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CN1496268A - 溶瘤病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种减少肿瘤细胞存活力的方法，包含给予肿瘤细胞不是常见人病原体的病毒。病毒优选表现出差异易感性，其中正常细胞不受病毒影响。在干扰素存在时差异易感性更明显。肿瘤特征在于具有低水平的或无PKR活性，或者为PKR－/－，STAT1－/－或同时为PKR－/－和STAT1－/－。病毒选自棒状病毒和小核糖核酸病毒，优选为疱疹性口腔炎病毒(VSV)或其衍生物。

Description

溶瘤病毒
本申请要求美国临时申请＿＿＿＿的权益，在2000年9月8日请求根据37 CFR 1.53(c)(2)从1999年9月17日提交的美国申请09/397,873获得的有效提交日为1999年9月17日，在此引入其内容作为参考。
本发明涉及一种新颖的癌症治疗方法。更具体地说，本发明涉及选择性感染和抑制肿瘤细胞生长的病毒。
发明背景
溶瘤细菌或溶瘤细菌组合物对攻击人类和动物赘生物的用途是已知的。例如欧洲专利546 121，英国专利1,587,244和美国专利3,192,116公开了用非致病细菌产生脊椎动物肿瘤的液化和溶解。然而在许多情况下，例如使用梭状芽孢杆菌时，肿瘤仅部分被破坏，并仍然可能发生肿瘤再生。为保证控制肿瘤生长，建议给予细菌，然后给予化疗药物，如5-氟尿嘧啶或烷化剂(如英国专利1,069,144)。
一些病毒也表现出杀肿瘤特性，例如，小核糖核酸病毒H-1(Dupressoir et al.，1996.Cancer Res，49.3203-3208)，新城疫病毒(Reichand et al.，1992.J.Surg.Res，52：448-453)或含药物易受基因的逆转录病毒载体(Takamiya et al.，1993.J.Neurosurg，79：104-110)。WO97/26904和WO96/03997公开了抑制肿瘤细胞生长的突变单纯疱疹病毒(HSV-1761)。给予肿瘤细胞在长重复区(RL)的每个γ34.5拷贝包含一个759碱基对缺失的HSV-1716可以杀灭这些细胞。然而，此病毒是特异性针对神经细胞的，因为已知HSV选择性栖居于神经系统。另外，常见人病原体作为溶瘤病毒的用途是有限的，因为普通人群已经感染过这些病毒并获得了对这些病毒的免疫应答。对癌症治疗中用作治疗剂的病毒的相似病毒株预先存在的免疫应答可能减弱病毒作为治疗剂的效果。
也报道过其它病毒株的溶瘤活性。ONYX-015人腺病毒(由ONYX药物产生)被认为优选在p53阴性肿瘤细胞中复制。这种病毒在临床试验中表现出治疗头和颈部癌症患者的希望(Kim，D.，T.et al.，Nat Med，1998.4：1341-1342)。第3型呼肠孤病毒正在被OncolyticBiotech公司开发为癌症治疗剂，它优选在PKR-/-细胞中生长(Yin，H.S.，J Virol Methods，1997.67：93-101；Strong，J.E and P.W.Lee.，J Virol，1996.70：612-616；Strong，J.E.，et al.，Virology，1993.197：405411；Minuk，G.Y.，et al.，J Hepatol，1987.5：8-13；Rozee，K.R.，et al.，Appl Environ Microbiol，1978.35：297-300)。第III型呼肠孤病毒在表达突变ras癌基因的细胞中表现出增强的复制特性(Coffey，M.C.，et al.，Science，1998.282：1332-1334；Strong，J.E.，et al.，Embo J，1998.17：3351-1362)。Mundschau和Faller(Mundschau，L.J.and D.V.Faller，J Biol Chem，1992.267：23092-23098)报道了ras癌基因产物激活PKR的抑制因子，此结果与PKR化学抑制因子2-氨基嘌呤增加正常细胞中第III型呼肠孤病毒生长的发现相结合提示PKR是呼肠孤病毒生长的关键调节因子。
