CN1803836A

CN1803836A - 海蜇胶原蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN1803836A
Application number: CN 200610042188
Authority: CN
Inventors: 石红旗
Original assignee: First Institute of Oceanography SOA
Current assignee: First Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2006-01-13
Publication date: 2006-07-19
Anticipated expiration: 2026-01-13
Also published as: CN100369929C

Abstract

本发明公开了一种海蜇胶原蛋白。其是从海蜇的中胶层提取的，该胶原蛋白为白色纤维状固体或浅黄色固体粉末，堆密度为0.110－0.645g/ml，该胶原蛋白在酸性溶液中完全溶解，呈澄清透明溶液；该胶原蛋白的单链分子量在10－30万道尔顿，糖含量为2.5－5％，氨基酸含量为80－95％mg/100mg；其中，天门冬氨酸占7.9－8.3％，谷氨酸占10.0－12.9％，苏氨酸占3.5－4.0％，缬氨酸占3.5－3.9％，异亮氨酸占2.2－2.5％，赖氨酸占3.4－3.8％，羟赖氨酸占2.0－2.7％。该海蜇胶原蛋白的制备方法是：(1)使用盐渍海蜇或新鲜海蜇；(2)原料的预处理；(3)分离中胶层；(4)解离中胶层；(5)超滤分离浓缩；得到分子量在10－30万道尔顿的胶原蛋白，其截留率95％－98％；该方法可以有效回收蛋白酶，使反应体系循环利用，得到的胶原蛋白产品纯度高。

Description

海蜇胶原蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及海洋生物化工原料的改进，具体讲是一种海蜇胶原蛋白及其制备方法。其属于生物医药化工技术领域。

背景技术

海蜇，又名水母，属腔肠动物。海蜇是肉食性的，以浮游生物，小的甲壳类、多毛类甚至小的鱼类为食。身体呈伞体半球形，伞径一般30至45厘米，大的可达100厘米。海蜇的表皮层与胃层之间为中胶层(mesoglea)，中胶层非常发达，占据了其身体的几乎整个厚度，其中含有纤维及少量来源于外胚层的细胞。中胶层硬而厚，电子显微镜下可见中胶层有许多小纤维。中胶层中的主要成分是水分，其中含有极少量的蛋白质及多糖，含有机物为5％，并以胶原蛋白质的形式存在，这种物质具有很强的弹性和粘合力。海蜇是我国久负盛名的食用大型浮游动物，近年来，养殖界攻克了人工育苗、螅状体幼体越冬和幼蜇放流等技术难关，具有持续的海蜇资源供应。海蜇皮主要成分为蛋白质(胶原蛋白)，不含胆固醇和脂肪酸。有美国专利(USpatent6,894,029)报道了利用口冠水母科的口冠水母(Stomolophus meleagris)采用冻干、碱洗、酸洗、蛋白酶消化、分级盐析工艺，制得类II胶原，用于治疗类风湿关节炎。还有日本专利(JP2004099513)报道了利用洋须水母科的海月水母(Aureiiaaurita)，采用缓冲液萃取胶原、胶原沉淀和分离、胶原脱水、冷冻干燥工艺制备胶原，从海月水母中提取的活性水母胶原具有抗菌活性，microorganismPropionibacterium acnes疮疱丙酸杆菌，是引起面部丘疹的致病菌。国内较多文献报道了从牛腱、猪皮、猪软骨、鱼皮、鱼鳞中提取胶原蛋白的技术和工艺，均是采用酶解盐析提取工艺，采用盐析提取存在的问题是蛋白酶回收困难、盐回收困难和酸性溶液的循环利用困难。现有技术的海蜇胶原提取方法，均是采用将海蜇内外胚层与中胶层混合提取。这种内外胚细胞杂蛋白溶解和解离，对海蜇胶原提取带来影响。另外大多采用胶原蛋白酶解离与盐析工艺结合提取，盐析工艺缺点是采用大量的食盐，对形成含盐废水。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种海蜇胶原蛋白及其制备方法，采用新的纯化工艺，有效回收提取工具酶，循环利用反应体系，得到的活性胶原蛋白纯度高，收得率高。

