CS237334B2 - Processing of aminopropylaminobleomycine derivative - Google Patents

Description

Tento vynález se týká nových aminopropylaminobleomycinových derivátů.

Bleomyciny jsou protinádorové antiblotické sloučeniny objevené Umezawou v roce 1966, jedním z autorů tohoto vynálezu [Journal of Antibiotics 19A, 200 (1966)]. Bleomycin je produkován mikroorganismem Streptomyces verticillus (Actinomycet).

Bleomycin je bazický, ve vodě rozpustný glykopeptid, který je schopen snadné komplexace s jedním atomem dvojmocné mědi. Obvyklou kulturou je produkováno 16 bleomycinů, všechny jsou izolovány [například Umezawa a spol.: Journal of Antibiotics 19A, 210 (1966)]. Různé bleomyciny jsou popsány také v USA patentu 3 922 262 a v obnoveném USA patentu 30 451. Pro svoji významnou protizánětlivou účinnost jsou bleomyciny široce používány v klinických oblastech therapie rakoviny navzdory některým nežádoucí vedlejším efektům, jako je jejich pulmonární (plicní) toxicita.

Zvláště jsou užitečné při léčení squamosního buněčného karcinomu, dále pak rakoviny kůže, hlavy a krku, rakoviny plic a maligního lymphomu. Stále je však žádoucí, aby byla dále zlepšena protinádorová účinnost bleomycinů a dále sníženy vedlejší účinky, zvláště pulmonární toxicita.

Autoři tohoto vynálezu věnovali pozornost faktu, že aminopropyl-N-methylaminopropylamlnobleomycin (ve zkratce APMP) silně Inhibuje růst HeLa buněk a intenzívně studovali snížení pulmonární toxicity APMP. Tento vynález je založen na objevu, že chemickou modifikací terminální aminoskupiny APMP různě substituovanými alkylovými skupinami je možné značně snížit pulmonární toxicitu.

Nové aminopropylaminobleomyciny podle tohoto vynálezu zahrnují jak formu obsahující měď, tak i formu, která neobsahuje atom mědi. Tyto nové aminopropylaminobleomyciny jsou sloučeniny obecného vzorce I [BX]-NH-(CH₂)₃-A-(CH₂)3-B (I) v němž [BX] znamená zbytek vytvořený odtržením hydroxylové skupiny z karboxylové skupiny bleomycinové kyseliny obecného vzorce

^Rt

I I —N-—R—N—

I I ^R2 ^R2 (v případě formy, která obsahuje atom mědi, je ve vzorci vynechán atom mědi),

A znamená skupinu obecného vzorce

kde

Rj znamená nižší alkylovou nebo· benzylovou skupinu,

R2 znamená nižší alkylovou nebo benzylovou skupinu,

R znamená nižší alkenylovou skupinu a n znamená číslo 0 nebo^ 1, a

B znamená skupinu obecného vzorce

R4 —N—R3 kde

R₃ a R znamenají nezávisle na sobě buď atom vodíku, nebo alkylovou skupinu, která může být substituována jednou nebo· více fenylovými, naftylovými, anthranylovými, furylovými, thienylovými, norbornenylovými nebo cykloalkylovým-i skupinami [tyto· skupiny mohou být dále substituovány jedním nebo více atomy halogenu, nižší alkylovou skupinou, nižší alkoixyskupinou, kyanoskupinou, halogenmethylovou skupinou nebo benzyloxyskupinou (benzyloxyskupina může být substituována jedním nebo více atomy halogenu nebo nižší alkoxyskupinou, benzyloxyskupinou nebo cykloalkylmethyloxyskupinou), s tím, že alespoň jedna ze skupin R3 a R4 neznamená atom vodíku.

JakO' příklady nižších alkylových skupin lze uvést methylovou, ethylovou, propylovou, isopropylovou, butylovou a isobutylovou skupinu, jako· příklady atomů halogenu atom fluoru, chloru a bromu, jako· příklady nižších alkylenových skupin ethylenovou, trlmethylenovou, tetramethylenovou, pentamethylenovou a hexamethylenovou skupinu, íako příklady cykloalkylových skupin cykíope-ntylovou, cyklohexylovou, cykloheptylovou, cyklooktylovou, cyklodekanylovou, cykloundekanylovou, cyklododekanylovou a cyklotridekanylovou skupinu, jako· příklady nižších alkoxylových skupin methoxyskupinu, ethoxyskupinu, propoxyskupinu a butoxyskupinu a jako příklady halogenmethylových skupin lze uvést trifluormethylovou a trichlormethylovou skupinu.

Příklady skupiny

Ri —N— (RJ ve shora uvedené skupině A jsou skupiny

CH3

I —N—

C2H5 —N— a

C₂H₅C_cH₅ —N— jestliže n znamená číslo 0, a skupiny

CH3 —N—

I

CH3

C2H5 I —N—

I

C2H5

C4H9 I —N— a

I

C4H9

CH3 I —N— ch₂c₀h₅ jestliže n znamená číslo 1.

Příkladem skupiny

Rlř —N—R—N—

R2r je skupina

CH3CH

ГГ —N— (CH2)3—N—

I ' I CH3CH

Příklady sloučenin obecného vzorce I, které jsou žádoucí z hlediska farmakologieké účinnosti, jsou ty sloučeniny, v nichž A znamená skupinu /“A

-N N~

CH3CH3 —N—( CH₂)3-NII

CH3CH3 nebo skupinu

Ri —ΜΙ (R2)n я

1β kde R_f znamená nižší alkylovou skupinu. R₂ znamená nižší alkylovou nebo benzylovou skupinu, n znamená číslo 0’ nebo 1 a R₃ a R- ve skupině B znamenají nezávisle na sobě 1. atom vodíku, 2. benzylovou skupinu, která může být substituovaná jedním nebo více atomy halogenu nebo benzyloxyskupinou, kyanoskupinou, halogenmethylovo-u skupinou, halogenbenzyloxyskupinou, nižší alkoxybenzyloxyskupinou, benzyloxy benzyloxyskupinou nebo cykloalkylmethoxyskupínou, 3. naftylmethylovo-u skupinu, 4. halogenfenylethylovou skupinu nebo 5. nižší alkylovou skupinu substituovanou cykloalkylovou skupinou s 8 až 13 atomy uhlíku, s tím, že alespoň jedna ze skupin R₃ a R4 neznamená atom vodíku.

Příklady representativních sloučenin po>dle tohoto vynálezu jsou uvedeny v tabulce

1.

Tabulka · 1

sloučenina č.	název sloučeniny	zkratka
1	3-{N-me thyl-N- [ 3‘ - (2*‘-p-chlorfenylethylamino) pr opy 1 ] aminojpropylammoBLM	MCLPE
2	3-{Ν-πιο11^1-Ν- [ 3‘- (2“-f enylethylamino) propyl ] aminojpropylammoBLM	MPE
3	3-|N-methyl-N- [ 3‘- (benzylamino) propyl ] o.mmo.jpropylamlnoBLM	MBZ
4	3-[I4-methyl-N-[3‘-(p-chlorbenzylamino]propyl ] aminojpropylamrnoBLM	MCLBZ (p)
5	3-{N-methyl-N- [ 3‘- (m-chlorbenzylamino) propyl ] aminojpropylaminoBLM	MCLBZ (m)
6	3-[N-methyl-N- [ 3‘- (o-chlorbenzylamino) propyl ] omínojpropy]aminoBLM	MCLBZ (o)
7	3-|N-m ethyl-N- [ 3‘- [ m,p-dichlorbenzylamino) propyl] aminojpr^c^f^y^l^ó^nin^t^í^L^M	MDCLBZ (m, p)
8	3-fN-methyl-N-[ 3‘- (ο,ρ-dichlorbenzylamino) propyl ] amino'propylammoBLM	MDCLBZ (o, p)
9	3-(14--^1^1--- [ 3‘-(p-fluorbenz,y lamino )propyl ] amino}propylaminoBLM	MFBZ (p)
10	3-{14-methyl-N-[3‘-(p-brombenzylaminoj- . propyl ] amínojprc^p^yl^mno^I^I^M	MBRBZ (p)
11	3-{^Nmethyl-N-[3‘-(pentofluoг benzylamino ) propyl ] aminoipropylammoBLM	MPFBZ
12	3-|N-methyl--- [ 3‘-(p-methoxybenzylamino*) propyl ] aminojpr opylaminoBLM	MMOBZ (p)
13	3-jN-methyl-N-[ 3‘-(o',p-dimethoxybenzylamino) propyl] amino^jpr^o^f^yil^nib^T^I^l^M	MDMOBZ (0, p)
14	3-{I4-methyl-N- [ 3‘- [ l“-p-chlorf enylethylamino· jpropyl] аmi.nOjproιpylаmiinoBLM	MCLAPE (p)
15	3-(14--^ Unyl--- [ 3‘- (m,p-dibenzyloxybenzylamino·) propyl ] amino|pr opylaminoBLM	MDBZOBZ (m, p)
16	3-jI4-methyl-N- [ 3‘- (3“-fenylpro·pylo.mino) propyl ] amrnoípropylaminoBLM	MPP
17	S-IN-methyl--- [ 3‘- [ 2“,2“-dif enylethylamino ] propyl ] aminojpr opylaminoBLM	MDPE

sloučenina č.	název sloučeniny	zkratka
18	3jN-methyl-N-[3‘-(p-kyanobenzylamino]propyl ] aminojpropylaminoBLM	MCNBZ
19	3-|N-methyl-N- [ 3‘- [ m-trif luormethylbenzylamino') pr opyl ] amin ojpropy laminoBLM	MTFBZ (m)
20	3-{N-methyl-N- [ 3‘- (a-naftylmethylamino) propyl ] aminojpropylaminoBLM	MNAPH
21	3-(N-methyl-N- [ 3‘- (9-anthramethylamino) propyl ] aminojpropylaminoBLM	MANTRA
22	3-(N-methyl-N- [ 3‘- (cyklooktylmethylamino) propyl ] aminojpr opy laminoBLM	MCO
23	3-{N-methyl-N- [ 3‘- (dibenzylmethylamino)propyl]amino]propylaminoBLM	MDBZME
24	3-{N-methyl-N- [ 3‘- (l“-fenylethylamino)propyl] aminojpropylaminoBLM	MAPĚ
25	3-{N-methyl-N- [ 3 ‘- (2“-f urylmethylamino) propyl ] aminojpropylaminoBLM	MFUR
26	3-{N-methyl-N-[3‘-(2“-thienylmethylami- no] propyl ] aminojpropylaminoBLM	MTHIO
27	3-(N-methyl-N-[ 3‘- (dibenzylamino Jpropyl ] aminojpropylaminoBLM	MDBZ
28	3-|N-methyl-N- [ 3‘- (cyklopentylmethylamino] propyl ] aminojpropylaminoBLM	MCP
29	3-jN-methyl-N- [ 3‘- (cyklohexylmethylamino) propyl ] aminojpropylaminoBLM	MCHM
30	3-{N-methyl-N- [ 3‘- (cyklohexylethylamino jpropyl ] amino|propylaminoBLM	MCHE
31	3-{N-methyl-N-[ 3‘-(čykloheptylmethyl- amino)propyl]aminojprppylaminoBLM	MCHEP
32 ..	3-|N-methyl-N-[ 3‘-(cykloundekanylmethylamino] propyl] aminojpr opylaminoBLM	MCU
33	3-jN-methyl-N- [ 3‘- (5“-norbornen-2-methylamino) propyl ] aminojpr opylaminoBLM	MNB
34	3-|N-methyl-N- [ 3‘- (bis/m,p-dibenzyloxybenzyl/aminoi) propyl ] aminojpropylamlnoBLM	MDDBZOBZ
35	3-(N,N-dimethyl-N- [ 3‘- (dibenzylamino ]propyl ] aminojpropylaminoBLM	MMDBZ
36	3-{N,N-dimethyl-N- [ 3‘- (cyklooktylmethylaminojpropyl] aminojpropylaminoBLM	MMCO
37	3-|N,N-diethyl-N- [ 3‘- (dibenzylamino ] propyl] aminojpropylaminoBLM	EEDBZ
38	3-|N,N-dibutyl-N- [ 3‘- (dibenzylamino) pr opyl] aminojpropylaminoBLM	BBDBZ

