CN1946742A

CN1946742A - 通过还原氨基化制备的羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物

Info

Publication number: CN1946742A
Application number: CNA200580012503XA
Authority: CN
Inventors: 诺贝特·灿德尔; 沃尔弗拉姆·艾希纳; 哈拉尔德·康拉特; 弗兰克·哈克特; 克劳斯·朗格尔; 米歇莱·奥尔兰多; 罗纳德·弗兰克
Original assignee: FREZENEWSKABUE GERMANY Co Ltd
Current assignee: FREZENEWSKABUE GERMANY Co Ltd
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2005-03-11
Publication date: 2007-04-11
Also published as: KR20070012400A; NO20064631L; SG151261A1; KR101186821B1; TWI417303B; EP2336192A1; AR048035A1; WO2005092928A1; ZA200607251B; AU2005225513B2; CA2558738C; JP2007527892A; DE202005021885U1; CA2558738A1; BRPI0508607A; EA010501B1; CN101659704A; AU2005225513A1; JP5191729B2; US20070134197A1

Abstract

本发明涉及羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉和蛋白质的偶联物，这些偶联物是羟烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物的至少一个醛基或酮基或半缩醛基与蛋白质的至少一个氨基通过还原氨基化反应形成的，这样羟烷基淀粉或其衍生物与蛋白质通过偶氮甲碱键或氨基键共价连接。本发明也涉及制备这些偶联物的方法和这些偶联物的特殊应用。

Description

通过还原氨基化制备的羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物

技术领域

本发明涉及羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，和蛋白质的偶联物，其中这些偶联物是羟烷基淀粉或羟烷基淀粉衍生物的至少一个醛基与蛋白质的至少一个氨基通过还原氨基化反应形成的，以使得该羟烷基淀粉或其衍生物通过偶氮甲碱键或氨基亚甲基键与蛋白质共价连接。本发明也涉及制备这些偶联物的方法和该偶联物的具体应用。

背景技术

根据广泛接受的观点，当蛋白质偶联到聚合物分子上时，可以改善蛋白质的稳定性，并降低对这些蛋白质的免疫应答。WO94/28024披露了一种用聚乙二醇(PEG)修饰的生理活性蛋白，其显示降低的免疫原性，而且在血流中的循环比非偶联蛋白长得多，即，具有较长的血浆半衰期。

WO03/074087涉及一种把蛋白质偶联到来源于淀粉的修饰多糖的方法。蛋白质与多糖(羟烷基淀粉)之间的结合作用是共价键，该共价键是在羟烷基淀粉分子的末端醛基或该末端醛基经化学修饰后所得的官能团与蛋白质的官能团之间形成的。其公开了氨基、硫基和羧基作为蛋白质反应基团。此外，虽然其中列出了不同键的多种可能性，包括不同官能团、理论上适合的不同连接分子和不同的化学方法，但是其工作实施例只描述了两种选择：第一，使用氧化的羟乙基淀粉，采用乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)活化作用直接与蛋白质偶联，或者采用未氧化的羟乙基淀粉，直接(即不需要连接化合物)与蛋白质偶联形成希夫碱，随后还原成各自的胺。因此，WO 03/074087的工作实施例并未公开包含羟乙基淀粉、蛋白质和一种或多种连接分子的单一偶联物。此外，尽管其涉及了通过还原氨基化作用形成偶联物，但是WO03/074087并不包含任何关于进行该还原氨基化作用的蛋白质的优选氨基的信息。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，和蛋白质的新的偶联物，其中当施用于需要的患者时，该偶联物具有有益的治疗效果。

本发明进一步的目的是提供羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，和蛋白质的新的偶联物，其中该偶联物是寡肽或多肽的氨基与羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉的醛基或酮基或半缩醛基或与其醛基官能化的衍生物通过还原氨基化反应形成的。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述新偶联物的方法，其中所述方法是在特殊的和选择的反应条件下进行的。

因此，本发明涉及一种制备包含蛋白质和聚合物或聚合物衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物是羟烷基淀粉，所述方法包括将聚合物或聚合物衍生物的至少一个醛基或酮基或半缩醛基与蛋白质的至少一个氨基通过还原氨基化作用共价连接，所述方法进一步包含通过开环氧化反应在聚合物中引入至少两个醛基，并且所述聚合物的至少一个醛基与蛋白质的氨基反应，或者该聚合物与至少双官能化合物反应，所述双官能化合物包括两个官能团M和Q，一个官能团M与聚合物反应，一个官能团Q被化学修饰，产生醛基或酮基或半缩醛基官能化的聚合物衍生物，所述的官能化衍生物通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。

因此，本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或聚合物衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉，可以通过制备偶联物的方法获得该偶联物，所述方法包括将聚合物或聚合物衍生物的至少一个醛基或酮基或半缩醛基与蛋白质的至少一个氨基通过还原氨基化作用共价连接，所述方法进一步包含通过开环氧化反应在聚合物中引入至少两个醛基并且所述聚合物的至少一个醛基与蛋白质的氨基反应，或者该聚合物与至少双官能化合物反应，所述化合物包括两个官能团M和Q，一个官能团M与聚合物反应，一个官能团Q被化学修饰，产生醛基或酮基或半缩醛基官能化的聚合物衍生物，所述的官能化衍生物通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。

在本发明的上下文中，术语“蛋白质”涉及任意的氨基酸序列，其具有至少2个，优选至少5个，更优选至少10个，更优选至少15个，更优选至少20个，更优选至少25个，更优选至少30个，更优选至少35个，更优选至少40个，更优选至少45个，更优选至少50个，及更优选至少100个氨基酸。

该蛋白质可以通过化学合成方法来制备，或者可以来源于任意的人或其它哺乳动物，并可以通过从天然来源中纯化而获得。

根据本发明，该蛋白质可以是生长因子、细胞因子、活化剂、抑制剂、酶、抗体、抗原、转运蛋白、生物粘着蛋白、激素、受体、抑制因子、或其功能性衍生物或片段。在本发明的上下文中，术语“功能性衍生物或片段”涉及能够全部或部分地维持原始分子的所需生物学性质或活性的衍生物或片段，例如，能够维持原始分子至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，特别优选至少90％的所需的生物学性质或活性。所述片段特别优选的例子是，例如抗体片段。

蛋白质的例子是红细胞生成素(EPO)例如重组人EPO(rhEPO)、集落刺激因子(CSF)例如G-CSF样重组人G-CSF(rhG-CSF)、α-干扰素(IFNα)、β-干扰素(IFNβ)或γ-干扰素(IFNγ)例如IFNα和IFNβ样重组人IFNα或IFNβ(rhIFNα或rhIFNβ)、白细胞介素例如IL-1到IL-18，例如IL-2或IL-3样重组人IL-2或IL-3(rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白例如凝结因子II-XIII样因子VII，VIII，IX、α1-抗胰蛋白酶(A1AT)、活化的蛋白C(APC)、纤溶酶原活化因子例如组织型纤溶酶原活化因子(tPA)，例如人组织纤溶酶原活化因子(hTPA)、AT III例如重组人AT III(rhAT III)、肌红蛋白、白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、生长因子例如表皮生长因子(EGF)，血小板生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，脑源性生长因子(BDGF)，神经生长因子(NGF)，B-细胞生长因子(BCGF)，脑源性神经营养生长因子(BDNF)，睫状神经营养因子(CNTF)、转化生长因子例如TGFα或TGFβ、BMP(骨形成蛋白)、生长激素例如人生长激素、肿瘤坏死因子例如TNFα或TNFβ、生长抑素、生长激素、生长介素、血红蛋白、激素或激素原例如胰岛素、促性腺素、促黑激素(α-MSH)、曲普瑞林、下丘脑激素例如抗利尿激素(ADH)和催产素及释放激素和释放抑制激素、甲状旁腺激素、甲状腺激素例如甲状腺素、促甲状腺素、促甲状腺激素释放素、促乳素、降钙素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1，GLP-2等)、毒蜥外泌肽(exendine)例如毒蜥外泌肽-4、来普汀、加压素、胃泌素、胰泌素、整联蛋白、糖蛋白激素(例如LH，FSH等)、melanoside-刺激激素、脂蛋白和载脂蛋白例如载脂蛋白-B、载脂蛋白-E、载脂蛋白-La、免疫球蛋白例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段、水蛭素、组织路径抑制剂、植物蛋白例如凝集素或蓖麻毒素、蜂毒、蛇毒、免疫毒素、E抗原、α-蛋白酶抑制剂、豕草变应原、黑色素、寡聚赖氨酸蛋白、RGD蛋白或任选这些蛋白的其中一个的相应受体；或者任意这些蛋白或受体的功能性衍生物或片段。

优选的酶是例如糖类特异性酶、蛋白水解酶、氧化酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、激酶和连接酶。特别的非限制性的例子是门冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺酶、谷氨酰胺酶-天冬酰胺酶、苯丙氨酸酶、色氨酸酶、酪氨酸酶、超氧化物歧化酶(SOD)、内毒素酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、嘌呤核苷磷酸化酶、胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶、glucodase、葡糖酸氧化酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖醛酸酶、透明质酸酶、凝血激酶、链激酶、尿激酶、MAP-激酶、DNA酶、RNA酶、乳铁蛋白及其功能性衍生物或片段。

根据本发明的优选实施方案，该蛋白质选自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、AT III、IL-2、IL-3、肌红蛋白、SOD、A1AT、和BSA。

根据本发明特别优选的实施方案，该蛋白质选自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhAT III、rhIL-2、rhIL-3、肌红蛋白、SOD、A1AT、和BSA。

红细胞生成素(EPO)是一种红系祖细胞成熟为红细胞所必需的糖蛋白激素。在成年人中，它在肾中生成。EPO是调节循环中的红细胞水平所必需的。低水平组织氧的条件可以刺激EPO的生物合成增加，接着EPO会刺激红细胞生成。如在慢性肾功能衰竭中所观察到的那样，肾功能的缺失，例如，一般导致EPO生物合成减少伴有红细胞减少。红细胞生成素是一种约34,000Da的酸性糖蛋白激素。人红细胞生成素是一种作为单体自然存在的166个氨基酸的多肽(Lin等，1985，PNAS82，7580-7584，EP 148 605 B2，EP 411 678 B2)。在例如U.S.4,703,008中描述了编码红细胞生成素的基因的鉴别、克隆和表达。在例如U.S.4,667,016中描述了从细胞培养基中纯化重组红细胞生成素，该细胞培养基支持包含重组红细胞生成素质粒的哺乳动物细胞的生长。在本技术领域一般确信，EPO在体内的生物活性主要取决于EPO结合唾液酸的程度(参见，例如EP 428 267B1)。理论上，14个唾液酸分子可以结合到1分子EPO的糖侧链的末端，该糖侧链连接到N-和O-糖基化位点。要获得高唾液酸化的EPO制品，必须经过高度复杂的纯化步骤。红细胞生成素的进一步详细信息可参见Krantz，Erythropoietin(红细胞生成素)，1991，Blood，77(3)：419-34(综述)和Cerami，Beyond erythropoiesis：novelapplications for recombinant human erythropoietin(红细胞生成：重组人红细胞生成素的新应用)，2001，Semin Hematol.，(3 Suppl 7)：33-9(综述)。

G-CSF是一种21kDa的糖蛋白，其通过两个链内二硫键和包含一个O-连接糖部分来稳定化。成熟的G-CSF有174个氨基酸。在动物体内，G-CSF是由骨髓基质细胞、巨噬细胞和成纤维细胞合成的。它的主要功能是作为中性粒细胞和其前体细胞的生长和分化因子。但是本领域也已知，G-CSF能够活化成熟的中性粒细胞。此外，它还能刺激各种其他的造血祖细胞的生长/分化(与其它的造血生长因子产生协同作用)，并促进内皮细胞的增殖和迁移。在临床上，G-CSF被用于治疗中性粒细胞水平不足(例如由再生障碍性贫血、脊髓发育不良、AIDS、或化学疗法所导致)。

G-CSF可以用化学合成的方法制备，或者可以是任意地来源于人(参见例如，Burgess，A.W.等.1977，Stimulation by human placentalconditioned medium of hemopoietic colony formation by human marrowcells(人胎盘条件培养基刺激人骨髓细胞造血集落形成)，Blood 49(1977)，573-583；Shah，R.G.等1977，Characterization ofcolony-stimulating activity produced by human monocytes andphytohemagglutinin-stimulated lymphocytes(人单核细胞和植物凝集素刺激的淋巴细胞产生的集落刺激活性的表征)，Blood 50(1977)，811)或其它哺乳动物，或者可以是从自然来源例如人胎盘、人血或人尿中纯化。另外，许多的上皮癌、急性髓细胞样白血病和各种肿瘤细胞系(膀胱癌、成神经管细胞瘤)都能表达该因子。

此外，表达性G-CSF也包括G-CSF变体，其中一个或多个氨基酸(例如，1到25个，优选1到10个，更优选1到5个，最优选1或2个)被其他的氨基酸置换，而且显示G-CSF活性(参见，例如Riedhaar-Olson，J.F.等1996，Identification of residues critical to the activityof human granulocyte colony-stimulating factor(人粒细胞集落刺激因子活性关键残基的鉴定)，Biochemistry 35：9034-9041 1996；U.S.5,581,476；5,214,132；5,362,853；4,904,584)。在本领域也描述了G-CSF的活性测定(G-CSF的体外活性测定参见例如Shirafuji，N.等1989，A new bioassayfor human granulocyte colony-stimulating factor(hG-CSF)using murinemyeloblastic NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera fromnormal healthy persons and patients with infectious and hematologicaldisorders(用鼠成髓NFS-60细胞作为靶标的一种新的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)生物测定法，以及检测其在正常健康者和传染病和血液病患者血清中的水平)，Exp.Hematol.1989，17，116-119；G-CSF的体内活性测定参见例如Tanalca，H.等.1991，Pharmacokinetics of recombinanthuman granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethyleneglycol in rats(与聚乙二醇偶联的重组人粒细胞集落刺激因子在大鼠中的药代动力学)，Cancer Research，51，3710-3714，1991)。公开了G-CSF活性测定试验的其他出版物包括，U.S.6,555,660；Nohynek，G.J.等.1997，Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylatedrecombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenicand nonneutropenic CD rats(糖基化和非糖基化重组人粒细胞集落刺激因子在中性白细胞减少和非中性白细胞减少CD大鼠中的效果的比较)，Cancer Chemother Pharmacol(1997)39；259-266。

优选地，该G-CSF是重组产生的。这包括通过基因组或cDNA克隆或通过DNA合成获得的外源性DNA序列的原核或真核宿主表达。适当的原核宿主包括各种细菌例如大肠杆菌。适当的真核宿主包括酵母例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞和猴细胞。

蛋白质的重组产生方法是本领域已知的。一般地，包括用适当的表达载体转染宿主细胞、在能产生蛋白质的条件下培养宿主细胞和从宿主细胞中纯化蛋白质。详细的信息参见例如Souza，L.M.等.1986，Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor：effects onnormal and leukemic myeloid cells(重组人粒细胞集落刺激因子：对正常和白血病骨髓细胞的影响)，Science 1986232：61-65，1986；Nagata，S.等.1986，Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocytecolony-stimulating factor(人粒细胞集落刺激因子cDNA的分子克隆和表达)，Nature 319：415-418，1986；Komatsu，Y.等.1987，Cloning ofgranulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages andits expression in Escherichia coli(来自人巨噬细胞的粒细胞集落刺激因子cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达)，Jpn J Cancer Res.1987 78(11)：1179-1181。

在一个优选的实施方案中，该G-CSF具有人成熟G-CSF的氨基酸序列(参见例如，Nagata，S.等.1986，Molecular cloning and expression ofcDNA for human granulocyte colony-stimulating factor(人粒细胞集落刺激因子cDNA的分子克隆和表达)，Nature 319：415-418，1986)，可以在其氨基末端进一步包含甲硫氨酸，形成175个氨基酸的蛋白质。此外，G-CSF可以包含丝氨酸或苏氨酸残基来代替甲硫氨酸。

用于本发明的方法和根据本发明的偶联物中的G-CSF可以包括在Thr133位经O-连接糖基化连接到G-CSF上的一个糖侧链，即该G-CSF被糖基化(V.Gervais等，Eur.J.Biochem.1997，247，386-395)。该糖侧链的结构可以是NeuNAc(α2-3)Gal(β1-3)[NeuNAc(α2-6)]GalNAc和(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc(NeuNAc＝N-乙酰神经氨酸，GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺)。

也有人建议，与天然多肽相比可以引入至少一个其他的糖链来修饰G-CSF和其他多肽(U.S.5,218,092)。根据所使用的宿主，该G-CSF表达产物可以是用哺乳动物或其他真核的糖类糖基化的。通常，当用真核细胞制备G-CSF时，该蛋白质在翻译后糖基化。因此，糖侧链可以在哺乳动物，特别是人、昆虫或酵母细胞的生物合成期间连接到G-CSF上。

重组人G-CSF(rhG-CSF)通常用于治疗不同形式的白细胞减少。这样，rhG-CSF的商业制剂也是可以利用的，其商品名为非格司亭(Gran和Neupogen)、来格司亭(Neutrogin和Granocyte)和那托司亭(Neu-up)。Gran和Neupogen是非糖基化的，在重组大肠杆菌细胞中产生。Neutrogin和Granocyte是糖基化的，在重组CHO细胞中产生，Neu-up是非糖基化的，在重组大肠杆菌细胞中产生的完整rhG-CSF的N末端含有5个取代的氨基酸。

干扰素是介导对病毒感染和其他生物诱导物应答的抗病毒、抗增殖和免疫调节活性的细胞因子。与IFNα不同，IFNβ是高度物种特异性的。IFNβ有两种亚型，IFNβ1a和IFNβ1b。当用工业化生产时，IFNβ1a和IFNβ1b的主要区别在于用来产生它们的各自的细胞系统不同。IFNβ1a是由哺乳动物细胞制备的，IFNβ1a被命名为1a是因为它的氨基酸序列与天然干扰素β的氨基酸序列相同。IFNβ1b是由细菌产生的。干扰素，像大多数其他的哺乳动物蛋白质一样，在翻译后通过糖基化作用而修饰。但是细菌缺乏使蛋白质糖基化的能力，因此IFNβ1b不包括在天然物质中发现的糖侧链。IFNβ1a具有166个氨基酸，分子量为约22,500D，IFNβ1b具有165个氨基酸，分子量为约18,500Da，这是因为由于采用细菌制备方法，IFNβ1b的N-末端没有甲硫氨酸和糖基化作用。在例如EP 0 218 825 A1中给出了人干扰素β的氨基酸序列。在下列文献中报道了干扰素β的晶体结构：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)pp 11813-11818，Biochemistry，Karpusas M，Nolte M，Benton CB，Meier W，Lipscomb WN，Goelz S。干扰素β的商业制品是Betaseron(IFN beta 1b)、Avonex和Rebif(IFNβ1a)。IFNβ1b制备方法包括细菌性发酵大肠杆菌菌株，该大肠杆菌携带包含人干扰素β_ser17基因的基因工程质粒。从人成纤维细胞中可以获得该天然基因，并且可以通过在17位用丝氨酸残基取代半胱氨酸残基的方法来改变该基因。通过重组DNA技术，使用引入了人干扰素β基因的遗传工程中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，产生IFNβ1a。IFNβ1a的氨基酸序列与来源于天然成纤维细胞的人干扰素β的氨基酸序列相同。天然干扰素β和干扰素β1a分别通过各自包含单个N-连接复合糖部分在Asn80处糖基化。根据说明，干扰素β药物可以用于治疗复发-缓解型多发性硬化。但是施用该干扰素β药物产品会带来很多严重的副作用。此外它们通过注射(肌内或皮下)给药，会导致另外的危险。为了减少副作用和易于(例如，低频率)给药，已经进行了大量的开发工作以改善IFNβ的性质。蛋白质的聚合物修饰是一项可以用于改善蛋白质性质的技术。主要使用的技术是用聚乙二醇修饰干扰素，称为PEG化。

单核细胞/巨噬细胞、类淋巴母细胞、成纤维细胞和许多不同细胞类型在由病毒、核酸、糖皮质激素和其他诱导物诱导后天然产生IFNα型。已知IFNα有至少23种不同的变体。各蛋白质的分子量在19-26kD之间，蛋白质包含的长度为156-166和172个氨基酸。所有的IFNα亚型在115-151氨基酸位都具有一个共同的保守序列区，而氨基末端则是可变的。许多IFNα亚型的序列仅有1或2个位置不同。在1/98位和29/138位的半胱氨酸之间形成了二硫键。29/138的二硫键对于生物活性是必需的，而1/98的键则可以还原而不影响生物活性。所有的IFNα型包含潜在的糖基化位点，但大多数亚型并未被糖基化。与IFNγ不同，IFNα蛋白在pH＝2时是稳定的。用遗传修饰的大肠杆菌进行IFNα的工业化生产。由于细菌缺少使蛋白质糖基化的能力，用于已批准的药物产品的IFNα的两种变体(IFNα2a和IFNα2b)都是未糖基化的。常规的IFNα主要缺点在于其副作用。干扰素α药物可以用于治疗丙型肝炎，为改善干扰素α药物已经做了大量的工作。蛋白质的聚合物修饰是一项可以用于改善蛋白质性质的技术。主要使用的技术是用聚乙二醇修饰干扰素，称为PEG化。两种商业可用的IFNα的PEG化变体是PEGIntron(SP)和Pegasys(Roche)。

抗凝血酶III(AT III)是一种抑制凝血酶和因子Xa的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Travis，Annu.Rev.Biochem.52：655，1983)。也可轻度抑制因子IXa、XIa、XIIa、tPA、尿激酶、胰蛋白酶、纤溶酶和激肽释放酶(Menache，Semin.Hematol.28：1，1991；Menache，Transfusion 32：580，1992；Lahiri，Arch.Biochem.Biophys.175：737，1976)。人AT III是在肝中合成的，其为一种分子量(MW)约58,000D的具有432个氨基酸的单链糖蛋白。它的血浆浓度在14-20mg/dL之间(Rosenberg，Rev.Hematol.2：351，1986；Murano，Thromb.Res.18：259，1980)。该蛋白质含有3个二硫键(Cys 8-128，Cys 21-95，Cys 247-430)和占总质量15％的4个N-连接糖链(Asn 96，-135，-155，-192)(Franzen，J.Biol.Chem.255：5090，1980；Peterson，The Physiological Inhibitions of Blood Coagulation and Fibrinolysis(凝血和纤维蛋白溶解的生理抑制)，Elsevier/North-Holland Biomedical Press1979，p 43)。抗凝血酶是一种serpin型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，在血液凝固的控制中是主要的重要因子。AT III是在人血浆中循环的最丰富的内源抗凝因子。该丝氨酸蛋白酶抑制剂参与调节生理和病理状态的凝固(Opal，Crit.Care Med.2002，30：325)。它以两种具有较低的凝血酶抑制容量的形式循环(Pike，J.Biol.Chem.272：19562，1997；Ersdal-Badju，Fed.Proc.44：404，1985)(85-95％是具有4个双触角、单和二唾液酸化寡糖链的α异构体，5-15％是高肝素亲和力的β异构体，其在Asn 135缺少糖基化，2-6末端唾液酸连接)。一小部分循环的AT III通常与在血管内皮细胞表面上的蛋白聚糖结合。这些蛋白聚糖主要是硫酸乙酰肝素，其分子结构与肝素类似，能够以与肝素相同的方式催化对凝血酶的抑制。与肝素的明确限定的戊糖单元结合的AT III会导致蛋白质的构象变化(Choay，Ann.NY Acad.Sci.370：644，1981；Choay，Biochem.Biophys.Res.Commun.116：492，1983；Olson，J.Biol.Chem.266：6353，1991；Bauer，Semin.Hematol.28：10，1991；Carell，Thromb.Haemost.78：516，1997)。该结合的催化作用使得AT III对凝血酶和因子Xa的抑制活性增加了1000倍(Rosenberg，Fed.Proc.44：404，1985；Bjork，Antithrombin and relatedinhibitors of coagulation proteinases(抗凝血酶和相关的凝血蛋白酶抑制剂)in Barett，Salvesen(eds.)：Proteinase Inhibitors，vol 17，Amsterdam，The Netherlands Elsevier Science Publishers(Biomedical Devision)1986p489；Olson，J.Biol.Chem.267：12528，1992)。部分AT III定位于通常产生内源性凝血级联的内皮表面，使得AT III能快速中和这些凝血酶，保护天然表面以免形成血栓。因此，AT III预防血栓形成的关键性质是它能与催化剂肝素相结合，经历改变其抑制性质的构象变化，并且不可逆地与凝血酶或因子Xa结合，并由此抑制它们的活性。AT III也具有显著的抗炎性质，其中一些抗炎性质是由它在凝血级联中的作用而产生的(Roemisch，Blood Coagul Fibrinolysis.2002，13：657)。活化的凝血蛋白酶，例如活化的因子X和凝血酶可以促成炎症的发生；例如，通过释放促炎介质。AT III对这些蛋白酶的抑制作用可以防止它们与细胞的特异性相互作用和后续的反应(Roemisch，Blood Coagul Fibrinolysis 2002，13：657)。非依赖于凝固的AT III的抗炎性质包括与细胞的直接相互作用，导致例如前列环素的释放。AT III与近来鉴别出的一个细胞受体多配体聚糖-4(syndecan-4)的结合导致了对例如脂多糖类介质诱导的细胞内信号的干扰，这样使得炎症应答下调(Roemisch，Blood Coagul Fibrinolysis2002，13：657)。除了分析游离AT III的结构，由于肝素AT III络合物对于AT III生理功能的重要性，也进行了许多研究来评估肝素的低聚糖单元的络合位(Choay，Ann.NY Acad.Sci.370：644，1981；Choay，Biochem.Biophys.Res.Commun.116：492，1983；Olson，J.Biol.Chem.266：6353，1991；Bauer，Semin.Hematol.28：10，1991；Carell，Thromb.Haemost.78：516，1997)。可以用经典的人血浆分级分离技术来制备ATIII。使用高亲和力的肝素作为AT III配体进行亲和色谱(肝素-sepharose)，然后用热处理法使病毒灭活，可以用于从血浆中分离。除了从血浆中分级分离外，近来更多地选择重组生产技术来产生AT III，该技术为该重要的治疗性蛋白的生产提供了一种更安全的途径(Levi，Semin Thromb Hemost 27：405，2001)。ATryn^TM是GTC Biotherapeutics在转基因山羊中产生的一种重组人AT III(rh AT III)。已经有详细的研究对来源于血浆的AT III(ph AT III)和rh AT III的结构和功能性质进行了比较(Edmunds，Blood，91：4561，1998)。根据该实验，除了糖基化外，rh AT III在结构上与ph AT III相同。在转基因产生的物质的Asn 155位上发现了低聚甘露醇结构，而在来源于血浆的蛋白质中则探测到了络合物结构。pd AT III的某些半乳糖单元在rh AT III中被GalNac单元所取代。在rh AT III中岩藻糖基化程度较高是另一个不同之处。最后，这两种蛋白质的唾液酸化模式在两方面不同：rh AT III的唾液酸化较少并包含N-乙酰-和N-羟乙酰神经氨酸。这两种分子的两个糖部分之间的结构差异也导致了生物化学性质的不同。如下的AT III药物在欧洲的医疗市场中是可以得到的：(来源：IMS-ATC group 2001)：Kybernin(Aventis Behring)、AT III(Baxter，Grifols)、Atenativ(Pharmacia)、Aclotine(LFB)、Anbin(Grifols)。

因子VIII参加内在的蛋白酶凝血级联系统，并且可以在将因子X转换成活化型Xa的因子IXa的反应中作为辅助因子，Xa最终导致纤维蛋白凝块的形成。因子VIII的缺乏或不稳定会导致血友病A，其为一种隐性x-连锁的凝血障碍。在所有的种族中，血友病A的频率为每10,000个男性出生儿中1-2个。患者的因子VIII表达水平远低于正常水平或者属于所谓的crm(交叉反应物质)阳性患者组(约5％的患者)，其血浆中含有大量的因子VIII(正常水平的至少30％)，但是该蛋白质是非功能性的。所有患者中约50％具有严重的血友病A，其中因子VIII活性小于正常水平的1％；他们经常自发性出血流入关节、肌肉和内脏中。30-40％患者发生的轻度血友病A与活性为正常水平的5-30％有关。其仅仅在重大的创伤或外科手术后才会发生出血。在约10％的患者中会发生中度严重血友病A；在此，因子VIII的活性为正常水平的2-5％，较小的创伤后就会发生出血。因子VIII的人体内半衰期通常是10-15小时，但必须注意的是，另一种因子-van Willebrand因子也会影响其释放、稳定性和分解动力学。因子VIII既可以通过常规提取从捐赠的人血浆中产生，也可以用近来的重组系统来产生。例如，幼仓鼠肾(BHK)细胞可以用于产生Kogenate(Bayer)，而中国仓鼠卵巢(CHO)细胞可以用于另一种产品Rekombinate(Baxter)。名义分子量为267kD的含有2351个氨基酸的完全单链蛋白质(Toole等，1984，Nature 312：342)或完全或部分去除了B-域的其他形式，能获得更稳定的产物而且在制备中可以获得更高收率(Bhattacharyya等.2003，CRIPS 4/3：2-8)。在高尔基体中前体产物被加工成200和80kD的两条多肽链，在血中表达与金属离子一起保持的这两条链(Kaufman等，1988，J.Biol.Chem.，263：6352)。前凝血剂活性需要凝血酶进一步分裂以得到54kD和44kD的重链片段和72kD的轻链片段(Aly等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：4933)。在来源于人血浆的因子VIII浓缩物中，断裂的某些具有完全活性的因子VIII形式已经在文献中进行了描述(Anderson等，1986，Proc.Natl.Acad，Sci.83：2979)。施用血浆或重组因子VIII通常的副作用是会在大量患者中(高达30％)发生免疫反应，这使得该因子丧失了治疗价值。过去，已经开始有各种尝试通过耐受性的口腔诱导来使患者具有耐受性，但结果都不是太令人鼓舞。也有人提出诱导耐受性的新的遗传学方法，但并未发现其广泛的应用。本发明人考虑到，HES化的蛋白质具有轻度免疫原性，因此可以减少这种并发症。因子VIII高度富含赖氨酸残基(在全部2350个氨基酸中有超过220个)，可以用于还原氨基化的途径。