本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种海蜇胶原蛋白。所述的胶原蛋白是从海蜇的中胶层提取的，该胶原蛋白为白色纤维状固体或浅黄色固体粉术，堆密度为0.110-0.645g/ml，该胶原蛋白在酸性溶液中完全溶解，呈澄清透明溶液；该胶原蛋白的单链分子量在10-30万道尔顿，糖含量为2.5-5％，氨基酸含量为80-95％mg/100mg；其中，天门冬氨酸占7.9-8.3％，谷氨酸占10.0-12.9％，苏氨酸占3.5-4.0％，缬氨酸占3.5-3.9％，异亮氨酸占2.2-2.5％，赖氨酸占3.4-3.8％，羟赖氨酸占2.0-2.7％。

一种上述海蜇胶原蛋白的制备方法，按如下步骤进行；

(1)采用的原料为大型海蜇，使用盐渍海蜇或新鲜海蜇；

(2)原料的预处理；

将经盐渍脱水后的海蜇，用浓度为0.1-0.5％的碱性溶液洗涤、浸泡；浸泡时间0.5-2h，浸泡后的溶液pH为6-8，碱洗时有氨气产生，气泡明显；海蜇皮的上下皮层由原来的白色不透明，变为透明，而且容易剥离去掉，除去不良气味，氨离子及杂质；

(3)分离中胶层；

将碱性溶液洗涤、浸泡后的盐渍脱水海蜇，去掉透明的上下皮层，可明显见白色的中胶层，磨碎该白色的中胶层；

(4)解离中胶层；

采用蛋白酶解离磨碎的中胶层，酶用量0.1％-2％，解离温度10-30℃，搅拌解离时间10-48h；

(5)超滤分离浓缩；

将上述蛋白酶解离的中胶层离解液，采用超滤膜过滤器，控制膜进口压力在12kg/cm²，或采用外加电场10-70V/cm，截留浓缩分子量在10-30万道尔顿的胶原蛋白，其截留率95％-98％；

再将剩下的含有蛋白酶的离解液，采用醋酸纤维HFA-200膜，将蛋白酶截流分离出来，回收该蛋白酶重复循环使用；

(6)分离浓缩的胶原蛋白再经冷冻干燥，即采用慢速冻结方式，升华阶段的真空度在10-30Pa，冷阱温度在-50±0.1℃，得到白色纤维状固体或浅黄色固体粉末。

所述的(1)步采用的大型海蜇原料包括：根口水母科(Rhizostomalidae)的海蜇属的海蜇(Rhopilema esculentum Kishinouye)；黄斑海蜇(Rhopilema hispidum)和叶腕水母科(Lobonematidae)的叶腕水母属(Lobonema)的叶腕海蜇(LobonmaSmithi)。

所述的(1)步原料盐渍海蜇质量符合国家标准，即水分，小于68％，食盐，18-25％，明矾，1.2-2.2％。

所述的(2)步原料的预处理中采用的碱性溶液为氢氧化钠溶液，碳酸钠溶液，碳酸氢钠溶液。

所述的(4)步解离中胶层所采用的蛋白酶或为酸性蛋白酶，或碱性蛋白酶。

所述的(4)步解离中胶层之后，还可将浓缩的湿胶原蛋白，再经胶原酶深度水解，该胶原酶的用量0.1-2.0％，解离温度20-40℃，解离时间10-48h，得到水解多肽，即，得到含30个左右的氨基酸残基的结构胶原多肽，该多肽分子长度为30-50纳米，分子量3000-20000道尔顿。

所述的(5)步超滤分离浓缩中所采用超滤膜，或采用聚合物膜Diaflo(XM30)，或采用聚芳醚砜膜，或采用中空纤维素膜，或采用非对称超滤UF膜，或采用非对称超滤FS膜，或采用非对称超滤HF膜，或采用非对称超滤T膜。

本发明海蜇胶原蛋白及其制备方法的优点在于：由于在(2)步原料的预处理中，将经盐渍脱水后的海蜇，用浓度为0.1-0.5％的碱性溶液洗涤、浸泡；碱洗时有氨气产生，气泡明显；碱洗预处理目的是将海蜇皮上下皮层(即表皮层与胃层)，由原来的白色不透明，变为透明，软化容易剥离，去除有色层；再是除去盐渍过程中的明矾等杂质和分解的氨类物质等，恢复海蜇蛋白活性；使得(3)步分离中胶层，去掉透明的上下皮层，顺利得到白色的中胶层，以便磨碎该白色的中胶层。由于在(4)步解离中胶层是，采用蛋白酶解离磨碎的中胶层，同时保留胶原蛋白的糖含量。采用苯酚-硫酸法(张维杰，1999)测定样品中糖含量；以果糖为标准，于490nm处测定。由于采用超滤浓缩纯化工艺，可以有效回收蛋白酶，使反应体系循环利用。本工艺得到的胶原蛋白产品，明显不同于牛、猪、鱼等提取的胶原蛋白的特征。采用分离的脱水脱腥的中胶层，经绞碎后，采用蛋白酶解离，超滤工艺，冷冻干燥，得到纯度高，具有活性的胶原蛋白。若进一步得到胶原蛋白多肽，可以将未干燥胶原，再经胶原酶深度水解，得到水解多肽，采用喷雾干燥工艺得到干粉，以利于存储。经不论从紫外吸收，常规氨基酸质量分数测定，还是从红外谱图测定看，所提取的蛋白质凝胶是胶原蛋白，与文献报道的海蜇胶原蛋白相符，而且获得的胶原蛋白纯度也较高。本发明海蜇胶原蛋白以盐渍海蜇原料计算，胶原蛋白收得率为3-5％。

