ−３８８に対する抗腫瘍効果ＤＢＡ／２
マウスを用いて継代培養したＰ−３８８腹水細胞を１０
匹からなる群の各ＤＢＡ／２マウスの腹腔内Ｋ　Ｉ　Ｘ
　１ｏｓ個／匹移植し、移植の２４時間後から各種抗腫
瘍剤、それぞれ単独およびヒト免疫グロブリン、ヒト免
疫グロブリンＦ（ａｂ’）２と各種抗腫瘍性物質との結
合物のそれぞれの水溶液を１日１回５日間連続、合計で
５回各マウスの腹腔内に注射し、試料投与群の平均生存
日数（Ｔ）および対照群の平均生存日数（０）を求め、
延命率（Ｔ１０Ｘ１００）を算出した。結果を表−１１
乃至表−１３に示す。
表−１１ 表−１２ 表−１３ 実施例１１ １１−１ ５００■のデキストランを５００−の蒸留水に溶解させ
、ｐＨをＩＮのＮａＯＨを加えて１１とする。室温で、
２５０η／ｍｊＫ調整したＢｒ０Ｎのアセトニトリル溶
液を、すばやく攪拌しながら加える。ＮａＯＨを加えて
ｐＨを１０．８〜１１．０に調整する。Ｂｒ０Ｎを加え
終った後１０分ｐＨを保っておく。そこに２．５−の水
に溶解した１００１９のへキサメチレンジアミンを加え
てｐＨをＩＮのＨＯＩ　Ｋて９．０にあわせる。５分間
、攪拌した後、２５０Ｉｖのメルフアランを加えて、ｐ
Ｈを６．５におとしｐＨを１５分間そのままに保つ。反
応終了後４℃で反応液を１０−に濃縮する。１０ｍの濃
縮液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア・ジャ／
ぞン社）を充填した直径５備、高さ９０３のカラムを通
して反応液中の高分子量物質及び低分子量物質を完全に
分離した。溶出液を超遠心分離で４０，０００ｆＸ６Ｇ
分、遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して
製品たる化合物を得た。この結合物はメルフアラン−デ
キストラン結合体で１分子のデキストランあたり３０分
子〜５０分子のメルフアランが全台していた。この結合
体１００４とヒト免疫グロブリン１００ｑをグルタルア
ルデヒドを用いて結合体を作製した。同様圧してヒト免
疫グロブリンＦ（ａｂ’）１を用いて結合体を得た。
　１−２ ５００■のデキストランを５００−の蒸留水に溶解させ
、ｐ）（をＩＮのＮａＯＨを加えて１１とする。室温で
２５０η／−の濃度に調整したＢｒ０Ｎのアセトニトリ
ル溶液をすばやく攪拌しながら加える。
ＮａＯＨを加えてｐＨを１０．８〜１１．０に調整する
。
Ｂｒ０Ｎを加え終った後１０分間ｐＨを保っておく。
そこに２．５−の水に溶解した１００■のへキサメチレ
ンジアミンを加えてｐＨをＩＮのＨＵＪにて９．０にあ
わせる。５分間、攪拌した後、２５０＋１９のマイトマ
イシンＣを加えてｐＨを６．５におとし、ｐＨを１５分
間、そのままに保つ。反応終了後、４℃で反応液を１０
ｄＫ濃縮する。１０ｄの濃縮液をセファデックスＧ−２
５（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径５ｃＩ
ｎ、高さ９０ｃｒｎのカラムを通して反応液中の高分子
量及び低分子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心
分離で４０，０００ｒ×６０分遠心分離して得られた上
清液を０℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。この
結合物はマイトマイシンＯ−デキストラン結合体で１分
子のデキストランあたり３０分子〜５０分子のマイトマ
イシン０が結合していた。
この結合体１００ηとヒト免役グロブリン１００＋１９
をグルタルアルデヒド最終１００μｆ／ｄとなる濃度で
加えて室温で１時間反応を行ないヒト免疫グロブリン結
合デキストラン−マイトマイシンｃを得た。
　ｌ　−３ ５００ｑのデキストランを５００艷の蒸留水に溶解させ
ｐＨをＩＮのＮａＯＨを加えて１１とする室温で２５０
η／−の濃度に調整したＢｒ０Ｎのアセトニトリル溶液
をすばやく攪拌しながら加える。ＮａＯＨを加えてｐＨ
を１０．８〜１１．０に調整する。Ｂｒ０Ｎを加え終っ
た後１０分間ｐＨを保っておく。そこに２．５ｍｌの水
Ｋｇ解した１００ηのへキサメチレンジアミンを加えて
ｐＨをＩＮのＨＯ／にて９．ＯＫあわせる。５分間攪拌
した後、２５０■のメソトレキセートを加えてｐＨを６
．５におとしてｐＨを１５分間そのままに保つ。反応終
了後、４℃で反応液を１０ｍＫ＠縮する。ｌＯ−の濃縮
液をセファデックスＧ−２５（ファルマシアφジャパン