α-抗胰蛋白酶(A1AT，也称作α1-蛋白酶抑制剂)是一种蛋白酶抑制剂，其显示出可以抑制事实上所有哺乳动物的丝氨酸蛋白酶(TravisAnn.Rev.Biochem.52(1983)p.655)，包括中性白细胞弹性蛋白酶、凝血酶、因子Xa和XIa。A1AT是一种在肝中合成的具有394个氨基酸、分子量为53kD的单链糖蛋白。血浆浓度为1-1.3g/l。在整个蛋白中仅存在一个半胱氨酸，因此不会形成分子内二硫键。该分子含有占分子量12％的三个糖侧链(Asn 46，83，247)(Mega J Biol.Chem.255(1980)p.4057；Mega J.Biol.Chem.255(1980)p.4053；Carell FEBS Letters 135(1981)p.301；Hodges Biochemistry21(1982)p.2805)。已经发现分别具有2或3个触角结构的两种类型的糖链(Hodges J：Biol.Chem.254(1979)p.8208)。在一般人群中，人A1AT至少具有20种不同的形式。这种微异质性是两种类型的糖链含量不同的结果。其关键功能是对中性白细胞弹性蛋白酶的活性控制(Travis Ann.Rev.Biochem.52(1983)p.655)。不受控制的弹性蛋白酶活性会导致对上皮组织的攻击，造成不可挽回的损害。在灭活过程中，A1AT作为底物用于将弹性蛋白酶结合到蛋白酶的活性中心，接着形成络合物而使该蛋白酶灭活。缺乏A1AT会导致例如，与肺的上皮组织损害有关的肺气肿。A1AT中两种类型的糖侧链对A1AT三个N-糖基化位点的分布在每个A1AT同种型中是不同的。A1AT的经典制备方法是使用不同的亲和层析步骤从人血浆中提取的血浆分级分离技术。但是，较新的生产A1AT的方法是使用重组技术。PPLTherapeutics已经发展出了一种方法，允许从转基因羊的奶中回收重组人A1AT(rHA1AT)(Olman Biochem.Soc.Symp.63(1998)p.141；TebbuttCurr.Opin.Mol.Cher.2(2000)p.199；Carver Cytotechnology 9(1992)p.77；Wright Biotechnology(NY)9(1991)p.830)。至于该分子的蛋白质部分，rhA1AT显示了与pdA1AT相同的结构。但是，对于其他重组产生的人蛋白质的情况，糖侧链会有不同，特别是唾液酸残基的量会不同。

组织型纤溶酶原活化因子(tPA)是一种在血块溶解中重要的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。当存在纤维蛋白凝块时，tPA将纤溶酶原转变成可以降解纤维蛋白的纤溶酶。当存在纤维蛋白时，tPA的活性增强，结果导致纤维蛋白特异性的纤溶酶原活化(M.W.Spellman，L.J.Basa，C.K.Leonard，J.A.Chakel，J.V.O′Connor，The Journal of Biological Chemistry264(1989)p.14100)。纤溶酶溶解纤维蛋白，可以获得纤维蛋白降解产物。通过正反馈机制，纤溶蛋白通过刺激tPA介导的纤溶酶原活化可以促进其自身的降解(R.J.Stewart等.The Journal of Biological Chemistry275(2000)pp.10112-10120)。htPA是纤维蛋白溶解的生理活化剂，在不同类型的组织中都存在纤维蛋白溶解。它是一种分子量约68kD的糖蛋白。在天然形式中，tPA以单链形式(单链组织型纤溶酶原活化剂，sctPA)存在，其可以通过在肽键Arg 275-Ile 276处的纤溶酶分裂转变成双链结构(双链组织型纤溶酶原活化剂，tctPA)。对于纤维蛋白溶解的处理，可以产生重组rtPA(重组组织型纤溶酶原活化剂)。不同类型的tPA显示了在糖结构上的结构差异。I型tPA在氨基酸Asn117、Asn184和Asn448位具有N-连接寡糖。II型tPA在Asn117和Asn448处糖基化。两种类型在Thr61位都包含O-连接的岩藻糖残基(K.Mori等.The Journalof Biological Chemistry 270(1995)pp.3261-3267)。研究了CHO-细胞中表达的tPA的糖结构，表明糖链的2、3和4触角结构具有较多的种类(M.W.Spellman，L.J.Basa，C.K.Leonard，J.A.Chakel，J.V.O′Connor，TheJournal of Biological Chemistry 264(1989)p.14100)。tPA的一级结构包含数个据信将要交联的半胱氨酸，另外在83位有一个游离的半胱氨酸残基，其可以与另一个tPA相互作用形成二聚体。多个结果表明，tPA的体内清除率会受到糖结构，特别是在Asnl 17位连接的高甘露醇寡糖的影响。提出的另一种清除机制包括肝细胞上的高亲和力受体识别在Thr61位的O-连接的岩藻糖残基。该残基在Cys83附近。已经发展出一种生物工程tPA(TNK-tPA)来延长半衰期。在117位的糖基化位点转移到103位。在117位的天冬酰胺被谷氨酰胺取代，在103位的苏氨酸被天冬酰胺取代。由于在蛋白酶区域的四丙氨酸取代，TNK-tPA对于纤溶酶原活化物抑制剂1的灭活作用具有耐受性(R.J.Stewart等.The Journalof biological Chemistry 275(2000)pp.10112-10120)。TNK-tPA可以作为单一静脉推注药物施用，而tPA只能作为丸药使用，然后输注。

活化蛋白C(APC)是一种与严重败血症有关的凝固和炎症的调节因子。活化蛋白C是通过凝血酶与血栓调节蛋白偶合而由它的无活性前体(蛋白C)转变而成的。该复合物N-末端的短活化肽从蛋白质C的重链上脱落，形成活化蛋白C。Drotrecoginα(活化的)是一种重组人活化蛋白C(rhAPC)。它的氨基酸序列与来源于血浆的活化蛋白C相同，并具有相似的性质。在市场销售的活化蛋白C是Eli Lilly的Xigris。它是在人细胞系(HEK293)中产生的，在该细胞系中引入了蛋白C表达载体。使用该细胞系是由于其具有正确络合物系列翻译后修饰的序列能力，该翻译后修饰是功能性活性所需要的。重组人活化蛋白C是一种包含4个N-糖基化位点和12个二硫键的双链糖蛋白。该重链包含250个氨基酸。在该链中，7个残基是半胱氨酸，3个是N-连接的糖基化位点(Asn-248，Asn-313和Asn-329)。这7个半胱氨酸残基在形成3个重链内二硫键和1个链间二硫键。轻链包含1个N-连接糖基化位点(Asn-97)和17个半胱氨酸残基，后者形成8个轻链内二硫键和1个链间二硫键。在轻链上的前9个谷氨酸是γ-羧酸化的(Gla)，而天冬氨酸71是β羟基化的。rhAPC与来源于人血浆的活化蛋白C具有相同的氨基酸序列，但是与后者的不同之处在于它的糖基化模式。活化蛋白C是一种属于丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶。它在调节凝固中发挥主要作用。活化蛋白C抗血栓功能的基础是它能够抑制凝血酶的功能。此外，活化蛋白C是一种与严重败血症相关的炎症的重要调节因子。内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂是活化蛋白C的天然抑制剂，导致活化蛋白C体内循环活性半衰期非常短暂(短于30分钟)。从循环中清除活化蛋白C是由至少三个过程的组合介导的，这三个过程包括内源性蛋白酶抑制剂对活化蛋白C酶活性的抑制，器官例如肝或肾清除活化蛋白C和/或活化蛋白C-丝氨酸蛋白酶抑制剂络合物，及循环或组织蛋白酶分解活化蛋白C和/或活化蛋白C-丝氨酸蛋白酶抑制剂络合物。用24μg/kg/h的剂量进行24小时输注的I期临床研究得到了稳态的血浆浓度70ng/ml。在输注结束时测得的rhAPC的半衰期为0.5-1.9小时。血浆rhAPC浓度在输注结束后2小时内降低到10ng/ml的检测限度以下。由于其较短的生理和药代动力学半衰期，在临床应用于治疗败血症时，活化蛋白C按一定的速率连续地输注，以维持所需的血浆浓度。进行了一些尝试来改善活化蛋白C的药代动力学分布。例如D.T.Berg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(2003)pp.4423-4428描述了一种具有延长的血浆半衰期的活化蛋白C工程变体。

因子VII参加蛋白酶的内源性凝血级联系统并通过活化凝血级联的外部途径来加速止血。因子VII通过因子Xa、因子XIIa、因子IXa或凝血酶的轻度蛋白水解作用转变为因子VIIa。在组织因子和钙离子存在下，因子VIIa随后通过限制性蛋白水解把因子X转变成因子Xa。在组织因子和钙存在下，因子VIIa也可以把因子IX转变为因子IXa。因子VII是一种由406个氨基酸残基组成的维生素K-依赖型糖蛋白(分子量为50K道尔顿)。因子VII可以从捐赠人的血浆中常规提取，也可以用近来的重组系统来生产。Novo Nordisk使用幼仓鼠肾(BHK)细胞来生产NovoSeven。其表达为一种具有406个氨基酸、名义分子量为55kDa的单链蛋白质(Thim，L.等，Biochemistry 27：7785-7793(1988))。该分子包含4个糖侧链。在Ser 52，60位有2个O-连接的糖侧链，在Asn 145，322位有2个N-连接的糖侧链(Thim，L.等，Biochemistry 27：7785-7793(1988))。

据称，因子VII与因子VIII或因子IX的抑制剂一起可以用于治疗血友病A或B患者发生的出血。因此，本发明也涉及HAS-因子VII偶联物在制备与因子VIII或因子IX的抑制剂一起用于治疗血友病A或B患者发作的药物中的应用。

因子IX是一种维生素K-依赖型血浆蛋白质，其通过在Ca(2+)离子、磷脂、和因子VIIIa存在下将因子X转变成它的活化形式参与血液凝固的内源性途径。因子IX是一种分子量约为55,000Da、在单链中包含415个氨基酸的糖蛋白(Yoshitake S.等，Biochemistry 24：3736-3750(1985))。因子IX可以从捐赠人的血浆中常规提取，也可以用近来的重组系统来生产。Wyeth使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产了BeneFIX。它具有与来源于血浆的因子IX的Ala¹⁴⁸等位型相同的一级氨基酸序列，并且与内源性因子IX具有相似的结构和功能性质。该蛋白质包含8个糖侧链。在Ser 53，61位和苏氨酸159，169，172，179位有6个O-连接的糖侧链，在Asn 157，167位有2个N-连接的糖侧链(YoshitakeS.等，Biochemistry 24：3736-3750(1985)；Balland A.等，Eur J Biochem.1988；172(3)：565-72)。

据称，因子IX可以用于控制和预防血友病B(先天性因子IX缺乏或克里斯马斯病)患者的出血性发作，包括控制和预防在外科环境中的出血。因此，本发明也提供一种HAS-因子IX偶联物在制备用于控制和预防血友病B(例如，先天性因子IX缺乏或克里斯马斯病)患者的出血性发作(包括控制和预防在外科环境中的出血)的药物中的应用。

在本发明的上下文中，术语“羟烷基淀粉”(HAS)涉及一种被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。本发明一个优选的羟烷基淀粉具有根据通式(I)的结构

其中该淀粉分子的还原端呈非氧化型，末端糖单元呈半缩醛型，根据如溶剂的不同，该半缩醛型可以与醛型平衡。

本发明使用的术语羟烷基淀粉并不限于如通式(I)中为简便起见所示在末端糖部分包含羟烷基R₁、R₂和/或R₃的化合物，也涉及其中在末端糖部分和/或淀粉分子HAS′中其余部分的任何位置的至少一个羟烷基被羟烷基R₁、R₂、或R₃取代的化合物。

羟烷基淀粉也可能包含两个或多个不同羟烷基。

包含在HAS中的至少一个羟烷基可包含两个或多个羟基。根据一个优选的实施方案，包含在HAS中的至少一个羟烷基包含一个羟基。

术语“羟烷基淀粉”也包括其中烷基被单-或多取代的衍生物。在本文中，优选烷基被卤素，特别是氟取代，或被芳基取代。此外，羟烷基的羟基也可被酯化或醚化。

此外，也可使用直链或支链的取代或未取代的烯基代替烷基。

羟烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除了所述醚衍生物外，本发明中也可使用其他淀粉衍生物。例如，可用包含酯化羟基的衍生物。这些衍生物可以是，例如含2-12个碳原子的未取代一元或二元羧酸或其取代衍生物的衍生物。特别有用的是含2-6个碳原子的未取代一元羧酸的衍生物，特别是乙酸的衍生物。本文中，优选乙酰基淀粉、丁酰基淀粉和丙酰基淀粉。

此外，优选含2-6个碳原子的未取代二元羧酸的衍生物。

对于二元羧酸衍生物，该二元羧酸的第二个羧基也被酯化是有用的。此外，二元羧酸的单烷基酯衍生物也适用于本发明。

对于取代的一元或二元羧酸，取代基优选地可与上述用于取代烷基残基的取代基相同。

淀粉的酯化技术是本领域公知的(参见，例如，Klemm D.等，Comprehensive Cellulose Chemistry Vol.2，1998，Whiley-VCH，Weinheim，New York，特别是4.4章，Esterification of Cellulose(ISBN3-527-29489-9)。

根据本发明的一个优选的实施方案，使用根据上述通式(I)的羟烷基淀粉。在通式(I)中，明确说明的糖环和以HAS′表示的残基共同代表优选的羟烷基淀粉分子。HAS′中包含的其他糖环结构可以与明确说明的糖环相同或不同。

根据通式(I)的残基R₁、R₂、和R₃没有特别的限制。根据一个优选的实施方案，R₁、R₂、和R₃分别独立地是氢或在各烷基残基中具有2到10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，或基团(CH₂CH₂O)_n-H，其中n是一个整数，优选1，2，3，4，5或6。优选氢和具有2到10个碳原子的羟烷基。更优选具有2到6个碳原子的羟烷基，更优选具有2到4个碳原子的羟烷基，甚至更优选具有2到3个碳原子的羟烷基。因此，“羟烷基淀粉”优选包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉，其中特别优选羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，最优选羟乙基淀粉。

烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是直链或支链的，并且可以被适当取代。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R₁、R₂、和R₃分别独立地是氢或含2到6个碳原子的直链或支链羟烷基。

因此，R₁、R₂、和R₃优选地可以是羟乙基，羟戊基，羟丁基，羟丙基例如2-羟丙基、3-羟丙基、2-羟异丙基，羟乙基例如2-羟乙基，特别优选是氢和2-羟乙基。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R₁、R₂、和R₃分别独立地是氢或2-羟乙基，特别优选R₁、R₂、和R₃中至少一个残基是2-羟乙基的实施方案。

羟乙基淀粉(HES)对于本发明所有的实施方案都是最优选的。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物为羟乙基淀粉，并且聚合物衍生物为羟乙基淀粉衍生物。

羟乙基淀粉(HES)是天然支链淀粉的衍生物，可被体内的α-淀粉酶降解。HES是糖聚合物支链淀粉的取代衍生物，其在玉米淀粉中的浓度高达95％重量。HES具有有利的生物性质，在临床上用作血容量置换剂及用于血液稀释疗法(Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498)。

支链淀粉由葡萄糖单位组成，其中主链中含有α-1，4-糖苷键，并且可以在分支位点处发现α-1，6-糖苷键。该分子的物理化学性质主要由糖苷键的类型决定。由于存在切口α-1，4-糖苷键，因此产生了每一圈约6个葡萄糖单体的螺旋结构。聚合物的物理化学性质和生化性质可通过取代来改变。可以利用碱性羟乙基化引入羟乙基。通过调节反应条件，可以使未取代的葡萄糖单体中各羟基对羟乙基化作用具有不同反应性。基于此事实，本领域技术人员可以在有限的范围内改变取代模式。

HES的主要特征在于分子量分布和取代程度。表述取代程度有两种可能的方式：

1.取代程度可表示为取代的葡萄糖单体相对于所有葡萄糖部分的比例。

2.取代程度可表示为摩尔取代程度，其表述的是每个葡萄糖部分的羟乙基数。

在本发明的内容中，以DS表示的取代程度涉及如上所述的摩尔取代程度(也可参见Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278，如上述引用，特别是p.273)。

HES溶液以多分散组合物存在，其中各分子在聚合度、分支位点的数目和模式及取代模式上彼此不同。因此，HES是不同分子量的化合物的混合物。因此，特定的HES溶液由借助统计方式得到的平均分子量来确定。在本文中，M_n计算为取决于分子数的算术平均值。可选择地，平均重量M_w(或MW)代表取决于HES质量的单位。

在本发明的上下文中，羟乙基淀粉可优选具有1至300kD的平均分子量(平均重量)。羟乙基淀粉可进一步显示0.1到3的优选摩尔取代程度，优选0.1到2，更优选0.1到0.9，优选0.1到8，羟乙基的C₂∶C₆取代的优选比例范围是2到20。

本发明的上下文中使用的术语“平均分子量”涉及用如Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498所述的LALLS-(低角激光散射)-GPC方法确定的重量。另外对于10kD或更小的平均分子量，可以用先前LALLS-GPC确定的标准值来进行校准。

根据本发明一个优选的实施方案，所使用的羟乙基淀粉的平均分子量为1到300kD，更优选2到200kD，更优选4到130kD，更优选4到70kD。

平均分子量约130kD的HES的例子是取代程度为0.1到0.9，优选0.2到0.8，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、或0.8，优选0.4到0.7，例如0.4、0.5、0.6、或0.7的HES。

平均分子量约130kD的HES的例子是来自Fresenius的Voluven。Voluven是一种人造胶体，其用于例如在治疗和预防低血容量症的治疗适应症中进行容量置换。Voluven的特征是平均分子量为130,000+/-20,000D，摩尔取代程度为0.4，C₂∶C₆的比例约9∶1。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中羟烷基淀粉是平均分子量为4到100kD，优选4到70kD的羟乙基淀粉。

平均分子量的优选范围是例如，4到70kD，或10到70kD，或12到70kD，或18到70kD，或50到70kD，或4到50kD，或10到50kD，或12到50kD，或18到50kD，或4到18kD，或10到18kD，或12到18kD，或4到12kD，或10到12kD或4到10kD。

根据本发明特别优选的实施方案，所使用羟乙基淀粉的平均分子量范围在4kD以上和70kD以下，例如约10kD，或在9到10kD，或10到11kD或9到11kD的范围内，或约12kD，或在11到12kD或12到13kD或11到13kD的范围内，或约18kD，或在17到18kD或18到19kD或17到19kD的范围内，或约50kD，或在49到50kD或50到51kD或49到51kD的范围内。

至于摩尔取代程度(DS)的上限，其值可以高达3.0，例如0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0，优选小于2.0的值，更优选小于1.5的值，更优选小于1.0的值，例如0.7、0.8、或0.9。

因此，摩尔取代程度的优选范围是0.1到2，或0.1到1.5，或0.1到1.0，或0.1到0.9，或0.1到0.8。摩尔取代程度的更优选范围是0.2到2，或0.2到1.5，或0.2到1.0，或0.2到0.9，或0.2到0.8。摩尔取代程度的更优选范围是0.3到2，或0.3到1.5，或0.3到1.0，或0.3到0.9，或0.3到0.8。摩尔取代程度甚至更优选的范围是0.4到2，或0.4到1.5，或0.4到1.0，或0.4到0.9，或0.4到0.8。

至于所涉及的取代程度(DS)，DS优选至少0.1，更优选至少0.2，更优选至少0.4和更优选至少0.4。DS的优选范围是0.1到3，优选0.1到2，更优选0.1到0.9，更优选0.1到0.8，更优选0.2到0.8，更优选0.3到0.8，甚至更优选0.4到0.8，更优选0.1到0.7，更优选0.2到0.7，更优选0.3到0.7，及更优选0.4到0.7。特别优选的DS的值是，例如0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，或0.9，更优选0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，甚至更优选0.3，0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，更优选0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，例如特别优选0.4和0.7。

在本发明的上下文中，摩尔取代程度的一个给定值，例如0.9，可以是该确定值，或者可以理解成0.85到0.94的范围，或0.8，可以是该确定值，或者可以理解成0.75到0.84的范围。因此，例如，给定值0.1可以是确定值0.1或者0.05到0.14的范围，给定值0.4可以是确定值0.4或者0.35到0.44的范围，给定值0.7可以是确定值0.7或者0.65到0.74的范围。

羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉的分子量和其取代程度DS的特别优选组合是例如，10kD和0.4，或10kD和0.7，或12kD和0.4，或12kD和0.7，或18kD和0.4，或18kD和0.7，或50kD和0.4，或50kD和0.7或100kD和0.7。

关于C₂∶C₆的取代比例，所述取代优选在2到20的范围内，更优选2到15，甚至更优选3到12。

根据本发明的另一个实施方案，也可使用平均分子量不同和/或取代程度不同和/或C₂∶C₆的取代比例不同的羟乙基淀粉的混合物。因此，所使用的羟乙基淀粉的混合物可具有不同平均分子量和不同取代程度和不同C₂∶C₆的取代比例，或者具有不同平均分子量和不同取代程度和相同或大约相同的C₂∶C₆的取代比例，或者具有不同平均分子量和相同或大约相同的取代程度和不同的C₂∶C₆的取代比例，或者具有相同或大约相同的平均分子量和不同取代程度和不同C₂∶C₆的取代比例，或者具有不同平均分子量和相同或大约相同的取代程度和相同或大约相同的C₂∶C₆的取代比例，或者具有相同或大约相同的平均分子量和不同取代程度和相同或大约相同的C₂∶C₆的取代比例，或者具有相同或大约相同的平均分子量和相同或大约相同的取代程度和不同的C₂∶C₆的取代比例，或者具有大约相同的平均分子量和大约相同的取代程度和大约相同的C₂∶C₆的取代比例。

在根据本发明的不同偶联物和/或不同方法中，可使用不同的羟烷基淀粉，优选不同的羟乙基淀粉，和/或不同的羟烷基淀粉的混合物，优选不同的羟乙基淀粉的混合物。

根据本发明的还原氨基化反应，其中聚合物或聚合物衍生物通过还原氨基化作用经至少一个醛基共价连接到蛋白质的至少一个氨基上，其进行的温度优选是0到40℃，更优选0到37℃，更优选0到25℃，特别是4到21℃，特别优选0到21℃。反应时间优选0.5到72小时，更优选2到48小时，特别优选4到7小时。至于反应的溶剂，优选是水性介质。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在4到21℃，但特别优选在0到21℃下进行的。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在水性介质中进行的。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在4到21℃，特别优选0到21℃，在水性介质中进行的。

在本发明中使用的术语“水性介质”涉及一种溶剂或溶剂的混合物，以所包含溶剂的重量为基准，其包含水的含量为至少10％重量，更优选至少20％重量，更优选至少30％重量，更优选至少40％重量，更优选至少50％重量，更优选至少60％重量，更优选至少70％重量，更优选至少80％重量，甚至更优选至少90％重量或高达100％重量。优选的反应介质是水。

该反应介质的pH值一般在4到9的范围内，或者4到8或者4到7.5或者4到7.3。

根据本发明一个优选的实施方案，进行还原氨基化反应的pH在10以下，优选在7.5以下，优选7.3，更优选小于或等于7，最优选在7以下，即在酸性范围内。因此优选的范围是3到7以下，更优选3.5到6.5，更优选4到6，更优选4.5到5.5，特别优选约5.0，即4.6或4.7或4.8或4.9或5.0或5.1或5.2或5.3或5.4。优选的范围还包括下列范围：3到6.9，或3到6.5，或3到6，或3到5.5，或3到5，或3到4.5，或3到4，或3到3.5，或3.5到6.9，或3.5到6.5，或3.5到6，或3.5到5.5，或3.5到5，或3.5到4.5，或3.5到4，或4到6.9，或4到6.5，或4到6，或4到5.5，或4到5，或4到4.5，或4.5到6.9，或4.5到6.5，或4.5到6，或4.5到5.5，或4.5到5，或5到6.9，或5到6.5，或5到6，或5到5.5，或5.5到6.9，或5.5到6.5，或5.5到6，或6到6.9，或6到6.5或6.5到6.9。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在pH为7或更小，更优选pH为6或更小的条件下进行的。

本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在0到21℃，优选4到21℃，pH为7.5或更小，优选7或更小，优选6或更小的条件下进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在pH为7或更小，优选6或更小的水性介质中进行的。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在4到21℃，pH为7或更小，优选6或更小的水性介质中进行的。

用于该反应的聚合物衍生物∶蛋白质的摩尔比优选在200∶1到5∶1的范围内，更优选100∶1到10∶1，特别优选75∶1到20∶1。

令人惊奇地发现，在上述给定的优选pH范围，特别是pH在7以下并大于或等于4时，聚合物衍生物主要与位于蛋白质N-末端的氨基反应。在本发明的上下文中，术语“主要”涉及这样的实施方案，其中至少80％，优选至少85％的可用的N末端氨基通过还原氨基化作用而反应。至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的可用的N-末端氨基反应也是可以的。尽管与N末端氨基以外的其他氨基偶联并不能完全排除，但我们相信，根据本发明在pH 7以下，优选6以下的经还原氨基化作用的偶联基本上选择性地发生在N末端氨基上。特别地，这些反应条件优选用于在这些条件下稳定的蛋白质。如果该蛋白质是例如酸不稳定的，例如α1-抗胰蛋白酶，那么优选需要选择适当的反应条件，特别是小于7.5到大于5的pH。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该蛋白质包含N末端氨基和至少一个另外的氨基，所述偶联物包含主要偶联到N末端氨基上的聚合物。

根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及一种把醛基或酮基或半缩醛基官能化的羟烷基淀粉或者醛基或酮基或半缩醛基官能化的羟烷基淀粉衍生物主要连接到蛋白质的N末端氨基上的方法，所述方法包括在pH为7或更小，优选6或更小的条件下将所述羟烷基淀粉或其衍生物进行还原氨基化反应，所述还原氨基化反应优选在水性介质中进行。

根据本发明，优选醛基官能化的羟烷基淀粉或醛基官能化的羟烷基淀粉衍生物。

根据本发明另一个优选的实施方案，本发明涉及一种把醛基或酮基或半缩醛基官能化的羟乙基淀粉或者醛基或酮基或半缩醛基官能化的羟乙基淀粉衍生物选择性地连接到蛋白质的N末端氨基上的方法，所述方法包括在pH为7或更小，优选6或更小的条件下将所述羟乙基淀粉或其衍生物进行还原氨基化反应，所述还原氨基化反应优选在水性介质中进行，所使用的羟乙基淀粉优选是平均分子量是约10kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约10kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约12kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约12kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约18kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约18kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约50kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约50kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约100kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉。

该聚合物衍生物和蛋白质在醛基或酮基或半缩醛基与氨基之间的反应是一种产生希夫碱的还原氨基化作用。随后在该反应后，该碱可以用至少一种还原剂还原，以在该聚合物衍生物和蛋白质之间形成稳定的键。该反应在至少一种还原剂存在下反应也是可能的。根据一个优选的实施方案，该还原氨基化反应在至少一种还原剂存在下进行。

优选的还原剂是硼氢化钠、氰基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物例如4-(二甲胺)吡啶硼烷络合物、N-乙基二异丙胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物、或三甲胺硼烷络合物。特别优选氰基硼氢化钠。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在NaCNBH₃存在下进行的。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在pH为7或更小，优选6或更小的水性介质中，在还原剂，优选NaCNBH₃存在下进行的。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该还原氨基化作用是在4到21℃，pH为7或更小，优选6或更小的水性介质中，在还原剂，优选NaCNBH₃存在下进行的。

