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CN88101810A - 免疫球蛋白结合物 - Google Patents

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Abstract

免疫球蛋白结合物，它包括与单克隆抗体或其片段结合的idarubic in(Ida)，所述片段至少含有抗体上的一个抗原结合位点，它可用于治疗患有癌症的人或其他动物，或从细胞群落中除去T淋巴细胞亚群。

Description

本发明涉及免疫球蛋白结合物及其制备和使用。
已经知道使用单克隆抗体（MoAb）治疗肿瘤的目标抗肿瘤剂的一般概念，其治疗意义正在给予评价。一般研究涉及生产能对肿瘤细胞进行选择性定位和杀伤的抗体和毒性试剂的结合物。主要注意力集中于使一系列植物和细菌毒素与抗体结合而构建免疫毒素，这样，它们与抗原的结合和内化则导致细胞死亡。实际上，许多被认为是特异于肿瘤的MoAb与正常细胞的亚群也发生反应，从而使正常组织受到潜在的伤害，因此，使用这种强力毒素可能是不现实的。一种比植物毒素更安全的方法是使常规的抗肿瘤药物（如doxorubicin、Vindesine、Chlorambucil、Melphalan和Methotrexate）与抗体偶联。由于目前所用抗肿瘤剂的非特异的毒性效应，一直企图通过使它们与肿瘤抗原的MoAb偶联而提高其治疗指数。
为了抑制胸腺来源的T细胞对于移植的排斥反应，所作努力通常集中于使用抗胸腺细胞球蛋白以降低T细胞活性。最近，随着单克隆抗体的发展，已有可能根据其离体功能和由MoAb确定其特异的表面抗原的存在而确定T细胞亚群。这刺激了对于T细胞的移植排斥的控制机理的探索，通过L3T4和Ly-2鼠抗原进行定义，将主要组成部分集中于辅助细胞/诱导细胞和细胞毒性的/抑制细胞几个亚群。虽然OKT3    MoAb（一种抗pan    T细胞试剂）已证明具有活体效应，但我们在最近的研究中发现，抗20种不同鼠淋巴细胞抗原的20种MoAb在小鼠中没有活体的效应，因此不能用于活体研究。因此应当寻找一种方法，使这些高度特异性的MoAb能够具有更强的效力并完全去除其靶细胞。利用具细胞毒性的药物与MoAb偶联即是这样一种研究。
药物-MoAb结合物的临床潜力包括对癌证进行免疫化疗，缓解各种免疫调控失常和异源移植的排斥反应。许多研究表明，毒素和药物当与肿瘤相关抗原刺激的MoAb偶联后，对肿瘤细胞具有特异的细胞毒性。但是，虽然毒素-抗体结合物已被大量用来在离体中在骨髓移植之前根除T细胞，但对于在活体中使用药物-MoAb结合物以根除T细胞和研究T细胞在移植排斥中的免疫调控作用没有给予足够的重视。
Anthracycline类是用于癌症化疗的一组重要的抗肿瘤剂，其中的doxorubicin和daunorubicin已证明对于固体肿瘤具有效力。但是，使daunorubicin和doxorubicin与抗体偶联时，如果偶联是通过氨基进行的则导致大部分药物活性的丧失。最近，利用bromodaunorubicin通过碳原子14已使daunorubicin与几种MoAb偶联。这些结合物表现出离体活性。但没有活体研究的报道（Gallego    et    al，Int.J.Cancer    1984    33：373-744）。而且还发现;daunorubicin-MoAb结合物在浓度大于10μg/ml时表现出非特异的毒性。
现在我们正发现，Idarubicin（4-脱甲氧基的daunorbicin，Ida）可与MoAb偶联，而且结合物在离体和活体中具有选择性的强力的抗肿瘤活性。Ida-MoAb结合物在活体中当剂量小于8.0mg/kg没有明显的非特异毒性。Ida-MoAb结合物比daunorubicin-MoAb结合物具有更大的离体和活体效应。
进一步，我们通过使Ida和已知与不同的淋巴细胞亚群（L3T4+、Ly-2+和Thy-1+）反应的MoAb偶联，评价了Ida-MoAb结合物特异性根除细胞的能力。我们已发现这是一种极为有效的排除细胞的方法。例如，抗Ly-2.1的MoAb在活体中测不到对于Ly-2.1+细胞的效应，但与细胞毒性剂Ida偶联后能变成一种有效的细胞毒性剂。
利用抗Ly-2和L3T4抗原的MoAb，我们已经证实Ida-MoAb能够在离体和活体中除去靶细胞。能够提供这样的Ida-MoAb结合物，它们比之抗淋巴细胞球蛋白或抗pan    T细胞的试剂如OKT3    MoAb，具有更大的潜力以去除与移植排斥有关的特异的T细胞亚群。
因此，本发明提供了含有与单克隆抗体或其片段（至少包括抗体中的一个抗原结合位点）结合的Ida的免疫球蛋白结合物。
Ida的记载见于US-A-4077988。最好是使2-8个Ida分子与每个抗体或抗体片段分子共价连接，更好是2-6个。Ida分子一般（但并不是不必须）在14位与单克隆抗体或抗体片段结合。它们最好是直接相连，但也能够插入一个惰性载体或连接物。然而，Ida也可通过氨基与单克隆抗体或抗体片段结合。这可以通过可降解的肽间隔子、葡聚糖载体、酸敏感间隔子或聚谷氨酸达到。用于连接的基团包括合成多聚氨基酸（如聚L-谷氨酸和聚L-门冬氨酸）的羧酸基团，或者，插入蛋白如人血清清蛋白或功能化的葡聚糖如羧甲基葡聚糖也可起载体的作用。这些载体的大小可在10-60千道尔顿的范围。
每种抗体或抗体片段一般特异于细胞表面的一种抗原，此细胞正是期望作为Ida靶子的细胞。例如，抗体或抗体片段可特异于一种期望的靶组织如人肿瘤。期望作为Ida靶子的人肿瘤的例子有乳房、结肠、肺、前列腺、卵巢、胸腺和其他癌症、肉瘤和白血病等。抗体或抗体片段也可特异于一种动物肿瘤。可使用一种特异于人铁传递蛋白受体（TFR）的抗体或抗体片段，此受体存在于分裂细胞、红色前体细胞和多种肿瘤的细胞上。一种合适的抗TFR的单克隆抗体可以是由LiCR-LON-HMy-2（HMy-2）细胞上的铁传递蛋白体刺激的抗体。