sloučenina č.	název sloučeniny	zkratka
39	3-ÍN-methyl-N-benzyl-N- [ 3‘-dibenzylamino) př opyl ] aminojpropylaminoBLM	MTBZ
40	3-|N-benzyl-N- [ 3‘- (dibenzy lamino) pr opyljc^mniojprop^ylé^mno^E^LM	ATBZ
41	3-|N,N-drmethyl-N- [ 3‘- (N,N-di:methyl-N/3“-dibenzylaminopropyl/aminoJpropyl ] amino'propy]^aminc^F^LM	PPDBZ
42	3-{N,N-dimethyl-N- [ 3‘- (N,N-dimethyl-N^“-cyklooktylmethylaminopropyl/amino) propyl ] aminojpr opylamdr^cB^LM	PPCO
43	3- [ 4‘- (3“-dibenzylaminopropyl) piperazin-1-yl ] pr opylaminoBLM	PYDBZ
44	3- [ 4‘- (3“-p-chloiibenzylaminopropyl) piperazin-l-yl] propylaminoBIM	PYCLBZ
45	3- [ 4‘- (3“-cyklooktylmethylaminopropyl) pipsrazin-l-yl ] propylaminoBIM	PYCO
46	3-|N,]^’(^Ii^1:hyl-N-[3‘-(2“-p-chlOrfenyleíhylamino) propyl ] aminojpr opylaminoBLM	EECLPE
47	3-{N-methyl-N- [ 3‘- (cyklotridekanylmethylaminoj propyl ] amino] propylaminoBLM	MCT
48	3-|!N-met]iyl-N- [ 3‘- (bis./3“,4“-di/p-chlořbenzylo.v'^/l^e^in^^^l//nminj) propyl ] amino}propyle.minoBLM	MDDCL
49	3-{N-methy/-N- [ 3‘- [ bis/3“,4“-di/m,p-dichlorbenzyloixy/benzyl/amino ] propyl ] amino· propyl a mi noB L M	MDDCL
50	3-lN-methyl-N- [ 3‘- (bis/3“,4“-di/p-methoxybenzyloxy/benzyl/amino) propyl ]aminojpropylammoBLM	MDDMO
51	3-{{^--^f^Ťliyl-N- [ 3‘- (bis/4“-(p-benzyloxy)benzyloxy/ben-zy ктто) propyl ] amino]propylamínoBLM	MDBZOBZOBZ
52	3dN-methy/-N- [ 3‘-(bis/p-cyklooktylmethyloxybenzyl/amino) propyl ] amino]propylammoBLM	MDCDBZ
53	3-{N-methy/-N- [ 3‘- (bis/3“,4“,5“-tribenzyloxybenzyllamino') propyl ] aminojpr opylaminoBLM	MDTBZOBZ

Poznámka: „BLM“ znamená: bleomycin.

Z těchto sloučenin jsou více žádoucí sloučeniny č. 7, 15, 18, 19, 20, 22, 32, 34, 35, 37,

38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,

51, 52 a 53, ' zvláště pak sloučeniny č. 32, 34 a 43.

Sloučeniny podle tohoto· vynálezu obecného vzorce I se vyrábějí dále uvedeným způsobem.

Vynález se týká způsobu výroby amino propylaminobleomycinového derivátu· obecného vzorce I nebo jeho soli (BXJ—NH—(CH₂)₃-A—(СН₂)з-В (Ij v němž [BX] znamená zbytek kyseliny, vytvořený odtržením hydroxylové skupiny z karboxylové skupiny ' bleomycinové kyseliny, vzorce

CONH

CH

CONH₂

CH

I 0 _ZCH /

HO

H

A znamená skupinu obecného- vzorce

HOCH —N— (R₂)n

\ /

ψR, —N—R—N—

II _RaR kde

nebo

Ri, R₂ znamená alkylovou skupinu s 1 až atomy uhlíku nebo benzylovou skupinu,

R znamená alkylenovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku a n znamená číslo· 0 nebo· 1,

B znamená skupinu obecného vzorce /

—N \

Rv němž R₃ a R4 nezávisle na sobě znamenají a) atom vodíku nebo· b) skupinu obecného vzorce

Re

I —CH—Rjj kde R5 a Rc znamenají nezávisle na sobě 1. atom vodíku, 2. cykloalkyl s 5 až 13 atomy uhlíku, 3. alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, která může· být substituována jednou nebo· více cykloalkylovými skupinami s 5 až 13 atomy uhlíku nebo fenylovými skupinami, které mohou být popřípadě substituovány atomem halogenu, 4. fenylovou skupinu, která může být substituována jedním nebo více atomy halogenu · nebo· alkylovými skupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, cykloalkyl (Cj—C.^Jmethyloxyskupmami, alkoxyskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, benzyloxyskupinami, kyanoskupinami, halogenmethylskupinami, halogenbenzyloxyskupinami, alkoxytCf-Jbenzyloxyskupinami nebo^ benzy^ybenzyloxy-skupinami, 5. naftylovou skupinu, 6. thienylovou skupinu, 7. furylovou skupinu, 8. anthranylovou skupinu nebo· 9. norbornenylovou skupinu, s tím omezením, že alespoň jeden-že substituentů · Rj a R_ř; má jiný význam než vodík. Způsob spočívá v tom, že se aminopropylaminobleomycin · obecného vzorce JI [ BX ] —NH— ( CH₂ )₃ - - -A“ ·(CH Ja—NHj (II) v němž [BX] má shora uvedený význam·, a A“ znamená skupinu —N— nebo má výH znám uvedený výše pro· A, nechá reduktivně zkondenzovat s karbonylovou sloučeninou obecného vzorce III

R5—CO—Rg [III] kde R5 a Rg mají výše uvedený význam, a získaný produkt obecného vzorce I se popřípadě převede na svoji sůl.

Mezi redukční činidla, která se při kondenzaci používají, patří hydridoboritany, jako· je například kyanohydridoboritan sodný. Kondenzaci lze uskutečnit také katalytickou hydrogenací za použití katalyzátorů, jako je například paládium na uhlí. Množství použité karbonylové sloučeniny závisí na typu žádaného produktu a nelze je generalizovat. Zhruba se však pohybují v oblasti od 0,5 do· 25 molů, obvykle 0,7 až 20 molů na 1 mol sloučeniny obecného vzorce II.

Derivát, v němž R4 znamená atom vodíku, se získá použitím· 1 až 1,5 molu karbonylové sloučeniny, zatímco derivát, v němž Rj a R4 znamenají stejnou skupinu, se získá použitím 10 molů karbonylové sloučeniny. Jestliže se má vyrábět derivát, v němž Rf, R3 a R4 znamenají stejnou skupinu (například sloučenina č. 40), pak se použije 15 molů karbonylové sloučeniny. Jestliže je sloučenina obecného vzorce III těžko rozpustná v methanolu, jako· například. m,p-dibenzyloxybenzaldehyd, lze její množství snížit prodloužením reakční doby. Kondenzace· se provádí v rozpouštědle, jako je například methanol, voda, dimethylformamid, acetonitril nebo jejich směs. · Reakční teplota závisí na typu zamýšleného žádaného produktu. Obvykle se reakční teplota pohybuje v rozmezí od —5 do 70 ^CC. s výhodou od 0 do 50 stupňů Celsia. Jestliže R4 v žádaném derivátu znamená atom vodíku, pak reakční teplota je 0 až 25 °C. Vyšší reakční teplota, například. 35 až 50 cc, je výhodná, ·jestliže se používá keton nebo* aldehyd, v němž R3 a R4 jsou shodné a stericky značně bráněné, anebo jestliže se používá aldehyd, který je málo rozpustný. Reakční doba je 3 až · 70 hodin. Delší reakční doba je výhodná pro· kondenzaci aldehydu, který je stericky velmi bráněný nebo< málo rozpustný.

Shora popsané deriváty se izolují následujícím^ způsobem.

Jestliže se jako redukční · činidlo použije hydridoboritan, pak se pH reakční směsi přidáním· kyseliny chlorovodíkové upraví na 1; Reakční · směs· se 5 až 10 minut míchá za teploty · místnosti, · aby se rozložil nadbytek redukčního · · ' činidla. · Potom se reakční směs zneutralizuje. · Methanol se · za sníženého tlaku oddestiluje. Nadbytek aldehydu nebo ketonu se odstraní extrakcí etherem nebo butanolem·. Vodná vrstva se odsolí projitím kolonou adso-rptivní pryskyřice, jako· je například Amberliť¹·) XAD—2 (Rohm and Haas Co.), v destilované vodě, přičemž se žádaný produkt adsorbuje na pryskyřici. Sůl se z kolony vymyje destilovanou vodou. Adsorbovaná fáze se eluuje kyselým vodným methanolem, jako je například 0,02N roztok vodné kyseliny chlorovodíkové v methanolu (v poměru 1 : 4 objemovým dílům). Eluované frakce, které obsahují modrý bleomyclnový derivát, se spojí. Jestliže je to· · . nutné, pak se spojené frakce zneutralizují Dowexem^(R) 44 (OH-anex firmy Don Chemical Co,), nahuštěním za sníženého tlaku a Iyofilizací se získá surový modrý prášek žádaného· derivátu. Surový prásek lze vyčistit následujícím způsobem.

Roztok surovéhn prášku v destilované vodě se nechá projít kolonou naplněnou CM237334

-Sephadexem·⁰*) C—25 (Na+-typ; Pharmacia Fine Chemic-als Co·.), který se zekvilibruje s pufrem 0,05M kyseliny octové a octanu sodného o· pH 4,5. Žádaný produkt se adsorbuje na pryskyřici. Adsorbovaná fáze se pak eluuje technikou lineárního· koncentračního gradientu a to tak, že · se ke shora uvedenému pufrovacímu roztoku kontinuálně přidává chlorid sodný. Koncentrace chloridu sodného se tak zvýší až na 1,OM koncentraci. Jestliže jsou eluované frakce se žádaným produktem stále ještě znečištěny, pak po shora uvedené chromatografii následuje další chromatografie na adsorptivní pryskyřici, jako- je například Amberlit^(R) XAD—2.

Roztok surové substance v destilované vodě se nechá procházet kolonou naplněnou pryskyřicí v pufrovacím roztoku, jako je například 4% vodný roztok octanu amonného·. Žádaný produkt se adsorbuje na pryskyřici. Adsorbovaná fáze se eluuje způsobem lineárního koncentračního gradientu, a to tak, že se k pufrovacímu roztoku kontinuálně přidává methanol, takže se koncentrace methanolu postupně zvyšuje. V tomto případě se jako první eluují nezreagované výchozí materiály, pak následuje derivát, v němž R4 znamená atom vodíku, a konečně derivát, v němž R₃ a R4 · znamenají shodnou skupinu. Frakce lze oddělit za použití ultrafialového monitoru. Jestliže žádaná frakce stále ještě obsahuje nečistoty, pak se shora uvedená chromatografie opakuje až se dosáhne úplného oddělení.

Spojené frakce, které obsahují žádaný produkt, se destilací za sníženého tlaku zbaví methanolu, ·odsolí se na AmberlltďR’ XAD— —2 a lyofilizují se. Získá se modrý amorfní prášek aminopropylaminobleomycmového derivátu obsahujícího měď. Forma, která neobsahuje měď, · se · získá z formy, · která · · obsahuje · měď,· · odstraněním': mědi · ’známým způsobem, ·· jako je · například způsob · používající · EDTA (ethylendiaminotetraoctová · kyselina) ( japonská · patentová · publikace č. 31 875/ /77; · USA patent 3 929 993). ' Příklad postupu, podle něhož · se odstraňuje měď, je popsán níže.