用于该反应的聚合物衍生物∶蛋白质的摩尔比优选在200∶1到10∶1的范围内，更优选100∶1到10∶1，特别优选75∶1到20∶1。

因此，本发明也涉及一种制备偶联物的方法，所述方法包括将包含醛基的聚合物或聚合物衍生物在水性介质中，在还原剂存在下与蛋白质的氨基反应，所述还原剂优选是NaCNBH₃。

根据本发明的第一个优选实施方案，根据该方案聚合物包含通过开环氧化反应引入聚合物中的至少两个醛基，该聚合物优选包含至少一个根据下列通式的结构

根据本发明的该实施方案，每个氧化剂或氧化剂的组合都是可以使用的，其中该氧化剂能够氧化聚合物的至少一个糖环，以得到具有至少一个，优选至少两个醛基的打开的糖环。下面通过反应流程来说明该反应，其中该反应流程显示了聚合物的糖环，该糖环被氧化后得到具有两个醛基的开环：

适当的氧化剂是，高碘酸盐例如碱金属的高碘酸盐或其两种或多种的混合物，优选高碘酸钠和高碘酸钾。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物用高碘酸盐进行开环氧化反应，以得到具有至少一个，优选至少两个醛基的聚合物衍生物。

对于该氧化反应，可以使用是具有氧化型或非氧化型，优选非氧化型还原端的聚合物。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中使用的是具有非氧化型还原端的聚合物。

反应温度的优选范围是0到40℃，更优选0到25℃，特别优选0到5℃。反应时间的优选范围是1分钟到5小时，特别优选10分钟到4小时。根据所需的氧化程度，即氧化反应得到的醛基数目，可以适当选择高碘酸盐∶聚合物的摩尔比。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中在0到5℃的温度下进行开环氧化反应。

该聚合物和高碘酸盐的氧化反应优选在水性介质，最优选在水中进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中开环氧化反应是在水性介质中进行的。可以加入至少一种适当的缓冲液将该反应混合物调节至适当的pH值。优选的缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸盐或硼酸盐缓冲液。

用于所述开环氧化反应的羟乙基淀粉优选是平均分子量是约10kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约10kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约12kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约12kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约18kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约18kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约50kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约50kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约100kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉。

可以用至少一种适当的方法从反应混合物中纯化所得到的聚合物衍生物。如果需要，可以在用适当的方法分离前沉淀该聚合物衍生物。

如果首先沉淀该聚合物衍生物，可以例如将与该反应混合物所处的溶剂或溶剂混合物不同的至少一种溶剂或溶剂混合物和该反应混合物在适当的温度接触。根据本发明一个特别优选的实施方案，其中所使用的溶剂是水性介质，优选是水，该反应混合物与2-丙醇或丙酮和乙醇的混合物，优选1∶1的混合物(v/v)接触，这表示所述化合物为同样的体积，温度优选是-20到+50℃，特别优选是-20到25℃。

可以用包含一个或多个步骤的适当方法来进行聚合物衍生物的分离。根据本发明一个优选的实施方案，用适当的方法例如离心分离或过滤将该聚合物衍生物首先从该反应混合物或该反应混合物与例如水2-丙醇混合物的混合物中分离出来。第二步，可以对分离出来的聚合物衍生物进行进一步处理，例如后处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换色谱、反相色谱法、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冷冻干燥。根据一个甚至更优选的实施方案，将分离出来的聚合物衍生物首先进行透析，优选在水中透析，然后冷冻干燥直至反应产物中的溶剂含量根据所需的产物规格显著地降低。进行冷冻干燥的温度是20到35℃，优选20到30℃。

根据一个优选的实施方案，用至少一种适当的方法，例如超滤和/或透析来纯化氧化反应得到的氧化聚合物，以例如除去不想要的低分子量盐和聚合物组分，因此也提供一种控制氧化聚合物的分子量范围的方法。

该氧化聚合物可以直接与蛋白质反应或在第一步中适当复原，例如冷冻干燥并溶解于水中用于第二步中与蛋白质结合。关于该聚合物的至少一个醛基通过还原氨基化作用与蛋白质的至少一个氨基偶联，可以参考上文中详细公开的还原氨基化反应的特定反应参数，例如pH或温度。根据本发明特别优选的实施方案，根据所用的蛋白质为rhIL 2、rhIL 3、rhIFNα、rhIFNβ、rhEPO、rhAT III、rhG-CSF、BSA、肌红蛋白和SOD，该还原氨基化作用优选在0到5℃，例如约4℃，pH为约4.5到5.5，例如约5.0的条件下进行，反应时间为约20到30小时，例如约24小时。

根据第二个优选实施方案，该聚合物与至少双官能化合物反应，该双官能化合物包含至少一个能与该聚合物反应的官能团M和至少一个官能团Q，Q是醛基或酮基或半缩醛基并且其通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。

优选使用一种化合物，除了具有醛基或酮基或半缩醛基外，它还具有至少一个羧基或至少一个反应性羧基，优选一个羧基或一个反应性羧基。醛基或酮基或半缩醛基和羧基或反应性羧基可以用任何适当的间隔基分开。其中，该间隔基可以是任选取代的直链、支链和/或环状的烃残基。一般地，该烃残基具有1到60，优选1到40，更优选1到20，更优选2到10，更优选2到6，特别优选2到4个碳原子。如果存在杂原子，该间隔基通常包含1到20，优选1到8，特别优选1到4个杂原子。该烃残基可以包含具有例如5到7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直链和/或环烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有5到7，优选6个碳原子的芳残基。最优选地，该烃残基是苯残基。根据该优选实施方案，该羧基和醛基可以位于苯环的1，4-位、1，3-位或1，2位，优选在1，4-位。

反应性酯、异硫氰酸酯或异氰酸酯可以作为反应性羧基。优选的反应性酯来源于N-羟基琥珀酰亚胺类例如N-羟基琥珀酰亚胺或硫代-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类例如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟基唑类例如羟基苯并三唑。特别优选的是N-羟基琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和硫代-N-羟基琥珀酰亚胺。所有的醇可以单独使用或者可以两种或几种适当组合使用。作为反应性酯，特别优选五氟苯酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯。

因此，根据一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与甲酰苯甲酸反应。

根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与甲酰苯甲酸五氟苯基酯反应。

根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与甲酰苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应。

根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反应。

根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与双官能化合物反应，其中该双官能化合物是选自α-酮基羧酸、唾液酸或其衍生物及磷酸吡哆醛的生物相容性化合物。

对于α-酮基羧酸，优选是由氨基酸衍生的α-酮基羧酸，大多数情况下也可以在人体内发现。优选的由氨基酸衍生的α-酮基羧酸选自酮基-缬氨酸、酮基-亮氨酸、酮基-异亮氨酸和酮基-丙氨酸。α-酮基羧酸中的羧基与该聚合物的基团Q反应，其中基团Q为氨基。这样就形成了酰胺基。然后α-酮基羧酸剩余的游离酮基可以与蛋白质的官能团，特别是氨基反应。这样形成了可以氢化的亚氨基。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与α-酮基羧酸反应。

至于唾液酸或其衍生物，优选其是生物相容性的，特别地，它们是在人体内发现的N-和/或O-乙酰化的糖类。在一个优选的实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸。由于吡喃糖结构，这些化合物显示出了所需要的刚性，以实现作为间隔基的功能。另一方面，通过选择性氧化向这些化合物中引入醛基也是可能的。在人体内可以发现唾液酸，例如在糖基化蛋白的聚糖链中作为末端单糖。

在一个优选的实施方案中，唾液酸可以被选择性氧化为醛基。

选择性氧化唾液酸的方法在本领域是已知的，例如L.W.Jaques，B.F.Riesco，W.Weltner，Carbohydrate Research，83(1980)，21-32和T.Masuda，S.Shibuya，M.Arai，S.Yoshida，T.Tomozawa，A.Ohno，M.Yamashita，T.Honda，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，13(2003)，669-673。优选在与聚合物的氨基反应前进行唾液酸的氧化。

然后该任选氧化的唾液酸经其羧基与聚合物的氨基反应。

所得到的化合物包含醛基，该醛基可以进一步通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与任选氧化的唾液酸反应。

至于磷酸吡哆醛(PyP)，它是一种具有高度生物相容性的双官能化合物，也称作维生素B6。PyP是一种辅酶，其参与氨基酸侧链的氨基转移、脱羧、消旋化和很多的修饰。所有需要PyP的酶通过在氨基酸和辅酶之间形成希夫碱来发挥作用。

PyP的磷酸基可以与聚合物，优选羟烷基淀粉，特别是羟乙基淀粉的氨基反应形成磷酰胺。然后PyP的醛基可以与蛋白质的氨基反应，形成希夫碱，然后该希夫碱会被还原。在一个优选的实施方案中，该偶联物的结构是HES-NH-P(O)2-O-(吡哆醛)-CH-NH-蛋白质。

在PyP的情况中，优选通过使用如上所述的二氨基化合物向该聚合物中引入该聚合物的官能团。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与磷酸吡哆醛反应。

与包含M和Q的化合物(其中M优选是羧基或反应性羧基，并且Q是醛基或酮基或半缩醛基)反应的羟乙基淀粉，最优选是平均分子量是约10kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉。其他的可能是平均分子量是约10kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约12kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约12kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约18kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约18kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约50kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约50kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约100kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉。特别优选地，所使用的羟烷基淀粉和甚至更优选的羟乙基淀粉具有氧化型的还原端。

接着，所得到的具有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。关于聚合物的至少一个醛基或酮基或半缩醛基通过还原氨基化作用与蛋白质的至少一个氨基偶联，可以参考上文中详细公开的还原性氨基化作用的特定反应参数，例如pH或温度。根据本发明一个特别优选的实施方案，根据使用哪种G-CSF作为蛋白质，与蛋白质的氨基反应的温度是优选0到40℃，更优选0到25℃，特别优选4到21℃。反应时间优选从30分钟到72小时，更优选2到48小时，特别优选4到17小时。优选用水性介质作为反应溶剂。反应介质的pH值优选在4到9的范围内，更优选4到8，特别优选4.5到5.5。

根据第三个优选的实施方案，该聚合物在其任选氧化的还原端与至少双官能的化合物反应，该双官能化合物包含氨基M和官能团Q，其中所述氨基M与该聚合物任选氧化的还原端反应，并且其中官能团Q被化学修饰，得到可以与蛋白质的氨基通过还原氨基化作用反应的醛基官能化的聚合物衍生物。

在本发明的上下文中使用的术语“该聚合物经还原端反应”或“该聚合物经氧化的还原端反应”涉及的方法，包括羟烷基淀粉主要经其(选择性氧化的)还原端反应。该聚合物是羟烷基淀粉，特别是羟乙基淀粉。

术语“主要经其(选择性氧化的)还原端”涉及的方法，包括用于给定反应的统计学上大于50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，例如95％，96％，97％，98％，或99％的聚合物分子经每聚合物分子至少一个(选择性氧化的)还原端反应，其中经至少一个还原端反应的给定聚合物分子可以经包含在所述聚合物中的并且不是还原端的至少另外一个适当的官能团在相同的给定反应中反应。如果一个或多个聚合物分子经至少一个还原端，同时经包含在该聚合物中的并且不是还原端的至少另外一个适当的官能团反应，那么在这些聚合物分子的所有反应的官能团中，统计学上优选大于50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，例如95％，96％，97％，98％，或99％的是还原端，其中所述官能团包括还原端。

在本发明的上下文中，术语“还原端”涉及可以作为醛基和/或相应的乙缩醛的形式存在的聚合物分子的末端醛基。当还原端被氧化时，醛基或乙缩醛基为羧基和/或相应的内酯的形式。

对于官能团Q，包括如下的官能团：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；

-1，2-二醇；

-1，2-氨基-硫醇；

-叠氮化物；

-1，2-氨基醇；

-氨基-NH₂或包含结构单元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；

-羟氨基-O-NH₂，或包含结构单元-O-NH-的羟氨基衍生物，例如羟烷基氨基、羟芳基氨基、羟芳烷基氨基或羟烷芳基氨基；

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单元-NH-O-；

-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的残基，其中G是O或S，并且M是

例如：

--OH或-SH；

-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；

-烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；

-烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；

-活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单元O-N，其中N是杂芳基化合物的一部分，或其中G＝O和Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；

其中Q不存在或者是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂，或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；

-乙烯基卤化物基团，例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸(triflate)；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal，其中Hal是Cl、Br、或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含-S-S-结构的二硫基；

-基团

根据本发明一个优选的实施方案，术语“官能团Q”涉及的官能团Q包括化学结构-NH-，例如-NH₂-，或包含结构单元-NH-的氨基的衍生物，例如氨烷基、氨芳基、氨芳烷基、或烷芳氨基。

根据本发明一个优选的实施方案，官能团M是具有结构R′-NH-的基团，其中R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基，其中该环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以直接连接到NH基上，或者根据另一个实施方案，可以通过氧桥连接到NH基上。该烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以被适当地取代。优选的取代基包括卤素，例如F、Cl或Br。特别优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选氢和未取代的烷基和烷氧基。

在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。

根据本发明的另一个实施方案，官能团M具有R′-NH-R″-结构，其中R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或结构单元-SO₂-。官能团R″的具体实例是

其中，如果G出现两次，则分别独立地是O或S。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团M选自：

其中G是O或S，并且如果出现两次，则分别独立地是O或S，并且R′是甲基。

根据本发明一个特别优选的实施方案，官能团M是氨基-NH₂。

根据第一个选择，为氨基NH₂的官能团M与该聚合物的氧化的还原端反应，得到酰胺基，其连接该聚合物和包含M和Q的化合物。

根据第二个选择，为氨基NH₂的官能团M与该聚合物的未氧化的还原端通过还原氨基化作用反应，得到亚氨基，优选接着使该亚氨基氢化得到氨基，该亚氨基和氨基分别连接该聚合物和包含M和Q的化合物。在这种情况下，官能团Q可以是氨基。如果所得到的聚合物衍生物随后与至少双官能化合物反应，该反应通过羧基或反应性羧基，如下文所述，或者通过与氨基反应的该至少双官能化合物的另一个基团进行，则优选该包含M和Q的化合物是伯胺，其仅包含一个氨基作为官能团。在该特定情况下，尽管该化合物仅包含一个官能团，但仍将其视为包含M和Q的双官能化合物，其中包含在该化合物中的M是氨基并与聚合物的还原端发生还原氨基化作用，其中Q是还原氨基化作用及随后的氢化而得到的仲氨基。

根据第三个选择，该聚合物的未氧化的还原端通过还原氨基化作用与氨反应，得到聚合物的末端亚氨基，优选随后氢化该亚氨基得到聚合物的末端氨基，这样就形成了末端的伯氨基。在该特定情况下，氨被视为包含M和Q的双官能化合物，其中所使用的氨包含的M是NH₂，其中Q是还原氨基化及随后的氢化得到的伯氨基。

术语“氨基Q”涉及的官能团Q，包括化学结构-NH-，例如-NH₂-，或包含结构单元-NH-的氨基衍生物，例如氨烷基、氨芳基、氨芳烷基、或烷芳氨基。

根据本发明一个优选的实施方案，官能团Q是具有如下结构R′-NH-的基团，其中R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基，其中该环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以直接连接到NH基上，或者根据另一个实施方案，可以通过氧桥连接到NH基上。该烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以被适当地取代。优选的取代基包括卤素，例如F、Cl或Br。特别优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选氢和未取代的烷基和烷氧基。

根据本发明的另一个实施方案，官能团Q具有R′-NH-R″-结构，其中R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或结构单元-SO₂-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自

其中，如果G出现两次，则分别独立地是O或S。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团Q选自：

根据本发明一个特别优选的实施方案，官能团M是氨基-NH₂。

根据本发明另一个特别优选的实施方案，官能团M和Q都包含氨基-NH-。根据一个特别优选的实施方案，官能团M和Q都是氨基-NH₂。

根据本发明一个优选的实施方案，该包含M和Q的化合物是同型双官能化合物，更优选是包含M和Q、最优选氨基-NH₂作为官能团的同型双官能化合物，或根据另一个实施方案，是羟氨基-O-NH₂，或基团

其中G优选是O。这些包含M和Q的化合物的实例是

与包含M，其中M优选是氨基-NH-，更优选是氨基-NH₂，更优选M和Q都包含氨基-NH-，特别优选M和Q都包含氨基-NH₂的化合物反应的羟乙基淀粉，优选是平均分子量是约10kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约10kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉。也可能是平均分子量是约12kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约12kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约18kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约18kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约50kD并且DS是约0.4的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约50kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉，或者平均分子量是约100kD并且DS是约0.7的羟乙基淀粉。

在M和Q都是氨基-NH₂的情况中，M和Q可以用任何适当的间隔基分开。其中，该间隔基可以是任选取代的直链、支链和/或环状的烃残基。一般地，该烃残基具有1到60，优选1到40，更优选1到20，更优选2到10，更优选2到6，特别优选2到4个碳原子。如果存在杂原子，该间隔基通常包含1到20，优选1到8，特别优选1到4个杂原子。该烃残基可以包含具有例如5到7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直链和/或环烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有1到20，优选2到10，更优选2到6，特别优选2到4个碳原子的烷基链。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与1，4-一氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反应，得到聚合物衍生物。

包含M和Q的至少双官能化合物与该聚合物的反应优选在0到100℃，更优选4到80℃，特别优选20到80℃的温度下进行；反应时间优选为4小时到7天，更优选10小时到5天，特别优选17小时到4天。至少双官能化合物∶聚合物的摩尔比优选是10到200，特别是50到100。

作为至少双官能化合物和聚合物的反应溶剂，优选至少一种非质子溶剂，特别优选含水含量不超过0.5％重量，优选不超过0.1％重量的无水非质子溶剂。其中适当的溶剂包括二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

作为至少双官能化合物和聚合物的反应溶剂，也可以使用水性介质。

根据一个优选的实施方案，包含该聚合物和至少双官能化合物的该聚合物衍生物在游离的官能团Q上被化学修饰，得到包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物。根据该实施方案，优选该聚合物衍生物与至少一种至少双官能的化合物反应，其中至少双官能的化合物包含能与官能团Q反应的官能团和醛基或酮基或半缩醛基。

作为至少双官能化合物，具有醛基或酮基或半缩醛基和至少一个能与聚合物衍生物的官能团Q形成键的官能团的每个化合物都是适合的。该至少一个官能团选自与官能团Q相同的组，并且选择可以与Q反应的官能团。在优选的情况中，Q是氨基-NH₂-或包含结构单元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基，优选所使用一种化合物，其除了具有醛基或酮基或半缩醛基外，还具有至少一个羧基或至少一个反应性羧基，优选一个羧基或一个反应性羧基。醛基或酮基或半缩醛基和羧基或反应性羧基可以用任何适当的间隔基分开。其中，该间隔基可以是任选取代的直链、支链和/或环状的烃残基。一般地，该烃残基具有1到60，优选1到40，更优选1到20，更优选2到10，更优选2到6，特别优选2到4个碳原子。如果存在杂原子，该间隔基通常包含1到20，优选1到8，特别优选1到4个杂原子。该烃残基可以包含具有例如5到7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直链和/或环烷基。

根据一个优选的实施方案，该烃残基是具有2到6个，优选2到4个碳原子的烷基。在醛基或酮基与羧基之间不存在碳原子也是可能的。可选择地，该烃残基可以是具有3到11个碳原子，优选3到6或3到5个碳原子的取代或未取代的环烃基。当环烃基被取代时，取代基可以选自取代或未取代的氨基或烷氧基。如果存在，取代基的数目优选是1到3。进一步地，该烷基和/或环烃基可以包含一个或多个杂原子，例如O或S，特别是O。在这种情况中，优选存在1到3，特别是1到2个杂原子。在本文中优选的化合物选自下列的化合物：

R＝H、烷基、芳基、酰基、SiR’₃

R’＝烷基、芳基

根据一个甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有5到7，优选6个碳原子的芳基残基。更优选地，该烃残基是苯残基。根据该优选的实施方案，该羧基和醛基可以位于苯环的1，4-位、1，3-位或1，2-位，优选1，4-位。

至于反应性羧基，包括反应性酯、异硫氰酸酯或异氰酸酯。优选的反应性酯来源于N-羟基琥珀酰亚胺类例如N-羟基琥珀酰亚胺或硫代-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类例如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟基唑类例如羟基苯并三唑。特别优选的是N-羟基琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和硫代-N-羟基琥珀酰亚胺。所有的醇可以单独使用或者可以其中两种或几种适当组合使用。作为反应性酯，特别优选五氟苯酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯。

根据一个特别的实施方案，能与官能团Q形成化学键的官能团是反应性羧基，其中Q优选是NH₂，或包含结构单元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基，特别是NH₂。

在这种情况中，能与官能团Q形成化学键并且是羧基的该官能团可以适当地反应，得到如上所述的反应性羧基。因此，优选包含羧基和醛基或酮基或半缩醛基的至少一个至少双官能化合物发生反应，其中羧基转变成反应性羧基，纯化得到的至少双官能化合物并与聚合物衍生物的官能团Q反应。

包含能反应得到反应性羧基的羧基的至少双官能化合物的实例是上文所列的化合物1到11。在本文中，术语“羧基”也涉及二羧酸化合物的内酯和内酐。

因此根据一个优选的实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰苯甲酸反应，其中Q是氨基-NH₂，或包含结构单元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基。

根据另一个实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰苯甲酸五氟苯基酯反应，其中Q是氨基。

根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，其中Q是氨基。

根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该包含Q的聚合物衍生物进一步与4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反应，其中Q是氨基。

对于α-酮基羧酸，优选是由氨基酸衍生的α-酮基羧酸，在大多数情况下可以在人体内发现。优选的由氨基酸衍生的α-酮基羧酸选自酮基-缬氨酸、酮基-亮氨酸、酮基-异亮氨酸和酮基-丙氨酸。α-酮基羧酸中的羧基与该聚合物的基团Q反应，其中Q为氨基。这样就形成了酰胺基。然后α-酮基羧酸剩余的游离酮基可以与蛋白质的官能团，特别是氨基反应。这样形成了可以氢化的亚氨基。

至于唾液酸或其衍生物，优选其是生物相容性的。特别地，它们是在体内可以发现的N-和/或O-乙酰化的糖类。在一个优选的实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸。由于吡喃糖结构，这些化合物显示出了所需要的刚性，以实现作为间隔基的功能。另一方面，通过选择性氧化向这些化合物中引入醛基也是可能的。在人体内可以发现唾液酸，例如在糖基化蛋白的聚糖链中作为末端单糖。

选择性氧化唾液酸的方法在本领域是已知的，例如L.W.Jaques，B.F.Riesco，W.Weltner，Carbohydrate Research，83(1980)，21-32和T.Masuda，S.Shibuya，M.Arai，S.Yoshida，T.Tomozawa，A.Ohno，M.Yamashita，T.Honda，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，13(2003)，669-673。优选地可以在与聚合物的氨基反应前进行唾液酸的氧化。

然后该任选氧化的唾液酸经其羧酸基与聚合物的氨基反应。

PyP的磷酸基可以与聚合物、优选羟烷基淀粉、特别是羟乙基淀粉的氨基反应形成磷酰胺。然后PyP的醛基可以与蛋白质的氨基反应，形成希夫碱，然后该希夫碱可以被还原。在一个优选的实施方案中，该偶联物的结构是HES-NH-P(O)2-O-(吡哆醛)-CH-NH-蛋白质。

作为包含氨基和例如甲酰苯甲酸的聚合物衍生物的反应溶剂，优选至少一种非质子溶剂或至少一种极性溶剂。其中适当的溶剂包括水、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

作为包含氨基的聚合物衍生物和包含羧基的至少双官能化合物的反应溶剂，也可以使用水性介质。在本发明的上下文中使用的术语“水性介质”涉及一种溶剂或溶剂的混合物，以所包含溶剂的重量为基准，其包含水的含量为至少10％重量或至少20％重量或至少30％重量或至少40％重量或至少50％重量或至少60％重量或至少70％重量或至少80％重量或至少90％重量或高达100％重量。

该反应的温度优选是0到40℃，更优选0到25℃，特别优选15到25℃。反应时间优选0.5到24小时，特别优选1到17小时。

根据一个优选的实施方案，该反应在活化剂存在条件下进行。适当的活化剂包括，碳二亚胺类例如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，特别优选二异丙基碳二亚胺(DIC)。

用至少一种适当的方法从反应混合物中纯化所得到的聚合物衍生物。如果需要，可以在用至少一种适当的方法分离前沉淀该聚合物衍生物。

可以用包含一个或多个步骤的适当方法来进行聚合物衍生物的分离。根据本发明一个优选的实施方案，用适当的方法例如离心分离或过滤将该聚合物衍生物首先从该反应混合物或该反应混合物与例如水2-丙醇混合物的混合物中分离出来。第二步，可以对分离出来的聚合物衍生物进行进一步处理，例如后处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换色谱、反相色谱法、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冷冻干燥。根据一个甚至更优选的实施方案，将分离出来的聚合物衍生物首先进行透析，优选在水中透析，然后冷冻干燥直至反应产物中的溶剂含量根据所需的产物规格显著地降低。冷冻干燥可以在20到35℃，优选20到30℃的温度下进行。

接着，所得到的具有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。关于至少一个醛基或酮基或半缩醛基通过还原氨基化作用与蛋白质的至少一个氨基偶联，可以参考上文中详细公开的还原氨基化作用的特定反应参数，例如pH或温度。根据本发明一个特别优选的实施方案，根据使用哪种G-CSF作为蛋白质，该还原氨基化作用进行的温度是0到10℃，如1到8℃，或2到6℃，例如4℃，pH是约4.5到5.5，例如5。反应时间是约10到20小时例如12到19小时，或14到18小时例如约17小时，或20到30小时例如约24小时。根据本发明特别优选的实施方案，根据所用的蛋白质为rhIL 2、rhIL 3、rhIFNα、rhIFNβ、rhEPO、rhAT III、BSA、肌红蛋白和SOD，该还原氨基化作用的温度优选是0到5℃，例如约4℃，pH为约4.5到5.5，例如约5.0，反应时间为约20到30小时，例如约24小时。

因此，根据上述优选的实施方案，在聚合物通过其氧化的还原端反应的情况下，本发明也涉及根据下列通式的偶联物：

根据一个特别优选的实施方案，如上所述，该聚合物是羟乙基淀粉，即HAS′是HES′，并且n＝2，3或4，最优选4。因此，在聚合物通过其氧化的还原端反应的情况下，本发明也涉及根据下列通式的偶联物：

根据另一个优选的实施方案，在聚合物通过其氧化的还原端反应的情况下，本发明也涉及根据下列通式的偶联物：

其中n＝2，3，或4，R₄独立地是氢或甲氧基，并且如果R₄是氢则m＝0，如果R₄是甲氧基则m＝1，HAS优选是HES′。

在上述的每个通式中，与蛋白质连接的氮来源于蛋白质的氨基，聚合物衍生物通过醛基与该蛋白质连接。

根据上述的实施方案，其中官能团M和Q包含氨基-NH₂，也可以M是氨基-NH₂，Q包含β羟氨基-CH(OH)-CH₂-NH₂并优选是β羟氨基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含两个氨基M和Q的化合物中的氨基Q是β羟氨基-CH(OH)-CH₂-NH₂。

在这种情况下，M和Q可以用任何适当的间隔基分开。其中，该间隔基可以是任选取代的直链、支链和/或环状的烃残基。一般地，该烃残基具有1到60，优选1到40，更优选1到20，更优选2到10，更优选1到6，特别优选1到2个碳原子。如果存在杂原子，该间隔基通常包含1到20，优选1到8，特别优选1到4个杂原子。该烃残基可以包含具有例如5到7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直链和/或环烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有1到20，优选1到10，更优选1到6，更优选1到4，特别优选1到2个碳原子的烷基链。更优选地，M和Q用亚甲基隔开。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与1，3-二氨基-2-羟丙烷反应。

在聚合物通过其氧化的还原末端反应的情况下，根据通式的聚合物衍生物形成了

特别优选HAS′＝HES′。

包含M和Q的至少双官能化合物，特别优选1，3-二氨基-2-羟丙烷，与聚合物反应的优选温度是40到120℃，更优选40到90℃，特别优选60到80℃。反应时间优选17到168小时，更优选17到96小时，特别优选48到96小时。至少双官能化合物∶聚合物的摩尔比优选是200∶1到10∶1，特别是50∶1到100∶1。

作为至少双官能化合物和聚合物的反应溶剂，优选是至少一种非质子溶剂，优选含水不超过0.5％重量，优选不超过0.1％重量的无水非质子溶剂。其中适当的溶剂包括二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

聚合物衍生物的β羟氨基Q一般可与至少双官能化合物反应，该至少双官能化合物包含至少一个能与Q反应的官能团，并进一步包含至少一个是醛基或酮基或半缩醛基的官能团或者能修饰成醛基或酮基或半缩醛基的官能团。根据本发明另一个实施方案，直接通过化学氧化来化学修饰β羟氨基，得到醛基。