企图用免疫球蛋白结合物排除特异的T淋巴细胞群落时，抗体或抗体片段所特异的细胞表面抗原，其本身又是特异于这些T淋巴细胞的。因此，抗体或抗体片段可以特异于辅助细胞、抑制细胞或细胞毒性的T淋巴细胞群。
单克隆抗体或抗体片段最好来自准备施用免疫球蛋白结合物的同样品种。因此，人或小鼠的单克隆抗体或抗体片段一般被用在企图对人施用结合物的地方。另外，抗体或抗体片段最好是IgG类的。抗体片段可以是Fab、Fab′或F（ab′）片段。也可使用IgM单体，它可通过蛋白水解酶消化IgM抗体产生。
免疫球蛋白结合物是根据本发明的方法制备的，即使da与单克隆抗体或其片段结合。最好是使14-卤代Ida与单克隆抗体或其片段反应。14-取代基可以是氟、氯、溴或碘，但最好是溴。14-溴-Ida的记载见于US-A-4125607。因此，结合可由包括下述步骤的方法完成：
（a）使单克隆抗体或其它片段与过量摩尔的14-卤代-Ida混合，
（b）使混合物于18-37℃下反应，
（c）去掉所有沉淀，
（d）由凝胶过滤去掉未反应的起始物质，以及
（e）由吸附层析或离子交换层析去掉吸附的药物（Ida）。
步骤（a）一般在一种可与水混合的有机溶剂（例如N，N-二甲基甲酰胺）中进行。步骤（a）中14-卤代-Ida的过量摩尔数最好是从0至50倍。在步骤（b）中，反应最好进行1-8小时。反应温度一般为室温。
但可以使用其他的结合方法。如果结合物要求有插在Ida和单克隆抗体或抗体片段间的一个惰性载体或连接物，则一般首先使载体或连接物与Ida的C-14碳原子结合，然后与抗体或抗体片段连接。而且，如上所述，抗体或抗体片段可以使用可降解肽间隔子、葡聚糖载体、酸敏感间隔子或聚谷氨酸，通过氨基与Ida结合。
本发明的免疫球蛋白结合物能用来治疗患有癌症的人或其他哺乳动物。能够施用治疗有效量的结合物。癌症可以是固体肿瘤，腹水肿瘤或白血病。上面已经提及了可以处理的人肿瘤。可以使用两种或更多的结合物，其中每种结合物的单克隆抗体或抗体片段具有不同的特异性。
结合物可通过注射施用。可以通过非胃肠道施用，例如静脉注射。它可以进行局部施用或直接施用在肿瘤中。结合物对病人的施用数量依赖于多种因素，例如待处理的肿瘤和病人的条件。但是，结合物的一般施用剂量为每m2患者体面积10-200mg。结合物可与其他化疗药物一起使用，或与提高结合物活性的药物一起施用，例如血管活性剂或肿瘤坏死因子。
免疫球蛋白结合物还可用来从细胞群落中特异性地排除了T淋巴细胞亚群。可对人或动物施用治疗有效量的结合物，其中结合有针对待排除的淋巴细胞上的细胞表面抗原的单克隆抗体或抗体片段。另外，细胞群落可在离体中与这种结合物保温。
可以使用抗两种或更多的细胞表面抗原的混合结合物。待排除的淋巴细胞可以是辅助细胞、抑制细胞或细胞毒性的T细胞。
本发明的这一技术方案可用来防止移植受体中的移植组织的排斥反应。结合物可作为免疫抑制剂使用。对移植受体施用有效量的结合物以防止移植排斥。在此例中，被排除的最好是细胞毒性的T细胞。通过施用合适的结合物以排除抑制T细胞可治疗人或动物的癌症。通过施用以排除辅助T细胞的结合物为目的能够治疗自身免疫疾病。在每一种情况中，结合物的施用途径和剂量如上面所述。
将免疫球蛋白结合物与可用于药物的载体或稀释剂配制成药物组合物。可使用任一种合适的载体或稀释剂。合适的载体和稀释剂包括生理盐水溶液和Ringers氏葡糖液。
下述实例说明本发明。在附图中，图1-12涉及实例1，图13-17涉及实例2。更具体地说：
图1    代表anthracycline衍生物的结构;
图2    代表Idarubicin（Ida）与抗-Ly-2.1（0.5mg）的偶联。每摩尔抗-Ly-2.1中掺入的Ida摩尔数（■）（左座标）及蛋白回收（●）（右座标）表示为反应混合物中Ida的毫微摩尔数（横座标）的函数;
图3 代表抗-Ly-2.1结合物对ITT（1）75NS E3靶细胞的抗体滴定度，以%莲座细胞形成（纵座标）对抗体稀释度（×10-1）（横座标）作图。系列稀释以0.5mg/ml的抗-Ly-2.1（▲）或具有2（●）或8（○）mol Ida/mol抗体的抗-Ly-2.1中的任一种溶液进行;
图4 代表在24小时的检测中，Ida（■）或Ida-抗-Ly-2.1，5mol Ida/mol抗体，（●）对于E3细胞的抑制效应，以[3H]胸苷掺入的%抑制（纵座标）对Ida浓度（M）（横座标）作图;
图5 代表在30分钟的抑制检测中，Ida（■），Ida-抗-Ly-2.1，5mol Ida/mol抗体（●）或Ida-抗-TFR，5mol Ida/mol抗体（○）对于（Ly-2+）E3细胞的抑制效应，以[3H]胸苷掺入的%抑制（纵座标）对Ida浓度（M）（横座标）作图;
图6 代表在30分钟的特异性检测中，Ida-抗-Ly-2.1，5mol Ida/mol抗体（○）和结合物加抗-Ly-2.1（●）对于E3靶细胞的抑制效应，以[3H]胸苷掺入的%抑制（纵座标）对Ida浓度（M）（横座标）作图;
图7 代表皮下注射了2×106细胞的CBF1小鼠中的E3胸腺瘤的生长。由箭头标出对每组10只小鼠进行静脉内治疗，PBS（□），Ida（■），抗-Ly-2.1（▲），Ida-抗-TFR（○）或Ida-抗-Ly-2.1（●）。以肿瘤的平均大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图。误差柱代表平均值的±标准误差;
图8 代表用2.0×10E3肿瘤细胞皮下注射CBF1小鼠，并在第4和5天用Ida-抗-Ly-2.1结合物进行静脉内治疗的单个肿瘤的生长曲线。以肿瘤大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图;