Produkt, který obsahuje atom mědi, · se · rozpustí v destilované vodě. Výsledný roztok se nechá projít kolonou naplněnou Amberlitem^(R) XAD—2 v destilované vodě. Žádaný produkt se adsorbuje na koloně. Kolona se pak promyje vodným roztokem chloridu sodného, který obsahuje 5 -°/o disodné soli ethylendiaminotetraoctové kyseliny (stručně EDTA . 2Na).

Ionty mědi se účinkem EDTA . 2Na odstraní. Na pryskyřici zůstane adsorbován aminopropylaminobleomycin, který neobsahuje atom mědi. Pryskyřice se promyje roztokem chloridu sodného, aby se odstranila EDTA . . 2Na, potom destilovanou vodou a konečně kyselým vodným methanolem, jako je například 0,02N roztok kyseliny chlorovodíkové (vodné) v methanolu (v poměru 1 : 4 v objemových dílech). Frakce, které vyka zují absorpční maximum při 290 nm, se spojí. Přidáním Dowe-xu⁰*’ 44 (OH-typ; Dow Cemical Co·.) se pH spojených frakcí upraví na hodnotu 6,0. Spojené frakce se zahustí · za sníženého tlaku a koncentrát se lyofilizuje. Získá se tak amorfní prášek hydrochloridu aminopropylaminobleomycmu, který neobsahuje atom · mědi. Jestliže se místo· vodné kyseliny chlorovodíkové použije vodná kyselina sírová, pak se získá síran. Použitím vhodné kyseliny v elučním stupni lze tedy získat sůl žádané kyseliny.

Aminopropylaminobleomycinový derivát připravený shora popsaným způsobem hydrolýzou působením 6N vodné kyseliny chlorovodíkové při 105 °C po dobu 20 hodin dává rozkladné produkty obvyklé pro bleomyciny, například L-threonin, /ř-amino-zMá-amino-6-karboxy-5-methylpyridin-2-yl J propionovou kyselinu, 4-amino>3-hydroxy-2-methyl-pentanovou kyselinu, £3-iydroxy-L-histidin, /ř-amino-L-alanin a 2‘-(2-aminoethyl)-2,4‘-bithiazol-4-karboxylovou kyselinu, vedle aminosloučenin. Při methanolýze Amberlistem 15 aminopropylaminobleomycinoivý · derivát dává (stejně jako v případě bleomycin.u) L-gulosu a methylglukosid 3-O-karbamoyl-D-manosy, podle plynové chromatografie. Shora uvedená fakta podporují názor, že chemická struktura aminopropylamino·bleomycinového derivátu vyrobeného· způsobem podle tohoto vynálezu je taková, jak je uvedeno ve shora uvedeném obecném vzorci I.

Jako sloučeniny obecného vzorce II, které jsou výchozím materiálem pro syntézu bleomycinových derivátů podle vynálezu, lze zde uvést

1. 3-[N-(3-apiinopropyl)amino‘h9ropyl- , aminbblepmycin (APP), _:

2. 3-[N-(3-aminoprópyl)-N-methylamino'jpropylaminobleomycin (APMP),

3. 3-[N-( 3-aminopropyl )-N,N-dimethylamino] propylaminobleomycin · (MMHH ],

4. 3- [ N- [ 3-aminopropyl) -N,N-diethylaminoj propylaminobleomycin (EEHH),

5. 3- [N-( 3-aminopropyl )-N,N-^(^ibi^tylamino]propylaminobleomycin (BBHH),

6. 3-{N-[ 3‘- (N‘-/3-aminopropyl/-N‘,N‘-dimethylamino) pr opyl ] -N,N-dimethylaminojpropylaminobleomycin (PP4M),

7. 3- [4- (3-aminopropyl) piperazin-l-yl ] propylaminobleomycin (PYJ a

8. 3- [ N- (3-a min op rop у 1) -N-methyl-N-benzylamino· ] pr opy1aminobleomycm(písmena v závorkách znamenají zkratky příslušné sloučeniny). Tyto sloučeniny se syntetizují buď 1. kondenzací bleomycinové kyseliny se sloučeninou obecného· vzorce IV kálií. Extrakcí organickým rozpouštědlem se získá 3-benz.amidopropyl-N,N-dmlkylamin obecného vzorce VI

NH₂- (CH₂) 3—A— (CH₂)3-NH₂ (IV) v němž A znamená jak shora uvedeno, podobným způsobem jako je uvedeno v literatuře (například způsob, který popisuje japonský patentový vykládací spis „Koikai“ č. 63 089/79; USA patent 4 195 018) nebo·' 2. pěstováním bleomycin · produkujícího· · ' kmene Streptomyces verticillus jako · je například Streptomyces verticillus NK—68 - 144 (ATCC 31 307), který je popsán v obnoveném ' USA patentu 30 451, za přítomnosti ' aminu obecného vzorce IV.

Mezi příklady sloučenin · obecného vzorce IV patří

1. bis· (3-aminopropyl )amin,

2. bis (3-aminopropyl jmethylamin,

3. bis (3-amínopropу 1) dimethylamoniová sůl, .

4. bis (3-aminopropyl)diethylamoniová sůl,

5. bis (β-aminopropy 1) dibutylamoniová sůl,

6. 1,3- [ bis (3-ami.nopropyl) dimethylamino·· ] propan,

7. l,4-[bis(3-am.inopropyl)piperazin a

8. bis(3-aminopropyl) (methyl)benzylamoniová sůl.

Ze sloučenin obecného vzorce IV sloučeniny obecného vzorce IVa a IVb

R 2

NH2— (CH·,)·,—N— (CH2h—NH₂(IVa) ' T '

R₂

NH2- (CH2)

R,R,

II

N—R—N— (CH.>)3—NH.> (IVb) II'·

R2R2 v nichž R,, R₂ a R znamenají . jak shora uvedeno, jsou nové sloučeniny, poprvé synteticky připraveny autory tohoto vynálezu. Tyto sloučeniny lze vyrábět například následujícími postupy.

Sloučenina obecného vzorce IVa, v němž Rj a R₂ znamenají stejnou skupinu, se vyrábí zpracováním 3-aminopropyl-N,N-dialkylaminu obecného vzorce V

Ri

NH2—(CH2)3— n—r₂ (V)

Ri I

C₀H5—CO—NH—(CH2)3—N—R₂ (VI) (v němž Rj a R2 znamenají stejnou skupinu jak shora uvedeno). Tento amin se zpracováním s N-(3-brompr opyl )-f talirnidem převede na kvartréní amoniovou sůl obecného· vzorce VII

Rt I [ C_gH3—CONH— (CILL -n··-(CH₂ )3—

R2 -N=Phth]Br- (VII) (v němž Phth znamená ftalylovou skupinu a Rj a R2 znamenají stejnou skupinu vybíránu ze skupin shora uvedených pro· R, a R2). Kvartérní sůl se zhydrolyzuje zahříváním s 6N kyselinou - chlorovodíkovou 8 hodin na 110 °C. Vzniklá kyselina fialová a · kyselina benzoová (jako· vedlejší produkty) se odstraní.

Zahuštěním hydrolyzační směsi se odstraní pokud možno· všechna kyselina chlorovodíková. Zbytek se rozpustí v destilované vodě. Roztok se nechá projít kolonou anexu (Cl-typ). Zahuštěním eluentu se získá hydrochlorid sloučeniny obecného· vzorce IVa, v němž R_:l a R₂ znamenají stejnou skupinu. Jako příklady sloučenin, které byly vyrobeny podle· shora uvedeného postupu, lze uvést bis (3-aminopropyl Jdimethylamoniovou sůl, bis (3-ami.nopropyl Jdiethylamoniovou sůl a bis (3-aminop-ropy 1) dibutylamoniovou sůl.

Jiná sloučenina obecného vzorce IVa, v němž Rj a R2 znamenají různé skupiny, se vyrábí například tak, že se N-methylbenzylamin zpracuje se 2 ekvivalenty 3-brompropylftalimidu za přítomnosti báze a výsledná kvartérní amoniová sůl se hydrolyzuje jak shora popsáno. Příkladem- sloučeniny vyrobené tímto způsobem je bis(3-am.inopropyl) (methylJ-benzylamoniová sůl.

Sloučenina obecného· vzorce IVb se vyrábí například zpracováním l,3-bis(dimethylamino)propanu s 3-brompropylftalimidem za vzniku 1,3- [ bis (3-f talimidopropyl) dimethylamino] propanu. Výsledná sloučenina se hydrolyzuje jak shora popsáno, z hydrolyzátu se odstraní kyselina fialová jako vedlejší produkt, směs se zpracuje s iontoměničem a zahustí. Příkladem sloučeniny vyrobené podle tohoto· postupu je tetrahydrochlorid 1.3-[bis (3-aminopropyl) dimethylamino] propanu.

Mezi sloučeniny obecného vzorce III, které se používají jako· další výchozí materiály, patří (v němž Rt a R₂ znamenají stejnou skupinu vybranou ze skupin shora uvedených pro

Rj- a R2) s 1,5 ekvivalentu benzoylchloridu.

Reakční směs se zalkalizuje přidáním al237334 p-chloríenylacetaldehyd, fenylacetaldehyd, benzaldehyd, p-chlorbenzaldehyd, m-chlorbenzaldehyd, o-chlorbenzaldehyd, m,p-dichlorbenzaldehyd, o,p-dichlorbenzaldehyd, p-fluorbenzaldehyd, p-brombenzaldehyd, pentafluorbenzaldehyd, p-methoxybenzaldehyd, o,p-dimethoxybenzaldehyd, p-chlorfenyl-methyl-keton, m,p-dibenzyloxybenzaldehyd, 3-fenylpropanol, difenylacetaldehyd, p-kyanobenzaldehyd, m-trifluormethylbenzaldehyd, 1,3-difenylaceton, acetofenon, furfural, thiof en-2-karboaldehyd, cyklohexanon, 2-cyklohexylacetaldehyd, 5-norbornen-2-acetaldehyd, a-naftylaldehyd, antracen-9-aldehyd, cykloktankarbaldehyd, 2-thiofenkarboxaldehyd, cyklopentankarbaldehyd, cyklohexankarbaldehyd, cykloheptankarbaldehyd, cyklooktankarbaldehyd, cykloundekankarbaldehyd, m,p-dibenzyloixybenzaldehyd, cyklotridekankarbaldehyd,

3.4- di(p-chlorbenzyloxy) benzaldehyd,

3.4- di (m,p-dichlorbenzyloxy) benzaldehyd,

3,4-di (p-methoxybenzyloxy) benzaldehyd, 4- (p-benzy loxybenzyloxy) benzaldehyd,p-cyklooktylmethyloxybenzaldehyd a 3,4,5-tribenzyloxybenzaldehyd.

Novými sloučeninami obecného vzorce III jsou

3,4-di (p-chlorbenzylo xy) benzaldehyd,

3,4-di (3‘,4‘-dichlorbenzyloxy) benzaldehyd,

3,4-di (p-methoxybenzyloxy) benzaldehyd, 4- (4‘-benzylO'xybenzyloxy) benzaldehyd a 4-cyklooktylmethyloxybenzaldehyd.

Tyto sloučeniny se vyrábějí následujícím způsobem.

(HO)_n

(R₇O)n (ixj (X) kde

R₇ znamená p-methoxybenzylovou, 3,4-dichlorbenzylovou, p-chlorbenzylovou, p-benzyloxybenzylovou nebo cyklooktylmethylovou skupinu,

X znamená atom halogenu a n znamená číslo 0 nebo 1.