该氧化反应可以使用所有能把β羟氨基转变成醛基的适当的氧化剂。优选的氧化剂是高碘酸盐，例如碱金属的高碘酸盐。特别优选高碘酸钠，优选使用其水溶液。该溶液具有的碘酸盐浓度优选是1到50mM，更优选1到25mM，特别优选1到10mM。氧化反应的温度是0到40℃，优选0到25℃，特别优选4到20℃。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中β羟氨基Q的氧化作用是使用高碘酸盐进行的。

因此，本发明也涉及一种制备偶联物的方法，其中当使用的聚合物具有氧化的还原端时，优选用高碘酸盐氧化具有β羟氨基的聚合物衍生物，特别优选

并且特别是HAS′＝HES′，得到具有醛基的聚合物衍生物，特别优选

并且特别是HAS′＝HES′。

根据本发明，也可以用包含1-氨基-2羟基结构的上述化合物与包含羧基或反应性羧基和醛基、酮基或半缩醛基的上述至少双官能化合物反应，得到可以与蛋白质的氨基进行还原氨基化作用的聚合物衍生物。

所得到的具有醛基A的聚合物衍生物随后与蛋白质反应。因此，本发明也涉及一种制备偶联物的方法，所述方法包括具有β羟氨基的聚合物衍生物与蛋白质的氨基反应，当所使用的聚合物具有氧化的还原端时，特别优选根据下式

并且，特别是HAS′＝HES′。

所得到的具有醛基的聚合物衍生物随后通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。对于蛋白质的至少一个氨基与聚合物的至少一个醛基通过还原氨基化作用的偶联，可以参考上述详细公开的内容。

因此，根据上述的优选实施方案，本发明也涉及一种如下通式的偶联物

特别是HAS′＝HES′，当所使用的聚合物具有氧化的还原端时。在上述通式中，与蛋白质连接的氮来源于蛋白质的氨基，聚合物衍生物通过醛基与该蛋白质连接。

根据本发明的另一个实施方案，聚合物先与合适的化合物反应，产生包含至少一个反应性羧基的第一聚合物衍生物。该第一聚合物衍生物再与另一种至少双官能化合物反应，其中该另一种化合物的至少一个官能团与聚合物衍生物的至少一个反应性羧基反应，并且该另一种化合物的至少另一个官能团是醛基或酮基或半缩醛基，或者是化学修饰成醛基或酮基或半缩醛基的官能团，其中所得到的包含该醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物，如上所述，通过还原氨基化作用，与蛋白质的至少一个氨基反应。也可以改变各化合物的相互反应顺序。

根据该另一个实施方案的第一种替代方案，包含至少一个反应性羧基的聚合物的制备方法包括，在聚合物的还原端选择性氧化该聚合物，然后使氧化的聚合物与合适的化合物反应，该氧化的聚合物为内酯

和/或羧酸

或羧酸的合适的盐例如碱金属盐，优选钠盐和/或钾盐，且HAS′优选为HES′，得到包含至少一个反应性羧基的化合物。

该聚合物、优选羟乙基淀粉的氧化可以根据得到上述结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法组合来进行。

虽然氧化反应可根据所有得到羟烷基淀粉的氧化的还原端的所有适宜方法进行，但优选如DE 196 28 705 A1所述采用碱性碘溶液进行，将该文献的内容(实施例A，第9栏，第6至24行)在此引入作为参考。

向在还原端已选择性氧化的聚合物中引入反应性羧基可以采用所有可能的方法和所有合适的化合物进行。

根据本发明一个特别的方法，在还原端已选择性氧化的聚合物在其氧化的还原端与至少一种醇反应，优选与至少一种酸性醇，如25℃下的pK_A值为6到12或7到11的酸性醇反应。该酸性醇的分子量可以是80到500克/摩尔，如100到200克/摩尔。

合适的酸性醇是所有具有酸性质子并能与氧化的聚合物反应形成各自反应性聚合物酯的醇H-O-R_A，优选如下式

更优选如下式

优选的醇是N-羟基琥珀酰亚胺类例如N-羟基琥珀酰亚胺或硫代-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类例如对硝基苯酚、邻，对二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟基唑类例如羟基苯并三唑。特别优选的是N-羟基琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和硫代-N-羟基琥珀酰亚胺。所有的醇可以单独使用或者可以两种或几种适当组合使用。在本发明的上下文中，也可以使用例如通过添加碳酸的二酯而释放各自的醇的化合物。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法，其中在还原端被选择性氧化的聚合物通过该氧化的聚合物与酸性醇，优选与N-羟基琥珀酰亚胺和/或硫代-N-羟基琥珀酰亚胺反应而活化。

根据本发明一个优选的实施方案，还原端被选择性氧化的聚合物与至少一种碳酸二酯R_B-O-(C＝O)-O-R_C反应，其中R_B与R_C可相同或不同。优选地，该方法产生如下式的反应性聚合物

其中HAS′优选为HES′。

作为合适的碳酸二酯化合物，可使用的化合物其醇成分分别独立地是N-羟基琥珀酰亚胺类例如N-羟基琥珀酰亚胺或硫代-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类例如对硝基苯酚、邻，对二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟基唑类例如羟基苯并三唑。特别优选的是N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和硫代-N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，特别优选N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法，其中在还原端被选择性氧化的聚合物通过该氧化的聚合物与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应而活化。

酸性醇与氧化的聚合物或氧化的聚合物的盐反应，酸性醇∶聚合物的摩尔比优选是5∶1到50∶1，更优选8∶1到20∶1，优选的反应温度是2到40℃，更优选10到30℃，特别优选15到25℃。反应时间优选是1到10小时，更优选2到5小时，更优选2到4小时，特别是2到3小时。

碳酸二酯化合物与氧化的聚合物或氧化的聚合物的盐反应，二酯化合物∶聚合物的摩尔比一般为1∶1到3∶1，例如1∶1到1.5∶1。反应时间一般是0.1到12小时，例如0.2到6小时，或0.5到2小时，或0.75到1.25小时。

根据本发明一个优选的实施方案，氧化的聚合物与酸性醇和/或碳酸二酯的反应在至少一种非质子溶剂，如含水不超过0.5％重量，优选不超过0.1％重量的无水非质子溶剂中进行。其中适当的溶剂包括二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。优选反应温度是2到40℃，更优选10到30℃。

氧化的聚合物与至少一种酸性醇的反应中，可以使用至少另一种活化剂。

适当的活化剂包括，羰二咪唑、碳二亚胺类例如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，特别优选二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。

因此本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原端被氧化的聚合物与酸性醇在另一种活化剂存在下反应，得到反应性聚合物酯。

根据本发明的一个实施方案，氧化的聚合物与碳酸二酯和/或酸性醇的反应在低碱活性下进行，其中该低碱活性可以通过按10∶1的水∶反应混合物的体积比例将混合物加入水中来确定。在添加前，基本上不包含缓冲液的水在25℃下pH值为7。添加反应混合物后测定pH值，反应混合物的碱活性值优选不超过9.0，更优选不超过8.0，特别优选不超过7.5。

根据本发明的另一个实施方案，该氧化的聚合物与N-羟基琥珀酰亚胺在干燥DMA中，在没有水的条件下，与EDC反应，选择性得到如下式的聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯

更优选HAS′是HES′。

令人惊讶的是，该反应不会得到由EDC与HES的OH基团反应而产生的副产物，并且意外地抑制了EDC与氧化聚合物形成的O-酰基异脲分别成为各自N-酰基脲的重排反应。

根据本发明的另一个优选实施方案，该氧化的聚合物与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在干燥DMA中，在没有水和活化剂的条件下反应，选择性得到如下式的聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯

更优选HAS′是HES′。

根据本发明另一个实施方案，还原端被选择性氧化的聚合物在氧化的还原端处与唑化物例如羰二咪唑或羰基二苯并咪唑反应，得到具有反应性羧基的聚合物。如果使用羰二咪唑，得到如下式的反应性咪唑聚合物衍生物

优选HAS′是HES′。

根据本发明所述另一个实施方案的第二种替代方案，要向聚合物中引入至少一个反应性羧基，通过聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应向还原端未氧化的聚合物中引入该反应性羧基。

因此，本发明也涉及一种方法和偶联物，其中通过聚合物的至少一个羟基和至少一种碳酸二酯R_B-O-(C＝O)-O-R_C反应，其中R_B与R_C可相同或不同，以向还原端未氧化的聚合物中引入反应性羧基。

根据本发明的另一个实施方案，还原端未氧化的聚合物在至少一个羟基上与唑化物例如羰二咪唑、羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并咪唑反应，得到具有反应性羧基的聚合物。

作为合适的碳酸二酯化合物，可使用的化合物其醇成分分别独立地是N-羟基琥珀酰亚胺类例如N-羟基琥珀酰亚胺或硫代-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类例如对硝基苯酚、邻，对二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟基唑类例如羟基苯并三唑。

特别优选对称的碳酸二酯化合物，因此R_B与R_C相同。碳酸二酯的醇组分优选选自N-羟基琥珀酰亚胺、磺化的N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑，和硝基-和卤素-取代的苯酚。其中优选硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。特别优选的是N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和硫代-N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。

因此，本发明也涉及一种羟烷基淀粉衍生物，优选羟乙基淀粉衍生物，其中所述淀粉的至少一个羟基，优选至少两个羟基经与碳酸二酯化合物反应而得到各自的反应性酯。

根据本发明的一个实施方案，还原端未氧化的聚合物与至少一个碳酸二酯化合物的反应温度是2到40℃，更优选10到30℃，特别是15到25℃。优选的反应时间是0.5到5小时，更优选1到3小时，特别优选2到3小时。

碳酸二酯化合物∶聚合物的摩尔比取决于聚合物的取代程度，即与碳酸二酯化合物反应的羟基数与未反应的聚合物中羟基数的相对比例。

根据本发明的一个实施方案，碳酸二酯化合物∶聚合物的脱水葡萄糖单元的摩尔比是1∶2到1∶1000，更优选1∶3到1∶100，特别优选1∶10到1∶50，所得到的取代程度是0.5到0.001，优选0.33到0.01，特别优选0.1到0.02。

根据本发明的一个实施方案，还原端未氧化的聚合物与碳酸二酯的反应在至少一种非质子溶剂，特别优选在含水不超过0.5％重量，优选不超过0.1％重量的无水非质子溶剂中进行。其中适当的溶剂包括二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

因此本发明也涉及一种如上所述的方法，其中还原端未氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应得到反应性羧基是在无水非质子溶剂中进行的，该溶剂优选是二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。

包含至少一个反应性羧基的反应性聚合物衍生物，其优选如上所述由聚合物与酸性醇、碳酸酯和/或唑化物反应得到，进一步与另一种至少双官能化合物反应，其中该另一种化合物的至少一个官能团F₁与聚合物衍生物的至少一个反应性羧基反应。该另一种化合物的至少一个官能团F₁没有明确的限制，只要可与聚合物的至少一个反应性羧基反应即可。优选的官能团F₁是例如，氨基或羟基或硫基或羧基。

该另一种至少双官能化合物包含至少另一个是醛基的官能团F₂或能化学修饰成醛基的官能团F₂。该化学修饰可以是，例如，官能团F₂与另一种连接化合物的官能团F₃反应，或氧化或还原合适的官能团F₂。

如果F₂与另一种化合物的官能团F₃反应，官能团F₂特别可选自：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；

-1，2-二醇；

-1，2-氨基醇；

-1，2-氨基硫醇；

-叠氮化物；

-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的残基，其中G是O或S，并且M是

例如：

--OH或-SH；

-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；

-烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；

其中Q不存在或者是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂，或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal是Cl、Br、或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含-S-S-结构的二硫基；

-基团

基团

其中F₃是能与上述基团之一形成化学键的基团，其优选选自上述基团。此外，第二连接化合物优选具有至少一个可与蛋白质的氨基通过还原氨基化反应的醛基或酮基或半羧醛基。

与聚合物反应的该至少双官能连接化合物的官能团F₁和醛基或酮基或半缩醛基，和/或与聚合物反应的该至少双官能连接化合物中的官能团F₁和F₂，和/或该另一种至少双官能连接化合物中的官能团F₃与醛基或酮基或半缩醛基，可分别利用任何合适的间隔基分隔。其中该间隔基可以是任选取代的直链、支链和/或环状的烃残基。一般地，该烃残基具有至多60，优选至多40，更优选至多20，更优选至多10个碳原子。如果存在杂原子，该间隔基通常包含1到20，优选1到8，更优选1到6，更优选1到4，特别优选1到2个杂原子。优选该杂原子是O。该烃残基可以包含具有例如5到7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直链和/或环烷基。

具有官能团F1和F2的化合物的实例有例如：具有2至20个碳原子的任选取代的二氨基烷，特别优选1，2-二氨基乙烷、1，3-二氨基丙烷、和1，4-二氨基丁烷。具有官能团F₃和醛基或酮基或半缩醛基的优选化合物的实例是例如甲酰基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰基苯甲酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯和4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸，或者选自α-酮基羧酸、神经氨酸或其衍生物及磷酸吡哆醛的生物相容性化合物。

根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与双官能化合物反应，其中该双官能化合物是选自α-酮基羧酸、神经氨酸或唾液酸或其衍生物及磷酸吡哆醛的生物相容性化合物。

对于α-酮基羧酸，优选是由氨基酸衍生的α-酮基羧酸，在大多数情况下也可以在人体内发现。优选的由氨基酸衍生的α-酮基羧酸选自酮基-缬氨酸、酮基-亮氨酸、酮基-异亮氨酸和酮基-丙氨酸。α-酮基羧酸中的羧基与该聚合物的基团Q反应，其中Q为氨基。于是形成了酰胺基。然后α-酮基羧酸剩余的游离酮基与蛋白质的官能团，特别是氨基反应。于是形成了可以氢化的亚氨基。

然后该任选氧化的唾液酸可以经其羧基与聚合物的氨基反应。

PyP的磷酸基可以与聚合物、优选羟烷基淀粉、特别优选羟乙基淀粉的氨基反应形成磷酰胺。然后PyP的醛基可以与蛋白质的氨基反应，形成希夫碱，然后该希夫碱可被还原。在一个优选的实施方案中，该偶联物的结构是HES-NH-P(O)2-O-(吡哆醛)-CH-NH-蛋白质。

因此，本发明也涉及一种制备偶联物的方法，所述方法包括使聚合物，优选羟乙基淀粉，在其任选被氧化的还原端与选自酸性醇、碳酸二酯和唑化物的化合物反应，得到具有至少一个反应性羧基的聚合物衍生物，所述聚合物衍生物与至少一种至少双官能化合物反应，得到具有醛基或酮基或半缩醛基或者能经化学修饰得到醛基或酮基或半缩醛基的官能团的聚合物衍生物，任选化学修饰所述官能团得到包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物，再由该包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物与蛋白质的氨基通过还原氨基化作用反应。

因此，本发明也涉及一种偶联物，其包含聚合物，优选羟乙基淀粉，和彼此共价连接的蛋白质，该偶联物可通过制备偶联物的方法获得，该方法包括，聚合物在它任选被氧化的还原端与选自酸性醇、碳酸二酯和唑化物的化合物反应，得到具有至少一个反应性羧基的聚合物衍生物，所述聚合物衍生物与至少一种至少双官能化合物反应，得到具有醛基或酮基或半缩醛基或者能经化学修饰得到醛基或酮基或半缩醛基的官能团的聚合物衍生物，任选化学修饰所述官能团得到包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物，再由该包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物与蛋白质的氨基通过还原氨基化作用反应。

具有官能团F₁和被氧化而得到醛基的官能团F₂的化合物的具体的例子是，例如具有氨基作为F₁以及β羟氨基作为F₂的化合物。一个特别优选的例子是1，3-二氨基-2-羟基丙烷。该氧化反应可以使用所有可将β羟氨基转化成醛基的合适的氧化剂来进行。优选的氧化剂是高碘酸盐，例如碱金属的高碘酸盐。特别优选高碘酸钠，优选使用其水溶液。该溶液具有的碘酸盐浓度优选是1到50mM，更优选1到25mM，特别优选1到10mM。氧化反应的温度是0到40℃，优选0到25℃，特别优选4到20℃。

可以用至少一种适当的方法从反应混合物中纯化所得到的聚合物衍生物。如果需要，可以在用至少一种适当的方法分离前沉淀该聚合物衍生物。

本发明也涉及一种包含羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物，其中羟烷基淀粉用它的氧化的还原端经酰胺键与第一交联化合物偶联，所述交联化合物还经酰胺键与第二交联化合物连接，所述第二交联化合物经偶氮甲碱和/或氨基键与蛋白质连接，其中所使用的第一交联化合物是二氨基官能化化合物并且所使用的第二交联化合物优选是羧基和醛基或酮基或半缩醛基，更优选是羧基和醛基官能化化合物。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂、和R₃分别独立地是氢或具有1到10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，并且

其中L是任选取代的、直链、支链和/或环状的烃残基，任选包含至少一个杂原子，具有1到60，优选1到40，更优选1到20，更优选1到10，更优选1到6，更优选1到2个碳原子，特别优选1个碳原子，L特别是CH₂。

其中L₁和L₂独立地是任选取代的、直链、支链和/或环状的烃残基，任选包含至少一个杂原子，包含烷基、芳基、芳烷基杂烷基、和/或杂芳烷基部分，所述残基具有1到60，优选1到40，更优选1到20，更优选1到10个碳原子，并且

其中D是一个键，优选是通过适当的官能团F₂与L₁连接和适当的官能团F₃与L₂连接而形成的共价键。

本发明也涉及如上所述的偶联物，其中L₁是-(CH₂)_n-，其中n＝2，3，4，5，6，7，8，9，10，优选是2，3，4，5，6，更优选2，3，4，特别优选4。

本发明也涉及如上所述的偶联物，其中L₂包含任选适当取代的芳基部分，优选芳基部分包含6个碳原子，特别优选L₂是C₆H₄。

本发明也涉及如上所述的偶联物，其中F₂选自下列基团：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；

-1，2-二醇；

-1，2-氨基硫醇；

-叠氮化物；

-1，2-氨基醇；

-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的残基，其中G是O或S，并且M是

例如：

--OH或-SH；

-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；

-烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；

其中Q不存在或者是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂，或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal是Cl、Br、或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含-S-S-结构的二硫基；

-基团

-基团

其中F₃是能与F₂形成化学键的官能团，优选选自上述的基团，F₂优选包含-NH-部分，更优选包含氨基，F₃优选包含-(C＝G)-部分，更优选-(C＝O)-部分，更优选-(C＝G)-G-部分，更优选-(C＝O)-G-部分，特别优选-(C＝O)-O，D特别优选是酰胺键。

本发明也涉及如上所述的偶联物，其具有如下式的结构：

n＝2，3，或4，R₄独立地是氢或甲氧基，并且如果R₄是氢则m＝0，如果R₄是甲氧基则m＝1。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)并且该蛋白质是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，具有如下式的结构：

其中-CH₂-N2-部分的碳原子来源于醛基，该醛基是通过开环氧化反应引入到该聚合物中的，并且其中氮原子来源于蛋白质的氨基。

本发明也涉及如上所述的偶联物，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。

本发明也涉及如上所述的任意的偶联物，其中羟乙基淀粉的分子量为2到200kD，优选4到130kD，更优选4到70kD。

本发明也涉及如上所述的偶联物，其中该蛋白质选自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、AT III、IL-2、IL-3、肌红蛋白、SOD和BSA，优选选自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhAT III、rhIL-2、rhIL-3、肌红蛋白、SOD、和BSA，和/或A1AT、因子VII、因子VIII、因子IX、tPA和APC。

在制备本发明的偶联物的方法中，上述方法的转化率是至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，特别是95％或更多，例如至少98％或99％。

根据本发明的偶联物可以是至少50％纯度，甚至更优选至少70％纯度，甚至更优选至少90％，特别是至少95％或至少99％纯度。在最优选的实施方案中，该偶联物是100％纯度，即，不存在其他的副产物。

因此，根据另一个方面，本发明也涉及一种包含本发明的偶联物的组合物，其中该偶联物的量可以是至少50wt-％，甚至更优选至少70wt-％，甚至更优选至少90wt-％，特别是至少95wt-％或至少99wt-％。在一个最优选的实施方案，该组合物由偶联物组成，即偶联物的量是100wt.-％。

根据另一个方面，本发明也涉及一种如上所述的偶联物或用所述方法得到的偶联物，在用于治疗人或动物体的方法中应用。

因此，本发明涉及一种药物组合物，包含治疗有效量的如上所述的偶联物或用如上所述的方法得到的偶联物。

在本发明的上下文中，术语“治疗有效量”是指对于给定条件和给药方案提供治疗效果的量。

因此，在一个优选的实施方案中，该药物组合物进一步包含至少一种药学可接受的稀释剂、佐剂和/或载体。优选地，该药学可接受的稀释剂、佐剂和/或载体特别用于IFNα、IFNβ、EPO、AT III、G-CSF、APC、A1AT、tPA、因子VII、因子VIII或因子IX治疗中。

本发明的所有蛋白质-HAS偶联物优选通过静脉内、皮下或肌肉内途径给药。所选择的具体途径取决于所要治疗的情况。优选地，该偶联物可以与适当的载体，例如本领域已知的载体(例如，在第一代/未修饰的无白蛋白或含白蛋白生物药物中用作赋形剂)、适当的稀释剂，例如用于静脉内、皮下或肌肉内给药的无菌溶液一起给药。所需要的剂量取决于所要治疗情况的严重性、患者的个体应答、所用的给药方法等等。本领域技术人员可以根据他的常规知识确定正确的剂量。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是EPO，在制备用于治疗贫血性疾病或相关的造血机能障碍疾病或病症的药物中的应用。

红细胞生成素同种型的给药优选采用胃肠外途径。所选择的具体途径取决于所要治疗的情况。红细胞生成素同种型的给药优选作为制剂的一部分来完成，该制剂包含适当的载体例如人血清白蛋白、适当的稀释剂例如缓冲盐溶液、和/或适当的佐剂。所需的剂量可以足够地提高患者的血细胞比容，可以根据所要治疗情况的严重性、所用的给药方法等等而不同。用本发明的药物组合物治疗的目的优选使血中血红蛋白值的增加超过6.8mmol/l。为此，可以利用使血红蛋白值每周增加0.6mmol/l到1.6mmol/l的方法来进行该药物组合物的给药。如果血红蛋白值超过8.7mmol/l，优选应当中止该治疗，直至血红蛋白值低于8.1mmol/l。本发明的组合物优选用于适合皮下或静脉或胃肠外注射的制剂中。对此适宜的稀释剂和载体是，例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯酸纳、聚山梨酯80、HAS和注射用水。该组合物可以一周三次给药，优选一周两次，更优选一周一次，最优选两周一次。优选地，该药物组合物的给药量是0.01-10μg/kg患者体重，更优选0.1到5μg/kg，0.1到1μg/kg，或0.2到0.9μg/kg，最优选0.3-0.7μg/kg，最优选0.4-0.6μg/kg体重。一般地，优选每剂量给药为10μg到200μg，优选15μg到100μg。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是G-CSF，在制备用于治疗以造血或免疫功能降低为特征的疾病的药物中的应用，其中所述疾病优选是化学治疗、放射治疗、传染性疾病、重度慢性粒细胞减少症、或白血病的结果。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是因子VIII，在制备用于治疗血友病A的药物中的应用。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-AT III偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，在制备用于治疗AT III遗传性缺乏、静脉闭塞性疾病、烧伤和冠状动脉旁路移植(CABG)术中的肝素耐受、由外伤或胃肠手术导致的肠穿孔、弥散性血管内凝血(DIC)和/或败血症，和预防与通气治疗有关的微血块形成的药物中的应用。因此包含本发明HAS-AT III偶联物的该药物组合物可以用于上述目的。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是A1AT，在制备用于治疗肺气肿、囊性纤维化、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、和/或支气管炎的药物中的应用。因此包含本发明HAS-A1AT-偶联物的该药物组合物可以用于上述目的。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是tPA，在制备用于治疗心肌梗塞(心脏病发作)、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病，特别是闭塞性动脉疾病的药物中的应用。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是APC，在制备用于治疗重度败血症、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病，特别是闭塞性动脉疾病的药物中的应用。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是IFNα，在制备用于治疗白血病例如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、癌症例如类癌瘤、恶性黑色素瘤和肝炎例如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的药物中的应用。

根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是IFNβ，在制备用于治疗多发性硬化症，优选复发型多发性硬化症的药物中的应用。

本发明也涉及HAS-因子VII偶联物在制备用于和因子VIII或因子IX的抑制剂一起治疗血友病A或B患者发作的药物中的应用。

本发明也涉及HAS-因子IX偶联物在制备用于控制和预防血友病B(例如先天性因子IX缺乏或克里斯马斯病)患者的出血性发作，包括控制和预防在外科环境中的出血的药物中的应用。

本发明将通过下面的附图、表格和实施例进行解释说明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

附图1a

图1a显示根据实施例2.1(a)制备的HES-G-CSF偶联物Neupogen的SDS page分析。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBluePlus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。

泳道B：如实施例2.1(a)所述的G-CSF(Neupogen)与HES偶联后的粗产物。

泳道C：G-CSF起始物。

附图1b

图1b显示根据实施例2.1(a)制备的HES-G-CSF偶联物Granocyte的SDS page分析。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道B：如实施例2.1(a)所述的G-CSF(Granocyte)与HES偶联后的粗产物。

泳道C：G-CSF起始物。

附图2

图2显示根据实施例2.1(b)制备的HES-G-CSF偶联物的SDS page分析，G-CSF是具有与商业品Neupogen基本相同的特性的纯化hG-CSF。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道B：G-CSF与HES 10/0.4在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶联后的粗产物。

泳道C：G-CSF与HES 10/0.7在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶联后的粗产物。

泳道D：G-CSF与HES 50/0.4在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶联后的粗产物。

泳道E：G-CSF与HES 50/0.7在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶联后的粗产物。

泳道F：G-CSF起始物。

附图3

图3显示根据实施例2.2制备的HES-G-CSF偶联物的SDS page分析，G-CSF是具有与商业品Neupogen基本相同的特性的纯化hG-CSF。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道B：G-CSF与氧化的HES 10/0.7在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶联后的粗产物。

泳道C：G-CSF与氧化的HES 50/0.4在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶联后的粗产物。

泳道D：G-CSF与氧化的HES 50/0.7在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶联后的粗产物。

泳道E：G-CSF起始物。

附图4

图4显示根据实施例2.3制备的HES-G-CSF偶联物的SDS page分析，G-CSF是Neupogen或Granocyte。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道B：根据实施例2.3的粗产物(i-N)。

泳道C：根据实施例2.3的粗产物(ii-N)。

泳道D：根据实施例2.3的粗产物(iii-N)。

泳道E：根据实施例2.3的粗产物(iv-N)。

泳道F：根据实施例2.3的粗产物(i-G)。

泳道G：根据实施例2.3的粗产物(ii-G)。

泳道H：根据实施例2.3的粗产物(iii-G)。

泳道I：根据实施例2.3的粗产物(iv-G)。

泳道J：Neupogen。

附图5

图5显示根据实施例2.4制备的HES-G-CSF偶联物的SDS page分析，G-CSF是具有与商业品Neupogen基本相同的特性的纯化hG-CSF。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道B：根据实施例2.4的粗产物(vi)。

泳道C：根据实施例2.4的粗产物(v)。

泳道D：G-CSF起始物。

泳道E：蛋白质标记物SeeBluePlus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。

泳道F：根据实施例2.4的粗产物(ix)。

泳道G：根据实施例2.4的粗产物(viii)。

泳道H：根据实施例2.4的粗产物(vii)。

泳道I：G-CSF起始物。

附图6

图6显示根据实施例2.5制备的HES-G-CSF偶联物的SDS page分析，G-CSF是具有与商业品Neupogen基本相同的特性的纯化hG-CSF。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的10％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道B：根据实施例2.5的粗产物。

泳道C：G-CSF起始物。

附图7

图7显示根据实施例2.6制备的HES-蛋白质偶联物的SDS page分析。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。将体积大于15μl的样品真空浓缩至15μl。

泳道B：IL-2与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道C：IL-2与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道D：对照：用硼氢化钠处理过的IL-2，不含醛基-HES。

泳道E：IFNα与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道F：IFNα与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道G：对照：用硼氢化钠处理过的IFNα，不含醛基-HES。

附图8

图8显示根据实施例2.6制备的HES-蛋白质偶联物的SDS page分析。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。将体积大于15μl的样品真空浓缩至15μl。

泳道B：IL-3与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道C：IL-3与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道D：对照：用硼氢化钠处理过的IL-3，不含醛基-HES。

泳道E：肌红蛋白与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道F：肌红蛋白与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道G：对照：用硼氢化钠处理过的肌红蛋白，不含醛基-HES。

附图9

图9显示根据实施例2.6制备的HES-蛋白质偶联物的SDS page分析。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONS ORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的3-8％Tris-醋酸凝胶和Tris-醋酸SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道B：BSA与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道C：BSA与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道D：对照：用硼氢化钠处理过的BSA，不含醛基-HES。

附图10

图10显示根据实施例2.6制备的HES-蛋白质偶联物的SDS page分析。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。将体积大于15μl的样品真空浓缩至15μl。