图9 代表皮下注射了3.0×106细胞的CBF1小鼠中的E3胸腺瘤的生长。由箭头标出对每组10只小鼠进行静脉内治疗;PBS（□）;抗-Ly-2.1（▲），Ida（■）或Ida-抗-Ly-2.1结合物（●）。以肿瘤的平均大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图。误差柱代表平均值的±标准误差;以及
图10代表皮下注射了3.0×106细胞的CBF1小鼠中的E3胸腺瘤的生长。由箭头标出对每组10只小鼠进行瘤内治疗;PBS（□）;抗-Ly-2.1（▲），Ida（■）或Ida抗-Ly-2.1结合物（●）。以肿瘤的平均大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图。误差柱代表平均值的±标准误差;
图11代表用2×106细胞进行皮下注射的裸鼠中异源移植的COLO205人肿瘤的生长。对每组10只小鼠静脉注射的下述物质由箭头标出;PBS（△），游离的Ida（◆），Ida-250-30.6结合物（●），Ida和250-30.6（◇）的混合物和250-30.6（▲）。以肿瘤的平均大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图。误差柱代表肿瘤平均大小的±标准误差;
图12代表静脉注射（箭头）（Ida-250-30.6结合物处理的异源移植裸鼠中的单个肿瘤的生长曲线。虚线代表PBS处理的小鼠中肿瘤的平均大小。以肿瘤大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图;
图13表示Ida（Idarubicin）与抗-L3T4（0.5mg）的偶联。每摩尔抗-L3T4（◆）掺入的Ida摩尔数（左座标）和蛋白回收（●）（右座标）表示为反应混合物中Ida的毫微摩尔数（横座标）的函数;
图14表示抗-Thy-1结合物对于ITT（1）75 NS E3靶细胞的抗体滴定度，以%莲座状细胞形成（纵座标）对抗体稀释（×10-1）（横座标）作图来测定。系列稀释以1.0mg/ml的抗-Thy-1（◆）或与1（○）、4（●）或7（◇）mol Ida/mol抗-Thy-1的结合物中的任一种溶液进行;
图15表示Ida-MoAb和MoAb处理对小鼠脾脏中L3T4+和Ly-2+细胞数目的效应，用Ida-抗-L3T4处理（●-●），抗-L3T4处理（▲-▲），Ida-抗-Ly-2.1处理（●…●），抗-Ly-2.1处理（▲…▲）或未处理（□…□），以%莲座状细胞形成（纵座标）对天数（横座标）作图;
图16表示混合的Ida-MoAb结合物处理对于CBA小鼠中P388D1肿瘤移植（与H-2交叉和非H-2的差别）存活率的效应。每组10-15只小鼠皮下注射8.0×106P388D1肿瘤细胞，并通过静脉接受下述物质之一（箭头）：（ⅰ）PBS（◆），（ⅱ）抗-L3T4和抗-Ly-2.1（○），（ⅲ）Ida-抗-L3T4（■），（ⅳ）Ida-抗-Ly-2.1（●）和（ⅴ）Ida-抗-L3T4和Ida-抗-Ly-2.1（▲）。以肿瘤的平均大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图。误差柱代表平均值的±标准误差;以及
图17表示Ida-抗-Thy-1结合物对于CBA小鼠中P388D1肿瘤移植存活率的效应。每组10只小鼠皮下注射1.0×107P388D1肿瘤细胞，并通过静脉接受下述物质之一（箭头）：（ⅰ）PBS（□），（ⅱ）抗-Thy-1（●）和（ⅲ）Ida-抗-Thy-1（▲）。以肿瘤的平均大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图。误差柱代表平均值的±标准误差。
图18表示用8×10细胞/小鼠注射的裸鼠中异源移植的COLO205（30.6+，17.1+）的生长。对每组10只小3鼠腹腔注射的下述物质由箭头标出：PBS（□）;17.1-Ida（○）;30.6-Ida（△）或30.6-Ida和17.1-Ida的混合物（●）。以肿瘤的平均大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图。误差柱代表平均值的±标准误差。Ida的总剂量为200μg。
图19表示移植肿瘤片段（1-5mg）的裸鼠中异源移植的LIM2210人结肠胂瘤的生长。由箭头标明对每组10只小鼠静脉注射下述物质：PBS（□）;17.1-Ida（◆）;JGT-13-Ida（▲）;27.1-Ida（●），30.6-Ida（○）。以肿瘤的平均大小（cm2）（纵座标）对肿瘤接种后的天数（横座标）作图。误差柱代表平均值的±标准误差。Ida的总剂量为80μg。
实例1
材料和方法
肿瘤细胞
本研究中所检查的细胞系包括（Ly-2+）鼠胸腺瘤ITT（1）75 NS E3变异株（E3）（Smyth et al，J.Natl Cancer Inst 1986 76∶503-510），（Ly-2-，TFR-）淋巴瘤EL4（Horowitz et al，Science 1968 160∶533-535），（TFR+）人细胞系CEM（Foley et al，Cancer 1965 18：522-529）和（250-30.6+）人细胞系COLO 205等。离体细胞保存在Dulbecco修饰的Eagle氏培养基（DME）或RPMI 1640培养基（Flow Laboratories，Sydney，Australia）中，其中补充有10%热失活的新生下的小牛血清（Flow），2mM谷氨酰胺（Commonwealth Serum Laboratories，Sydeny，Australia）;100μg/ml链霉素（Glaxo，Melbourne，Australia）和100I.U./ml青霉素（Commonwealth Serum Laboratories）。E3肿瘤通过在（C57BL/6×BALB/C）F1小鼠（CBF1，小鼠）中连续传代而活体保存。用磷酸盐缓冲的盐水（PBS）pH7.3洗涤和离心（400g×5分钟）来自腹水的细胞两次，再悬浮于PBS中，皮下注射（S.C.）入小鼠腹壁中;在处理前使其发育成可触知的肿瘤。对小鼠进行一系列静脉（i.v.）或肿瘤内（i.t.）注射，随后每天用测径尺测量肿瘤的大小，沿着肿瘤的垂直轴测量。以肿瘤的平均大小记录数据（两个直径的积±标准误差）。