Sloučenina obecného vzorce VIII a sloučenina obecného vzorce IX se nechají zreagovat v rozpouštědle, jako je například aceton, za teploty v rozmezí od teploty místnosti do· teploty varu rozpouštědla. Po^ ukončení reakce se z reakční směsi oddestiluje rozpouštědlo. К reakční směsi se přidá voda a organické rozpouštědlo. Aldehyd se převede do organické fáze. Jestliže je to nutné, surový produkt získaný z organické fáze se vyčistí rekrystalizací nebo chroma tografií na koloně silikagelu nebo adsorptivní pryskyřice. Získá se tak čistý produkt.

Shora uvedený cyklotridekankarbaldehyd je také novou sloučeninou. Vyrábí se následujícím způsobem: Chlorid titaničitý se přidá ke směsi zinkového prachu, bezvodého tetrahydrofuranu a dibrommethanu. К výchozí směsi se přidá cyklotridekanon. Získá se methylencyklotridekan, který se pak epoxiduje m-chlorperbenzoovu kyselinou.

Po vyčištění se epoxidovaný produkt nechá zreagovat s etherátem fluoridu boritého v bezvodém dichlormethanu. Vyrobí se tak cyklotridekankarbaldehyd.

Fyzikálně-chemické vlastnosti representativních aminopropylaminobleomycinových derivátů podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

TLC + ¹ sloučeniny, která obsahuje atom mědi R_f elektroforéza⁺² sloučeniny, která obsahuje atom mědi,

Rm (Rm alaninu = = 1,0)

UF absorpční maximum sloučeniny,.

která neobsahuje atom mědi nm (E Í%/1 cm) sloučenina č.

zkratka

1	MCLPE	291	(87)	0,75	1,01
2	MPE	291	(104)	0,81	1,08
3	MBZ	291	(106)	0,82	1,09
4	MCLBZ (p)	291	(91)	0,77	1,09
5	MCLBZ (m)	291	(91)	0,78	1,09
6	MCLBZ (o)	291	(91)	0,81	1,09
7	MDCLBZ (m, p)	291	(89)	0,72	1,02
8	MDCLBZ (o, p)	291	(89)	0,75	0,99
9	MFBZ (p)	291	(89)	0,82	1,03
10	MBRBZ (p)	291	(86)	0,77	1,06
11	MPFBZ	291	(91)	0,79	1,10
12	MMOBZ (p)	291	(104)	0,83	1,07
13	MDMOBZ (0, p)	283	(100)	0,83	0,97
14	MCLAPE (p)	291	(88)	0,76	1,04
15	MDBZOBZ (m, p)	285	(65)	0,55	0,90
16	MPP	291	(102)	0,79	1,05
17	MDPE	291	(89)	0,72	1,07
18	MCNBZ (p)	291	(95)	0,83	1,08
19	MTFBZ (m)	291	(87)	0,74	0,99
20	MNAPH	283	(117)	0,75	0,98
21	MANTRA	352	(24)	0,68	0,85
		290	(73)
22	MCO	291	(86)	0,72	1,02
23	MDBZME	291	(88)	0.63	1,01
24	MAPĚ	291	(104)	0,83	1,01
25	MFUR	291	(98)	0,84	1,06
26	MTHIO	291	(91)	0,81	1,02
27	MDBZ	291	(88)	0,65	1,00
28	MCP	291	(91)	0,81	1,13
29	MCHM	291	(91)	0,78	1,11
30	MCHE	291	(90)	0,72	1,04
31	MCHEP	291	(90)	0,74	1,01
32	MCU	291	(87)	0,54	0,99
33	MNB	291	(96)	0,78	1,04
34	MDDBZOBZ	285	(86)	0,12	0,75
35	MMDBZ	291	(87)	0,67	0,99
36	MMCO	291	(90)	0,71	0,98
37	EEDBZ	291	(90)	0,60	1,03
38	BBDBZ	291	(87)	0,45	0,99
39	MTBZ	291	(83)	0,55	0,97
40	ATBZ	291	(87)	0,50	0,96
41	PPDBZ	291	(84)	0,69	1,11
42	PPCO	291	(87)	0,52	1,12
43	PYDBZ	291	(93)	0,67	0,95
44	PYCLBZ	291	(99)	0,80	1.01
45	PYCO	291	(99)	0,74	0,98
46	EECLPE	291	(82)	0,72	1,11
47	MCT	292	(99)	0,43	1,06
48	MDDCL	286	(101)	0,04	0,17
49	MDDDCL	284	(82)	0,01	0,02
50	MDDMO	280	(93)	0,15	0,87
51	MDBZOBZOBZ	282	(84)	0,08	0,21
52	MDCOBZ	287	(87)	0,02	0,51
53	MDTBZOBZ	294	(61)	0,01	0,19
Poznámky:

+ 1 Silanizovaný silikagel 60F 254^(R) (MerckCo.), methanol s 6% roztokem octanu amonného (60 : 40 objemovým dílům).

+2 Avicel SF(^R) (FMC Co.); kyselina mravenčí — kyselina octová — voda (27 : 75 : 900 objemovým dílům), 800 V, 15 minut.

Biologické vlastnosti typických příkladů sloučenin podle tohoto vynálezu jsou popsány níže.

1. Antimikrobiální účinnost na Mycobacterium smegmatics ATCC 697 a Bacillus subtilis.

Účinnost na shora uvedené testované mikroorganismy byla stanovována razítkovou technikou na agarových plotnách s tím, že účinnost bleomycinů A₂ (forma, která neob sahuje atom médi), který se používá jako standard, je 1000 ^g/mg.

2. Účinnost inhibice růstu buněk HeLa S_;!.

Buňky HeLa S₃ se naočkují do média (MEM obsahující 10% hovězí sérum) v plastických Petriho miskách. Dva dny po naočkování se к médiu přidá testovaný bleomycin. V inkubaci se pokračuje další tři dny. Pak se buňky spočítají. Procentuální inhibice růstu se vypočte podle následující rovnice:

Procentuální inhibice růstu (v %) = 100 x (B—Aj/(B—C) kde A znamená konečný počet buněk třetí den po přidání testovaného vzorku, В znamená konečný počet buněk kontrolního vzorku (bez přidání testovaného vzorku) a C znamená počet buněk v den přidání testovaného vzorku. ID₅₀ (koncentrace způso bující 50% inhibici) se vyhodnotí z křivky koncentrace vzorku proti procentuální inhibici.

Výsledky testů získaných podle bodů 1 a 2 jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

sloučenina č.	zkratka	antimikrobiální účinnost sloučeniny neobsahující atom mědi; účinnost v ^g/mg	koncentrace způsobující 50% inhibici růstu (ID50) sloučeniny neobsahující atom mědi na kulturu HeLa buněk; (Ug/mg
na Mycobacterium symegmatis ATCC 607	na Bacillus subtilis
1	MCLPE	16 800	13 266	0,54
2	MPE	7 280	7 660	0,60
3	MBZ	6 384	7 230	0,20
4	MCLBZ (p)	11 536	7 142	0,57
5	MCLBZ (m)	7 615	5 490	0,80
6	MCLBZ (o)	6 548	4 545	1,10
7	MDCLBZ (m, p)	10 601	4 263	0,82
8	MDCLBZ (o, p)	13 013	2 940	1,05
9	MFBZ (p)	8 116	8145	0,75
10	MBRBZ (p)	15 446	6 001	0,57
11	MPFBZ	7 950	1509	1,60
12	MMOBZ (p)	5 491	6 607	0,75
13	MDMOBZ (o, p)	5 351	5 312	1,30
14	MCLAPE (p)	16 959	5 459	0,52
15	MDBZOBZ (m, p)	4 516	1772	0,36
16	MPP	8 453	10 295	0,46
17	MDPE	21084	3 554	1,00
18	MCNBZ	3163	4 347	1,10
19	MTFBZ (m)	8 504	6 063	0,75
20	MNAPH	6 581	4 785	0,78
21	MANTRA	13 250	4 504	0,80
22	MCO	22 860	12 300	0,45
23	MDBZME	14 920	2 593	1,45
24	MAPĚ	7 901	14 089	1,00
25	MFUR	4 790	9 548	0,30
26	MTHIO	5 595	10 620	0,39
27	MDBZ	14 194	1138	0,89
28	MCP	13 595	16 180	1,00
29	MCHM	15 414	12 148	0,63
30	MCHE	35 030	14 440	0,56
31	MCHEP	25 924	20143	0,48
32	MCU	28 308	8146	0,58
33	MNB	16 219	13 332	0,68
34	MDDBZOBZ	164	49	0,38
35	MMDBZ	13 784	1742	0,87

sloučenina č.	zkratka	antimikrobiální účinnost sloučeniny neobsahující atom mědi; účinnost v ^g/mg	koncentrace způsobující 50% inhibici růstu (ID5o) sloučeniny neobsahující ato-m mědi na kulturu HeLa buněk; ^g/mg
na Mycobacterium symegmatis ATCC 607	na Bacillus subtilis
36	MMCO	21840	20 000	0,29
37	EEDBZ	10 680	1047	0,70
38	BBDBZ	17 910	530	2,00
39	MTBZ	7 746	580	2,30
40	ATBZ	4 450	479	1,90
41	PPDBZ	16 000	7 100	0,66
42	PPCO	26 000	14 600	0,51
43	PYDBZ	14 420	1 230	0,50
44	PYCLBZ	11 350	6 080	0,31
45	PYCO	43 000	15 100	0,81
46	EECLPE	17 480	13 310	0,52
47	MCT	3 915	1760	0,18
48	MDDCL	14	8	0,058
49	MDDDCL	23	8	0,063
50	MDDMO	145	35	0,90
51	MDBZOBZOBZ	163	46	0,12
52	MDCOBZ	268	49	0,13
53	MDTBZOBZ	11	26	0,62

Z tabulky 3 je vidět, že sloučenina podle tohoto vynálezu má silnou účinnost spočívající v inhibici růstu kultury HeLa buněk a rovněž i silnou antimikrobiální účinnost.

3. Pulmonární toxicita u myší.

(pulmonární fibrosa) bod: akumulace exudátu v pulmo- nární alveoli a fibrosa podobná změna v alveolárním septu body: fibrosa v několika oblastech body: roztroušená fibrosa bodů: fibrosa u více než dvou třetin celkové plochy.

Pro test byly použity ICR myši (samečci, staří 15 týdnů, 9 myší v každé skupině). Každá myš dostávala denní dávku 5 mg/kg testovaného vzorku intraperitoneální injekcí jednou denně, po dobu 10 po sobě následujících dnů. Od ukončení podávání testovaného vzorku byly myši po dobu 5 týdnů pozorovány, potom byly utraceny a pitvou sledován výskyt a stupeň pulmonární fibrosy. Vyhodnocení bylo děláno na základě porovnání počtu myší trpících pulmonární fibrosou a na základě stupně onemocnění. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

V tabulce 4 je stupeň onemocnění vyjádřen číselně podle následující stupnice:

,,Poměr“ byl vypočten ze srovnání s ,,bleomycinovým komplexem“.