具体实施方式

实施例1)

取盐渍海蜇120g，在0.2M氢氧化钠溶液100ml，浸泡2h，浸泡后的溶液为pH6.5，碱洗时有氨气产生，气泡明显，可以除去氨离子及杂质。海蜇皮由白色不透明，变为透明(与冷冻脱水海蜇类似)，可明显见中胶层。去掉上下皮层，白色中胶层切片后置冰柜中保存。

取上述中胶层，磨碎，加0.1M乙酸，20ml，再加600mg胃蛋白酶(华美，Sina-American Biotec，pepsin 1∶3000)，在室温下搅拌解离30h。

采用超滤膜过滤器，控制膜进口压力在1-2kg/cm²，并采用外加电场10-70V/cm，截留浓缩分子量在10-30万道尔顿的胶原蛋白，其截留率98％；所采用超滤膜，或采用聚合物膜Diaflo(XM30)，或采用聚芳醚砜膜，或采用中空纤维素膜，或采用非对称超滤UF膜，或采用非对称超滤FS膜，或采用非对称超滤HF膜，或采用非对称超滤T膜。

分离浓缩的胶原蛋白再经冷冻干燥，即采用慢速冻结方式，升华阶段的真空度在10-30Pa，冷阱温度在-50±0.1℃，得到3.851g纤维状浅色固体的胶原蛋白，其收得率3.21％。本发明海蜇胶原蛋白以盐渍海蜇原料计算，收得率的计算公式：C％＝(m₁/m)×100％，其中，C％为收率，m₁为胶原蛋白重量(g)，m为盐渍海蜇的重量(g)。

该胶原蛋白的堆密度为0.110-0.645g/ml；该胶原蛋白在酸性溶液中完全溶解，呈澄清透明溶液；该胶原蛋白的单链分子量在10-30万道尔顿，糖含量为2.5-5％，氨基酸含量为80-95％mg/100mg；其中，天门冬氨酸占7.9-8.3％，谷氨酸占10.0-12.9％，苏氨酸占3.5-4.0％，缬氨酸占3.5-3.9％，异亮氨酸占2.2-2.5％，赖氨酸占3.4-3.8％，羟赖氨酸占2.0-2.7％。

胶原蛋白的糖含量，采用苯酚-硫酸法(张维杰，1999)测定样品中糖含量。以果糖为标准，于490nm处测定。以吸光值(A490)为横坐标，糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：A490＝0.004×C-0.0016，R＝0.9999。称取0.114g样品，用0.5M乙酸溶解定容至50ml，测定糖含量为3.09％。

再将剩下的含有蛋白酶的离解液，使用醋酸纤维膜(HFA-200)，将胃蛋白酶(分子量35000)截流以回收循环使用。

实施例(1)-(7)具体工艺条件与结果见表1：

对照实施例：

取50g盐渍海蜇，0.2M氢氧化钠，100ml浸泡2h，取40g中胶层，破碎，0.5M乙酸250ml，0.5％蛋白酶250mg，搅拌室温温育，48h，15℃。离心，有大量为解离物。3.5M盐析，有泡沫产生，4.5M有白色固体物，5.5M有大量絮状沉淀，透析袋(8000-12000D)透析。冷冻，干燥24h，得到0.761g浅絮状白色固体。得率1.52％。

本发明海蜇胶原蛋白氨基酸组成含量测定：

称取干燥的海蜇胶原蛋白10mg，加入浓度为5.7mol/L的盐酸溶液2mL，置于110度烘箱内水解24h，用HITACHI835氨基酸自动分析仪测定，氨基酸含量为92.57mg/100mg。氨基酸组成含量结果见表2。