小鼠
CBA，（C57 BL/6×BALB/C）小鼠（CBF1，小鼠）和裸鼠（nu/nu）由Department of Pathology，University of Melbourne产生。每个实验中所用的实验组为8-10只性别和年龄都相同的小鼠。
单克隆抗体
所用的MoAb是：（ⅰ）与鼠Ly-2.1具有特异性反应的抗-Ly-2.1（IgGl）（Hogarth    et    al，Immunology    1982    46：135-144）;（ⅱ）与人铁传递蛋白受体（TFR）反应的A3C6（抗-TFR）（Ig    Gl）（Panaccio    et    al，Immunology    and    Cell    Biology    65，461-472，1987）;以及（ⅲ）一种称为250-30.6的抗体，它对人结肠癌细胞上的抗原发生反应。
通过40%硫酸铵沉淀由腹水中分离MoAb，溶于PBS中并在同样缓冲液中透析。使这些粗制品吸附在Protein-A-Sepharose（Pharmacia Inc.，Piscataway，New Jersey）上，用PBS（pH7.3）充分洗涤，然后用0.2M甘氨酸/HCl（pH2.8）洗脱，或者使它们通过Affigel蓝色柱（Bio-RadLaboratories Pty.Ltd.，Sydney）。中和以后，在PBS中透析MoAb，然后等分并贮存在-70℃。A3C6如下述得到：用2×106LiCR-LON-HMy-2（HMy-2）细胞（OKT9+ve）腹腔注射CBA小鼠使其免疫，以每周一次持续三周，最后一次注射三天后取出脾脏，与P3-NSI-AG4-1（NS-1）细胞融合。
结合物的制备与定量
完整的抗-Ly-2.1、抗-TFR MoAb或250-30.6（在pH8.0的硼酸盐缓冲液中，1-2mg/ml）与溶于10mg/ml（N，N）-二甲基甲酰胺（DMF）中的摩尔过量的（1-50倍）14-溴-4-脱甲氧基的dAUNORUBICIN（Br-Ida）混合。反应在室温下进行4小时，然后离心（400g×5分钟）去除所有沉淀。利用Sephadex G-25柱（PD-10;Pharmacia）通过凝胶过滤层析以除去游离的Br-Ida和他其未反应的起始物质，然后使结合物通过Porapak Q柱（Millipore）以除去所有被吸附的药物（Niederwieser et al，J.Chromatog.1971 54∶215-223）。药物-MoAb结合物中掺入的Ida量，通过测定483的光吸收（E498＝3.4×103M-1cm-1）及蛋白质测定（Bradford，Anal Biochem.1976 72∶248-253）来确定。
抗体活性
利用羊抗小鼠免疫球蛋白（SAMG）进行莲座状技术检测以测定Ida-MoAb结合物的抗体活性，并与经历了用于偶联方法中相同程序的游离MoAb相比较（Parish    and    Mckenzie，J.Immunol    Methods    1978    20∶173-183）。
药物活性
（a）24小时抑制检测：100μl细胞（2-5×106/ml）加至平底微量滴定板中，于37℃保温1小时。使游离的Ida（溶于PBS中）和Ida-MoAb结合物无菌过滤，在无菌的PBS中进行系列稀释;50ul游离的Ida或结合物加至细胞中，每份样品使用2个重复小孔;对照孔加入50ul PBS，细胞于37℃，7%CO中培养24小时。
（b）30分钟抑制检测：200ul细胞（2-5×10/ml）收集于灭菌的Eppendorf管中，再悬浮于无菌药物或结合物中，于37℃混合30分钟。然后使细胞离心（400g×5分），再悬浮于生长培养基中，取100ul的等分试样接种于微量滴定板中，每份样品使用2个重复小孔，然后保温16-24小时。在这两种检测中的保温期间过后，加入50ul含有1μCi[3H]-胸苷（比活度＝5Ci/mmol;Amersham）的生长培养基，使平板保温2-4小时。然后收集细胞，干燥，分离单个样品并用β-闪烁计数器计数。[3H]-胸苷的掺入表达为对照掺入的抑制百分比。重复测定表明，任何一点都产生标准误差，但在任何给定的实验点都不超过5%。
毒性
对于每组10-20只的CBA小鼠，给予一次各种剂量Ida或Ida-抗-Ly-2.1的静脉注射，针对所施用的药物剂量（mg/kg）记录小鼠的存活率。取下这些小鼠的器官称重，然后进行福尔马林固定并用苏木精和曙红染色。
结果
结合物的制备及特性
Br-Ida（图1）与好几种MoAb共价偶联：针对人TFR的，针对人结肠癌细胞抗原的（抗体250-30.6）和针对鼠Ly-2变异抗原的。通过改变加至MoAb中的Br-Ida的摩尔过量数，使较高的Ida掺入和较低的蛋白回收之间达成妥协。从而确定了结合的反应条件。Ida-抗-Ly-2.1（图2）、Ida-抗-TFR和Ida-250-30.6（数据未给出）掺入3-5个Ida分子，蛋白回收在50%以上。Br-Ida和MoAb的反应可产生两类的连接（图1C和D）。为了确定存在哪一种，使结合物用pH4.5或pH9.0处理48小时，释放出的游离药物吸附在Porapak    Q中，然后通过分光光度法再次对样品定量。用碱（pH9.0）处理时50%的结合药物被释放，而在pH4.5没有明显的释放。这表明至少有50%的药物是酯键连接的（图1D），因为酯键连接对碱性条件敏感，而胺键连接是稳定的。
抗体活性