Z tabulky 4 lze vidět, že některé ze sloučenin podle vynálezu nevykazují vůbec žádnou pulmonární fibrosu, a že v těch případech kdy byla fibrosa pozorována, stupeň pulmonární toxicity je velmi snížen, výskyt je menší než asi poloviční a stupeň e nižší než asi jedna sedmina ve srovnání s APMP—BLM. Jelikož až dosud bylo velmi těžké eliminovat vedlejší účinky bleomycinů, zvláště pulmonární fibrosu, je překvapivý fakt, že sloučeniny podle tohoto vynálezu nevykazují žádný vedlejší efekt vedoucí к pulmonární fibrose, i když jen při testování na zvířatech.

bod: žádná fibrosa

sloučenina č	Tab výskyt počet myší trpících pulmonární fibrosou (:%)
1	2/9	(22)
2	3/9	(33)
3	2/8	(25)
4	1/7	(14)
5	4/9	(44)
6	5/9	(56)
7	1/9	(11)
8	1/9	(И)
9	2/9	(22)
10	2/9	(22)
11	2/9	(22)
12	2/7	(29)
13	2/6	(33)
14	2/9	(22)
15	1/9	(U)
17	1/5	(20)
18	0/9	(0)
19	1/9	(И)
20	1/9	(И)
22	0/9	(0)
27	1/5	(20)
32	0/9	(0)
34	0/9	(0)
35	0/9	(0)
38	0/9	(0)
39	0/9	(0)
41	0/9	(0)
42	0/9	(0)
43	0/9	(0)
44	0/9	(0)
45	0/9	(0)
46	0/9	(0)
47	0/9	(0)
48	Q/9	(0)
49	0/9	(0)
50	Q/9	(0)
51	0/9	(0)
52	0/9	(0)
53	0/9	(0)
APMP	9/9	(100)

4. Akutní toxicita

Hodnota LD₅o byla zjišťována tak, že několik reprezentativních sloučenin podle tohoto vynálezu bylo podáváno 10 po sobě následujících dnů.

A) Způsob pokusu

Myším samečkům CDF_l/SLC (všichni ve stáří 6 týdnů, 7 myší v každé skupině) byu 1 к а 4 stupeň poměr celkový počet pulmonární poměr fibrosy/celkový počet testovaných zvířat (% )

0,35	3/27	(11)	0,13
0,53	7/27	(26)	0,31
0,40	2/24	(8)	0,10
0,22	1/21	(5)	0,19
0,70	7/27	(26)	0,31
0,90	6/27	(22)	0,26
0,18	1/27	(4)	0,05
0,18	2/27	(7)	0,08
0,35	3/27	(U)	0,13
0,35	4/27	(15)	0,18
0,35	2/27	(7)	0,08
0,46	3/21	(14)	0,17
0,53	2/18	(U)	0,13
0,35	3/27	(11)	0,13
0,18	1/27	(4)	0,05
0,32	1/15	(7)	0,08
0,00	0/27	(0)	0,00
0,18	1/27	(4)	0,05
0,18	1/27	(4)	0,05
0,00	0/27	(0)	0,00
0,32	1/15	(7)	0,08
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0.00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	Ю)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
0,00	0/27	(0)	0,00
1,6	48/27	(178)	2,15

ly podkožně podávány různé sloučeniny podle tohoto vynálezu. Dávky byly různé pro každou sloučeninu. Hodnota LD₅₀ (denní dávka) byla vyhodnocena z úmrtnosti myší během podávání podle Behrens-Karberovy metody.

B) Výsledky pokusu

Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5

LD50 (mg/kg/den) číslo sloučenina zkratka

32	MCU	17,5
34	MDDBZOBZ	60,0
37	EEDBZ	50,0
43	PYDBZ	12,5
	bleomycinový komplex	20

Sloučeniny podle tohoto . vynálezu mají protinádorovou účinnost a současně značně snížené vedlejší účinky, jako je například pulmonární toxicita, jak je zřejmé z jejich shora popsaných biologických vlastností. Lze tedy očekávat, že tyto sloučeniny budou užitečné jako karcinostatika se sníženými vedlejšími účinky. Při použití jako- karcinostatíka lze sloučeninu podávat v různých dávkových formách, jako jsou například pevné prostředky, masti a roztoky, obvykle ale ve formě injekcí. Sloučenina se podává jednou až pětkrát týdně v dávce 5 až 200 mg/ /týden.

Vynález je dále podrobněji popsán a objasněn v příkladech, ale není těmito- příklady omezen.

Příklad 1

Stupeň A:

K roztoku 1,0 g trlhydrochloridu 3-[N-methyl-N- (3-aminopr opyl) amino ] propylaminobleomycinu (ve formě obsahující atom mědi] ve 30 ml methanolu se přidá nejdříve 227 mg cykloundekankarboxaldehydu a pak 26 mg kyanhydridoboritanu sodného. Směs se nechá reagovat 16 hodin za teploty místnosti. Reakční směs se přidáním 6N kyseliny chlorovodíkové upraví tak, aby pH bylo 1,0. Směs se nechá stát 10 minut, aby se zpracování ukončilo. Reakční směs se pak zneutralizuje IN roztokem hydroxidu sodného. Methanol se za sníženého- tlaku oddestiluje. Odparek se rozpustí v 50 mililitrech destilované vody a extrahuje se etherem. Odstraní se tak nadbytek aldehydu.

Vodná vrstva se nechá projít lOOml kolonou Amberlitu^) XAD—2 (Rohm and Haas Co.} v roztoku - 4% vodného octanu amonného spolu s roztokem 2% vodné kyseliny octové (v poměru 1 : 1 objemovým dílům). Žádaný produkt se adsorbuje. Adsorbovaná fáze se eluuje technikou lineárního koncentračního gradientu, přičemž se použije 500 ml shora popsaného· pufru, ke kterému se kontinuálně přidává 500' ml methanolu. Frakce o' celkovém objemu 200 ml, které byly - eluovány asi 65% methanolem a které vykazovaly absorpční maxima při vlnové délce asi 290 nm, se spojí. Vodný roztok, který se získá oddestilováním methanolu za sníženého tlaku z těchto frakcí se nechá projít lOOml kolonou Amberlifq.(^R) XAD—2 (Rolím and Haas Co.) v destilované vodě.

Žádaný produkt se adsorbuje. Kolona se promyje 150 ml destilované vody. Žádaný produkt se eluuje směsí 0,02M vodné kyseliny chlorovodíkové s methanolem (v poměru 1 : 4 - objemovým dílům). Modré frakce bleomycinového- derivátu se spojí, zneutralizují se Ddwexein⁽R⁾ 44 (anex OH-typu firmy Dow Chemical Co.), zahustí za sníženého tlaku a lyofilizují.

Shora získaný lyofilizovaný prášek se rozpustí v 10 ml destilované vody. Roztok se nechá projít 100 ml kolonou CM-Sephadexu^(K) C—25 (Na+-typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.), která se ekvilibruje 0,05M kyselinou octovou v pufru octanu sodného- o· pH 4,5. Produkt se adsorbuje na koloně. Žádaný produkt se eluuje technikou lineárního- koncentračního gradientu, a to tak, že se ke shora uvedenému pufru kontinuálně přidává chlorid sodný až se postupně dosáhne 1.0M koncentrace chloridu sodného. Kolonou se nechá protéci celkem 550 ml eluentu. Celkem se spojí 120 ml modrých frakcí eluováných asi 0,65M chloridem sodným. Spojené frakce se odsolí shora uvedeným Amberlitem^(R) XAD—2 a lyofilizují. Získají se tak 872 mg (79% výtěžek) modrého amorfního prášku měď obsahujícího- 3-{N-methyl-N- [ 3‘- (cykloundekanylmethylamino Jpropyl] aminojpropylaminobleomycinu.

Stupeň B:

Produkt obsahující atom mědi (872 mg), který byl získán ve stupni A, se rozpustí v 18 ml destilované vody. Měd se odstraní následujícím způsobem. Výsledný roztok se nechá projít lOOml kolonou Amberlitu XAD— —2 v destilované vodě. Produkt se adsorbuje. Pryskyřice se promyje 300 ml vodného roztoku obsahujícího chlorid sodný a 5 proč. EDTA . 2 Na, potom postupně 100 ml 2% roztoku chloridu sodného a 150 ml destilované vody.

Konečně se adsorbovaná fáze eluuje směsí 0,02N vodné kyseliny chlorovodíkové a methanolu (1:4 objemovým dílům). Frakce eluátu, který vykazuje absorpční maximum. při vlnové délce asi 290 nm, se spojí. Hodnota pH spojených frakcí se Dowexem 44 (OH-typ, Dow Chemical Co.) upraví na 6,0. Frakce se za sníženého tlaku zahustí a pak se lyofilizují. Získá se 758 mg (výtě žek 90 %) bílého amorfního prášku trihydrochloridu 3-{N-methyl~N- [ 3‘-(cykloundekanyl-methylamino) propyl ] aminojpropylaminobleomycinu bez vázaného atomu mědi. Tato sloučenina vykazuje UF absorpční maximum při 291 пш a E (1%, lem) = 87, měřeno v destilované vodě.

IC absorpční maxima (v cm^-1]: 3425, 2950, 1650, 1550, 1520, 1440, 1400, 1260, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 980 a 800 (měřeno v KBr pastilkách). Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 2.

Ve shora uvedené reakci se jako aldehydová složka používá 988 mg m,p-dibenzyloxyaldehydu. Reakce se provádí 70 hodin při 27 °C. Reakční směs se čistí a měď se odstraní podobným způsobem jako je shora popsáno. Získá se tak 762 mg (57% výtěžek) bezbarvého amorfního prášku trihydrochloridu 3-ÍN-methyl-N-[3‘-(bis/m,p-dibenzyloxybenzyl/amino) propyl) amino)propylaminobleomycinu bez vázaného atomu mědi (sloučenina č. 34). Tato sloučenina vykazuje UF absorpční maximum při 285 nm a E (1%/lcm) — 86, měřeno v destilované vodě.

IC absorpční maxima (v cm¹, měřeno v KBr-tabletkách): 3425, 2950, 1650, 1550, 1510, 1460, 1430, 1380, 1320, 1270, 1190, 1140, 1060, 1020, 960, 800, 730, 690 a 650.

Podobně se jako aldehyd používá 174 mg cyklooktankarboxaldehydu. Reakce se provádí 24 hodin za teploty místnosti. Po vyčištění a odstranění mědi se získá 605 mg [58% výtěžek) bezbarvého amorfního prášku trihydrochloridu 3-[N-methyl-N-[3‘-(cyklooktylmethylamino· ) propyl ] aminojpropylaminobleomycinu bez vázaného atomu mědi (sloučenina č. 22). Tato sloučenina vykazuje UF absorpční maximum při 291 nm a E (1%/lcm) = 86, měřeno v destilované vodě.

IC absorpční maxima (v cm’¹, měřeno v KBr-pastilkách): 3425, 2925, 1650, 1550,1520, 1440, 1400, 1330, 1260, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 980 a 800.