泳道B：SOD与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道C：SOD与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道D：对照：用硼氢化钠处理过的SOD，不含醛基-HES。

泳道E：对照：用硼氢化钠处理过的EPO，不含醛基-HES。

泳道F：EPO与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道G：EPO与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道H：IFNβ与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道I：IFNβ与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道J：对照：用硼氢化钠处理过的IFNβ，不含醛基-HES。

附图11

图11显示根据实施例2.6制备的HES-蛋白质偶联物的SDS page分析。使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的3-8％Tris-醋酸凝胶和Tris-醋酸SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道B：AT III与根据实施例1.9合成的醛基-HES的偶联。

泳道C：AT III与根据实施例1.10合成的醛基-HES的偶联。

泳道D：对照：用硼氢化钠处理过的AT III，不含醛基-HES。

附图12

图12显示实施例4的体外结果。

在图中，x轴表示浓度，单位是pg/ml，y轴表示细胞数/100,000。

在图中，下列缩写是指：

G-CSF/A32 根据实施例2.5制备的G-CSF偶联物

G-CSF/A33 用于实施例2.5偶联物的G-CSF起始物

G-CSF/A57 未修饰的Neulasta

G-CSF/A58 未修饰的Neupegen

附图13

SDS-PAGE：根据实施例2.5的HES-修饰的G-CSF在DEAE-Sepharose CL-6B上层析后(见实施例3)的流过液和洗脱液；1.5％的指定级分经超滤脱盐，在SpeedVac中干燥，加到12.5％聚丙烯酰胺凝胶上。

附图14G-CSF的MALDI/TOF图谱(见实施例3)

附图15HES-修饰的G-CSF的MALDI/TOF图谱(见实施例3)

附图16

附图16显示的是实施例5(用凝胶电泳分析如实施例5.5所述制备的粗制α1AT-HES偶联物)的结果。

使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Power Pac 200电源(Bio-Rad，Munchen，D)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的3-8％Tris-醋酸凝胶和Tris-醋酸SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：未染色的SDS Page蛋白质标记物6.5-200KDa(SERVAElektrophoresis GmbH，Heidelberg，D)。分子量标记物由上至下为：200kD、116kD、67kD、45kD、29kD、21kD、14.3kD、6.5kD；

泳道B：如实施例5.5所述与醛基-HES的偶联；

泳道C：如实施例5.6所述与HES的偶联。

附图17

附图16显示的是实施例5(分析在离子交换层析后(参见实施例5.7)后收集的B1-C6级分)的结果。

凝胶电泳的条件参见附图16。

泳道B：B1级分

泳道C：C1级分

泳道D：C2级分

泳道E：C3级分

泳道F：C4级分

泳道G：C5级分

泳道H：C6级分

泳道I：A1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lot No.080604A)

附图18

附图18显示的是ProlastinHS(Bayer Vital GmbH，Leverkusen，Germany，Lot No.PR4HA43)、A1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lot No.080604A)和如实施例5.5所述合成的HES-A1AT偶偶联物的残留酶活性相对于浓度的曲线图。

附图19

附图19显示的是实施例6.2(b)的反应混合物的凝胶电泳。

使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。该凝胶使用Roti-Blue(CarlRoth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)根据制造商的说明染色。

泳道A：蛋白质标记物Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。

泳道B：h-CSF和在实施例6.1(d)中制备的HES衍生物偶联后的粗产物。

泳道C：h-CSF和在实施例6.1(b)中制备的HES衍生物偶联后的粗产物。

泳道D：h-CSF和在实施例6.1(j)中制备的HES衍生物偶联后的粗产物。

泳道E：对比反应：HES 50/0.7(Mw 47,000，DS＝0.76)。

附图20

附图20显示的是实施例6.2(d)的反应混合物的凝胶电泳。

泳道B：如实施例6.2(c)所述的缓冲液更换后的hG-CSF。

泳道C：h-CSF和在实施例6.1(f)中制备的HES衍生物偶联后的粗产物。

泳道D：h-CSF和在实施例6.1(h)中制备的HES衍生物偶联后的粗产物。

附图21

附图21显示的是实施例6.3的有丝分裂原性测定结果。Y轴代表NFS-60-细胞数/ml，X轴代表浓度，单位是pg/ml。

附图22

附图22显示的是实施例6.4的体内测定结果。

附图23

附图23显示的是通过凝胶电泳分析实施例7的粗制EPO-HES偶联物。

使用X Cell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的10％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；

泳道B：如实施例7.3所述EPO和醛基-HES的偶联；

泳道C：如实施例7.4所述EPO和醛基-HES在没有氰基硼氢化钠下的反应(对比反应A)；

泳道D：如实施例7.5所述EPO和氰基硼氢化钠在没有醛基-HES下的反应(对比反应B)。

从附图23可以明白地看出，在没有醛基-HES或没有氰基硼氢化钠的对比反应A和B中没有观测到反应。

附图24

附图24显示的是通过凝胶电泳分析实施例8.3.1的IFN-α-HES偶联物。

泳道X：Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD；

泳道A：如实施例8.3.1所述与醛基HES10/0.4偶联，条目A；

泳道B：如实施例8.3.1所述与醛基HES10/0.7偶联，条目B；

泳道C：如实施例8.3.1所述与醛基HES30/0.4偶联，条目C；

泳道D：如实施例8.3.1所述与醛基HES30/0.7偶联，条目D；

泳道E：如实施例8.3.1所述与醛基HES50/0.4偶联，条目E；

泳道F：如实施例8.3.1所述与醛基HES50/0.7偶联，条目F；

泳道G：对比反应，如实施例8.3.1所述没有醛基HES，条目G；

泳道I：对比反应，如实施例8.3.1所述没有醛基HES并且没有NaCNBH₃，条目I；

泳道J：对比反应，如实施例8.3.1所述含有醛基HES10/0.4，条目J；

泳道K：对比反应，如实施例8.3.1所述含有醛基HES10/0.4但没有NaCNBH₃，条目K。

附图25

附图25显示的是通过凝胶电泳分析实施例8.3.2的IFN-α-HES偶联物。

泳道A：如实施例8.3.2所述与醛基HES偶联，条目A；

泳道B：如实施例8.3.2所述与醛基HES偶联，条目B；

泳道C：如实施例8.3.2所述与醛基HES偶联，条目C；

泳道D：如实施例8.3.2所述与醛基HES偶联，条目D；

泳道E：如实施例8.3.2所述与醛基HES偶联，条目F；

泳道G：对比反应，如实施例8.3.2所述与HES偶联，条目G。

从附图25可以明白地看出，在对比反应G中没有观测到反应。

附图26

附图26显示的是通过凝胶电泳分析实施例8.3.3的IFN-α-HES偶联物。

通过凝胶电泳分析粗制IFN-α-HES偶联物。

泳道B：如实施例8.3.3.1所述IFNα与醛基HES的偶联；

泳道C：如实施例8.3.3.2所述IFNα与醛基HES的偶联；

泳道D：如实施例8.3.3.3所述IFNα与HES10/0.4钠的偶联(对比反应)。

附图27

附图27显示的是通过凝胶电泳分析实施例8.3.4的IFN-α-HES偶联物。

泳道A：如实施例8.3.4所述与醛基HES的偶联；

泳道B：对比反应；如实施例8.3.4所述与HES(MW＝7.6kD，DS＝0.41)的偶联。

从附图27可以明白地看出，在对比反应B中没有观测到反应。

附图28

附图28显示的是根据实施例9.1的Intron A与NIH标准rhIFN-α2a的增殖活性的比较。

附图29

附图29显示的是根据实施例9.2的模拟温育的IFN-α-HES与未修饰的IFN-α起始物相比的相对体外活性。

附图30

附图30显示的根据实施例9.3的IFN-α-HES偶联物分别与未修饰的IFN-α起始物、Intron A和Pegasys相比的相对体外活性。

附图31

附图31显示的是根据实施例9.4的IFN-α-HES偶联物与Intron A相比的相对体外活性。

附图32

附图32显示的是在小鼠中静脉注射30μg/kg后，达到50％保护MDBK细胞对抗病毒感染所需的血清样品稀释度相对于时间的图。用未修饰的起始物处理的小鼠的血清只有非常低的抗病毒作用。用HES修饰IFN-α可以大大延长血清抗病毒作用。半衰期随着用于修饰IFN-α的HES的分子量而增加(见实施例10)。

附图33

附图33显示的是根据实施例11在兔的PK-研究中得到的数据。与IFN-α起始物相比，IFN-α-HES显示了显著延长的半衰期。在大于24小时时(约＜1000pCi/ml)，未修饰物的曲线变平，并且几乎没有观测到活性进一步降低。

附图34

附图34显示的是根据实施例11的兔的PK-研究。评价4到24小时之间的数据。与未修饰的IFN-α起始物相比，IFN-α-HES显示了显著延长的半衰期。

附图35

附图35显示的是对根据实施例11的PK-研究(显示的是：高达12小时的期间)的统计学评价。在未修饰的起始物(见附图35(a))的情况中，在开始的2小时中浓度降至几乎为0，而IFN-α-HES显示了显著延长的半衰期(附图25(b))。

附图36

附图36显示的是实施例6.5(根据本发明的HES-G-CSF偶联物、Neulasta和Neupogen半衰期测定的比较)的结果。

附图37

附图37显示的是用图表示的实施例10.3的结果(IFN-α-HES偶联物的抗病毒活性)。

附图38

附图38显示的是用图表示的实施例9.5的结果(IFN-α-HES偶联物的抗病毒活性)。

实施例

实施例1：醛基官能化的羟乙基淀粉的合成

实施例1.1(a)：通过高碘酸盐氧化其还原端已被选择性氧化的羟乙基淀粉并在0℃下温育而进行的合成

取100mg氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705A1)溶解于5mL 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中，并冷却至0℃。取21.4mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL相同缓冲液中并冷却至0℃。将这两份溶液混合，并在0℃温育10分钟，然后添加0.73mL甘油，反应混合物在21℃温育10分钟。将该反应混合物在水中透析24小时(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是10.5kD，DS是0.41。

实施例1.1(b)：通过高碘酸盐氧化其还原端已被选择性氧化的羟乙基淀粉并在21℃下温育而进行的合成

取100mg氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705A1)溶解于5mL 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中。取21.4mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL相同缓冲液中。将这两份溶液混合，并在21℃温育10分钟，然后添加0.73mL甘油，反应混合物在21℃温育10分钟。将该反应混合物在水中透析24小时(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences DeutschlandGmbH，Bonn，D)并冻干。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是10.5kD，DS是0.41。

实施例1.2(a)：通过高碘酸盐氧化具有未氧化的还原端的羟乙基淀粉并在0℃下温育，合成醛基官能化的羟乙基淀粉

取100mg HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备)溶解于5mL 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中，并冷却至0℃。取21.4mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL相同缓冲液中并冷却至0℃。将这两份溶液混合，并在0℃温育10分钟，然后添加0.73mL甘油，反应混合物在21℃温育10分钟。将该反应混合物在水中透析24小时(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是8.5kD，DS是0.41。

实施例1.2(b)：通过高碘酸盐氧化具有未氧化的还原端的羟乙基淀粉非氧化并在21℃下温育，合成醛基官能化的羟乙基淀粉

取100mg HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备)溶解于5mL 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中。取21.4mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于5mL相同缓冲液中。将这两份溶液混合，并在21℃温育10分钟，然后添加0.73mL甘油，反应混合物在21℃温育10分钟。将该反应混合物在水中透析24小时(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是8.5kD，DS是0.41。

实施例1.3：由氨基官能化的羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸合成醛基官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是14.5kD，DS是0.41。

取5.1g(0.51mmol)氧代-HES10/0.4溶于15mL无水二甲亚砜(DMSO，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，在氮气中滴加到5.1mL(51mmol)1，4-二氨基丁烷的10mL无水二甲亚砜溶液中，并在40℃下搅拌19小时。添加反应混合物至80mL乙醇和80mL丙酮的混合物中。离心分离产生的沉淀，用20mL乙醇和20mL丙酮的混合物洗涤，再溶解于80mL水中。将该溶液在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。收率是67％(3.4g)氨基-HES 10/0.4。

取150mg 4-甲酰基苯甲酸和230mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入204μl N，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃温育30分钟后，加入1g氨基-HES 10/0.4。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到84mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.4：由羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸合成醛基官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.7的分子量是14.5kD，DS是0.76。

取83mg 4-甲酰基苯甲酸和180mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF，肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入78μl N，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃温育30分钟后，加入0.5g氧代-HES10/0.7。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到37.5mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于2.5mL水和2.5mL DMF的混合物中，并如上所述再沉淀。如上所述离心分析收集反应产物，再溶解于10mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.5：由羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸合成醛基官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。

取50mg 4-甲酰基苯甲酸和108mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于3mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入47μl N，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃温育30分钟后，加入0.3g氧代-HES 10/0.7。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到23mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于1.5mL水和1.5mL DMF的混合物中，并如上所述再沉淀。如上所述离心分析收集反应产物，再溶解于10mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.6：由氨基官能化的羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸五氟苯基酯合成醛基官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES 10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.7的分子量是14.5kD，DS是0.76。

取6.0g(0.6mmol)氧代-HES10/0.7溶于20mL无水二甲亚砜(DMSO，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，在氮气中滴加到6mL(60mmol)1，4-二氨基丁烷的11mL无水二甲亚砜溶液中，并在40℃下搅拌19小时。添加反应混合物至80mL乙醇和80mL丙酮的混合物中。离心分离产生的沉淀，用20mL乙醇和20mL丙酮的混合物洗涤，再溶解于80mL水中。将该溶液在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。收率是52％(3.15g)氨基-HES 10/0.7。

4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯根据J.S.Lindsey等，Tetrahedron 50(1994)pp.8941-68，特别是p.8956所述合成。取50mg氨基-HES10/0.7溶于0.5mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入15.3mg 4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯。在22℃振荡22小时后，把反应混合物加入到3.5mL冰冷的2-丙醇中。在4℃下离心收集沉淀产物，用4mL冰冷的2-丙醇洗涤，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.7：由羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸五氟苯基酯合成醛基官能化的羟乙基淀粉

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.7的分子量是14.5kD，DS是0.76。

4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯根据J.S.Lindsey等，Tetrahedron 50(1994)pp.8941-68，特别是p.8956所述合成。取200mg氧代-HES10/0.7溶于2mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入61.2mg 4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯。在22℃振荡22小时后，把反应混合物加入到15mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于1.4mL水和0.7mL DMF的混合物中，并如上所述再沉淀。如上所述离心收集反应产物，再溶解于10mL水中，并在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.8：由氨基官能化的羟乙基淀粉和4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸合成醛基官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES 10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1。

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是14.5kD，DS是0.41。

取80.5mg 4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸(Calbiochem-Novabiochem，Lufelfingen，CH)和61mg 1-羟基-1H-苯并三唑(Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于3mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入45.4μl N，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃温育30分钟后，加入0.3g氧代-HES10/0.4。在22℃振荡22小时后，把反应混合物加入到23mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于2mL水和1mL DMF的混合物中，并如上所述再沉淀。如上所述离心收集反应产物，再溶解于10mL水中，在水中透析1天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.9：由氨基官能化的羟乙基淀粉和4-甲酰苯甲酸合成醛基官能化的羟乙基淀粉

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是14.5kD，DS是0.41。

取150mg 4-甲酰苯甲酸和230mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入204μl N，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃温育30分钟后，加入1g氨基-HES 10/0.4。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到84mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.10：通过高碘酸盐氧化其还原端已被氧化的羟乙基淀粉，合成醛基官能化的羟乙基淀粉

当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是10.5kD，DS是0.41。

取300mg氧代-HES10/0.4溶解于15mL 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中。取64.2mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于15mL相同缓冲液中。将这两份溶液混合，并在21℃温育30分钟后，添加2mL甘油，反应混合物在21℃温育10分钟。将该反应混合物在水中透析24小时(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例2：通过还原氨基化作用合成G-CSF偶联物

G-CSF是与商业品Neupogen(Amgen，München，D)具有基本相同性质的纯化的G-CSF。

实施例2.1(a)：通过还原氨基化作用，使用含未氧化的还原端的羟乙基淀粉在pH＝7.4合成G-CSF-偶联物(对比实施例)

在实施例2.1中，试图采用WO 03/074087(实施例12，第22-23页)的合成方法来制备HES-G-CSF偶联物。

向3.33μl G-CSF(Neupogen，来自Amgen，München，D或Granocyte，来自Aventis Pharma AG，Zurich，CH，各3mg/mL)的0.1M磷酸缓冲液pH7.4水溶液中添加3.33μl HES10/0.4(MW＝10ka，DS＝0.4，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，79mg/mL)在相同缓冲液中的溶液。向该混合物中加入3.33μl 60mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，所得混合物在22℃温育4小时。然后，再添加3.33μl新制备的60mM氰基硼氢化钠溶液。在30小时的温育时间内，共加入5份3.33μl新制备的60mM氰基硼氢化钠溶液。用凝胶电泳法分析该反应混合物。未观察到反应。

实施例2.1(b)：通过还原氨基化作用，使用含未氧化的还原端的羟乙基淀粉在pH＝5.0到9.2合成G-CSF-偶联物(对比实施例)

向3.33μl G-CSF(3mg/mL)在给定缓冲液中的溶液中添加3.33μlHES(30mg/mL)在相同缓冲液中的溶液。将该混合物冷却到4℃，在4℃向该混合物中加入3.33μl 60mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，所得混合物在4℃温育20小时。

使用如下的HES制剂和缓冲液：

a)缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0

-HES 10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.4的分子量是8.5kD，DS是0.41。

-HES 10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。

-HES50/0.4(MW＝50kD，DS＝0.4，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。当用LALLS-GPC测定时，HES 50/0.4的分子量是57kD，DS是0.41。

-HES50/0.7(MW＝50kD，DS＝0.7，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。当用LALLS-GPC测定时，HES 50/0.7的分子量是47kD，DS是0.76。

b)缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.2

-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)。当用LALLS-GPC测定时，HES 10/0.7的分子量是10.5kD，DS是0.76。

c)缓冲液：0.1M硼酸钠缓冲液pH 8.3

d)缓冲液：0.2M硼酸钾缓冲液pH 9.2

通过凝胶电泳分析各反应混合物。偶联反应未观察到或可以忽略(未显示对反应b)到d)的凝胶扫描)。

实施例2.2：通过还原氨基化作用，使用含氧化的还原端的羟乙基淀粉在pH＝5.0到9.2合成G-CSF-偶联物(对比实施例)

向3.33μl G-CSF(3mg/mL)在给定缓冲液中的溶液中添加3.33μl氧代-HES(30mg/mL)在相同缓冲液中的溶液。将该混合物冷却到4℃，在4℃向该混合物中加入3.33μl 60mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，所得混合物在4℃温育17小时。

使用如下的HES制剂和缓冲液：

a)缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0

-氧代-HES 10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)。当用LALLS-GPC测定时，HES10/0.7的分子量是14.5kD，DS是0.76。

-氧代-HES50/0.4(MW＝50kD，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)。当用LALLS-GPC测定时，HES50/0.4的分子量是42kD，DS是0.41。

-氧代-HES50/0.7(MW＝50kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)。当用LALLS-GPC测定时，HES50/0.7的分子量是57kD，DS是0.76。

b)缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.2

c)缓冲液：0.1M硼酸钠缓冲液pH 8.3

d)缓冲液：0.2M硼酸钾缓冲液pH 9.2

HES 10/0.4(MW＝8.4kD，DS＝0.41)的氧化作用由SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D根据DE 196 28 705 A1来进行。

实施例2.3：通过还原氨基化作用，使用由高碘酸氧化合成的醛基官能化的羟乙基淀粉合成G-CSF-偶联物

向3.33μl G-C SF(Granocyte，来自Aventis Pharma AG，Zurich，CH，和Neupogen，来自Amgen，München，D，各3mg/mL)在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.0中的水溶液中添加3.33μl醛基-HES(79mg/mL)在相同缓冲液中的溶液。向该混合物中加入3.33μl 60mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，所得混合物在21℃温育25小时。通过凝胶电泳分析各反应混合物。

使用下列醛基官能化的HES偶联物：

(i-N)根据上述实施例1.1(a)，用Neupogen制备；

(ii-N)根据上述实施例1.1(b)，用Neupogen制备；

(iii-N)根据上述实施例1.2(a)，用Neupogen制备；

(iv-N)根据上述实施例1.2(b)，用Neupogen制备；

(i-G)根据上述实施例1.1(a)，用Granocyte制备；

(ii-G)根据上述实施例1.1(b)，用Granocyte制备；

(iii-G)根据上述实施例1.2(a)，用Granocyte制备；

(iv-G)根据上述实施例1.2(b)，用Granocyte制备；

实施例2.4：通过还原氨基化作用，使用由羟乙基淀粉和甲酰-羧酸偶联合成的醛基官能化的羟乙基淀粉合成G-CSF-偶联物

向3.33μl G-CSF(3mg/mL)在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.0中的水溶液中添加3.33μl醛基-HES(118.5mg/mL)在相同缓冲液中的溶液，将溶液冷却到4℃。在4℃向该混合物中加入3.33μl 60mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，所得混合物在4℃温育17小时。通过凝胶电泳分析反应混合物。

使用下列醛基官能化的HES偶联物：

(v)根据上述实施例1.4制备；

(vi)根据上述实施例1.5制备；

(vii)根据上述实施例1.6制备；

(viii)根据上述实施例1.7制备；

(ix)根据上述实施例1.8制备。

实施例2.5：通过还原氨基化作用，使用由羟乙基淀粉和甲酰-羧酸偶联合成的醛基官能化的羟乙基淀粉合成G-CSF-偶联物

向2.5mL G-CSF(2.27mg/mL)在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.0中的水溶液中添加136mg如实施例1.3所制备的醛基-HES10/0.4，将溶液冷却到0℃。向该混合物中加入2.5mL冰冷的40mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，所得混合物在4℃温育17小时。通过凝胶电泳分析反应混合物。

实施例2.6：通过还原氨基化作用，分别使用根据实施例1.9和1.10合成的醛基官能化的羟乙基淀粉合成各种蛋白质偶联物

向wμl(见下表I)蛋白质P(见下表I)在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.0(xmg/mL；见下表I)中的水溶液中添加yμl(见下表I)HES-衍生物(如实施例1.9或1.10合成)在相同缓冲液中的溶液(200mg/mL)。将混合物冷却到4℃并在4℃加入zμl 120mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，所得混合物在4℃温育24小时。通过凝胶电泳分析粗反应混合物。观测到所有蛋白质都成功地偶联，如蛋白质带向较高分子量迁移所示(见附图7到11)。增加的带宽是由于所使用的HES衍生物的分子量分布和与蛋白质连接的HES衍生物的数量。

表I：根据实施例2.6进行的试验

条目	蛋白质P	w	x	y	z
条目	蛋白质P	w	x	y	z	1	rhIL-2(Strathmann Biotec，Hamburg，D)	15	1	4.41	3.88
2	rhIFN-α(Strathmann Biotec，Hamburg，D)	15	1	3.91	3.78	1	rhIL-2(Strathmann Biotec，Hamburg，D)	15	1	4.41	3.88
2	rhIFN-α(Strathmann Biotec，Hamburg，D)	15	1	3.91	3.78	3	rhIL-3(Strathmann Biotec，Hamburg，D)	10	1	3.34	2.67
4	超氧化物歧化酶SOD(来自牛的红细胞，Sigma，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen D)	6.67	3	3.21	1.97	3	rhIL-3(Strathmann Biotec，Hamburg，D)	10	1	3.34	2.67
4		6.67	3	3.21	1.97	5	肌红蛋白(来自马的骨骼肌，Sigma，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen D)	6.67	3	5	2.33
6	rhEPO	6.67	3	3.34	2	5	肌红蛋白(来自马的骨骼肌，Sigma，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen D)	6.67	3	5	2.33
6	rhEPO	6.67	3	3.34	2	7	rhAT III(ATryn^，GTC Biotherapeutics，Framingham，MA，USA)	6.67	3	1.73	1.68
8	rhIFN-β	40	0.5	5	9	7	rhAT III(ATryn^，GTC Biotherapeutics，Framingham，MA，USA)	6.67	3	1.73	1.68
8	rhIFN-β	40	0.5	5	9	9	BSA(Frakt.V，Carl Roth GmbH，Karlsruhe，D)	6.67	3	1.49	1.63

所使用的IFN-β是由包含二-和三-触角的糖侧链和N-乙酰氨基乳糖重复单元的CHO细胞产生的rhIFN-β1a。

所使用的EPO是重组产生的EPO，其具有人EPO的氨基酸序列，并与商业销售的Erypo(ORTHO BIOTECH，Jansen-Cilag)或NeoRecormon(Roche)具有基本相同的特性，可参照EP 0 148 605、EP0 205 564、EP0 411678。

实施例3：实施例2.5获得的G-CSF-偶联物的分析

A.纯化

获得的G-CSF是与商业品Neupogen具有基本相同的特性的纯化hG-CSF并且其中一份保持未修饰，作为对照。

1.在用阴离子交换层析纯化前G-CSF和G-CSF-偶联物样品的缓冲液更换

对于HES-修饰的G-CSF样品或未修饰G-CSF(作为对照)(0.5-5mg蛋白质)，用Vivaspin 6 Concentrator装置(10.000MWCO PES，Vivascience，Cat.Nr.VS0602)进行缓冲液更换。将样品浓缩到0.5-0.7mL并用10mM磷酸钠缓冲液pH7.2稀释到5mL。每个样品都进行3次上述浓缩/缓冲液更换循环。

2.G-CSF和其HES-修饰型在DEAE-Sepharose柱上的阴离子交换层析

纯化HES-修饰后的G-CSF和作为对比的未修饰G-CSF，并用所述的AKTA explorer 10系统在室温下通过阴离子交换层析分析。将HES化之前或之后的G-CSF等份用超滤法在所述缓冲液A(10mM磷酸钠，pH 7.2)中透析，或用约13倍体积的缓冲液A稀释。使用5.0倍柱容积(CV)的6.5M胍/HCl、5.0CV缓冲液A、5.0CV缓冲液C (1.5MNaCl在10mM磷酸钠中，pH 7.2)，然后使用10CV缓冲液A使含2mLDEAE-Sepharose(DEAE-Sepharose CL-6B，Pharmacia Kat.Nr.17-0710-01)的柱再生。然后按0.6ml/min的流速注入样品(0.8-4.5mL在10mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中)。根据所加的样品，用10mL(2mL样品环管)或20mL(5mL样品环管)的缓冲液A洗涤该样品环管，然后进一步用0-22CV的缓冲液A(流速＝0.8ml/min)进一步洗涤该柱。用超过5CV的从0％到100％缓冲液B的线性梯度洗脱，用2.5CV的100％缓冲液B按流速0.6ml/min进行等度过柱。用5CV的缓冲液A使该柱再平衡，并如上所述按流速1ml/min使该柱再生。

如果需要，用Vivaspin浓缩器浓缩样品，并如上所述进行缓冲液更换，在用0.2μm过滤单元(Corning，Cat.No.431215)过滤除菌之前或之后将样品在0-8℃贮存在10mM乙酸钠缓冲液pH 4.0中。制备下列样品用于体外生物测定和用于进一步的分析。按照下列B1部分所述确定蛋白质浓度：

I.0401-15/A33，0.44mg/mL，体积＝500μl

G-CSF(大肠杆菌)

II.0401-13/A32，0.28mg/mL，体积＝900μl

HES-修饰的G-CSF(大肠杆菌)

III.0401-28/A58，0.60mg/mL，体积＝350μl

Neupogen

IV.0401-28/A57，0.50mg/mL，体积＝400μl

Neulasta

B.分析

分析等分样品的蛋白质含量和修饰。

1.用RP-HPLC进行G-CSF蛋白质定量

用未修饰的蛋白质(浓度：0.453mg/mL)作为标准品对样品的G-CSF蛋白质含量进行定量。

使用的是Dionex HPLC系统，包括泵P 680A HPG，脱气单元Degasys DG 1210，自动采样器和注射器ASI-100，样品环管250μl，与装有软件Chromeleon层析管理系统的UV/Vis-Detektor UVD170U连接的恒温柱部分TCC 100。

使用前置柱CC8/4 Nucleosil 120-5 C4，Macherey-Nagel，Cat.No.721889，和分离柱40 C-4 Nucleosil MPN，5μm，125×4mm RP-柱(Macherey-Nagel，编号No.7200 45.40)。溶剂A是H₂O加0.06％(v/v)三氟乙酸，溶剂B是90％乙腈水溶液，其包含0.06％(v/v)三氟乙酸；流速：1ml/min。