通过莲座状技术测定抗体在结合前和结合后的滴定度，测定50%靶细胞形成莲座状时的抗体稀释度。含有2和8个Ida分子的Ida-抗-Ly-2.1结合物针对E3细胞的抗体滴定度分别为1∶56，000和1∶33，000，而未结合抗体的滴定度为1∶80，000（图3）。含有2和6个Ida分子的Ida-250-30.6结合物针对COLO    205细胞的抗体滴定度分别为1∶16，000和1∶11，000，而未结合抗体的滴定度为1∶33，000。因此，部分抗体活性由于结合过程而丧失，用具有不到6个Ida分子的MoAb结合物进行离体和活体研究。发现如果所掺入的Ida超过这一水平，则显著降低Ida-抗-Ly-2.1结合物的溶解度和抗体活性（数据未给出）。根据不同的抗体，通常可能掺入的Ida分子的最大数目会有所变化。
Idarubicin和Idaubicin-MoAb结合物的离体活性
在24小时的抑制检测中，测量Ida和两种Ida-MoAb结合物对于鼠ITT（1）75 NS E3细胞系（Ly-2+TFR-）和人CEM细胞系（Ly-2-TFR+）的离体细胞毒性，并确定I.D.50（相当于对照[3H]-胸苷掺入的50%抑制）的数值。结果示于图4和表1中。Ida的I.D.50对于测试的两种细胞系都在1.0-2.5×10-7M范围内（图4，表1）。与游离Ida的这些数值比较，Ida-抗-Ly-2.1对于E3的I.D.50大4倍（图4），Ida-抗-TFR对于CEM的I.D.50大1-2倍（表1）。因此，游离的Ida对于E3和CEM二者均分别比Ida-抗-Ly-2.1和Ida-抗-TFR具有更大的细胞毒性。但是，这些Ida-MoAb结合物对非反应的细胞系表现出的细胞毒性低10倍（表1），因此表明它们的细胞毒作用是特异性的，此特异性是由抗体活性的固位产生（图3）。
表1    Idarubicin-单克隆抗体结合物对于肿瘤细胞的效应
I.D.50的平均值
肿瘤细胞系    Ida    Ida-抗-Ly-2.1    Ida-抗-TFR
E3 1.2×10-74.3×10-72.3×10-6
（5）2（3） （2）
CEM 2.2×10-72.0×10-63.0×10-7
（5）    （2）    （3）
1I.D.50＝对照[3H]-胸苷掺入的50%抑制作用。
2＝所测试制备物的数目。
Ida-250-30.6结合物的活性比游离的Ida略低。对于COLO 205靶细胞系，游离Ida的I.D.50为6×10-8M，而结合物的I.D.50为3.5×10M。
为了检查结合是否对靶细胞表现出选择的细胞毒作用，使Ida-抗-Ly2.1和Ida-抗-TFR与E3（Ly-2+）细胞保温30分钟，然后洗掉未结合的结合物，并测量细胞毒性。Ida-抗-Ly-2.1结合物的I.D.50为6.2×10-7M，而游离Ida的I.D.50为5.2×10-7M（图5）。与此相反，非反应性Ida-抗-TFR结合物的I.D.50为5.0×10-6M，即比游离Ida的大10倍，表明Ida-抗-Ly-2.1结合物的抗体结合活性导致其选择性细胞毒性。与此相似，使Ida-250-30.6结合物和游离药物与COLO 205（25-30.6+ve）和E3（250-30.6-ve）细胞系保温30分钟，然后洗涤并进行细胞毒性检测。两种细胞系对游离药物表现出相似的剂量反应，即对于COLO 205为9.2×10-7M，对于E3为9，8×10-7M。然而，Ida-250-30.6结合物对COLO 205的毒性比对抗体非反应性的E3细胞系的大4倍。用CEM细胞系和Ida-抗-Ly-2.1作为非反应性对照得到类似结果（数据未给出）。为了进一步确证Ida-MoAb结合物对靶细胞的细胞毒性是特异性的。并是发生在抗体结合位点上，我们进行了利用游离的MoAb抑制结合物细胞毒性的研究。当Ida浓度为4.0×10-6M（2μg抗-Ly-2.1）时，抗-Ly-2.1结合物对E3细胞的细胞毒性在加入50μg（250μg/ml）抗-Ly-2.1时降低70%（图6），由此表明Ida-抗-Ly-2.1结合物的细胞毒性与其抗体结合能力直接相关。用250-30.6得到类似的对照结果。应当注意，在所有检测中，游离的抗-Ly-2.1，抗-TFR和250-30.6没有细胞毒性（数据未给出）
鼠胸腺瘤ITT（1）75    NS    E3的离体处理
为了评价对固体肿瘤的生长抑制作用，在腹部皮下接种2.0×10-6E3细胞的CBF1小鼠组（每组10只）静脉注射下列物质之一：（ⅰ）PBS;（ⅱ）抗-Ly-2.1;（ⅲ）Ida;（ⅳ）Ida-抗-TFR;或（ⅴ）Ida-抗-Ly-2.1。在肿瘤接种后第4和第5天（肿瘤大小＝0.1cm2）分别使小鼠接受20μg Ida和/或1200μg抗-Ly-2.1。
在第一次处理的24小时之内，Ida-抗-Ly-2.1处理的小鼠的肿瘤平均大小为PBS处理小鼠的20%（即肿瘤质量减少80%，图7）;很明显，单独的抗-Ly-2.1和与非特异性抗-TFR MoAb共价连结的Ida对E3肿瘤生长没有影响。单独接受Ida的小鼠肿瘤减小达50%;但这些小鼠中有3只死亡，而其他的则体重降低25%。接受Ida-抗-Ly-2.1的小鼠的单个肿瘤的生长曲线表明，在处理过程中10个肿瘤有9个消退（图8）;而10个肿瘤中有5个完全消退并不再出现（大于200天），那些在处理完成后还继续生长的肿瘤（10个中有5个），其生长速率比PBS和Ida-抗-TFR处理的小鼠的肿瘤要慢。进行进一步实验以评价，用Ida-抗-Ly-2.1对大肿瘤的静脉处理。CBF小鼠组（每组10只）接种3.0×106E3细胞，肿瘤接种后第6天（肿瘤大小＝0.2cm2）和第7天，使小鼠分别接受15μg和900μg的Ida和抗-Ly-2.1（图9）。在第7天，Ida-抗-Ly-2.1处理小鼠的肿瘤平均大小为PBS处理小鼠的50%，为Ida处理的小鼠的66%，此趋势一直持续到实验的终点（第18天）。10只接受Ida-抗-Ly-2.1的CBF1小鼠的单个肿瘤的生长曲线表明，有4个消退以及1个肿瘤体完全消除（大于200天;数据未给出）。因此，Ida-抗-Ly-2.1针对大肿瘤有效，而且在两个实验中，当与抗Ly-2.1 MoAb偶联时，Ida的抗肿瘤活性有显著提高。