Podobným způsobem se vyrábějí sloučeniny, které jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6 slouče- výchozí sloučenina obecného nina č. vzorce III [žádaná) počet ekvivalentů slouč. obec, vzorce III reakční reakční doba (h.) teplota (°C) výtěžek (%)

1	p-chlorfenylacetaldehyd	1,2	16	22	66
2	fenylacetaldehyd	1,2 .	16	22	71
3	benzaldehyd	1.2	16	22	85
4	benzaldehyd	1,2	48	0	45
4	p-chlorbenzaldehyd	1,2	16	22	66
5	m-chlorbenzaldehyd	1,2	16	22	83
6	o-chlorbenzaldehyd	1,2	16	22	69
7	m,p-dichlorbenzaldehyd	1,2	16	22	77
8	o,p-dichlorbenzaldehyd	1,2	16	22	71
9	p-fluorbenzaldehyd	1,2	16	22	80
10	p-brombenzaldehyd	1,2	16	22	75
11	pentafluorbenzaldehyd	1,2	16	22	56
12	p-methoxybenzaldehvd	1,2	16	22	80
13	o.p-dimethoxybenzaldehyd	1,2	16	22	58
14	p-chloracetofenon	2,0	24	37	57
15	m.p-dibenzyloxvbenzaldehyd	1,2	18	22	63
16	3-fenylpropanal	1,2	16	22	74
17	difenylacetaldehvd	1,2	16	22	67
18	p-kyanobenzaldehyd	1,2	16	22	83
19	m-trifluormethylbenzaldehyd	1,2	18	22	87
20	a-naftylaldehvd	1,2	18	22	60
21	antracen-9-aldehvd	1,2	18	22	61
22	cyklooktankarbaldehyd	2,0	24	37	58
23	1,3-difenvlaceton	5.0	30	37	71
24	acetofenon	5,0	30 '	22	59
25	furfural	1,2	16	22	71
26	2-thiofenkarboxaldehyd	1,2	16	22	59
27	benzaldehyd	10,0	16	22	67
28	cyklopentankarbaldehyd	1,2	16	22	61
29	cyklohexankarbaldehvd	1,2	16	22	60
30	2-cyklohexvlacetaldehyd	1,2	16	22	54
31	cykloheptylkarbaldehyd	1,2	16	22	74
32	cykloundekankarbaldehyd	2,0	16	22	71
33	5-norbornen-2-karbaldehvd	1,2	16	22	52
34	m,p-dibenzyloxybenzaldehyd	5,0	70	27	57

32

sloučenina č. (žádaná)	výchozí sloučenina obecného· vzorce III	počet ekvivalentů slouč. obec. vzorce III	reakční doba (h.)	reakční teplota (°C)	výtěžek (%)
47	cyklotridekankarbaldehyd	2,0	16	22	66
48	3,4-di (p-chlor benzyloxy) benzaldehyd	4,0	96	27	54
49	3,4--Π(Im,p-dichlcrbenzylcx.y)benzaldehyd	4,0	120	40	44
50	3,4-di (p-methoxybenzyloxy) benzaldehyd	4,0	24	40	49 '
51	4- (p-benzyloxybenzyloxy) benzaldehyd	4,0	24	40	41
52	p-cyklooktylmethyloxy- benzaldehyd	4,0	48	40	33
53	3,4,5-tribenzyloxybenzaldehyd	4,0	24	40	44

Příklad 2

Stupeň A:

K roztoku 1,0 g trihydrochloridu 3-[N,N-diethyl-N- (3-am‘inoprop yl) amino ] propylaminobleomycinu (fch-r^ma obsahující atom mědi) ve 30 ml methanolu se přidá nejdříve 42 mg benzaldehydu a pak · 51 mg kyanohydridobcritanu sodného. Směs se nechá reagovat · 16 hodin za teploty místnosti. Podobným · způsobem· jako v příkladu 1 se reakční směs zpracuje s kyselinou chlorovodíkovou, extrahuje se etherem a chromatografuje se na koloně Amberlitu(R) XAD— —2. Pak se odsolí Amberlitem XAD—2 jak shora popsáno a lyofilizuje. Získá se tak 832 mg (75% výtěžek) modrého· amorfního¹ prášku atom mědi obsahujícího 3-[N,N-diethyl-N’ (3‘7'dibenzy lamin o/propyl) amino ]propylaminobleomycinu.

Stupeň · B: ...

Atom mědi ' obsahující · produkt (832 mg), který · byl získán · ve stupni A, se rozpustí v 17 ml destilované vody. Měď se pak· odstraní stejným způsobem jako ve stupni B příkladu 1. · Po zahuštění za sníženého tlaku a lyofilizaci se získá 739 mg (92% výtěžek) trihydrochloridu 3- [ N,N-diethyl-N- (3‘-/dibenzylamino/pr opyl) amino ] propylaminobleomycinu jako bílý amorfní prášek. UF absorpční maximum· této látky je u 291 nm, E (1%, lem) = 90, měřeno v destilované vodě; IC absorpční maxima (v cm-¹, KBr-pastilka): 3425, 2975, 2925, 1640, 1550, 1520, 1490, 1450, 1400, 1320, 1260, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 980, 910, 800, 740, 690.

1,0 g tetrahydrochloridu 3-ÍN,N-dimethyl-N-[3‘-(N,N-dimethyl-N-/3“-aminopropyl/amino) pr opyl ] amincjpropylaminoblecmycinu (forma, která obsahuje atom mědi) se jako výchozí materiál podobným způsobem jako shora popsáno nechá zreagovat se 607 mg benzaldehydu. Reakční směs se vyčistí a atom mědi se odstraní. Získá se 587 mg (55'% výtěžek) bezbarvého·· amorfního prášku tetrahydrochloridu 34N,N-dimmthy]l-N-[3‘

- (N,N-dimethyl-N-/3“-dibenzylammopropyl/amino) pr opyl ] aminc{prcpylammcbleomycinu [sloučenina č. 41) (forma, která neobsahuje atom mědi).

Tato sloučenina má UF absorpční maximum při 291 nm a E (1 %/l cm) = 84, měřeno v destilované vodě; IC absorpční maxima [v crm¹·, měřeno· v· KBr-pasttikách): 3425. 2950, 1650, 1560, 1490, 1460, 1400,1330, 1260. 1190, · 1160, 1100. 1060, 1020, 980, 800, 740 a 600.

Jestliže se provede stejná reakce jakoshora uvedeno s tím, že se místo benzaldehydu použije 161 mg cyklcoktankarbaldthydu, reakční směs se podobným způsobem vyčistí a měď se odstraní, pak se získá 539 miligramů (52% · výtěžek) bezbarvého amorfního prášku atom mědi aeobsahuíccíoo tetrahydrochloridu 3-[N,N-dimethyl-N- [ 3‘- (N,N-^(^ii^(^ithyl-N-/^/3“-cyklooktylmethylaiminopropyl/amino) pr opyl ] aminojpr opvlaminobleomycinu · [sloučenina _ ·č. 42). · Tato, sloučenina má UF · absorpční maximum ·' při 29:1-.ш11 a-E · (1 ·%/! cm) — 87,· měřeno v destilované' vodě; · IC absorpční maxima · [v cm⁴, měřeno· v · K^i--?p^^^tlil^i^(^c^^:): 3425, · 2950, 1720, · 1660, 1550, 1520, 1490, · 1450. 1400, ' 1360, 1260, 1190, · 1140, 1100, 1060, 1020, · 980, · 880 aa. · 800.

Jestliže se podobným způsobem nechá 1,0 gramu tetrahydrochloridu 3-[4‘-3“-amincρropyljpiptridyl]pcopylammobleomycmu (forma, která obsahuje atom ' mědi) jako výchozí materiál zreagovat se 623 mg benzaldehydu, reakční směs se vyčistí a měď se odstraní, pak se získá 695 mg (65% výtěžek) tetrahydrochloridu 3- [ 4‘- (3“-dibenzylamincpropyljpiptridyl] propylaminobleomycinu (sloučenina č. 43) (ve formě, která neobsahuje atom mědi) jako· bezbarvý amorfní prášek. Tato sloučenina má UF absorpční maximum při 291 nm a E (1 %/! cm) = 93; IC absorpční spektrum (maxima v cm¹, měřeno v КВг-раэШкёсЬ): 3425, 2950, 1660, 1560, 1520, 1500, 1460, 1260, 1190, 1140, 1100, 1060, 1030, 980, 880, 810, 740 a 700.

Podobným způsobem byly vyrobeny sloučeniny, které jsou uvedeny v tabulce 7,

Tabulka 7

žádaná sloučenina	zkratka-	sloučenina obecného	počet	reakční	výtěžek
č. zkratka	slouče-	vzorce III	ekviva-	doba (h.)	(%)
	niny		lentů slou-
	obecného'		čeniny ob.
	vzorce II		vzorce III

35	MMDBZ	MMHH	benzaldehyd	I0,0	I6	72
36	MMCO	MMHH	cyklooktankarbaldehyd	2,0	24	57
37	EEDBZ	EEHH	benzaldehyd	I0,0	I6	69
38	BBDBZ	BBHH	benzaldehyd	I0,0	I6	68
39	MTBZ	MBZHH	benzaldehyd	I5,0	I6	68
40	ATBZ	APP	benzaldehyd	I5,0	20	65
4I	PPDBZ	PP4M	benzaldehyd	I0,0	I6	55
42	PPCO	PP4M	cyklooktankarbaldehyd	2,0	24	52
43	PYDBZ	PY	benzaldehyd	I0,0	I6	65
44	PYCLBZ	PY	p-chlor benzaldehyd	I,2	I6	48
45	PYCO	PY	cyklooktankarbaldehyd	2,0	24	43
46	EECLPE	EEHH	p-chlorfenylacetaldehyd	I,3	I6	4I

Příklad 3

Ve 300 ml destilované vody se suspenduje 50 g 3-aminopropyldimethylaminu a 62 g hydrogenuhličitanu sodného··. Za chlazení směsi ledem a za intenzivního míchání - se k suspenzi přikape I05 g [I,5 ekvivalentu] benzoylchloridu. Po 6 hodinách reakce za teploty místnosti se reakční směs okyselí koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 4. Nadbytek benzoylchloridu se odstraní extrakcí etherem. Hodnota pH vodné vrstvy se upraví - na I2 přidáním· 5N roztoku hydroxidu sodného. Pak se vodná vrstva extrahuje chloroformem. Chloroformový extrakt se vysuší nad síranem sodným. Rozpouštědlo ’ se ve vakuu oddestiluje za sníženého tlaku. . Získá se 9I g 3-benzamidopropyldimethylaminu. K . tomuto zbytku - se přidá roztok II8 .g - [I ekvivalent] N-3-brompropylftalimldu ve - 300 ml tetrahydrofuranu.

Směs se - míchá I8 hodin za teploty místnosti. Vys-rážené bezbarvé krystalky se odfiltrují, promyjí tetrahydrofuranem a vysuší. Získá se tak I88 g (90% výtěžek) bezbarvých krystalů kvartérní amoniové soli. Tato sůl se - rozpustí v I000 ml 6N kyseliny chlorovodíkové.- Směs se zahřívá 8 hodin na II0 stupňů Celsia. Dojde tak k hydrolýze. Poochlazení se vysrážená kyselina fialová a kyselina benzoová odfiltrují. Filtrát se odpaří dosucha za sníženého tlaku. Tím se odstraní nadbytek kyseliny chlorovodíkové.

Odparek se rozpustí v destilované vodě. Roztok se nechá projít kolonou iontoměniče Dowex(^R)—I (Cl-typ, objem: 600 ml). Eluent se za sníženého tlaku odpaří dosucha.

Získá se 96 g [90% výtěžek) bis(3-aminopropyl) dimethylamonium-tríhydrochloridu. Tato sloučenina je natolik hydroskopická, že není možno určit její teplotu tání. ¹H-NMR spektrum měřené v deuterované vodě vykazuje následující δ hodnoty:

2.1 až 2,8 ppm- (4H, m),

2,4 ppm [6H, s),

3.1 až 3,9 ppm [8H, m) (písmenka v závorkách označují typ signálu: m znamená multiplet, s znamená singlet).

Tyto hodnoty jsou v souhlase s přiřazenou strukturou. IC absorpční maxima - (v cm~I -měřeno v KBr-paattikách): 3425, 2975, 2625, 2000, I600, I480, I470, -I350, - í320,!300, I230, I200, II60, II40, I060, I040, I000, 930, 840 a 760.

Podobným způsobem jako shora popsáno za použití 3-aminopropyldiethylaminu, respektive 3-aminopropyldibutylaminu, se získá bis (3-aminopropyl) diethylamonium-trihydrochlorld, respektive bis (3-aminopropyl )dibutylamonium-trihydrochlorid. Fyzikálně-chemícké vlastnosti těchto sloučenin jsou uvedeny v tabulce 8.