在214，221，260和280nm波长下进行UV检测。

将约10-20μg样品注入到RP-HPLC柱中。采用下列梯度：

0-5分钟：0-10％B

-17分钟：10-45％B

-35分钟：45-80％B

-36分钟：80-100％B

-38分钟：100％B

-39分钟：10％B

-45分钟：10％B

采用在标准G-CSF制剂的洗脱位置处得到的波峰面积，并通过比较在约29分钟在280nm波长下所得波峰与参考标准品进行比较。

2.G-CSF蛋白质的还原+羧酰氨甲基化

取G-CSF蛋白质样品等份，如文献(Guillermina Forno，MarielaBollati Fogolin，Marcos Oggero，Ricardo Kratje，Marina Etcheverrigaray，Harald S.Conradt，Manfred Nimtz(2004)N-and O-linked carbohydratesand glycosylation site occupancy in recombinant humangranulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinesehamster ovary cell line(中国仓鼠卵巢细胞系分泌的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中N-及O-连接的糖和糖基化位点占据)；European J.Biochem，273(5)，907-919)所述进行还原和羧酰氨甲基化。羧酰氨甲基化反应产生修饰的半胱氨酸残基。羧酰氨甲基化的蛋白质在含1M尿素、pH7.8的25mM NH₄HCO₃中以0.2∶10的酶/底物比进行内切蛋白酶Glu-C消化，共18-24小时。

3.通过RP-HPLC分离内切-Glu-C肽

内切-Glu-C消化产生的肽在Dionex HPLC系统中分离，该系统包括泵P 680 AHPG，脱气单元Degasys DG 1210，自动采样器和注射器ASI-100，样品环管250μl，与装有软件Chromeleon层析管理系统的UV/Vis-Detektor UVD170U连接的恒温柱部分TCC 100。

使用前置柱CC8/4 Nucleosil 120-5 C4，Macherey-Nagel，Cat.No.721889，和分离柱40C-4 Nucleosil MPN，5μm，125×4mm RP-柱(Macherey-Nagel，编号No.720045.40)。溶剂A是H₂O加0.06％(v/v)三氟乙酸，溶剂B是90％乙腈水溶液，其包含0.06％(v/v)三氟乙酸；流速：1ml/min。采用下列的梯度：

0-5分钟：10％B

-17分钟：45％B

-65分钟：100％B

-67分钟：100％B

-69分钟：10％B

-75分钟：10％B

在214，221，260和280nm波长下进行UV检测。内切-Glu-C消化产生的肽是可分离的(未显示数据)。

4.通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI/TOF/TOF-MS)分析蛋白质水解的肽

采用质谱法检测所制备的不同样品中G-CSF的完整N-末端。还原且羧酰氨甲基化的蛋白质样品经内切蛋白酶Glu-C消化产生的样品(3-5μg)直接用于MS-分析(不包括步骤3的RP-HPLC)，采用含C18反相物质的ZipTip吸管尖端，根据制造商的说明进行纯化。用0.1％(v/v)苯甲酸洗涤后，以10μl 0.1％(v/v)甲酸在60％(v/v)乙腈中的溶液进行肽的洗脱。

蛋白质水解(内切Glu-C)的肽片段用Bruker ULTRAFLEX飞行时间(TOF/TOF)仪器以线性正离子模式进行分析，采用22.4mg 3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸在400μl乙腈和600μl 0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液中的溶液作为基质；并采用含19mg α-氰基-4-羟基肉桂酸在相同溶剂混合物中的溶液作为基质，使用反射器(reflectron)加强解析度，测定(糖基)-肽。取1μl浓度约1-10pmol-μl^-1的样品溶液与等量各基质混合。将混合物点样在不锈钢靶上，在室温下干燥后进行分析。在质量范围900-5000道尔顿下纪录质谱。下表将预期质量与各自G-CSF肽进行了关联。

表：由G-CSF产生的内切-Glu-C肽的理论(单同位素)质量

质量(道尔顿)	本研究的观测	氨基酸位置	人工修饰	肽序列
质量(道尔顿)	本研究的观测	氨基酸位置	人工修饰	肽序列	2132.11	+	1-20	Cys_CAM：pos 18rn/z 2189.13	MTPLGPAS SLPQSFLLKCLE
1512.81	+	21-34	……	QVRKIQGDGAALQE	2132.11	+	1-20	Cys_CAM：pos 18rn/z 2189.13	MTPLGPAS SLPQSFLLKCLE
1512.81	+	21-34	……	QVRKIQGDGAALQE	1534.74	+	35-47	Cys_CAM：pos 37，43m/z 1648.78	KLCATYKLCHPEE
4942.63	-	48-94	Cys_CAM：pos 65，75m/z 5056.68	LVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALE	1534.74	+	35-47	Cys_CAM：pos 37，43m/z 1648.78	KLCATYKLCHPEE
4942.63	-	48-94	Cys_CAM：pos 65，75m/z 5056.68	LVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALE	502.25	-	95-99	……	GISPE
2835.37	-	100-124	……	LGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEE	502.25	-	95-99	……	GISPE
2835.37	-	100-124	……	LGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEE	4026.08	+	125-163	……	LGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLE
1438.83	+	164-175	……	VSYRVLRHLAQP	4026.08	+	125-163	……	LGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLE

半胱氨酸残基被羧酰氨甲基化；在未修饰的G-CSF的MALDI/TOF图谱上探测标记为脂肪的肽。

在用如上所述的内切-Glu-C蛋白水解处理G-CSF后，包括蛋白质位点1-20的N-末端内切-Glu-C肽(MTPLGPASSLPQSFLLKCLE；m/z2189.1)在样品的MALDI/TOF-MS图谱上检测。

结果：

I.G-CSF和HES修饰的变体的纯化

用如A4所述的DEAE-Sepharose CL-6B柱来纯化HES-修饰的G-CSF和未修饰的G-CSF。

对于未修饰的样品0401-15/A33，流过液在280nm没有检测到显著的吸收，用体积6mL的40-50％缓冲液B(0.16-0.20M NaCl)洗脱的蛋白质在280nm处的特定波峰面积为660mAU×mL×mg^-1。

样品(HES-修饰的G-CSF)用体积为12mL的缓冲液B，按20-80％(0.08-0.32M NaCl)的较大梯度范围洗脱。在280nm处，在流过液中检测到约90％的总波峰面积，其中包含约50％的总蛋白质，通过如图13所示的SDS-PAGE分析进行检测，其分子量显然略高于洗脱的蛋白质。

蛋白质的回收率是根据洗脱级分的波峰面积(A280nm)与未修饰的G-CSF蛋白质相比来计算的。

表1.280nm下检测的波峰面积的比较

DEAE-Sepharose操作序号	说明	所计算的蛋白质注入量	洗脱液面积[280nm](mAU×mL)	与DS01 A33的洗脱液相比，洗脱液的收率^**
DEAE-Sepharose操作序号	说明	所计算的蛋白质注入量	洗脱液面积[280nm](mAU×mL)	与DS01 A33的洗脱液相比，洗脱液的收率^**	DS01 A33	G-CSF	0.5mg	330	(0.50mg)
DS03 A32	HES-修饰的G-CSF	4.0mg	1560	2.36mg	DS01 A33	G-CSF	0.5mg	330	(0.50mg)

^**蛋白质的RP-HPLC定量证实了该结果。

II.用内切蛋白酶Glu-C处理后的肽图谱和MALDI/TOF MS进行蛋白质分析

通过对羧酰氨甲基化未修饰的G-CSF(附图14)和市售品Neupogen(未显示数据)进行内切蛋白酶Glu-C消化得到的N-末端肽可以用MALDI/TOF-MS清楚地检测出来(MTPLGPASSLPQSFLLKC^*LE，m/z 2189.1；半胱氨酸被羧酰氨甲基化)。该信号在HES-修饰的样品(附图15)和Neulasta(未显示数据)中是不存在的，表明该肽被修饰。

HES修饰的G-CSF的N-末端序列测定显示其N-末端已封闭，提示该蛋白质衍生物的N-末端甲硫氨基残基被HAS衍生物修饰。

样品代码	说明	MALDI/TOF图谱
样品代码	说明	MALDI/TOF图谱	G-CSF A32	GES-修饰的G-CSF	I/4810
G-CSF A33	G-CSF	I/4811	G-CSF A32	GES-修饰的G-CSF	I/4810
G-CSF A33	G-CSF	I/4811	G-CSF A57	Neulasta	I/4812
G-CSF A58	Neupogen	I/4813	G-CSF A57	Neulasta	I/4812
G-CSF A58	Neupogen	I/4813	G-CSF A08	G-CSF	I/4815

参考文献：

Guillermina Fomo，Mariela Bollati Fogolin，Marcos Oggero，RicardoKratje，Marina Etcheverrigaray，Harald S.Conradt，Manfred Nimtz(2004)N-and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy inrecombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factorsecreted by a Chinese hamster ovary cell line(中国仓鼠卵巢细胞系分泌的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中N-及O-连接的糖和糖基化位点占据)Eur.J.Biochem，271(5)，907-919

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Nimtz，M.，Martin，W.，Wray，V.，Koppel，K.-D.，Agustin，J.和Conradt，H.S.(1993)Structures of sialylated oligosaccharides of humanerythropoietin expressed in recombinant BHK-21 cells(重组BHK-21细胞中表达的人红细胞生成素的唾液酸化寡糖的结构).Eur J.Biochem.213，39-56

Nimtz，M.，Noll G.，Paques，E.和Conradt，H.S.(1990)Carbohydratestructures of human tissue plasminogen activator variant expressed inrecombinant Chinese hamster ovary cells(在重组中国仓鼠卵巢细胞中表达的人组织纤溶酶原激活物变体的糖结构).FEBS Lett.271，14-18。

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E.Grabenhorst，A.Hoffmann，M.Nimtz，G.ZettlmeiBI和H.S.Conradt(1995)Construction of stable BHK-21 cells coexpressing humansecretory glycoproteins and human Galβ1-4GlcNAc-R2，6-sialyltransferase：2，6-linked NeuAc is preferably attached to the Gal1-4GlcNAcβ1-2Manβ1-3-branch of biantennary oligosaccharides from secreted recombinant-traceprotein(共表达人分泌型糖蛋白和人Galβ1-4GlcNAc-R 2，6-唾液酸转移酶的稳定BHK-21细胞的构建：2，6-连接的NeuAc优选连接到来自分泌重组痕量蛋白的二触角寡糖的Gal1-4GlcNAcβ1-2Manβ1-3-分支上).Eur.J.Biochem.，232，718-725

实施例4：在实施例2.5中得到的并根据实施例3纯化的G-CSF-偶联物的体外结果：G-CSF变体对小鼠NFS-60细胞的有丝分裂原性

已知G-CSF对嗜中性粒细胞系的造血细胞的增殖、分化和活化具有特定影响。采用小鼠NFS-60细胞(N.Shirafuji等，Exp.Hematol.1989，17，116-119)测试G-CSF变体的促有丝分裂能力。该细胞在含有5-10％WEHI-3B(DSMZ，Braunschweig，D；如DSMZ所述进行培养)条件培养基作为外源性IL-3来源的含10％胎牛血清的RPMI培养基(GibcoINVITROGEN GmbH，Karlsruhe，D)中生长，离心收集，洗涤，在24-孔板中按每孔100,000个细胞等分。将细胞在不含WEHI-3B条件培养基的RPMI培养基中37℃适应1小时，然后添加用相同的培养基稀释的G-CSF生长因子样品。在37℃下，将NFS-60细胞暴露于纯化的G-CSF变体3天，然后电子计数(Casy TT细胞计数器，Schrfe System，Reutlingen，D)细胞数。结果如附图12所示。如附图12所示，与未添加生长因子的培养基相比，不同G-CSF变体(0.5-50pg/mL)可在3天后刺激细胞数增加。

未修饰的对照蛋白质G-CSF/A33和G-CSF/A58对细胞的刺激程度非常类似(ED50＝5-10pg/mL)，而G-CSF偶联物G-CSF/A32和G-CSF/A57比未修饰型只显示活性稍微降低(ED₅₀＝10-25pg/mL)。

实施例5通过还原氨基化作用合成的A1AT(α1AT，α1aT)偶联物

实施例5.1由氧化的HES合成氨基-HES(A)

取6.09g氧代-HES(MW＝57,000kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，根据DE 196 28 705 A1制备)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于32mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.22mL 1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗涤，并离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为82％。

实施例5.2由实施例5.1的氨基-HES(A)合成醛基-HES(A)

取125mg 4-甲酰基苯甲酸和174mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于38mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入155μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃培养30分钟后，加入3.8g氨基-HES(A)(如实施例5.1所述制备)。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于20mL N，N-二甲基甲酰胺中，如实施例5.1所述用80mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。在离心后，将沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为77％。

实施例5.3由氧化的HES合成氨基-HES(B)

取10g氧代-HES(MW＝57,000kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，根据DE 196 28 705A1制备)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于52mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入2mL 1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到350mL冰冷的2-丙醇(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。在4℃离心收集沉淀产物，用80mL冰冷的2-丙醇洗涤，并离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为85％。

实施例5.4由实施例5.3的氨基-HES(B)合成醛基-HES(B)

取153mg 4-甲酰基苯甲酸和241mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于51mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入170μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃培养30分钟后，加入5.1g氨基-HES(B)(如实施例5.3所述制备)。在22℃振荡16小时后，把反应混合物加入到360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，如实施例5.1所述用360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。在离心后，将沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为87％。

实施例5.5醛基-HES(A)和(B)与A1AT通过还原氨基化作用偶联

取189mg醛基-HES(B)(如实施例5.4所述制备)和172mg醛基-HES(A)(如实施例5.2所述制备)的混合物溶解于2.88mL反应缓冲液(0.1M磷酸钠缓冲液，150mM氯化钠，pH 7.2)中。在20℃，加入1.67mL60mM氰基硼氢化钠溶液在相同缓冲液中的溶液，然后加入0.455mLA1AT溶液(c(A1AT)＝11.0mg/mL，在20mM磷酸钠缓冲液，150mM氯化钠，pH 7.2中，A1AT＝rhA1AT，由GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA提供，lot No.080604A)。在20℃温育该混合物。17小时后，加入溶解于200μl反应缓冲液中的另外的6.7mg氰基硼氢化钠，在相同温度下将该混合物再温育24小时。在总共温育25小时后，用凝胶电泳分析10μl该溶液(见附图16)。

实施例5.6HES与A1AT通过还原氨基化作用偶联(对比反应)

取362mg HES(MW＝56,000kD，DS＝0.41，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2.88mL反应缓冲液(0.1M磷酸钠缓冲液，150mM氯化钠，pH 7.2)中。在20℃，加入1.67mL 60mM氰基硼氢化钠溶液在相同缓冲液中的溶液，然后加入0.455mL A1AT溶液(c(A1AT)＝11.0mg/mL，在20mM磷酸钠缓冲液，150mM氯化钠，pH 7.2中，α1AT＝rhα1AT，由GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA提供，lot No.080604A)。在20℃温育该混合物。17小时后，加入溶解于200μl反应缓冲液中的另外的6.7mg氰基硼氢化钠，在相同温度下将该混合物再温育24小时。在总共温育25小时后，用凝胶电泳分析10μl该溶液(见附图17)。

实施例5.7用离子交换层析法(IEC)纯化HES-A1AT偶联物

可以用AKTA-Explorer层析系统在HiTrap Q HP柱上(均来自Amersham Biosciences)通过离子交换层析来纯化A1AT的偶联物。该纯化可以根据在″Chen，Hammond，Lang和Lebing，Purification of α1Proteinase Inhibitor from Human Plasma Fraction IV-1 by Ion ExchangeChromatography(通过离子交换层析从人血浆组分IV-1中纯化α1蛋白酶抑制剂)，VoxSanguinis 1998，74，232-241″中所述的从人血浆中分离A1AT的方法来进行。

样品制剂：在与AKTA-Explorer层析系统组合的HiPrep26/10脱盐柱(Amersham Biosciences)上更换缓冲液，使用20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH 8作为洗脱液。

用脱盐的水稀释粗制反应混合物(如实施例5.5制备，约5mL)后进行缓冲液更换，使最终体积为10mL，使用如下参数：

柱：HiPrep 26/10脱盐柱

流速：10ml/min

洗脱液：20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH 8

样品体积：10mL

洗脱液分级分离：2.5mL

平衡：5倍柱体积

洗脱长度：2倍柱体积

将最先的14mL洗脱液混合，然后加入结合缓冲液，最终体积达到20mL。用IEC纯化该包含约5mg蛋白质的该溶液，使用如下参数：

柱：HiTrapQ HP 1mL

流速：1ml/min

结合缓冲液(BB)：20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH8

洗脱缓冲液(EB)：20mM磷酸钠，1M氯化钠，pH 8

样品体积：20mL

流过液分级分离：2mL

洗脱液分级分离：1mL

起始浓度EB：0％

平衡：5倍柱体积

洗脱非结合样品：15mL

靶浓度EB：15％

洗脱长度：20mL

用SDS-Page来分析层析后收集的级分。混合包含HES-A1AT偶联物的级分(相应于B1-B6级分，洗脱体积为40到47mL，见附图17)。在一些混合级分中，检测到了少量的未反应的A1AT。层析后混合级分的起始浓度可以用A1AT(由GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA提供，lot No.080604A)作为参照标准品通过BCA(Pierce Cat.No.23225)来测定，为170μg/mL。在稀释和缓冲液更换为20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.2中以后，所得到的蛋白质浓度为54.5μg/mL(BCA(Pierce，A1AT来自GTC Biothearpeutics Inc.，Framingham，MA，lot No.080604A(作为参照标准品))。最终的溶液用于确定该偶联物的抑制效能。

实施例5.8确定HES-A1AT偶联物对于人粒细胞弹性酶的体外抑制效能

偶联物的弹性酶抑制活性测定是根据Castillo等，Anal.Biochem.1979，99，53-64，用Sunrise型Tecan UV-VIS-读板器进行的。

该测定是基于由弹性酶催化的对-硝基苯胺从N-Met-O-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO₂-苯胺中的释放。该分解会导致在405nm处吸光度增加。开始的水解速率与该酶的活性密切相关。在没有和存在不同浓度的该受试抑制剂的情况下进行测定。根据受试物质的抑制活性，酶活性的降低用A₄₀₅相对于时间的曲线的斜率降低来表示。用抑制曲线的斜率除以未抑制曲线的斜率得出在一定抑制剂浓度下残留的弹性酶活性。残留的酶活性和抑制剂浓度具有线性相关。通过线性回归，可以得到线性的平滑直线，这样就可以计算出在给定抑制剂浓度时的残留酶活性。用这种方法，可以比较不同抑制剂在相同浓度时的抑制活性(＝1-残留的酶活性)(见附图18)。

使用下列的参数：

底物浓度：1.5mM

弹性酶活性：7.5mU

波长：405nm

温度：20℃

时间间隔：15s

动态循环：25

测量形式：中心

测定溶液由300μl缓冲液(0.1M Hepes，0.5M NaCl，0.05％(m/v)Triton X-100，pH 7.5)组成，该缓冲液包含10％DMSO，1.5mM N-Met-O-琥珀酰基-Ala-A1a-Pro-Val-p-NO₂-苯胺，7.5mU弹性酶和不同量的抑制剂。

弹性酶购自Serva Electrophoresis GmbH，Heidelberg。所有其它的物质购自Sigma Aldrich，Taufkirchen。

用A1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lot No.080604A)作为偶联的起始物，与作为参照物的ProlastineHS(BayerVital GmbH，Leverkusen，Germany，Lot No.PR4HA43)通过比较来测定如实施例5.5所述合成的偶联物的抑制活性。附图18给出了残留的酶活性相对于时间的曲线。所有曲线的线性为R²＞0.98。在下文中，给出的是c(抑制剂)＝1μg/mL时的IC₅₀-值和弹性酶抑制作用，及起始物和偶联物相对于参照物的抑制活性。在下表中列出的数据清楚地表明，在与HES偶联后A1AT保留了大部分的活性。

实施例5.8的表

抑制剂	线性的平滑曲线方程	IC₅₀[μg/mL]	弹性酶抑制c(抑制剂)＝1μg/mL[％]	相对于prolastin的抑制活性
抑制剂	线性的平滑曲线方程	IC₅₀[μg/mL]	弹性酶抑制c(抑制剂)＝1μg/mL[％]	相对于prolastin的抑制活性	ProlastinA1ATHES-A1AT-偶联物	y＝-0.6754x+0.9627y＝-0.5046x+0.9558y＝-0.3757x+0.9627	0.6850.9031.232	71.354.941.3	77.057.9

实施例5.9：与rhα1AT和来自血浆的hα1AT相比较，确定HES-rhα1AT偶联物的体内半衰期

利用8-10周大的雌性小鼠(BALB/cOlaHsd，Harlan GmbH，Borchen，Germany)作为受试生物(42只小鼠，每个样品14只)。仅在施用不同的样品溶液前，测定每只动物的“原体重”。将100μL 50μg/mL下述样品在缓冲液pH＝7.2(20mmol磷酸钠，150mmol氯化钠)中的溶液静脉注射到小鼠的尾静脉中。

样品1：rhα1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lot No.080604A)

样品2：如实施例5.5制备的rhα1AT-HES偶联物

样品3：来自血浆的hαAT(SERVA Electrophoresis GmbH，Heidelberg，Germany)

在注射后1，2，4，10，24，31.5，48小时，杀死每组中的两只小鼠，从该动物的心脏中取出全血样品(～500μl)。用Microvette500Z-Gel(Sarstedt，Numbrecht，Germany)制备血清。把血清样品贮存在-80℃，直至开始测定α1AT的浓度。

用商业可用的α1AT-ELISA(Immundiagnostik，Bensheim，Germany)根据制造商的说明书测定α1AT浓度。

所得到的结果表明，与未修饰的rhα1AT起始物相比，rhα1AT-HES偶联物的血浆半衰期显著地增加。根据下表，所测定的偶联物半衰期与来自血浆的hα1AT的范围相同。

实施例5.9的表：样品1-3的血浆半衰期

样品号	在小鼠中的血浆半衰期[h]
样品号	在小鼠中的血浆半衰期[h]	1	1.2
2	3.6	1	1.2
2	3.6	3	3.2

实施例6G-CSF-偶联物的合成

实施例6.1醛基-HES衍生物的合成

实施例6.1(a)氨基HES10/0.4的合成

取5.12g氧代-HES10/0.4(MW＝14,500D，DS＝0.41，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D；根据DE 196 28 705 A1制备)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于25mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入5.13mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗涤，并离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为67％。

实施例6.1(b)醛基HES10/0.4的合成

取105mg 4-甲酰基苯甲酸和135mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于7mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入135μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入0.7g氨基HES 10/0.4(如实施例6.1(a)所述合成)。在22℃振荡18小时后，把反应混合物加入到42mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于5mL DMF中，并如上所述在42mL乙醇/丙酮中沉淀。离心分离后，把收集的沉淀物溶解于水中，在水中透析1天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为95％。

实施例6.1(c)氨基HES10/0.7的合成

取6.02g氧代-HES10/0.7(MW＝15,000D，DS＝0.76，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D；根据DE 196 28 705 A1制备)在氮气下溶解于32mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入6.03mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗涤，并离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为52％。

实施例6.1(d)醛基HES10/0.7的合成

取150mg 4-甲酰基苯甲酸和230mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入204μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入1g氨基HES 10/0.7(如实施例6.1(c)所述合成)。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到84mL冰冷的2-丙醇中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为83％。

实施例6.1(e)氨基HES30/0.4的合成

取5g氧代-HES30/0.4(MW＝28,000D，DS＝0.41，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D；使用根据DE 196 28 705A1的摩尔比的组分)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于28mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.67mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到175mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物。将粗产品溶解于40mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率没有测定。

实施例6.1(f)醛基HES30/0.4的合成

取130mg 4-甲酰基苯甲酸和153mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于36mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入110μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入2.61g氨基HES 30/0.4(如实施例6.1(e)所述合成)。在22℃振荡22.5小时后，把反应混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗涤。离心分离后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析1天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为81％。

实施例6.1(g)氨基HES30/0.7的合成

取5g氧代-HES30/0.7(MW＝31,000D，DS＝0.76，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D；使用根据DE 196 28 705A1的组分摩尔比)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于28mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufirchen，D)中，加入1.67mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到175mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物。将粗产品溶解于40mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率没有测定。

实施例6.1(h)醛基HES30/0.7的合成

取122mg 4-甲酰基苯甲酸和144mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于34mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入103μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入2.46g氨基HES 30/0.7(如实施例6.1(g)所述合成)。在22℃振荡22.5小时后，把反应混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗涤。离心分离后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析1天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为87％。

实施例6.1(i)氨基HES50/0.7的合成

取6.09g氧代-HES50/0.7(MW＝57,000D，DS＝0.76，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D；使用根据DE 196 28 705A1的组分摩尔比)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于32mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.22mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物并用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗涤，离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为82％。

实施例6.1(j)醛基HES50/0.7的合成

取125mg 4-甲酰基苯甲酸和174mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于38mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入155μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入3.8g氨基HES 50/0.7(如实施例6.1(i)所述合成)。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，并再溶解于20mL N，N-二甲基甲酰胺中，如上所述用80mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。离心分离后，把沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为77％。

实施例6.2通过还原氨基化作用合成HES-G-CSF偶联物

实施例6.2(a)缓冲液更换A

用Vivaspin 15R浓缩器(VS15RH11，5KD MWCO，Vivascience AG，Hannoyer，D)将33mL在pH4.0的10mM乙酸钠，50mg/mL山梨醇和0.004％吐温80中的0.454mg/mL的hG-CSF(纯化hG-CSF，具有与商业品Neupogen基本相同的特性)溶液在0℃渗滤至4mL，并用pH5.0的0.1M乙酸钠缓冲液再稀释为15mL。重复渗滤2次。在最后的渗滤步骤中最终浓度为3mg/mL。

实施例6.2(b)hG-CSF与实施例6.1(b)、6.1(d)和6.1(j)的醛基HES衍生物反应

在缓冲液更换为0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0(如上文实施例6.2(a)所述)以后，向1.67mL的hG-CSF溶液中加入在相同缓冲液中的1.67mLHES-衍生物的溶液和1.67mL 60mM氰基硼氢化钠溶液，将该溶液在4℃温育15.5小时。在混合前将所有溶液冷却到0℃。

使用如下的HES最终浓度：

根据实施例6.1(b)和6.1(d)制备的HES衍生物为39.4mg/mL。

根据实施例6.1(j)制备的HES衍生物为197mg/mL。

作为反应对照的为197mg/mL HES50/0.7(MW＝47,000D，DS＝0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)。

通过凝胶电泳法分析反应混合物(见附图19)。

实施例6.2(c)缓冲液更换B

用Vivaspin 15R浓缩器(VS15RH11，5KD MWCO，Vivascience AG，Hannover，D)将20mL在pH4.0的10mM乙酸钠，50mg/mL山梨醇和0.004％吐温80中的0.454mg/mL的hG-CSF(纯化hG-CSF，具有与商业品Neupogen基本相同的特性)溶液在15℃渗滤至4mL并用pH5.0的0.1M乙酸钠缓冲液再稀释为15mL。重复渗滤2次。在最后的渗滤步骤中最终浓度为1.5mg/mL。

实施例6.2(d)hG-CSF与实施例6.1(f))和6.1(h)的醛基HES衍生物反应

在缓冲液更换为0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0(如上文实施例6.2(c)所述)以后，向3.3mL的hG-CSF溶液中加入在相同缓冲液中的3.3mL789mg HES-衍生物的溶液和3.3mL的60mM氰基硼氢化钠溶液，将该溶液在4℃温育30小时。在混合前将所有溶液冷却到0℃。

17小时后，从反应对照中移出样品。通过凝胶电泳法分析反应混合物(见附图20)。

实施例6.3体外测定

G-CSF变体对小鼠NFS-60细胞的有丝分裂原性

已知G-CSF对嗜中性粒细胞系的造血细胞的增殖、分化和活化作用具有特定影响。用小鼠NFS-60细胞(N.Shirafuji等，Exp.Hematol.1989，17，116-119)测试G-CSF变体的促有丝分裂能力。细胞在含5-10％WEHI-3B(DSMZ，Braunschweig，D；如DSMZ所述培养)条件培养基作为外源性IL-3来源的含10％胎牛血清的RPMI培养基(GibcoINVITROGEN GmbH，Karlsruhe，D)中生长，离心收集，洗涤，在24-孔板中按每孔100,000个细胞等分。将细胞在不含WEHI-3B条件培养基的RPMI培养基中37℃适应1小时，然后添加用相同的培养基稀释的G-CSF生长因子样品。将NFS-60细胞暴露于纯化的G-CSF变体(根据实施例3A1和2纯化，根据实施例3B1进行蛋白质定量)。

Neupogen、Neulasta均来自Amgen，

如实施例6.2(b)制备的″HES-GCFS10/0.4偶联物″，

如实施例6.2(b)制备的″HES-GCFS10/0.7偶联物″，

如实施例6.2(d)制备的″HES-GCFS30/0.4偶联物″，

如实施例6.2(d)制备的″HES-GCFS30/0.7偶联物″

如实施例6.2(b)制备的″HES-GCFS50/0.7偶联物″，

″模拟温育″(＝反应对照，197mg/ml HES50/0.7，MW 47,000 D，DS0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach Rodheim，Germany)在37℃下3天，然后电子计数细胞数(Casy TT细胞计数器，Scharfe System，Reutlingen，D)。