社）全充填した直径５ｃＩｎ、高さ９０ｍのカラムを通
して反応液中の高分子量及び低分子量物質を完全に分離
品たる化合物を得た。この結合物はメントレキセートー
デキストラン結合体で１分子のデキストランあた＃）３
０分子〜５０分子のメソトレキセートが結合していた。
この結合体１００ｍ１９とヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ
’）２１２０■をグルタルアルデヒド最終１００μｆ／
−となる濃度で加え結合体を作製した。
同様にしてヒト免疫グロブリンを用いて結合体を得た。
実施例１２ １２−１ マイトマイシン０１１．３”Ｐを、０．０１Ｍのリン酸
緩衝液（ｐＨ６，８）に１ｍ１Ｋ溶解させる、ことに１
％のグルタルアルデヒド水溶液２０μｌを加えて室温で
８時間攪拌する。そこに１００ｑのヒト免疫グロブリン
を２０１ｎｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶解した
液を加えて１らに２時間室温で反応メさせる。
反応終了後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア・
ジャ、ｅン社）を充填した直径５ｃｒｎ１高さ９０ｍの
カラムを通して反応液中の高分子量物質及び低分子量物
質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０，００
０ｆＸ６０分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結
乾燥して製品たる化合物を得た。
ヒト免疫グロブリンに対するマイトマイシン０の結合量
は蛋白ηあたシ、９．６μＶであった。
ｌ　２−２ アドリアマイシン１９６■を０．０１　Ｍのリン酸緩衝
液（ｐＨ６，８）Ｋｉｍに溶解させる。ここに１％のグ
ルタルアルデヒド水溶液２０μｌを加えて室温で８時間
攪拌する。そこに１００１１ｆのヒト免疫グロブリンを
２０ｄのリン酸緩町液（ｐＨ６，８）に溶解した液を加
えて、さらに２時間室温で反応をさせる。反応終了後、
セファデックスＧ−２ｓ（ファルマシア・ジャ／ぞン社
）を充填した直径５６ｎ１高さ９０ｃｒＲのカラムを通
して、反応液中の高分子量物質及び低分子量物質を完全
に分離した。溶出液を超遠心分離で４０，０００　ｒＸ
　６０分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥
して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリンに対す
るアドリアマイシンの結合量は蛋白■あたり５．６μ？
であった。
同様にしてヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２を用いて
結合体を得た。
　２−３ メントレキセー）２００ｑを０．ＯＩＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ６，８）に１ｍ／に溶解させる。ここに１％のグ
ルタルアルデヒド水溶液２０μｌを加えて室温で８時間
攪拌する。そこに１００■のヒト免疫グロゾリンＦ（ａ
ｂ’）１を２０＋ｄのリン酸緩（液（ｐＨ６，８）に溶
解した液を加えてさらに２時間室温で反応をさせる。反
応終了後、セファデックスＧ−２５＜７アルマシア・シ
ャツぞン社）を充填した直径５譚、高さ９０ｃｆＲのカ
ラムを通して、反応液中の高分子量物質及び低分子量物
質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０，０Ｏ
ＯｆＸ６０分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結
乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリンＦ
（ａｂ’）＊に対するメントレキセートの結合量は蛋白
岬あたり７．８μ？であった。
実施例１３ １３−１ マイトマイシン０１１．３岬とヒト免疫グロブリンの１
００１１ｖｆ：０．２Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，
３）の１０−溶解させる。そこに５■のジエチルマロン
イミデートを加えて室温でｐＨを８．６に保ったまま、
１時間攪拌させる。さらに２．５Ｗのジエチルマロンイ