3S

Tabulka 8

syntetizovaný amin	IC spektrum (cm-1, KBr)	JH-NMR + 1 (ppm, 60 MHz, D 20)	Rw+2	R( +3
bis (3-aminopropyl ) -	3425, 2975, 2625, 2000,	2.1 až 2,8 (4H, m)	2,63	0,08
dimethylamonium-	1600, 1480, 1470, 1350,	3.1 až 3,9 (8H, m)
trihydrochlorid	1320, 1300, 1230, 1200,	2,4 (6H, s)
	1160, 1140, 1060, 1040,
	1000, 930, 840, 760.
bis (3-aminopropyl) -	3425, 2975, 2500, 2000,	1,6 (6H, t)	2,43	0,14
diethylamonium-	1600, 1480, 1400, 1280,	2,0 až 2,7 (4H, m)
trihydrochlorid	1180, 1060, 1000, 950,	3,1 až 4,0 (12H, m)
	900, 880, 800, 750.
bis (3-aminopropyl) -	3425, 2975, 2650, 2000,	1,15 (3H, t)	1,89	0,44
dibutylamonium-	1600, 1470, 1400, 1390,	1,3 až 2,2 (8H, m)
trihydrochlorid	1350, 1280, 1260, 1180,	2,0 až 2,7 (4H, m)
	1070, 1030, 990, 950,	3,1 až 4,0 (12H, m)
	900, 840, 800, 750.

Poznámka:

+ ¹ Písmena v závorkách: s znamená singlet, t znamená triplet, in znamená multiplet.

+ 2 Rychlost elektroforézy vzhledem k alaninu (Rm = 1,0) při elektroforéze na tenké vrstvě [AvicepR) SF (FMC Co.); kyselina mravenčí — kyselina octová — voda [25 : : 75 : 9O0 objemovým· dílům), 800 V, 6 minut).

+ :i Pohyblivost při chromatografii na tenké vrstvě silikagelu 60F 254 [Měrek Co.), methanol — 10'% vodný octan amonný — 10% vodný amoniak (1 : 1 : · 1 obj. d.); barveno ninhydrinem.

Příklad 4

K roztoku 53,6 g [2 ekvivalenty) N-(brompropyljftalimidu ve 300 ml acetonitrilu se přidá 13 g N,N,N‘,N‘-tetramethyM,3-di.amino-propanu. Směs se míchá 18 hodin za teploty · místnosti. Vytvoří se bílá sraženina 1,3-[ (3-ftalimidopropyl)dimethylammo]propan-dibromidu. Sraženina se odfiltruje, promyje acetonitrilem a vysuší. Výtěžek je 90 proč. · Tato kvartérní amoniová sůl se· rozpustí ve 200 ml 6N kyseliny chlorovodíkové. Směs se zahřívá 8 hodin na 110 °C, ab'y proběhla hydrolýza. Po ochlazení se vysrážená kyselina fialová odfiltruje a odstraní. Filtrát se nechá projít kolonou iontoměniče Dowex(^R)—1 (Cl-typ, 1200 ml). Eluát se za sníženého tlaku odpaří dosucha. Získá se 28,7 gramu tetrahydrochloridu · l,3-bis[(3-am.ino>propyl ) dimethylámino' ] propanu.

Tato sloučenina je příliš hydroskopická na to··, aby bylo možno stanovit její teplotu tání. Ή-NMR spektrum· (měřeno v deuterované vodě, hodnoty δ jsou udány v ppm):

2,0 až 2,9 (бН, m),

3,0 až 4,0 [12H, m),

3,45 [12H, s).

Písmenka v závorkách mají · stejné významy jako shora uvedeno. Hodnoty δ souhlasí se shora uvedenou strukturou sloučeniny. Hodnoty R_f a R_m, · které byly stanoveny tak, jak je uvedeno v poznámce u tabulky 7, byly 0,02, respektive 2,56. IČ absorpční maxima (cm“¹): 3425, 2975, 2600, 2000, 1720,

1600, 1480, 1470, 1400, 1300, 1230, 1200, 1150, 1060, 1000, 960, 920, 900, 850 a 760.

Příklad 5

K roztoku 20 g N-methylbenzyiaminu ve 300 ml tetra-hydrofuranu se přidá 17 g triethylaminu a 89 g N-(3-biⁱonmn^,opy].]ftalimidu. Směs se míchá 17 hodin za teploty místnosti. Bezbarvá sraženina se odfiltruje a překrystaluje z vodného ethanolu. Získá se 76 g [80% výtěžek) bezbarvých krystalků. Krystaly se rozpustí ve 380 ml 6N kyseliny chlorovodíkové, roztok se zahřívá 8 hodin na 110 °C, pak se ochladí, vysrážená kyselina fialová se odstraní odfiltrováním a filtrát se za sníženého tlaku zahustí, aby se odstranil nadbytek chlorovodíku. Odparek se rozpustí v destilované vodě. Roztok se nechá projít kolonou iontoměniče (Dowex^(R)—1, Cl-typ, 200 ml).

Eluát se za sníženého tlaku odpaří dosucha. Získá se 41 g (90% výtěžek) bis(3-amínopr opyl) methylbenzyl-amonium-trihydrochloridu. Tato sloučenina je příliš hydroskopická na to, aby bylo možno stanovit její teplotu tání. Ή-NMR spektrum (měřeno v deuterované vodě, hodnoty δ udány v ppm):

1.9 až 2,8 (4H, m),

2.9 až 4,0 (8H, m),

3,2 (3H, s),

4,70 až 4,75 [2H, m),

7,7 (5H, s).

Písmenka v závorkách znamenají jak . shora uvedeno. Tyto hodnoty souhlasí se shora uvedenou strukturou sloučeniny. Hodnoty R_f a Rm, které byly stanoveny za podmínek shora uvedených v tabulce 7, jsou 0,29, respektive 2,14. IČ absorpční maxima (v cm¹, měřeno v KBr-pastiikcichJ: 3425, 2975, 2650, 2000, 1600, 1470, 1400, 1310, 1220, 1200, 1180, 1140, 1070, 1030, 1000, 960, 890, 780, 750, 730 s 700.

Referenční příklad 1

V 10 ml dimethylformamidu se rozpustí 1000 mg bleomycinové kyseliny (Cu-komplexu) s 2948 mg l-hydroxybenztriazolu (stručně HOBTj. Roztok se ochladí na 0 °C. K tomuto roztoku se zs míchání přidá 1500 miligramů (10 ekvivalentů bleomycinové kyseliny] dicyklohexylkarbodiimidu (stručně DCC). Po deseti minutách se ke směsi přidá roztok 1,953 mg (10 ekvivalentů bleomycínu] trihydrochloridu N-( 3-aminopropyl )-Ν,Ν-dimethylaminopropylsminu, který byl připraven odděleně, s 2206 mg (30 ekvivalentů bleomycinuj N-methylmorfolinu v 5 mililitrech dimethylformamidu. Směs se zs míchání nechá reagovat 4 hodiny za teploty místnosti. Žádaný produkt se z reskční směsi vysráží přidáním acetonu (desetinásobek objemu reskční směsi). Sraženina se promyje důkladně acetonem s rozpustí se v destilované vodě. Roztok se nechá projít lOOml kolonou CM-Sephadexu C—25 (Ns+-typ Phsrmacia Fine Chemicsls Co.), který se ekvilibruje- roztokem 0,05M kyseliny octové s octanem- sodným (pufr, pH 4,5). Žádaná sloučenina se adsorbuje. Adsorbovaná fáze se eluuje technikou lineárního koncentračního gradientu, s to tak, že se ke shora uvedenému pufru kontinuálně přidává chlorid sodný tak dlouho, sž se koncentrace chloridu sodného zvýší na 1,0 M. Modré frakce, které byly eluovány ssi 0,45M koncentrací chloridu sodného- se spojí, odsolí ns ArnberlituCR) XAD—2 jak shora uvedeno s lyofilizují. Získá se tsk 624 mg bíléhs amorfního prášku stom mědi obsahujícího* 3-[N- (3-aminopropyl) -Ν,Ν-dimethylamino jpropylsminobleomycinu.

UF absorpční maxima (měřená v destilované vodě): 292 nm a 243 nm s E (1 °/o/l centimetr) = 124 respektive 155. - IČ absorpční maxima (v cm-¹) (měřeno jskoKBr-psstilky): 3425, 2975, 2925, 1720, 1640, 1560, 1460, 1400, 1370, 1330, 1300, 1250, 1200, 1140, 1100, 1060, 1010, 990, 930, 880 s 760.

Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 9.

Podobným způsobem, jako je shora popsáno, byly syntetizovány sloučeniny, které jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 9

syntetizovaná sloučenina obecného* vzorce II (zkratka)	amin, který byl použit jakovýchozí materiál; sloučenina obecnéhovzorce IV	UV absorpční maximum produktu, který obsahuje atom mědi, nm (E 1 %/lcm)	TLC produktu, který -obsahuje atom Cu Rf +1	elektroforézs produktu, který obsahuje stom mědi R,n +2
MMHH	bis( 3-aminopropyl jdimethyl-	292 (124)	0,81	1,10
	amoniová sůl	243 (155)
EEHH	bis (3-aminopropyl ) diethyl-	292 (116)	0,82	1,06
	smoniová sůl	243 (145)
BBHH	bis (3-aminopropyl) dibutyl-	292 (112)	0,73	1,04
	smoniová sůl	243 (139)
PP4M	bis (3-aminopropyl) methyl-	292 (111)	0,42	1,15
	benzylamoniová sůl	243 (138)
MBZHH	1,3- [ bis (3-aminopropyl) -di-	292 (123)	0,70 .	1,03
	meihylamino j propan	244 (152)

Poznámka:

+ ¹ Silanizovaný silikagel 60F 254^(R) (Merck Co.); methanol — 6% octan amonný (45 : : 55 objemovým dílům).

+2 Avicel SF(R) (FMC Co.); směs kyselina mravenčí — kyselina octová — voda (v poměru 25 : 75 : 900 objemovým dílům); 800 V, 15 minut.

chlorbenzylbromidu. Směs se vaří 24 hodin pod zpětným chladičem. Aceton se z reakční směsi odstraní oddestilováním za sníženého tlaku. Reakční směs po- oddestilování acetonu se smíchá se 200 ml vody. Žádaný produkt se extrahuje chloroformem.

Chloroformová vrstva se vysuší nad bezvoReferenční příklad 2

Syntéza 3,4-dí- (3‘,4‘-dichlorbenzyloxy) benzaldehydu

K roztoku 2 g 3,4-dihydroxybenzaldehydu ve 40 ml acetonu se přidá 4,40 g bezvodého uhličitanu draselného s 6,24 g 3,4-di237334 dým síranem sodným. Oddestilováním chloroformu za sníženého tlaku se vysráží bílé

Krystaly. Surové krystaly se rekrystalují z ethylalkoholu.

Získá se 4,99 g bezbarvých krystalků, které tají při 181 až 183 °C. IC absorpční spektrum (měřeno jako KBr-pastilky, vlnočet v cm“¹) vykazovalo následující absorpční maxima: 658, 693, 710, 760, 795, 805, 830, 875, 1030, 1135, 1168, 1200, 1245, 1280, 1370, 1403, 1437, 1460, 1470, 1510, 1585, 1600, 1690, 2730, 2930, 2870, 2910 a 3070.

NMR spektrum, které bylo měřeno v deuterochloroformu, vykazovalo následující signály:

5,20 (s,2H),

6,93 až 7,67 (m, 9H j,

5,23 (s, 2H),

9,87 (s, IH).

Podobným způsobem jako shora uvedeno byly vyrobeny sloučeniny, které jsou uvedeny v tabulce 10.

Tabulka 10 výchozí sloučenina obecný vzorec IX obecný vzorec VIII název žádaný produkt (obecný vzorec X) t. t. (°Cj IČ

NMR

3,4-dihydroxy- 3,4-di-(p-chlorbenzaldehyd -benzyloxyjp-chlorbenzyl- benzaldehyd bromid

108—110 660, 680, 755, 800,

848, 870, 1013, 1033,

1090, 1135, 1168, 1208,

1236, 1270, 1350, 1380,

1407, 1437, 1456, 1493,

1510, 1575, 1585, 1600,

1685, 1900, 2740, 2870,

2910, 3070.