结果如下表和附图21所示。在所有情况下，下表和附图21给出的蛋白质的量仅表示偶联物中G-CSF的含量。从附图21中可以看出，与未添加生长因子的培养基相比，所有的不同G-CSF变体(2.5-250pg/ml)都能在3天后刺激细胞数目增加。所有变体在浓度为250pg/ml时达到相同的最高刺激水平。

实施例6.3的表：由G-CSF变体诱导的小鼠NFS-60细胞的增殖

浓度[pg/ml]	0	2.5	2.8	5	5.7	10	11.3	25	28.4	50	56.7	250	283.5
浓度[pg/ml]	0	2.5	2.8	5	5.7	10	11.3	25	28.4	50	56.7	250	283.5	Neupogen	0.44	0.86	1.20	1.69	2.33	2.49	2.41
HES-GCFS10/0.7	0.44	0.72		0.93		1.44		2.14		2.41		2.41		Neupogen	0.44	0.86	1.20	1.69	2.33	2.49	2.41
HES-GCFS10/0.7	0.44	0.72		0.93		1.44		2.14		2.41		2.41		HES-GCFS10/0.4	0.44	0.72	0.97	1.40	2.17	2.67	2.75
HES-GCFS50/0.7	0.44	0.62		0.70		0.97		1.68		2.15		2.32		HES-GCFS10/0.4	0.44	0.72	0.97	1.40	2.17	2.67	2.75
HES-GCFS50/0.7	0.44	0.62		0.70		0.97		1.68		2.15		2.32		模拟温育	0.44	0.85	1.31	1.91	2.38	2.47	2.41
HES-GCFS30/0.4	0.44	0.82		1.21		1.62		2.28		2.50		2.60		模拟温育	0.44	0.85	1.31	1.91	2.38	2.47	2.41
HES-GCFS30/0.4	0.44	0.82		1.21		1.62		2.28		2.50		2.60		HES-GCFS30/0.7	0.44	0.80	1.09	1.66	2.20	2.35	2.44
Neulasta	0.44	0.63		0.80		1.12		1.83		2.25		2.33		HES-GCFS30/0.7	0.44	0.80	1.09	1.66	2.20	2.35	2.44

实施例6.4hG-CSF偶联物在大鼠中的体内生物效应

大鼠[雄性CRL：CD^大鼠(7周大)，Charles river Deutschland GmbH，Sanghofer Weg 7，D-97633 Sulzfeld]抵达时，随即分成每组5只。适应环境7天后，淘汰状态较差的大鼠，换成备用动物。大鼠抵达时的体重为181-203g。

每组随机选出的5只大鼠经静脉内施用下列未偶联或偶联的G-CSF样品(根据实施例3A1和2纯化，根据实施例3B1进行蛋白质定量)，每公斤体重施用100μg蛋白质(注射速度为15秒/剂量，载体：5ml PBS/kg体重)：

Neupogen、Neulasta均来自Amgen，

如实施例6.2(b)制备的″HES-GCFS10/0.4偶联物″(10/0.4)，

如实施例6.2(b)制备的″HES-GCFS10/0.7偶联物″(10/0.7)，

如实施例6.2(d)制备的″HES-GCFS30/0.4偶联物″(30/0.4)，

如实施例6.2(d)制备的″HES-GCFS30/0.7偶联物″(30/0.7)，

如实施例6.2(b)制备的″HES-GCFS50/0.7偶联物″(50/0.7)，

″模拟温育″(＝反应对照，197mg/ml HES50/0.7，MW 47,000D，DS0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach Rodheim，Germany)和载体对照(PBS，使用体积5ml/kg体重)。

在轻乙醚麻醉下，所有动物从眼球后静脉丛中抽取约200μl EDTA全血的血样。在试验前5天，在早晨对已禁食一夜的所有动物采血一次。在试验第1至8天，每天采血2次，间隔为12小时。第1天的第一份血样在施用G-CSF/G-CSF-HES-偶联物之前采集。

白细胞(WBC)计数用Bayer ADVIA^TM120(Fernwald，Germany)来进行。结果如附图22所示。

实施例6.5测定通过还原氨基化作用(实施例6.2(b))由HES50/0.7和G-CSF制备的偶联物的体内半衰期，并与Neupogen和Neulasta(Amgen)作比较

使用雌性小鼠BALB/cOlaHsd(Harlan GmbH/Borchen)。在施用的当天，测定动物的重量(19-22g)。在9只小鼠的尾静脉中按每kg体重100μg的剂量分别静脉注射如实施例6.2(b)制备的化学修饰的rh-G-CSF样品，及Neupogen和Neulasta(Amgen)样品。在注射1，3，6，11，22，30，49，72小时后(见下表)，用含肝素钠(Hirschmann，Eberstadt)的毛细管从每组3只小鼠的尾部静脉或眼球后静脉丛抽取约150μl全血的样品，并贮存在冰上，直至制备血浆。

实施例6.5的表：采样过程的操作

样品	小鼠号	1小时	3小时	6小时	11小时	22小时	30小时	49小时	72小时
样品	小鼠号	1小时	3小时	6小时	11小时	22小时	30小时	49小时	72小时	Neulasta	1	×				×		×
2											1
2	3
4	3		×				×		×
4	5
6	5
6	7												×	×
8	7
8	9
Neupogen	9	10	×				×		×
	11	10
	11	12
	13	12									×				×
	13	14
	15	14
	15	16			×	×
	17	16
	17	18
	HES-G-CSF	18								19	×				×		×
20										19
20		21
22		21		×				×		×
22		23
24		23
24		25											×	×
26		25
26		27

将全血在2000g离心10分钟。把血浆转移到另外的管中，并在3500g再离心5分钟。等分后在-80℃下贮存直至分析的当天。按照制造商的说明，使用ELISA(R&D GmbH，Wiesbaden)法来确定血浆样品中G-CSF的量。

结果如附图36所示，该附图清楚地表明，与Neupogen相比，根据本发明的HES-G-CSF偶联物的半衰期有了较大的增加(5.1小时相对于1.2小时)，与Neulasta相比，其具有基本相等的半衰期(5.1小时相对于5.2小时)。

实施例7HES和重组hEPO通过还原氨基化作用偶联

使用重组人EPO，其具有人EPO的氨基酸序列，并与商业可用的Erypo(Orhto Biotech，Jansen-Cilag)或NeoRecormon(Roche)具有基本相同的特性，参照EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 411 678。

实施例7.1氨基-HES的合成

取10g氧代-HES(MW＝57,000D，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D；使用根据DE 196 28 705 A1制备)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于53mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入2mL 1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到350mL冰冷的2-丙醇(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。在4℃离心收集沉淀产物并用80mL冰冷的2-丙醇洗涤，离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为85％。

实施例7.2醛基-HES的合成

取153mg 4-甲酰基苯甲酸和241mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于51mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入170μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入5.1g根据实施例7.1制备的氨基-HES。在22℃振荡16小时后，把反应混合物加入到360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，并如上所述在360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中沉淀。离心分离后，把沉淀物溶解于50ml水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为87％。

实施例7.3醛基-HES和EPO通过还原氨基化作用偶联

取625mg根据实施例7.2制备的醛基-HES溶解于1.67ml反应缓冲液(0.1M乙酸钠缓冲液，pH 5.0)，并冷却到0℃。加入冷却到0℃的在相同缓冲液中的1.67mL EPO溶液(3mg/ml)和1.67mL 60mM氰基硼氢化钠溶液，该混合液在0℃下温育。17小时后在用凝胶电泳分析后，纯化该反应混合物(见附图23，泳道B)。

实施例7.4反应对照A：在没有氰基硼氢化钠时醛基-HES和EPO的反应

取313mg根据实施例7.2制备的醛基-HES溶解于0.83ml反应缓冲液(0.1M乙酸钠缓冲液，pH 5.0)，并冷却到0℃。加入冷却到0℃的在相同缓冲液中的0.83mL EPO溶液(3mg/ml)和0.83ml反应缓冲液，在0℃温育该混合液。17小时后在用凝胶电泳分析后，纯化该反应混合物(见附图23，泳道C)。

实施例7.5反应对照B：EPO和氰基硼氢化钠的反应

将在反应缓冲液(0.1M乙酸钠缓冲液，pH 5.0)中的0.83mL EPO溶液(3mg/ml)冷却到0℃，加入冷却到0℃的在相同缓冲液中的0.83mL60mM氰基硼氢化钠溶液和0.83ml反应缓冲液，在0℃温育该混合液。17小时后在用凝胶电泳分析后，纯化该反应混合物(见附图23，泳道D)。

实施例7.6用于纯化EPO和EPO衍生物的离子交换层析

EPO样品的纯化可以在室温下使用AKTA explorer 10系统(Amersham Pharmacia Biotech)来进行，该系统包括泵P-903，具有0.6ml腔室的混和器M-925，具有10mm流动池的监视器UV-900，监视器pH/C-900，分段收集器Frac-900，样品环管2ml，以及Unicorn软件版本3.2.1.。用10CV的缓冲液A(20mM N-吗啉代-丙烷磺酸/NaOH缓冲液，pH 8.0)平衡包含5ml Q-Sepharose Fast Flow的柱。将EPO样品按照1∶10的比例用缓冲液A稀释(并最终把pH调节为pH7.8-8.2)，并按1ml/min的流速使用样品泵加样。用10ml缓冲液A洗涤样品泵后，进一步按1.0ml/min的流速用6CV的缓冲液A洗涤该柱。随后按0.8ml/min的流速使用4体积的20mM磷酸钠，pH6.5缓冲液B，用0-40％缓冲液C(0.5M NaCl在20mM磷酸钠，pH 6，5中)的较陡梯度在37分钟内洗脱EPO。记录206，260和280nm处的吸光度来绘制洗脱曲线。在洗脱完成后，用25ml缓冲液C按照1ml/min的流速使柱再生。最后用1M NaOH在该柱上运行60分钟，并用缓冲液C重恢复，保存至下一次使用。

实施例7.7EPO蛋白质测定

EOP蛋白质的定量测定是根据欧洲药典(European Pharmacopeia 4，Monography 01/2002：1316：erythropoietin concentrated solution(红细胞生成素浓缩溶液))在1em径长的杯中测定280nm处的UV吸光度而完成的。此外，可以使用RP-C4柱(Vydac Protein C4，Cat.#214TP5410，GraceVydac，Ca，US)通过RP-HPLC法来定量EPO；该HPLC法用红细胞生成素BRP1参照标准来校准(European Pharmacopeia，Conseil de l′Europe B.P.907-F67029，Strasbourg Cedex1)。

实施例7.8HES-修饰的EPO生物活性的体内测定

根据欧洲药典European Pharmacopeia 4，Monography 01/2002：1316：Erythropoietin concentrated solution(红细胞生成素浓缩溶液)和Ph.Eur.Chapter 5.3：″Statistical Analysis of Results of Biological Assays and Tests(生物测定结果的统计学分析)″所述的方法在红细胞正常的小鼠系统中进行EPO-生物测定；对于实施例7.3的HES-修饰的EPO，测定到在每mg EPO蛋白质中有418500单位的比活性值，这表明与EPO起始物相比，比活性提高了约4-5倍。

该研究的结果如下表所示。

实施例7.8的表

样品说明	所计算的EPO样品的比活性(基于A280和RP-HPLC测定)
样品说明	所计算的EPO样品的比活性(基于A280和RP-HPLC测定)	EPO起始物(未修饰)	89000U/mg
EPO起始物(反应对照A)	88500U/mg	EPO起始物(未修饰)	89000U/mg
EPO起始物(反应对照A)	88500U/mg	根据实施例7.3的EPO HES	418500U/mg

实施例8通过还原氨基化作用合成HES-IFN-α偶联物

使用的IFN-α是利用大肠杆菌(E.coli)通过重组DNA技术制得的重组人干扰素α-2b。它包含165个氨基酸并且氨基酸序列与天然的人干扰素α2b(hIFN-α2b)相同。

实施例8.1氧代-HES的合成

如下所述的在其还原端被氧化的HES(氧代-HES)是如DE 196 28705 A1所述用碱性碘溶液由HES制备而成的，在此将DE 196 28 705 A1(实施例A，第9栏，第6到24行)的内容引入本文作为参考。

实施例8.2HES衍生物的合成

在两步法中，用胺在实施例8.1的氧代-HES的还原端修饰该化合物，在第二反应中引入醛基。所得到的醛基-HES用于通过实施例8.3所述的还原氨基化作用制备IFN-α-HES偶联物。

实施例8.2.1从实施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES

取5.12g实施例8.1的氧代-HES(MW＝14.5kD，DS＝0.41，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于25mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入5.13mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗涤，并离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为67％。

实施例8.2.2从实施例8.2.1的氨基-HES合成醛基-HES

取105mg 4-甲酰基苯甲酸和135mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于7mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入135μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入0.7g氨基-HES(如实施例8.2.1所述合成)。在22℃振荡18小时后，把反应混合物加入到42mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于5mLDMF中，并如上所述在42mL乙醇/丙酮中沉淀。离心分离后，把收集的沉淀物溶解于水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为95％。

实施例8.2.3从实施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES

取6.02g实施例8.1的氧代-HES(MW＝14.7kD，DS＝0.76，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于32mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入6.03mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物，用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗涤，并离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为52％。

实施例8.2.4从实施例8.2.3的氨基-HES合成醛基-HES

取150mg 4-甲酰基苯甲酸和230mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入204μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入1g氨基HES(如实施例8.2.3所述合成)。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到84mL冰冷的2-丙醇中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences DeutschlandGmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为83％。

实施例8.2.5从实施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES

取5g实施例8.1的氧代-HES(MW＝28kD，DS＝0.41，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于28mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.67mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到175mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物。将粗产品溶解于40mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率没有测定。

实施例8.2.6从实施例8.2.5的氨基-HES合成醛基-HES

取130mg 4-甲酰基苯甲酸和153mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于36mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入110μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Al drich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入2.61g氨基-HES(如实施例8.2.5所述合成)。在22℃振荡22.5小时后，把反应混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗涤。离心分离后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析1天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为81％。

实施例8.2.7从实施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES

取5g实施例8.1的氧代-HES(MW＝30.8kD，DS＝0.76，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热过夜，在氮气下溶解于28mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.67mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到175mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物。将粗产品溶解于40mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率没有测定。

实施例8.2.8从实施例8.2.7的氨基-HES合成醛基-HES

取122mg 4-甲酰基苯甲酸和144mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufirchen，D)溶于34mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入103μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入2.46g氨基-HES(如实施例8.2.7所述合成)。在22℃振荡22.5小时后，把反应混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗涤。离心分离后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为87％。

实施例8.2.9从实施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES

取10g氧代-HES(MW＝42.1kD，DS＝0.41，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热2天，然后在氮气下溶解于53mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入2.01mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到350mL冰冷的2-丙醇(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。在4℃离心收集沉淀产物并用80mL冰冷的2-丙醇洗涤，离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为76％。

实施例8.2.10从实施例8.2.9的氨基-HES合成醛基-HES

取900mg 4-甲酰基苯甲酸和1053mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufirchen，D)溶于30mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入930μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入3g氨基-HES(如实施例8.2.9所述合成并溶解于20mL N，N-二甲基甲酰胺中)。在22℃振荡22.5小时后，把反应混合物加入到210mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，并用冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物洗涤。离心分离后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为97％。

实施例8.2.11从实施例8.1(A)的氧代-HES合成氨基-HES

取6.09g氧代-HES(MW＝56.8kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热过夜，然后在氮气下溶解于32mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.22mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到150mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物中。在4℃离心收集沉淀产物并用40mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)的混合物洗涤，离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为82％。

实施例8.2.12从实施例8.2.11的氨基-HES合成醛基-HES

取125mg 4-甲酰基苯甲酸和174mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于38mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入155μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入3.8g氨基-HES(如实施例8.2.11所述合成)。在22℃振荡19小时后，把反应混合物加入到160mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，并再溶解于20mL N，N-二甲基甲酰胺中，用80mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。离心分离后，把沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为77％。

实施例8.2.13从实施例8.1(B)的氧代-HES合成氨基-HES

取10g氧代-HES(MW＝56.8kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热过夜，然后在氮气下溶解于53mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入2mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃搅拌17小时后，将反应混合物加入到350mL冰冷的2-丙醇(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。在4℃离心收集沉淀产物并用80mL冰冷的2-丙醇洗涤，离心收集。将粗产品溶解于80mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为85％。

实施例8.2.14从实施例8.2.13的氨基-HES合成醛基-HES

取153mg 4-甲酰基苯甲酸和241mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于51mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入170μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入5.1g氨基-HES(如实施例8.2.13所述合成)。在22℃振荡16小时后，把反应混合物加入到360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，如上所述用360mL冰冷的丙酮和乙醇1∶1(v/v)混合物沉淀。离心分离后，把沉淀物溶解于50mL水中，在水中透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为87％。

实施例8.2.15从实施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES

取5.0g氧代-HES(MW＝29.3kD，DS＝0.86，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热过夜，然后在氮气下溶解于20mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入1.67mL 1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)。在40℃搅拌30.5小时后，将反应混合物加入到175mL冰冷的丙酮(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)的1∶1(v/v)混合物中。在4℃离心120分钟收集沉淀产物，并溶解于40mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值10kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为87％。

实施例8.2.16从实施例8.2.15的氨基-HES合成醛基-HES

取150mg 4-甲酰基苯甲酸和230mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入166μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入在20ml DMF中的3.02g氨基HES(如实施例8.2.15所述合成)溶液。在22℃振荡16小时后，把反应混合物加入到215mL冰冷的丙酮(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于20mL水中，并用如上所述的丙酮/乙醇沉淀。离心分离后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析2.5天(SnakeSkin透析管，阻断值10kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为87％。

实施例8.2.17从实施例8.1的氧代-HES合成氨基-HES

取5.0g氧代-HES(MW＝97.9kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)在80℃真空加热过夜，然后在氮气下溶解于20mL干燥二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，加入0.50mL 1，4-二氨基丁烷(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)。在40℃搅拌30.5小时后，将反应混合物加入到175mL冰冷的丙酮(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)的1∶1(v/v)混合物中。在4℃离心120分钟收集沉淀产物，并溶解于40mL水中，在水中透析2天(Snake Skin透析管，阻断值10kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为90％。

实施例8.2.18从实施例8.2.17的氨基-HES合成醛基-HES

取73mg 4-甲酰基苯甲酸和112mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，加入81.3μl N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在21℃温育30分钟后，加入在20ml DMF中的3.09g氨基HES(如实施例8.2.17所述制备)溶液。在22℃振荡16小时后，把反应混合物加入到215mL冰冷的丙酮(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于20mL水中，如上所述用丙酮/乙醇沉淀。离心分离后，把沉淀物溶解于30mL水中，在水中透析2.5天(Snake Skin透析管，阻断值10kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。分离产物的收率为96％。

实施例8.3通过还原氨基化作用合成IFN-α偶联物

实施例8.3.1以20μg的规模与IFN-α偶联

向溶解于包含150mM NaCl和0.3mM EDTA的0.375ml 25mM磷酸钠缓冲液pH7.5中的0.675mg IFN-α中加入4ml反应缓冲液(0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0)，将该溶液在Vivaspin 6浓缩器(Viva Science，5kDMWCO，Hannover，Germany)中按3939xg离心30分钟。用反应缓冲液把残留溶液稀释成6ml并如上所述离心，将该洗涤过程重复两次。IFN-α溶液的最终体积是0.236ml，相应地经计算IFN-α的最终浓度是2.86mg/ml。该蛋白质浓度没有通过实验进行证实。

向如上所述制备并冷却到0℃的7μl IFN-α溶液中，分别加入在相同缓冲液(乙酸钠，pH5.0)中并冷却到0℃的10μl(50当量)相应醛基-HES(见下表)溶液和11.3μl 60mM氰基硼氢化钠溶液。将该混合物在0℃温育17小时。用凝胶电泳分析该反应混合物。下面是所使用的醛基-HES溶液的浓度：

实施例8.3.1的表

条目	HES-衍生物	浓度[mg/ml]
条目	HES-衍生物	浓度[mg/ml]	A	醛基-HES(实施例8.2.2)	52
B	醛基-HES(实施例8.2.4)	52	A	醛基-HES(实施例8.2.2)	52
B	醛基-HES(实施例8.2.4)	52	C	醛基-HES(实施例8.2.6)	156
D	醛基-HES(实施例8.2.8)	156	C	醛基-HES(实施例8.2.6)	156
D	醛基-HES(实施例8.2.8)	156	E	醛基-HES(实施例8.2.10)	260
F	醛基-HES(A)(实施例8.2.12)	260	E	醛基-HES(实施例8.2.10)	260
F	醛基-HES(A)(实施例8.2.12)	260	G	没有HES衍生物，但有NaCNBH₃	-
I	没有HES衍生物，也没有NaCNBH₃	-	G	没有HES衍生物，但有NaCNBH₃	-
I	没有HES衍生物，也没有NaCNBH₃	-	J	未氧化的HES10/0.4(Mw 7.6kD；DS＝0.41)和NaCNBH₃	52
K	未氧化的HES10/0.4(Mw 7.6kD；DS＝0.41)，没有NaCNBH₃	52	J	未氧化的HES10/0.4(Mw 7.6kD；DS＝0.41)和NaCNBH₃	52

偶联物的SDS-Page分析如附图24所示。

实施例8.3.2以3mg的规模与IFN-α偶联

向溶解于包含150mM NaCl和0.3mM EDTA的25mM磷酸钠缓冲液pH7.5中的20mg IFN-α中加入8ml反应缓冲液(0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0)，将该溶液在Vivaspin 15R浓缩器(Viva Science，5kD MWCO，Hannover，Germany)中按3939xg离心99分钟。用反应缓冲液把残留溶液稀释成18ml并如上所述离心，将该洗涤过程重复两次。用反应缓冲液把IFN-α溶液稀释成6.66ml，计算IFN-α的最终浓度是3mg/ml。该蛋白质浓度没有经实验进行证实。

向如上所述制备并冷却到0℃的1ml IFN-α溶液中加入在相同缓冲液(乙酸钠，pH5.0)中并冷却到0℃的1ml醛基-HES(75当量)溶液和1ml 60mM氰基硼氢化钠溶液。将该混合物在0℃温育22小时。用凝胶电泳分析该反应混合物后纯化该反应混合物。对于在条目G中所述的反应，只使用0.666μl的相应溶液。下面是所使用的醛基-HES溶液的浓度：

实施例8.3.2的表

条目	HES-衍生物	浓度[mg/ml]
条目	HES-衍生物	浓度[mg/ml]	A	醛基-HES(实施例8.2.2)	117
B	醛基-HES(实施例8.2.4)	117	A	醛基-HES(实施例8.2.2)	117
B	醛基-HES(实施例8.2.4)	117	C	醛基-HES(实施例8.2.6)	350
D	醛基-HES(实施例8.2.8)	350	C	醛基-HES(实施例8.2.6)	350
D	醛基-HES(实施例8.2.8)	350	E	醛基-HES(实施例8.2.10)	584
F	醛基-HES(A)(实施例8.2.12)	584	E	醛基-HES(实施例8.2.10)	584
F	醛基-HES(A)(实施例8.2.12)	584	G	未氧化的HES10/0.4(Mw 7.6kD；DS 0.41)	117

偶联物的SDS-Page分析如附图25所示。

实施例8.3.3以3mg的规模与IFN-α偶联

实施例8.3.3.1通过还原氨基化作用将如实施例8.2.16制备的醛基-HES和IFN-α偶联

向溶解于包含150mM NaCl和0.3mM EDTA的25mM磷酸钠缓冲液pH7.5中的10mg IFN-α中加入8ml反应缓冲液(0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0)，将该溶液在Vivaspin 15R浓缩器(Viva Science，5kD MWCO，Hannover，Germany)中按3939xg离心30分钟。用反应缓冲液把残留溶液稀释成18ml并如上所述离心，将该洗涤过程重复两次。用反应缓冲液把终IFN-α溶液稀释成3.33ml，计算IFN-α的最终浓度是3mg/ml。该蛋白质浓度没有经实验进行证实。

向如上所述制备并冷却到0℃的1ml IFN-α溶液中加入在相同缓冲液中并冷却到0℃的1ml如实施例8.2.16制备的醛基-HES(75当量，352mg/ml)溶液和1ml 60mM氰基硼氢化钠溶液。将该混合物在0℃温育22小时。用凝胶电泳分析该反应混合物后纯化该反应混合物。使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

实施例8.3.3.2通过还原氨基化作用将如实施例8.2.18制备的醛基-HES和IFN-α偶联

向如实施例8.3.3.1所述制备并冷却到0℃的1ml IFN-α溶液中加入在相同缓冲液中并冷却到0℃的2ml如实施例8.2.18制备的醛基-HES(75当量，369mg/ml)溶液和1.5ml 60mM氰基硼氢化钠溶液。将该混合物在0℃温育22小时。用凝胶电泳分析该反应混合物后纯化该反应混合物。使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

实施例8.3.3.3反应对照：HES10/0.4(Mw 7.6kD；DS＝0.41)和IFN-α通过还原氨基化作用的偶联

向如实施例8.3.3.1所述制备并冷却到0℃的1mlIFN-α溶液中加入在相同缓冲液中并冷却到0℃的1ml HES10/0.4(75当量，117mg/ml)溶液和1ml 60mM氰基硼氢化钠溶液。将该混合物在0℃温育22小时。用凝胶电泳分析该反应混合物后纯化该反应混合物。使用XCell SureLock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用在还原条件下的12％Bis-Tris凝胶和MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

偶联物的SDS-Page分析如附图26所示。

实施例8.3.4以16mg的规模与IFN-α偶联

如实施例8.3.2所述更换20mg IFN-α溶液的缓冲液。用反应缓冲液把IFN-α终溶液稀释成6.37ml，经计算IFN-α的最终浓度是3.14mg/ml。用900μl反应缓冲液稀释100μl上述溶液，以摩尔消光系数18000为基准，用分光光度计在279nm处测量的蛋白质的浓度为3.01mg/ml。在与确定蛋白质浓度的物质组合后，最终体积为7.0ml，蛋白质浓度为2.74mg/ml。

向如上所述制备并冷却到0℃的5.91ml该IFN-α溶液(16.2mg)中加入在相同缓冲液(乙酸钠，pH5.0)中并冷却到0℃的在5ml反应缓冲液中的3.152g如实施例8.2.14的醛基-HES(75当量)和6ml 60mM氰基硼氢化钠溶液，并将该混合物在0℃温育22小时(见附图27，泳道A)。

作为反应对照，将1.09ml预冷的IFN-α溶液(3mg)，与在相同缓冲液中并冷却到0℃的1ml在反应缓冲液中的122mg非氧化HES10/0.4(Mw 7.6kD DS＝0.41)和1ml 60mM氰基硼氢化钠溶液混合(见附图27，泳道B)。

偶联物的SDS-Page分析如附图27所示。

实施例8.4IFN-α-HES偶联物的纯化

8.4.1通过还原氨基化的蛋白质与活化的HES衍生物温育纯化HES-IFN-α(从HES-衍生物中分离修饰和未修饰的蛋白质)

用AKTA explorer 10设备在室温下进行所有样品的纯化。用10CV的缓冲液A(20mM Tris/HCl，pH 8.0)使包含3ml Q-Sapharose Fast Flow的柱平衡。该样品按1∶10的比例用缓冲液A稀释，并按1ml/min的流速使用样品泵加样。用10ml缓冲液A洗涤样品泵后，进一步按1.0ml/min的流速用6CV的缓冲液A洗涤该柱。随后使用超过2CV的0-100％缓冲液B(0.3NaCl在20mM Tris/HCl，pH 8.0)线性梯度在37分钟内洗脱，并按0.8ml/min的流速用0.5CV的缓冲液B等度过柱。按照0.8ml/min的流速使用2CV缓冲液C(1.5M NaCl在20mM Tris/HCl中，pH 8.0)，然后使用0.5CV缓冲液B使柱再生。使用流速1.0ml/min和6CV的缓冲液A进行重平衡，以便下一次运行。

8.4.2材料和方法

设备：AKTA explorer 10(Amersham Pharmacia Biotech)，具有：

泵P-903

混合器M-925，具有0.6ml腔室

监视器UV-900，具有10mm流动池

监视器pH/C-900

泵P-950(样品泵)