人结肠肿瘤COLO    205的体内处理
在携有COLO    205异源移植物的裸鼠（nu/nu）中，评价Ida-抗-250-30.6结合物的效应。
2×106细胞皮下注射入腹壁中在4天内产生可触知的肿块（大约0.1cm2）。然后，每组10只小鼠静脉注射下列物质之一：（ⅰ）PBS;（ⅱ）250-30.6;（ⅲ）Ida加250-30.6（未结合的）;（ⅳ）Ida;（ⅴ）Ida-250-30.6结合物。在肿瘤接种后的第4、5、6、10天和12天，通过连续5次静脉注射施用总量为275μg的Ida。
在用PBS或未结合的250-30.6处理的小鼠组中没有明显的治疗效应。单独使用Ida，10只小鼠中有2只存活，而接受未结合的Ida加250-30.6的组中所有小鼠在第7天死去，在这之前表现出毒性病状（例如体重下降）。接受Ida-250-30.6结合物的小鼠的肿瘤大小呈现显著减小。这些结果示于图11中。与此相反，单个小鼠的肿瘤生长曲线（图12）表明，10只小鼠中有5只其肿瘤在第7天消退;然后这些肿瘤继续生长，10只小鼠只留下2只没有肿瘤。这些小鼠由于毒性而没表现出效果。
肿瘤内处理
肿瘤内治疗已表明对于动物和人类肿瘤的免疫治疗来说是一种有用的技术。因此进行了研究以确定Ida-抗-Ly-2.1结合物直接施用在E3固体肿瘤中后的抗肿瘤活性。每组10只CBF1小鼠皮下移植3.0×106E3细胞，肿瘤接种5天后发育出肿瘤（0.1-0.2cm2）。肿瘤移植后第4天和6天以2次注射进行处理，小鼠接受下述物质之一：（1）PBS;（2）Ida;（3）抗-Ly-2.1;或（4）Ida-抗-Ly-2.1（总Ida＝30μg）。Ida-抗-Ly-2.1表现最大的抗肿瘤活性，直接在肿瘤中单独施用游离的Ida和抗Ly-2.1不影响肿瘤生长。Ida-抗-Ly-2.1不影响肿瘤生长。Ida-抗-Ly-2.1处理的小鼠的平均肿瘤大小，在第8天为PBS处理小鼠的60%，在第13天为PBS处理小鼠的30%（图10）。Ida-抗-Ly-2.1处理的小鼠的单个肿瘤的生长曲线（数据未给出）表明，处理结束3天后有1个完全消退，剩余小鼠的肿瘤生长表现出迟滞性下降。
毒性
10只CBA（Ly2.1+）小鼠的急性毒性实验组注射一次不同剂量的Ida，Ida-抗-Ly-2.1或Ida-抗-TFR。所有注射Ida的小鼠首先是重量减少达初始重量的25%;然而在任一种Ida-MoAb结合物处理的小鼠中都未观察到重量降低。表2给出了Ida和Ida-MoAb结合物的毒性，以LD50和LD10的数值表明。如表中所示，IDA-抗-Ly-2.1的LD10为10.0mg/kg Ida，而对于游离Ida只有0.75mg/kg。另外，Ida-抗-TFR结合的物的LD10为8.0mg/kg。Ida-MoAb结合物没有测试其LD50的剂量。这些结果表明，Ida-MoAb结合物比游离的Ida具有更高的治疗指数。
表2    Idarubicin-单克隆抗体结合物对CBA小鼠的效应
Ida（mg/kg）
L.D.10L.D.50
Ida    0.75    3.00
Ida-抗-Ly-2.1    10.00    未测
Ida-抗-TFR    15.00    未测
组织病理学结果
急性效应：静脉施用游离Ida（1.0mg/kg）15天后在脾脏中导致白髓萎缩及某种程度的心肌纤维肥大（数据未给出）。与此相反，一次剂量的Ida-抗-Ly-2.1（2.4mg/kg）在15和30天后并不导致任何非特异性的组织毒性，只是在15天时观察到肝细胞有某些肿大。
实例2
材料和方法
小鼠
（DBA/2×BALB/C）F和CBA小鼠由Department    of    Pathology，University    of    Melbourne产生。每次实验中所用的实验组为10-20性别和年龄都相同的小鼠。
肿瘤细胞
本研究中所检查的细胞系包括（Ly-2+）鼠胸腺瘤ITT（1）775 NS E3变异株（E3），（L3T4+）淋巴瘤EL4（Horowitz et al，Science 1968 160：533-535），人结肠癌Colo 205（Semple et al，Cancer Res.1978 38：1345-1355）和（Ly-2-，L3T4-）人T细胞白血病CEM（Foley et al，Cancer 1965 18：522-529）。细胞如实例1所述离体保存。P388D1巨噬细胞系通过在（DBA/2×BALB/c）F1小鼠中连续传代而活体保存。用磷酸盐缓冲的盐水（PBS，pH7.3）洗涤和离心（400g×5分）来自腹水的细胞两次，再悬浮于PBS中，皮下注射入小鼠腹壁中，使其在那儿发育成可触知的肿瘤移植物。对小鼠进行一系列静脉注射，每次用测径尺测量肿瘤的大小，沿着肿瘤的垂直轴测量。以肿瘤的平均大小记录数据（两个直径的积±标准误差）。
单克隆抗体
针对鼠细胞表面抗原L3T4，Ly-2和Thy-1的单克隆抗体为横式系统使用，它们特异于不同的淋巴细胞亚群。
所用的MoAb是：（ⅰ）与鼠Ly-2.1具有特异性反应的抗-Ly-2.1（鼠IgG2a）（Horgarth    et    al，Immunology    1982    46：135-144），（ⅱ）与鼠L3T4具有特异性反应的H129.19（抗-L3T4）（大鼠IgG2b）（Pierres    et    al，J.Im-munology1984    132：2775-2782），以及（ⅲ）与鼠T细胞反应的抗-Thy-1（大鼠IgG2b）（Marshak-Rothstein    et    al，J.Immunology    1979    122：2491-2497）。如实例1所述分离、纯化和贮存抗体。如实例1所述，用羊抗小鼠免疫球蛋白（SAMG）通过莲座状技术检测确定抗体活性。