835, 5,16 (s,2H),

5,20 (s, 2H),

6,9 až 7,6 (m, 11H),

9,82 (s, IH).

3,4-dihydroxy- 3,4-di-(p-metho- olejovitá	750,	764,	790,	820, 860,
benzaldehyd xybenzyloxy) látka.	875,	935,	960,	985, 1000,
p-methoxyben- benzaldehyd	1028,	1118,	1170,	1187,
zylchlorid	1235,	1255,	1270,	1310,
	1340,	1390,	1430,	1465,
	1520,	1590,	1620,	1700,
	2740,	2850,	2880,	2950,
	3030.

3,88 (s, 6H),

5,18 (s, 2H),

5,22 (s, 2H),

6.83 až 7,6 (m, 11H),

9.84 (s, IH),

4-hydroxybenz- 4-(4-benzyloxy-	102—104 690,	725,	795,	810, 845,
aldehyd benzyloxy) -	875,	995,	1030,	1035,
4-benzyloxy- benzaldehyd	1115,	1165,	1180,	1215,
benzylchlorid.	1245,	1260,	1305,	1315,
	1385,	1425,	1453,	1515,
	1575,	1603,	1695,	1895,
	2750,	2810,	2830,	2875,
	2910,	2950,	3050,	3075.

5,07 (s, 4H],

6,85 až 7,93 (m, 13H),

9,83 (s, IH)

4-hydroxybenz- 4-(cyklooktylaldehyd methoxy )cyklooktylme- benzaldehyd thylbromld olejovitá 830, 860, 1010, 1033, látka 1110, 1160, 1215, 1255, 1313, 1360, 1393, 1425, 1445, 1465, 1710, 1787, 1600, 1692, 2740, 2855, 2920.

1,6 (široký s, 15H],

3,78 (d, J = 1,1 Hz) (2H),

6,96 a 7,80 (A₂B₂ systém, J — 1,4 Hz),

9,86 (s, IH).

rofuranu. Směs se nechá reagovat 12 hodin za teploty místnosti. Reakční směs se zředí 50 ml pentanu smíchá se se 100 ml 1M kyseliny chlorovodíkové a třepáním se promíchá. Organická vrstva se promyje postupně po sobě vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Po vysušení a zahuštění se získá methylencyklotridekan.

К roztoku této látky ve 40 ml bezvodého

Referenční příklad 3

Příprava cyklotridekankarbaldehydu

К míchané směsi 3 g zinkového prachu, ml bezvodého tetrahydrofuranu a 2,66 g dlbrommethanu se přikape roztok 2,13 g bezvodého chloridu titaničitého v 5 ml dichlormethanu. Po patnácti minutách se к výslednému roztoku přikape roztok 2 g cyklotridekanonu v 8 ml bezvodého* tetrahyd41 dichlormethanu se po ochlazení na —15 ^CC za míchání přikape roztok 2,64 g m-chlorperbenzoové kyseliny ve 40 ml bezvodého dichlormethanu. Po tříhodinové reakci se organická vrstva promyje postupně po sobě 10% roztokem siřičitanu sodného, 7% roztokem hydrogenuhličitanu a nasyceným roztokem chloridu sodného. Pak se organická vrstva vysuší a za sníženého tlaku se zahustí. Koncentrát se vyčistí chromatografii na sllikagelu [eluce směsí petroletheru s ethylacetátem v poměru 20 : 1]. Získá se 2,04 g (95%^: výtěžek vztaženo na výchozí keton) epoxidu. К roztoku epoxidu v bezvodém dichlormethanu se po ochlazení na —18 °C přikape komplex fluoridu boritého s etherem.

Po skončeném přidávání se к reakční smě si přidá voda. Organická vrstva se oddělí, zahustí a vyčistí chromatografii na silikagelu. Získá se olejovitý cyklotridekankarbaldehyd ve výtěžku 60 až 70 °/o. IC absorpční spektrum sloučeniny (měřeno jako KBr-pastilka) vykazuje následující absorpční maxima: 723, 735, 825, 970, 1070, 1110, 1128, 1196, 1220, 1225, 1285, 1350, 1420, 1450, 1465, 1590, 1710, 1735, 2700, 2870 a 2920.

NMR spektrum (měřeno v deuterochloroformu) vykazuje následující signály:

1,39 (široký singlet, 24H),

1,39 (široký singlet, 24H), (CH? x 12);

2,1 až 2,5 (m, 1H, — CH),

9,58 (d, J = 1,8 Hz) (1H, —CHO).

Claims (9)

1. PŘEDMĚT

   VYNALEZU

   1. Způsob výroby aminopropylaminobleomycinového derivátu obecného vzorce I [BX] — NH— (CH₂)₃- A— (CH₂)₃—В CONH

   I v němž [BX] znamená zbytek kyseliny, vytvořený odtržením hydroxylové skupiny z karboxylové skupiny bleomycinové kyseliny, vzorce skupinu obecného vzorce a R₂ znamená alkylovou skupinu s 1 atomy uhlíku nebo benzylovou skupi-

   HOCH

   A znamená

   -N— (R₂)n kde —N N — Ri až 4 nu,

   nebo

   R znamená nlkylenovou skupinu s 2 až

   6 atomy uhlíku a n znamená číslo· 0 nebo 1,

   B znamená skupinu obecného vzorce

   R« /

   —N \

   R.4 v němž R₃ a R4 nezávisle na sobě znamenají a) atom vodíku nebo b) skupinu obecného vzorce

   R«

   I —CH—R5 kde R5 a R_G znamenají nezávisle na sobě 1. atom vodíku, 2. cykloalkyl s 5 až 13 atomy uhlíku, 3. alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, která může být substituována jednou nebo více cykloalkylovými skupinami s 5 až 13 atomy uhlíku nebo fenylovými skupinami, které mohou být popřípadě substituovány atomem halogenu, 4. fenylovou skupinu, která může být substituována jedním nebo více atomy halogenu nebo alkylovými skupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, cykloalkyl (Cs—CuJmethyloxyskupinami, alkoxyskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, benzyloxyskupinami, kyanoskupinami, halogenmethylskupinami, halogenbenzyloxyskupinami, alkoxy( С_г_₄ jbenzyloxyskupinami nebo· benzyloxybenzyloxyskupinami, 5. naftylovou skupinu, 6. thienylovou skupinu, 7. f urylovou skupinu, 8. anthranylovou skupinu nebo 9. norbornenylovou skupinu, s tím omezením, že alespoň jeden ze substituentů R₅ a R_C) má jiný význam než vodík, nebo jeho solí, vyznačující se tím, že se aminopropylaminobleomycin obecného vzorce II [BX ] — NH— (CH₂)3—A“— (CH )3—NH2 (II) v němž [BX] má shora uvedený význam, a A“ znamená skupinu —N— nebo má výH znám uvedený výše pro A, nechá reduktivně zkondenzovat s karbonylovou sloučeninou obecného vzorce III

   R5-CO-R6 (III) kde R5 a R₆ mají výše uvedený význam, a získaný produkt obecného vzorce I se popřípadě převede na svoji sůl.
2. 2. Způsob výroby aminopropylaminobleo·mycinového derivátu obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází ze sloučenin výše uvedených · vzorců II a III za vzniku sloučenin obecného vzorce I, kde [BX] a A mají shora uvedený význam, B znamená skupinu obecného· vzorce

   R₄ /

   —N

   Rs v němž R3 a R4 nezávisle na sobě znamenají a) atom vodíku nebo b) alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, která je popřípadě substituována jednou nebo více fenylovými, naftylovými, anthranylovými, furylovými, thienylovými, norbornenylovými, nebo cykloalkylovými skupinami s 5 až 13 atomy uhlíku, tyto substituční skupiny jsou popřípadě dále substituovány jedním nebo· více atomy halogenu, jednou nebo více alkylovými skupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, . kyanoskupinami, halogenmethylovými skupinami nebo benzyloxyskupinami, s tím, že alespoň jedna ze skupin R3 a R4 je jiná než atom vodíku, vyznačující se tím, že se aminopropylaminobleomycin obecného vzorce II, v němž [BX] a A mají shora uvedený význam, nechá reduktivně zkondenzovat s karbonylovcu sloučeninou obecného vzorce III, v němž Rs a Rl. znamenají nezávisle na sobě a) atom vodíku, b) cykloalkylovou skupinu s 5 až 13 atomy uhlíku, c) alkylovou skupinu, která je popřípadě substituována jednou nebo více cykloalkylovými skupinami s 5 až 13 atomy uhlíku nebo· fenylovými skupinami, fenylová skupina je popřípadě dále substituována atomem halogenu, d) fenylovou skupinu, která je popřípadě substituována jedním· nebo více atomy halogenu, jednou nebo více · alkylovými skupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, benzyloxyskupinami, halogenmethylovými skupinami, e) naftylovou skupinu, f) thienylovou skupinu, nebo g) furylovou skupinu.
3. 3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se aminopropylaminobleomycin obecného vzorce II, v němž [BX] má shora uvedený význam, A znamená skupinu —NN— w

   CH.3CH

   -Ní-tC^h-NCH3CH nebo

   R¹ —N—

   I (R2)n kde

   Rj znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku,

   R2 znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo benzylovou skupinu a n znamená číslo 0 nebo 1, nechá reduktivně zkondenzovat s karbonylovou sloučeninou obecného vzorce III, v němž R₅ a R_(í znamenají nezávisle na sobě a) atom vodíku, b) cykloalkylovou skupinu s 5 až 13 atomy uhlíku, c] alkylovou skupinu substituovanou halogenfenylovou skupinou, d] fenylovou skupinu, která je popřípadě substituována jedním nebo· více . atomy halogenu nebo jednou nebo více benzyloxyskupinami, kyanoskupinami, halogenmethylovými skupinami, halogenbenzyloxyskupinami, alkoxybenzyloxyskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku v alko^xylové části, benzyloxybenzyloxyskupinami nebo cykloalkylmethyloxyskupinami s 5 až 13 atomy uhlíku v cykloalkylové části, nebo· e] naftylovou skupinu.
4. 4. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se aminopropylammobleomycin obecného vzorce II, v němž [BX] má shora uvedený význam, A znamená skupinu

   CH3

   - I —N— nebo nechá reduktivně zkondenzovat . s karbonylovou sloučeninou obecného vzorce III, · v němž R5 znamená atom vodíku a R( znamená fenylovou skupinu, která je popřípadě substituována jednou nebo· více benzyloxyskupinami nebo cykloalkylovými skupinami s 5 až 13 atomy uhlíku.
5. 5. Způsob podle· bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se aminopropylammobleomycin obecného vzorce II, v němž [BX] má shora uvedený význam, A znamená skupinu

   CH3 —N— nebo skupinu

   Q '\ ~N N~ \_/ nechá reduktivně zkondenzovat s cykloundekankařbaldehydtm nebo benzaldehydem, přičemž benzaldehyd je popřípadě substituován jednou nebo více benzyloxyskupinami.
6. 6. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že mo-láimí poměr aminopropylaminobleomycinu ke karbonylové sloučenině je 1 : : 0,5 až 25.
7. 7. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se kondenzace provádí po dobu 3 až 70 hodin v rozpouštědle za přítomnosti redukčního činidla při teplotě —5 až 70 °C.
8. 8. Způsob podle bodu 7, · vyznačující se tím, že se jako· rozpouštědlo používá methanol, voda, dimethylformamid, acetonitril nebo jejich směs.
9. 9. Způsob podle bodu 7, vyznačující se tím, že se jako· redukční činidlo používá hydridoboritanová sloučenina nebo paládium na uhlí.