ミデートを添加して１時間攪拌を行なった。反応終了後
、中性ＫｐＨをもどした後、４５％の飽和硫安を加えて
ヒト免疫グロゾリンーマイトマイシンＣ結合体を沈澱さ
せた。７０００　ｒ、　ｐ、ｍ。
で１５分遠心分離を行ない沈澱を集めた。沈澱を５μ？
１Ｍのリン酸緩ス液５７！に溶解し、蒸留水に対して透
析を行ない硫安が検出されなくなるまで（７２ｈｒ）ｉ
析した。透析終了後、セファデックスＧ−２５＜ファル
マシア・シャツミツ社）を充填した直径５ｔＭ、高さ９
０ｃＩｎのカラムを通して反応液中の低分子量物質を完
全にのぞいた。溶出液を一２０℃で凍結乾燥して製品た
る化合物を得た。ヒト免疫グロブリンＩ＋ｖ尚りの結合
量は６．３μ？であった。
同様にしてヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ’）雪を用い
て結合体を得た。
３−２ 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリンｉｏｏｔ１１ｇ
とメルファ゛ラン、アミノゾテリンナトリウムとの反応
を行ない８５■の結合化合物を得た。
実施例１４ 実施例１１、実施例１２、実施例１３で合成した化合物
について実施例８，９．１０の抗帥瘍試験を用いて効果
を調べた結果を表−１４乃至表−１６に示した。
表−１４ 表−１５ 表−１６ 代理人弁理士今　　村　　　元

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　　ヒト免疫グロブリンに抗ｍｉ性物質を結合し
    た化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。
  2. （２）　　ヒト免疫グロブリンが正常人由来のものであ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗腫
    瘍剤。
  3. （３）　　ヒト免疫グロブリンがＦ（ａｂ’）１である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記
    載の抗腫瘍剤。
  4. （４）抗＠瘍性物質が、アルキル化剤、代謝拮抗剤及び
    抗生物質から成る群から選択されることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の抗腫
    瘍剤。
  5. （５）　　アルキル化剤が、クロラムジチル、メルフア
    ラン及びそのエステル、ＡＯＮＵ並びにシクロホスファ
    ミドから成る群から選択きれることを特徴とする特許請
    求の範囲第４項に記載の抗腫瘍剤。
  6. （６）　　アルキル化剤がメルフアラン又はそのエステ
    ルであることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載
    の抗腫瘍剤。
  7. （７）代謝拮抗剤が、シタラビン、８−アザグアニン、
    ５−フルオロウラシル、メソトレキセート及びアミノプ
    テリンナトリウムから成る群から横を群木与選択される
    ことを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の抗腫瘍
    剤。
  8. （８）　　抗生物質が、マイトマイシンＣ１塩酸ドキソ
    ルビシン、塩酸ダウノル−シン、プレオマイシン及びア
    クチノマイシンＤから成る群から選択されることを特徴
    とする特許請求の範囲第４項に記載の抗腫瘍剤。
  9. （９）水浴性カルゼジイミドを用いて結合されることを
    特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれか
    に記載の抗腫瘍剤。 Ｏｎ　　イソシアナート、ジエチルマロンイミデート、
    グルタルアルデヒＰ１　ポリグルタミン酸又はデキスト
    ランを用いて結合されることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項乃至第８項のいずれかに記載の抗腫瘍剤。 ０１）注射剤の形態にあることを特徴とする特許請求の
    範囲第１項乃至第１θ項のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
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