Idarubicin-单克隆抗体结合物的制备
使MoAb（1-2mg/ml）与溶于N，N-二甲基甲酰胺中的（10mg/ml）5-20摩尔过量14-溴-4-脱甲氧基的daunorubicin（Br-Ida）在pH8.0（0.05M硼酸盐缓冲液）中于室温下混合4小时。如实例1所述进行反应和纯化，并测定所得结合物中的Ida的掺入量。
药物活性
如实例1所述进行两种检测（24小时和30分钟）以评价药物活性，所用细胞浓度为1-5×106/ml。
血清学
在这些实验中全部使用莲座状技术以测定抗体滴定度以及L3T4+和Ly-2+细胞的数目。此方法涉及结合的SAMG，它也检测与绵羊红细胞偶联的大鼠免疫球蛋白（Ig），以检测淋巴细胞表面上的抗体。Ig+脾细胞的表面Ig通过SAMG覆盖而除去（25ul及107/ul的2ml细胞）;细胞然后置于冰上的培养基中，其中含有0.01%叠氮化钠以阻止免疫球蛋白的再合成。
结果
本研究以不同的阶段进行：
（a）三种不同的Ida-MoAb结合物的离体特性，以及
（b）随后证实其用途：在肿瘤细胞异源移植的排斥之前或之中活跃地除去T细胞亚群。
结合物的制备及其特性
Br-Ida与针对鼠L3T4、Ly-2和Thy-1抗原的MoAb共价偶联。通过改变加入MoAb中的Br-Ida摩尔过量数而确立了结合的反应条件，并使较高的Ida掺入和较低的蛋白回收之间达成妥协。Ida-抗-L3T4（图13）、Ida-抗-Ly-2.1和Ida-抗-Thy-1（数据未出示）掺入3-6个Ida分子，其蛋白回收率大于50%。
抗体活性
通过莲座状技术测定抗体在结合前和结合后的滴定度，测定50%E3靶细胞形成莲座状时的抗体稀释度。含有1.4和7个Ida分子的Ida-抗-Thy-1结合物的抗体滴定度分别为1∶425，000，1∶170，000和1∶130，000，而未修饰抗体的滴定度为1∶550，000（图14）。因此，部分抗体活性由于与Ida的结合而丧失;然而，用少于4个分子的Ida-MoAb结合物进行离体和活体研究。同样，如果Ida-MoAb中掺入6个以上的分子，则Ida-抗-Ly-2.1和Ida-抗-L3T4两种结合物的抗体活性显著下降（数据未出示）
离体药物活性
利用24小时检测在不同反应性的靶细胞上测试Ida-MoAb结合物的细胞毒性，并与游离Ida的作比较。游离Ida的活性比Ida-MoAb结合物的大4倍，游离Ida针对所测试的肿瘤细胞系的I.D.50（对照[3H]-胸苷掺入的50%抑制）为6.6-9.0×10-8M。当针对ITT（I）75 NS E3细胞系（它是富含Ly-2抗原的天然细胞系的变异株）测试时，Ida-抗-Ly-2.1结合物显然是细胞毒性最强的结合物（I.D.50＝4.3×10-7M）。为了检查结合物对靶细胞作用的选择性，使Ida-MoAb结合物与靶细胞保温3分钟，然后洗掉未结合的结合物并测量细胞毒性。利用这种30分钟检测法，非反应性的Ida-MoAb结合物的I.D.50比游离Ida的大10-50倍，表明抗体结合对于Ida-MoAb结合物的细胞毒性是很重要的。应当注意，在离体和没有补体的情况下，实验中所用的MoAb没有一个具有对靶细胞的细胞毒作用。结果概括于表3中。
表3 Idarubicin-单克隆抗体对肿瘤细胞的效应（ID50平均值）1
ID50的平均值（Ida（M））
肿瘤细胞系    检测法    Ida    Ida-抗-    Ida-抗-    Ida-抗-
Ly-2.1    L3T4    Thy-1
E3 24小时27.8×10-84.3×10-7未测 9.0×10-7
30分钟31.8×10-74.3×10-7未测 1.2×10-6
EL4 24小时 6.6×10-8未测 6.0×10-7未测
30分钟 1.6×10-7未测 6.2×10-7未测
CEM 24小时 9.0×10-8未测 未测 未测
30分钟 2.2×10-76.0×10-6未测 未测
Colo205 24小时 8.0×10-8未测 未测 未测
30分钟 1.2×10-7未测 4.0×10-65.8×10-6
1I.D.50＝对照[3H]-胸苷掺入的50%抑制
2＝利用24小时细胞毒性检测
3＝利用30分钟检测
Idarubicin-单克隆抗体结合物的活体效应
通过测定结合物从脾脏中选择性除去L3T4+或Ly-2+细胞的能力，比较Ida-MoAb结合物和单独MoAb的活体免疫抑制效应。在0、2、5和10天，对CBA小鼠4次静脉注射抗-Ly-2.1或抗-L3T4结合物（30μgIda/1.5mg MoAb），通过莲花状技术监测脾脏中Ly-2+或L3T4+细胞数目。对于每一个处理，每天检查两只处理小鼠的脾细胞，使结果平均（图15）。从正常小鼠的的0天至Ida-抗-L3T4处理小鼠的第20天，L3T4+细胞数目迅速下降，从总的脾细胞的大约30%降至大约4%。这些L3T4+细胞的去除一直维持到60天以上，然后观察到缓慢的上升。单独用抗-L3T4的活体处理进行去除，也导致L3T4+细胞数目的急速下降（30%至5%）。
Ida-抗-Ly-2.1结合物在第10天将脾脏中的Ly-2+细胞数由25%降至5%;但Ly-2+细胞数在第15天开始上升，40天-50天时回复至正常水平。有趣的是单独的抗-Ly-2.1 MoAb不能显著除去Ly-2+细胞;未处理的对照小鼠中Ly-2+和L3T4+细胞数的波动可能是由于小鼠间的天然波动。因此很显然，Ida-抗-L3T4和Ida-抗-Ly-2.1与单独的MoAb相比，能够更有效地从处理小鼠脾脏中分别去除L3T4+或Ly-2+细胞。Ida-抗-Ly-2.1结合物的效应是很重要的，因为单独使用抗-Ly-2.1 MoAb完全没有效应，但如果与Ida偶联则能将它转化成强力的免疫抑制剂。因此，由药物-MoAb结合物维持的去除作用。适于用来检查活体Ly-2+和L3T4+细胞在移植排斥反应中的作用。