表2海蜇胶原蛋白氨基酸组成含量结果

氨基酸种类	海蜇胶原蛋白(mg/100mg)	氨基酸种类	海蜇胶原蛋白(mg/100mg)
氨基酸种类	海蜇胶原蛋白(mg/100mg)	氨基酸种类	海蜇胶原蛋白(mg/100mg)	天门冬氨酸Asp	8.31	缬氨酸Val	3.92
谷氨酸Glu	12.99	蛋氨酸Met	0.62	天门冬氨酸Asp	8.31	缬氨酸Val	3.92
谷氨酸Glu	12.99	蛋氨酸Met	0.62	丝氨酸Ser	3.19	苯丙氨酸Phe	1.21
组氨酸His	0.25	异亮氨酸Iso	2.46	丝氨酸Ser	3.19	苯丙氨酸Phe	1.21
组氨酸His	0.25	异亮氨酸Iso	2.46	甘氨酸Gly	18.01	亮氨酸Leu	3.66
苏氨酸Thr	4.05	赖氨酸Lys	3.40	甘氨酸Gly	18.01	亮氨酸Leu	3.66
苏氨酸Thr	4.05	赖氨酸Lys	3.40	丙氨酸Ala	7.74	羟赖氨酸Hydroxylys	2.41
精氨酸Arg	7.77	脯氨酸Pro	7.42	丙氨酸Ala	7.74	羟赖氨酸Hydroxylys	2.41
精氨酸Arg	7.77	脯氨酸Pro	7.42	半胱氨酸Cys	0	羟脯氨酸Hydroxypro	3.62
酪氨酸Tyr	0.33	色氨酸Try	0	半胱氨酸Cys	0	羟脯氨酸Hydroxypro	3.62

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1、一种海蜇胶原蛋白，其特征在于：所述的胶原蛋白是从海蜇的中胶层提取的，该胶原蛋白为白色纤维状固体或浅黄色固体粉末，堆密度为0.110-0.645g/ml，该胶原蛋白在酸性溶液中完全溶解，呈澄清透明溶液；该胶原蛋白的单链分子量在10-30万道尔顿，糖含量为2.5-5％，氨基酸含量为80-95％mg/100mg；其中，天门冬氨酸占7.9-8.3％，谷氨酸占10.0-12.9％，苏氨酸占3.5-4.0％，缬氨酸占3.5-3.9％，异亮氨酸占2.2-2.5％，赖氨酸占3.4-3.8％，羟赖氨酸占2.0-2.7％。

2、一种如权利要求1所述海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的制备方法按如下步骤进行；

(1)采用的原料为大型海蜇，使用盐渍海蜇或新鲜海蜇；

(2)原料的预处理；

(3)分离中胶层；

(4)解离中胶层；

(5)超滤分离浓缩；

将上述蛋白酶解离的中胶层离解液，采用超滤膜过滤器，控制膜进口压力在1-2kg/cm²，或采用外加电场10-70V/cm，截留浓缩分子量在10-30万道尔顿的胶原蛋白，其截留率95％-98％；

3、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的(1)步采用的大型海蜇原料包括：根口水母科(Rhizostomalidae)的海蜇属的海蜇(Rhopilemaesculentum Kishinouye)；黄斑海蜇(Rhopilema hispidum)和叶腕水母科(Lobonematidae)的叶腕水母属(Lobonema)的叶腕海蜇(Lobonma Smithi)。

4、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的(2)步原料的预处理中采用的碱性溶液为氢氧化钠溶液，碳酸钠溶液，碳酸氢钠溶液。

5、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的(4)步解离中胶层所采用的蛋白酶或为酸性蛋白酶，或碱性蛋白酶。

6、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的(4)步解离中胶层之后，还可将浓缩的湿胶原蛋白，再经胶原酶深度水解，该胶原酶的用量0.1-2.0％，解离温度20-40℃，解离时间10-48h，得到水解多肽，即得到含30个左右的氨基酸残基的结构胶原多肽，该多肽分子长度为30-50纳米，分子量3000-20000道尔顿。

7、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的(5)步超滤分离浓缩中所采用超滤膜，或采用聚合物膜Diaflo(XM30)，或采用聚芳醚砜膜，或采用中空纤维素膜，或采用非对称超滤UF膜，或采用非对称超滤FS膜，或采用非对称超滤HF膜，或采用非对称超滤T膜。