软件Unicorn版本3.21

柱：Amersham Biosciences C 10/10

柱材料：Q-Sepharose Fast Flow，编号17-0510-01，批号OD 06453

柱体积：3ml

缓冲液A：20mM Tris/HCl，pH 8.0，Lot-Nr.PL0746

缓冲液B：0.3M NaCl在20mM Tris/HCl中，pH 8.0，Lot-Nr.PL0747

缓冲液C：1.5M NaCl在20mM Tris/HCl中，pH 8.0，Lot-Nr.PL0748

方法

体积步骤缓冲液流速

1CV 平衡 100％缓冲液A 1.0ml/min

5-28ml 加样在缓冲液A中1∶10样品 1.0ml/min

10ml 洗涤样品泵 100％缓冲液A 1.0ml/min

5CV 洗出未结合样品 100％缓冲液A 1.0ml/min

开始分级分离 100％缓冲液A 1.0ml/min

6CV 洗脱，线性梯度 0-100％缓冲液B 0.8ml/min

2CV 等度洗脱 100％缓冲液B 0.8ml/min

2CV 再生 100％缓冲液C 0.8ml/min

0.5CV 再生 100％缓冲液B 0.8ml/min

停止分级分离 100％缓冲液B 0.8ml/min

5CV 再平衡 100％缓冲液A 1.0ml/min

检测：280nm，260nm，220nm

pH

传导性

分级分离：1ml级分

8.4.3结果

8.4.3.1根据实施例8的样品

样品组成：1mg EP2001(rhIFN-a2b)在25mM磷酸钠，0.13M NaCl和0.3mM EDTA，pH 7.5±0.2中

起始体积：0.5ml，按1∶10用缓冲液A＝5ml稀释

流过/洗涤：9.3ml

运行日期：2004-09-29

运行编号：QS24D39(见实施例8.4.4.1的表)

8.4.3.2根据实施例8.3.2(条目A)的样品

样品组成：2.5mg EP2001+97.5mg醛基HES10/0.4(NZA256)在0.1mM乙酸钠，20mM氰基硼氢化钠，pH 5.0中

起始体积：2.5ml，按1∶10用缓冲液A＝25ml稀释

流过/洗涤：44ml

运行日期：2004-09-29

运行编号：QS25 D56(见实施例8.4.4.1的表)

8.4.3.3根据实施例8.3.2(条目B)的样品

样品组成：2.5mg EP2001+97.5mg醛基HES10/0.7(NZA235A)在0.1mM乙酸钠，20mM氰基硼氢化钠，pH 5.0中

起始体积：2.5ml，按1∶10用缓冲液A＝25ml稀释

流过/洗涤：41ml

运行日期：2004-09-30

运行编号：QS26 D57(见实施例8.4.4.1的表)

8.4.3.4根据实施例8.3.2(条目C)的样品

样品组成：2.5mg EP2001+292mg醛基HES30/0.4(NZA328)在0.1mM乙酸钠，20mM氰基硼氢化钠，pH 5.0中

起始体积：2.5ml，按1∶10用缓冲液A＝25ml稀释

流过/洗涤：42ml

运行日期：2004-09-30

运行编号：QS27 D58(见实施例8.4.4.1的表)

8.4.3.5根据实施例8.3.2(条目D)的样品

样品组成：2.5mg EP2001+292mg醛基HES30/0.7(NZA329)在0.1mM乙酸钠，20mM氰基硼氢化钠，pH 5.0中

起始体积：2.5ml，按1∶10用缓冲液A＝25ml稀释

流过/洗涤：40ml

运行日期：2004-09-30

运行编号：QS28D59(见实施例8.4.4.1的表)

8.4.3.6根据实施例8.3.2(条目E)的样品

样品组成：2.5mg EP2001+487mg醛基HES50/0.4(NZA303)在0.1mM乙酸钠，20mM氰基硼氢化钠，pH 5.0中

起始体积：2.7ml，按1∶10用缓冲液A＝27ml稀释

流过/洗涤：50ml

运行日期：2004-09-30

运行编号：QS29 D60(见实施例8.4.4.1的表)

8.4.3.7根据实施例8.3.2(条目F)的样品

样品组成：2.5mg EP2001+487mg醛基HES50/0.7(NZA309)在0.1mM乙酸钠，20mM氰基硼氢化钠，pH 5.0中

起始体积：2.6ml，按1∶10用缓冲液A＝26ml稀释

流过/洗涤：50ml

运行日期：2004-09-30

运行编号：QS30 D61(见实施例8.4.4.1的表)

8.4.3.8根据实施例8.3.2(条目G)的样品

样品组成：1.7mg EP2001+98mg醛基HES10/0.4(Supramol Lot.407B)在0.1mM乙酸钠，20mM氰基硼氢化钠，pH 5.0中

起始体积：2.5ml，按1∶10用缓冲液A＝25ml稀释

流过/洗涤：42ml

运行日期：2004-10-1

运行编号：QS31 D62(见实施例8.4.4.1的表)

8.4.4结果比较

8.4.4.1 IFN-α洗脱峰的SDS-PAGE′分析

表1：在HES化的IFN-α的Q-Sepharose层析中在280nm处检测到的峰面积的比较(实施例8.4.4.1的表)

运行编号	计算的未修饰的IFN-α的应用量	洗脱面积(280nm)[mAU×ml]	洗脱面积(280nm)/mg未修饰的蛋白质[mAU×ml×mg^-1]	计算的总蛋白质产量[mg](在280nm处HPLC-定量)^*
运行编号	计算的未修饰的IFN-α的应用量	洗脱面积(280nm)[mAU×ml]	洗脱面积(280nm)/mg未修饰的蛋白质[mAU×ml×mg^-1]	计算的总蛋白质产量[mg](在280nm处HPLC-定量)^*	QS-24D39	1.0mg	961	961	0.42
QS-25D56	2.5mg	4370	1748	1.20	QS-24D39	1.0mg	961	961	0.42
QS-25D56	2.5mg	4370	1748	1.20	QS-26D57	2.5mg	5669	2268	1.64
QS-27D58	2.5mg	3350	1340	1.60	QS-26D57	2.5mg	5669	2268	1.64
QS-27D58	2.5mg	3350	1340	1.60	QS-28D59	2.5mg	2854	1142	1.54
QS-29D60	2.5mg	2255	902	1.52	QS-28D59	2.5mg	2854	1142	1.54
QS-29D60	2.5mg	2255	902	1.52	QS-30D61	2.5mg	9278	3711	3.44
QS-31D62	1.7mg	1918	1128	1.40	QS-30D61	2.5mg	9278	3711	3.44

^*来自RP-HPLC-3的定量分析的数据

实施例9 IFN-α抗病毒活性生物测定概述

实验程序概述：干扰素-α的抗病毒活性

在细胞培养基中预稀释测试物后，制备连续二倍稀释液。在96孔微量滴定板中，每个稀释度重复4份，将稀释的干扰素加入到新受胰蛋白酶消化的MDBK细胞(每孔40000个细胞)中。该测定在37℃温育24小时(每孔总体积：150μL(实施例9.1)或175μL(实施例9.2、9.3、9.4、10))。

然后，每孔(除阳性对照孔外)加入50μL稀释的VSV母液，得到0.1的感染复数。

在每个测定中包括下列的对照物：12个孔，其接受病毒和细胞培养基来代替干扰素(阴性对照)，和12个孔，其接受细胞培养基来代替干扰素和病毒(阳性对照)。

该测定在37℃温育42小时。

在培养期结束时，用50μL的MTT溶液(在细胞培养基中至少2mg/mL)置换每孔中的细胞培养上清液。将细胞培养3小时。向每孔中加入100μL异丙醇/HCl溶液(含40mM HCl的异丙醇)来溶解由增殖细胞形成的紫色甲染料。随后，在微量滴定板读数器上测定在570/630nm处溶液的吸光度值。

对于每个干扰素稀释度，用下式计算在干扰素和VSV存在下生长的MDBK细胞的增殖活性：

对于每个测试物，在4个分别的测定中确定干扰素-α的抗病毒活性。

实施例9.1 Intron A相对于NIH标准品的抗病毒活性

在所有实验中，使用Intron A(IFN-α2b，Schering-Plough)作为实验室内部参照物，其用NIH-标准品rhIFN-α2a(NIAID，NIH，Bethesda，USA，Gxa01-901-535)校准。NIH-标准品的比活性为9,000IU/ml。在实施例9所述的测试中实验室内部参照物Intron A具有8,487,000IU/ml的比活性。

Intron A相对于NIH-标准品rhIFN-α2a的增殖活性如附图28所示。

实施例9.2模拟温育的IFN-α-HES相对于未修饰的起始物的抗病毒活性

如实施例8.3.4所述，使用模拟温育的IFN-α-HES(如实施例8.3.2所述，条目G)作为反应对照。将该物质的抗病毒活性与未修饰的起始物的抗病毒活性相比较，来研究偶联和纯化过程对于生物活性的影响。模拟温育对于IFN-α的体外生物活性没有影响。

模拟温育的IFN-α-HES与未修饰的IFN-α起始物相比的相对体外活性如附图29所示。

实施例9.3 IFN-α-HES偶联物相对于IntronA的抗病毒活性

在实施例9所述的测定系统中，测定该偶联物(根据实施例8.4纯化的实施例8.3.2的条目A、B、C、D、E)并与未修饰的IFN-α起始物、Intron A和Pegasys(Roche)比较。计算该物质的CPE50的浓度。所有IFN-α-HES偶联物保持了基本上高于Pegasys的抗病毒活性。

IFN-α-HES偶联物与未修饰的IFN-α起始物、Intron A和Pegasys相比的相对体外活性如附图30所示。

实施例9.4 IFN-α-HES偶联物与Intron A相比的抗病毒活性

在实施例9所述的测定系统中，测定根据实施例8.4纯化的实施例8.3.4的IFN-α-HES偶联物并与Intron A比较。计算该物质的CPE50浓度。IFN-α-HES偶联物保持了比Intron A高25％的抗病毒活性。

IFN-α-HES偶联物与Intron A相比的相对体外活性如附图31所示。

实施例9.5 IFN-α-HES偶联物与Intron A相比的抗病毒活性

在实施例9所述的测定系统中，测定根据实施例8.4纯化的实施例8.3.3的IFN-α-HES偶联物并与Intron A和PegIntron比较。计算该物质的CPE50浓度。IFN-α-HES偶联物保持了与Intron A相比约25％的抗病毒活性，与PegIntron的体外活性处于同样的水平。

IFN-α-HES偶联物与Intron A相比的相对体外活性如附图38所示。

实施例10 IFN-α-HES偶联物的体内生物活性(在小鼠中的PK研究)

实施例10.1小鼠血清对如实施例9所述的测定系统的影响

在细胞培养基(对照)和小鼠血清(1∶40稀释液和1∶80稀释液)中制备干扰素-α的稀释液。如实施例9所述进行测定。

对于对照、1∶40稀释的小鼠血清和1∶80稀释的小鼠血清，在两个分别的测定中确定干扰素-α的抗病毒活性。结果表明，1∶40稀释和1∶80稀释的小鼠血清不会影响对干扰素-α抗病毒活性的生物测定。

实施例10.2在小鼠中的体内研究(I)

在抗病毒测定中测定混合血清的抗病毒活性。在每个时间点从两只小鼠(雌性BALB/c小鼠，8周大)收集血清，小鼠在静脉注射30μg/kg(以蛋白质含量为基准)干扰素-α或干扰素-α-HES偶联物2小时、4小时、12小时和24小时后被处死。

融化并通过涡旋(和稀释)充分均质化该血清样品。在细胞培养基中制备连续二倍稀释液。融化并通过涡旋充分均质化一瓶Intron A(已稀释的)。在细胞培养基中制备连续二倍稀释液。

根据如实施例9所述的1∶2稀释系列的剂量响应曲线来确定在CPE-测定中的EC50-稀释度。

确定该物质的半衰期并与未修饰的起始物和Pegasys比较。由EC50-稀释度相对于注射后时间的半对数图来计算半衰期。

测定(i)IFN-α-HES(实施例8.3.2，表的条目B)，(ii)IFN-α-HES(实施例8.3.2，表的条目D)，(iii)IFN-α-HES(实施例8.3.4)在高达24小时的抗病毒活性。从附图32中可以看出，半衰期从(i)(约3小时)超过(ii)(约5小时)到(iii)(约7小时)逐渐增加。

对于未修饰的IFN-α，血清的抗病毒活性太低而无法计算血清半衰期。在K.R.Reddy等，Advaced Drug Delivery Reviews 54(2002)571-586中，测定了IFN-α在大鼠中的血清半衰期(静脉内)为2小时。

实施例10.3在小鼠中的体内研究(II)

测定(i)PegIntron，(ii)IFN-α-HES30/0.8(实施例8.3.3.1)和(iii)IFN-α-HES 100/0.7(实施例8.3.3.2)在高达24小时的抗病毒活性。从附图37中可以看出，半衰期从(i)(约3.6小时)到(ii)和(iii)(约6.5和6.8小时)增加。

实施例11 IFN-α-HES偶联物的体内生物活性(在家兔中的PK研究)

实施例11.1 IFN-α和IFN-α-HES偶联物的放射性标记

采用氯胺T法用¹²⁵I标记用于PK研究的样品。氯胺T与碘化物反反应，生成卤间化合物类型(I-Cl)。该卤间化合物在酪氨酸的芳环上反应并在邻位取代。

实施例11.2参照实验：用¹²⁵I标记氧代-HES 50/0.4

在第一实验系列中，在给定的反应条件下，研究用例如HES和碘、多聚碘或多聚碘化物形成的络合物是否可以探测到痕量的碘。在比较中，在相同条件下标记氧代-HES(MW 42.1kD DS＝0.41)和IFN-α-HES(实施例8.3.2，表的条目E)，在纯化过程后测定样品中的放射性。根据文献报道，当螺旋结构有至少11个脱水葡萄糖单元时，支链淀粉可以和碘、多聚碘或多聚碘化物形成络合物。

仅仅在IFN-α-HES样品中，探测到了放射性。该结果证明，是IFN-α的酪氨酸残基的共价修饰，而不是在纯化过程中不能避免的潜在物理结合的碘，唯一地导致了放射性。可以考虑把氧代-HES 50/0.4(MW＝42.1kD，DS＝0.41)作为阴性对照。考虑到该氧代-HES类型的高分子量和低取代程度，如果存在的话，可以期望会存在最长的螺旋结构，因此在这种情况下，存在最高的碘络合物的危险。

实施例11.3用非放射性碘标记干扰素-α(“冷碘化作用”)

采用与IFN-α-HES偶联物50/0.4相同的标记和纯化方法用非放射性碘标记干扰素-α。在抗病毒测定中，其保持了抗病毒活性。但是，没有进行定量，因为在标记和纯化过程中，浓度发生了改变，由于可用物质的量太少而无法进行测定。

实施例11.4IFN-α-HES偶联物的放射性标记

根据实施例11.1用放射性¹²⁵I标记样品。该样品是IFN-α起始物，IFN-α-HES(实施例8.3.2，表的条目D)。该样品的比活性为38μCi/μg(IFN-α起始物)，41μCi/μg(IFN-α-HES30/0.7)。

实施例11.5在家兔中的体内PK研究

实施例11.5.1实验程序

该实验项目使用稀释液。制备4μCi/ml的溶液。稀释缓冲液是PBS。

4只新西兰白兔HsdIf：NZW.Source Harlan Winkelmann GmbH，D-33178Borchen.，性别：雌性；在实验开始时的体重：＞2.5kg。所有动物均静脉注射放射标记的受试物质，接受体积为1ml/kg体重，相当于4μCi/kg体重的剂量。在确定的时间点采集血样。在每个采样点，从动物的耳静脉采集约600μl血液用于进一步研究。

为了采血样，在全身性麻醉(氯胺酮/甲苯噻嗪)下将静脉留置导管放入耳静脉内。在应用前的采血点、应用本身和应用后最初的3个采血点(0.5小时、1小时和2小时)时维持麻醉。把导管留在动物内用于进一步的采样点，直至被动物本身切断。用插入耳静脉不同区域的插管来确定进一步的采血。

在采集血样后进行进一步的血样处理。为了测定血液内的放射性标记测试物，可以根据特定的溶解方案来处理收集的血样。为此，将250μl的血样转移到新的瓶中，并加入等量的Solvable^TM。在摇动的水浴中将样品在50℃温育1小时。在温育时间后，把样品冷却到室温，加入100μl EDTA-溶液[100mM]。随后加入300μl H₂O₂[30％]，在再次摇动后，在摇动的水浴中将样品在50℃温育1小时。在进一步处理前，收集样品。

在收集血液和溶解结束后，把样品转移到20ml闪烁瓶中，加入10ml闪烁混合物Ultima Gold^TM。把样品在2-8℃的黑暗中保存，直至在闪烁计数器中进行同位素¹²⁵I的测定(在加入混合物约72小时后)。

在数据的处理和统计分析之前，确定在特定实验条件下活性猝灭。回归系数(r²＝0.9970)是与线性拟合的参数。发现猝灭因数[pCi/cpm]是3.315938。

结果(见附图33)：

与起始物相比，IFN-α-HES显示出了显著延长的半衰期。在超过24小时的时间里(约＜1000pCi/ml)，未修饰物质的曲线变平，几乎没有观测到活性降低。测定的所有样品的放射性具有较小的标准差，证明了实验的质量。

由血样中IFN-α的浓度计算半衰期。该评估显示在附图34中，只考虑在4到24小时之间采集的血样的数据。对于未修饰物质，计算的半衰期为7小时。含有IFN-α-HES时，观测到半衰期有实质的增加(约33小时)。

根据附图35a和b的图所示的不同区室模型(截取0-12小时)对数据进行统计学分析。在一室模型中，明显地，在注射后的最初2小时期间，IFN-α的浓度迅速地降低。对于IFN-α-HES，半衰期明显地延长。IFN-α的统计学计算的半衰期是0.26小时，IFN-α-HES是7.7小时。根据非区室模型，统计学分析的结果为，未修饰的IFN-α的半衰期是147小时(基于24-120小时的数据)，IFN-α-HES的半衰期是42.7小时(基于36-120小时的数据)。如上所述，由于曲线在24小时后变平，未修饰的IFN-α的半衰期实质性地延长。

下表中概述了这两个样品的半衰期，其基于所述的计算模型。

实施例11.5.1的表

根据不同模型计算的IFN-α和IFN-α-HES的半衰期

	IFN-α起始物t_1/2	IFN-α-HESt_1/2
	IFN-α起始物t_1/2	IFN-α-HESt_1/2	非区室模型一室模型半对数图(见图33，4-24小时)	(147.0^*)0.267	42.7^**7.733

^*计算24-120小时的数据，^**计算36-120小时的数据

Claims

1.一种制备包含蛋白质和聚合物的偶联物的方法，其中该聚合物是羟烷基淀粉，所述方法包括：

(a)(1)通过开环氧化反应在聚合物中引入至少一个醛基，或者

(a)(2)聚合物与至少双官能化合物反应，所述化合物包含两个官能团M和Q，一个官能团M与聚合物反应，一个官能团Q是

(i)一个醛基或酮基或半缩醛基；或

(ii)一个可以化学修饰成醛基或酮基或半缩醛基官能化的聚合物衍生物的官能团；和

(b)通过还原氨基化作用把聚合物或其衍生物的至少一个醛基或酮基或半缩醛基与蛋白质的至少一个氨基共价连接。

2.如权利要求1的方法，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。

3.如权利要求2的方法，其中羟乙基淀粉的分子量是2到200kD，优选4到130kD，更优选4到70kD。

4.如权利要求1到3任一的方法，其中还原氨基化作用在水性介质中进行。

5.如权利要求1到4任一的方法，其中还原氨基化作用在NaCNBH₃存在下进行。

6.如权利要求1到5任一的方法，其中还原氨基化作用在pH7.5，优选7或更低的pH下进行。

7.如权利要求6的方法，其中pH是6或更低。

8.如权利要求1到7任一的方法，其中还原氨基化作用在0到25℃的温度下进行。

9.如权利要求1到8任一的方法，其中在(a)(1)中该聚合物用高碘酸盐进行开环氧化反应，得到具有至少一个醛基的聚合物衍生物。

10.如权利要求9的方法，其中开环氧化反应在水性介质中进行。

11.如权利要求9或10的方法，其中开环氧化反应在0到5℃的温度下进行。

12.如权利要求9到11任一的方法，其中使用的该聚合物具有非氧化形式的还原端。

13.如权利要求1到8任一的方法，其中在(a)(2)中官能团M是羧基或反应性羧基，官能团Q是醛基或酮基或半缩醛基。

14.如权利要求13的方法，其中包含M和Q的双官能化合物选自甲酰苯甲酸、4-甲酰苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、和4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。

15.如权利要求1到8任一的方法，其中在(a)(2)(ii)中官能团M是氨基，官能团Q是氨基。

16.如权利要求15的方法，其中包含两个氨基M和Q的化合物是具有2到20个碳原子的任选取代的二氨基烷。

17.如权利要求16的方法，其中该二氨基烷选自1，2-二氨基乙烷、1，3-二氨基丙烷、和1，4-二氨基丁烷。

18.如权利要求15到17任一的方法，另外还包括聚合物衍生物-其得自聚合物与包含两个氨基M和Q的至少双官能化合物的反应-在氨基Q上与另一种包含羧基或反应性羧基和醛基或酮基或半缩醛基的双官能化合物反应，得到具有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物。

19.如权利要求18的方法，其中所述另一种双官能化合物选自甲酰苯甲酸、4-甲酰苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、和4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。

20.如权利要求15的方法，其中包含两个氨基M和Q的化合物中的氨基Q是β-羟氨基。

21.如权利要求20的方法，其中氧化该β-羟氨基得到醛基。

22.如权利要求20或21的方法，其中包含两个氨基M和Q且Q是β-羟氨基的化合物是1，3-二氨基-2-羟丙烷。

23.如权利要求21或22的方法，其中使用高碘酸盐进行该氧化反应。

24.如权利要求1到23任一的方法，其中蛋白质选自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、AT III、IL-2、IL-3、肌红蛋白、SOD、和BSA，优选选自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhAT III、rhIL-2、rhIL-3、肌红蛋白、SOD、和BSA，或选自A1AT、因子VII、因子VIII、因子IX、tPA、和APC。

25.一种包含蛋白质和聚合物的偶联物，用如权利要求1到24任一所限定的方法得到。

26.如权利要求25的偶联物，其中该聚合物或其衍生物主要通过偶氮甲碱和/或氨基键偶联在蛋白质N-末端的氨基上，用于该反应的蛋白质包含N-末端氨基和至少另外一个氨基，优选另外一个赖氨酸基团。

27.如权利要求25或26任一的偶联物，其中所使用的聚合物包含通过开环氧化反应引入聚合物的至少一个醛基，该聚合物包含至少一个根据下列通式的结构

其中，R₁是氢或具有2到10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基。

28.如权利要求25或26的偶联物，其中该蛋白质通过偶氮甲碱和/或氨基键与聚合物衍生物共价连接，所述聚合物衍生物得自聚合物与包含两个氨基M和Q的双官能化合物通过官能团M反应，所得到的化合物通过Q与另一种包含羧基或反应性羧基和醛基或酮基或半缩醛基的双官能化合物反应，所述羧基或反应性羧基与氨基Q形成酰胺键，所述醛基或酮基或半缩醛基通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。

29.如权利要求28的偶联物，其中所述另一种包含羧基或反应性羧基和醛基或酮基或半缩醛基的双官能化合物选自甲酰苯甲酸、4-甲酰苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、和4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。

30.如权利要求29的偶联物，具有结构

如果聚合物通过其氧化的还原端反应，R₁、R₂、和R₃各自独立地是氢或羟烷基，n＝2，3，或4，R₄独立地是氢或甲氧基，如果R₄是氢则m＝0，如果R₄是甲氧基则m＝1。

31.如权利要求25或26的偶联物，其中该蛋白质通过偶氮甲碱或氨基键与聚合物衍生物共价连接，所述聚合物衍生物得自聚合物与包含两个氨基M和Q的化合物反应，Q是β-羟氨基，以及该β-羟氨基Q氧化成醛基。

32.如权利要求31的偶联物，其中包含两个氨基M和Q且Q是β-羟氨基的化合物是1，3-二氨基-2-羟丙烷。

33.如权利要求32的偶联物，具有结构

如果聚合物通过其氧化的还原端反应，R₁、R₂、和R₃各自独立地是氢或羟烷基。

34.如权利要求25到33任一的偶联物，其中蛋白质选自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、AT III、IL-2、IL-3、肌红蛋白、SOD、和BSA。

35.如权利要求25到33任一的偶联物，其中蛋白质选自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhAT III、rhIL-2、rhIL-3、肌红蛋白、SOD、和BSA。

36.如权利要求25到33任一的偶联物，其中蛋白质选自A1AT、因子VII、因子VIII、因子IX、tPA、和APC。

37.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，用于治疗人体或动物体的方法。

38.一种药物组合物，包含治疗有效量的如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过如权利要求1到24任一的方法制备的偶联物。

39.如权利要求38的药物组合物，还包含至少一种药学可接受的稀释剂、佐剂、或载体。

40.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是EPO并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗贫血性疾病或相关的造血机能障碍疾病或病症的药物中的应用。

41.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是G-CSF并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗以造血或免疫功能降低为特征的疾病的药物中的应用，其中所述疾病优选是化学治疗、放射治疗、传染性疾病、重度慢性中性粒细胞减少症、或白血病的结果。

42.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是AT III并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗遗传性缺乏、静脉闭塞性疾病、烧伤和冠状动脉旁路移植(CABG)术中的肝素耐受、预防与通气治疗有关的微血块形成、治疗由外伤或胃肠手术导致的肠穿孔、弥散性血管内凝血(DIC)和/或败血症的药物中的应用。

43.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是因子VIII并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗血友病A的药物中的应用。

44.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是A1AT并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗肺气肿、囊性纤维化、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、和/或支气管炎的药物中的应用。

45.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是tPA并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗心肌梗塞(心脏病发作)、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病，特别是闭塞性动脉疾病的药物中的应用。

46.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是APC并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗重度败血症、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病，特别是闭塞性动脉疾病的药物中的应用。

47.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是IFNα并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗白血病例如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、癌症例如类癌瘤、恶性黑色素瘤和肝炎例如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的药物中的应用。

48.如权利要求25到36或49到54任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是IFNβ并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于治疗多发性硬化症，优选复发型多发性硬化症的药物中的应用。

49.一种包含羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物，其中羟烷基淀粉用它的氧化的还原端经酰胺键与第一交联化合物偶联，所述交联化合物还经酰胺键与第二交联化合物连接，所述第二交联化合物经偶氮甲碱和/或氨基键与蛋白质连接，其中优选使用的第一交联化合物为二氨基官能化合物，并且优选使用的第二交联化合物为羧基和醛基或酮基或半缩醛基官能化的化合物，更优选为羧基和醛基官能化的化合物。

50.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该偶联物具有如下式的结构：

其中R₁、R₂、和R₃分别独立地是氢或具有1个，优选2到10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，并且

51.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该偶联物具有如下式的结构：

52.如权利要求51的偶联物，其中L₁是-(CH₂)_n-，其中n＝2，3，4，5，6，7，8，9，10，优选是2，3，4，5，6，更优选2，3，4，特别优选4。

53.如权利要求51或52的偶联物，其中L₂包含任选适当取代的芳基部分，优选包含6个碳原子的芳基部分，特别优选L₂是C₆H₄。

54.如权利要求51到53任一的偶联物，其中F₂选自下列基团：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；

-1，2-二醇；

-1，2-氨基-硫醇

-叠氮化物；

-1，2-氨基醇；

-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的残基，其中G是O或S，并且M是

例如：

--OH或-SH；

-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；

-烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；

其中Q不存在或者是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂，或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；

-乙烯基卤化物基团，例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基；

--(C＝O)-CH₂-Hal基，其中Hal是Cl、Br、或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含-S-S-结构的二硫基；

-基团

-基团

并且其中F₃是能与F₂形成化学键的官能团，优选选自上述的基团，F₂优选包含-NH-部分，更优选包含氨基，F₃优选包含-(C＝G)-部分，更优选-(C＝O)-部分，更优选-(C＝G)-G-部分，更优选-(C＝O)-G-部分，特别优选-(C＝O)-O，D特别优选是酰胺键。

55.如权利要求54的偶联物，其具有如下式的结构：

56.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该偶联物有如下式的结构：

其中-CH₂-N₂-部分的碳原子来源于通过开环氧化反应引入到该聚合物中的醛基，并且其中氮原子来源于蛋白质的氨基。

57.如权利要求54到71任一的偶联物，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。

58.如权利要求57的偶联物，其中羟乙基淀粉的分子量是2到200kD，优选4到130kD，更优选4到70kD。

59.如权利要求49到58任一的偶联物，其中蛋白质选自EPO、G-CSF、IFNα、IFNβ、AT III、IL-2、IL-3、肌红蛋白、SOD、和BSA，优选选自rhEPO、rhG-CSF、rhIFNα、rhIFNβ、rhAT III、rhIL-2、rhIL-3、肌红蛋白、SOD、和BSA，和/或选自A1AT、因子VII、因子VIII、因子IX、tPA、和APC。

60.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是因子VII并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于和因子VIII或因子IX的抑制剂一起治疗血友病A或B患者发作的药物中的应用。

61.如权利要求25到36或49到58任一的偶联物，或通过权利要求1到24任一的方法制备的偶联物，其中蛋白质是因子IX并且聚合物是HAS，优选HES，在制备用于控制和预防血友病B、优选先天性因子IX缺乏或克里斯马斯病患者的出血性发作，包括控制和预防在外科环境中的出血的药物中的应用。