Ida-抗-L3T4、Ida-抗-Ly-2.1和Ida-抗-Thy-1对于肿瘤移植存活率的效应
在这些实验中，用Ida-抗-L3T4、Ida-抗-Ly-2.1和Ida-抗-Thy-1结合物提高CBA小鼠中P388D1肿瘤移植的存活时间，异源移植为越过H-2（第Ⅰ和第Ⅱ类）和非H-2障碍。
（a）混合的结合物处理
每组10-15只CBA小鼠皮下注射8.0×106P388D1肿瘤细胞，并在-1、0（＝肿瘤接种的那一天）、3.5和10天静脉注射下述物质之一：（ⅰ）PBS，（ⅱ）抗-L3T4和抗-Ly-2.1，（ⅲ）Ida-抗-L3T4，（ⅳ）Ida-抗-Ly-2.1和（ⅴ）Ida-抗-L3T4和Ida-抗-Ly-2.1。所接受的Ida和MoAb的总量分别为125μg和5.75mg。PBS和MoAb处理小鼠的肿瘤移植都存活了14-17天，最大的肿瘤大小平均值为0.31cm2，这表明两种未结合的MoAb加在一起也不能有效地除去L3T4+和Ly-2+细胞，使得肿瘤移植物能够存活（图16）。此外，单独使用Ida-抗-Ly-2.1或Ida-抗-L3T4只能延长移植物的存活时间（20-28天），最大的肿瘤大小平均值为0.40cm2至0.50cm2。单独的Ida-抗-Ly-2.1或Ida-抗-L3T4可能都不能除去所有的T细胞，而强烈的抗原攻击（正如从完整的MHC差别所见）能够刺激残留的Ly-2+和L3T4+细胞增殖并激发排斥反应。与此相反，Ida-抗-Ly-2.1和Ida-抗-L3T4两种结合物的混合能够使14/15的P388D1肿瘤移植物避免排斥，在杀死小鼠之前其大小一直上升（第50天-2.00cm2）。这些结合物处理的P388D1肿瘤中发现有少数几个在第8至16天表现出大小有某些消退;然而，持续除去L3T4+和Ly-2+细胞（第10天）能使P388D1肿瘤移植物建立相容的肿瘤生长。
（b）Ida-抗-Thy-1结合物
每组10只CBA小鼠皮下注射107P388D1肿瘤细胞，并在-1、0、5和6天静脉注射下述物质之一：（ⅰ）PBS，（ⅱ）抗-Thy-1和（ⅲ）Ida-抗-Thy-1。Ida和抗-Thy-1的接受总量分别为130μg和5.4mg，PBS处理小鼠的肿瘤移植物存活28-32天，最大的肿瘤大小平均值为0.58cm（第6天）（图17）。用Ida-抗-Thy-1处理的小鼠，30%肿瘤移植物在第40天时被完全排斥，而剩下的70%持续生长，最终（第32天）使实验组的肿瘤大小平均值上升。因此，Ida-抗-Thy-1与混合的Ida-抗-Ly-2.1和Ida-抗-L3T4一样，能够除去Ly-2+和L3T4+细胞，从而使CBA小鼠中大部分P388D1肿瘤移植物在缺乏正常和迅速的排斥反应下存活。
实例3
根据实例1所述的程序，在Ida和单克隆抗体17.1之间（Thompson et al，Proc.Natl.Cancer Inst.70，409-419，1983，Murine IGG2A）以及在Ida和单克隆抗体30.6之间（Thompson et al，Br.J.Cancer 47，595-605，1983，Murine IGG2B）制备结合物。如实例2所述，使人结肠癌Colo 205细胞（30.6+，17.1+）以8×106细胞/小鼠皮下接种于裸鼠中。然后使接种小鼠经受一系列肠胃外处理。用测径尺测量肿瘤大小，沿着肿瘤的纵轴测量。以肿瘤大小的平均值记录数据（两个直径的积±标准误差）。结果示于图18中。
实例4
根据实例1所述的程序，在Ida和单克隆抗体17.1之间、在Ida和单克隆抗体JGT-13之间（小鼠IGG1与结肠肿瘤上的癌胚抗原起反应，但不与正常组织起反应）、在Ida和单克隆抗体27.1之间（小鼠IGG1与许多结肠肿瘤上的人乳脂肪小体抗原起反应）以及在Ida和单克隆抗体30.6之间制备结合物。将LIM2210人结肠肿瘤异源移植物（1-5mg）进行皮下移植到裸鼠中。然后使移植小鼠经受一系列静脉处理。用测径尺测量肿瘤大小，沿着肿瘤的纵轴测量。以肿瘤的平均大小记录数据（两个直径的积±标准误差）。结果示于图19中。

Claims (10)

1、一种制备免疫球蛋白结合物的方法，其特征在于该方法包括使idarubicin(lda)与单克隆抗体或其片段结合，所述片段至少含有抗体中的一个抗原结合位点。
2、根据权利要求1的方法，其中的单克隆抗体或其片段特异于所期望的靶组织。
3、根据权利要求2的方法，其中的靶组织是人类肿瘤。
4、根据权利要求1的方法，其中的单克隆抗体或其片段特异于一种T淋巴细胞表面抗原。
5、根据权利要求1的方法，其中的单克隆抗体或其片段特异于人类的铁传递蛋白受体。
6、根据前述权利要求中任一项的方法，其中使14-卤代-Ida与单克隆抗体或其片段反应。
7、根据权利要求6的方法，其中的14-卤代-Ida是14-溴-Ida。
8、根据权利要求6或7的方法，包括：
（a）使单克隆抗体或其片段与摩尔过量的14-卤代-Ida混合，
（b）使混合物于18-37℃下反应;
（c）去掉所有的沉淀，
（d）通过凝胶过滤去掉未反应的起始物质，以及
（e）通过吸附层析或离子交换层析去掉游离的Ida。
9、根据权利要求1至5中任何一项的方法，其中先使一种载体或连接物结合在Ida的C-14碳原子上，然后再与单克隆抗体或其片段连接。
10、一种从细胞群落中特异地除去T淋巴细胞亚群的方法，其特征在于该方法包括使细胞与一种免疫球蛋白结合物离体保温，所述结合物由权利要求1的方法产生，其中的单克隆抗体或其片段特异于待除去的淋巴细胞上存在的细胞表面抗原。
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