WO 99/04026教导了VSV作为载体在基因治疗中用于表达各种产物包括抗体、免疫原、毒素等对治疗各种疾病的用途。
干扰素是循环因子，它们与细胞表面受体结合，激活信号级联放大，最终导致许多生物应答。干扰素信号传递的两个结果是密切联系的：(1)抗病毒应答和(2)诱导生长抑制和/或凋亡信号。
美国专利4,806,347公开了γ干扰素和INF-γ片段(称作Δ4α2)抗人肿瘤细胞的用途。
WO 99/18799报道了新城疫病毒(NDV)和辛德比斯病毒对一些人类癌细胞的细胞毒活性。然而，这两种细胞都表明了它们对肿瘤细胞的细胞毒活性的选择性。
WO 99/18799公开了加入正常细胞的干扰素使这些细胞抗NDV，然而，在干扰素治疗的肿瘤细胞中没有观察到这一作用，这些肿瘤细胞继续表现出NDV诱导的敏感性。WO 99/18799也公开了VSV细胞抗KB细胞(头和颈部癌)和HT 1080(纤维肉瘤)的细胞毒活性，以及在干扰素存在下VSV对正常和肿瘤细胞中细胞毒性的减少。没有检验其它细胞类型的抗VSV细胞毒活性。
已经报道了VSV的某些突变株。Stanners，et al.，Virology(1987)160(1)：255-8.Francoeur，et al.，Virology(1987)160(1)：236-45.Stanners，et al.，J.Gen.Virol.(1975)29(3)：281-96.Stanners，et al.，Cell(1977)11(2)：273-81。
本发明涉及在疾病和癌症，优选白血病的治疗中有用的病毒配方。这种配方也可以包含溶瘤VSV株和化学试剂，例如赋予正常细胞抵抗病毒感染，但使患病或癌细胞易受病毒感染和溶解的细胞因子。
本发明的一个目标是克服以前领域中的缺点。
上述目标通过独立权利要求特点的结合而实现。从属权利要求公开了本发明实施方案进一步的优点。
发明概述
本发明涉及新颖的癌症治疗方法。更具体地说，本发明涉及选择性感染和抑制肿瘤细胞生长的病毒。
本发明提供了一种减低肿瘤细胞存活力的方法，包含将病毒给予肿瘤细胞，其中病毒的特征在于它不是常见的人病原体。肿瘤细胞优选缺乏PKR活性，病毒选自棒状病毒。病毒更优选为VSV。
本发明也定位于减低肿瘤细胞存活力的方法，包含将病毒给予肿瘤细胞，其中病毒的特征在于不能灭活宿主细胞内PKR活性。病毒优选为疱疹性口腔炎病毒、小核糖核酸病毒、流感病毒和腺病毒。
本发明也涉及在一群细胞中减低肿瘤细胞存活力的方法，包含将病毒给予细胞群，其中病毒的特征在于可以选择性感染并杀灭肿瘤细胞。优选地，病毒的特征进一步在于不能灭活宿主细胞中PKR活性。
本发明也涉及前面所定义的方法，其中在给予病毒前用干扰素处理细胞群。
本发明提供了一种识别易感于病毒处理的肿瘤的方法，包含：(a)将含肿瘤细胞的样品分为第一部分和第二部分；(b)用病毒处理第一部分及(c)判断第一部分中的死亡细胞百分比是否高于第二部分，其中如果第一部分中的死亡细胞百分比高于第二部分，则肿瘤易感于用病毒进行的处理。
本发明提供了一种识别易感于病毒处理的肿瘤的方法，包含：(a)将含肿瘤细胞的样品分为第一部分和第二部分；(b)用病毒和病毒存在时足以改善干扰素应答细胞存活的干扰素处理第一部分，并在无干扰素时用病毒处理第二部分；及(c)判断第一部分中的死亡细胞百分比是否高于第二部分，其中如果第一部分中的死亡细胞百分比高于第二部分，则肿瘤易感于用病毒进行的处理。
本发明定位于突变VSV，其特征在于突变VSV在干扰素应答细胞中生长很差。这里也将这些株称作VSV的减毒株，或在干扰素应答细胞中生长很差的VSV株。可以通过它们在单层干扰素应答细胞中比在干扰素不应答细胞中产生更小的噬斑而识别它们，见后面的描述。也可以通过当鼻内给予PKR+/-小鼠比野生Indiana具有更高的LD50而识别减毒VSV株，见后面描述的测定。
本发明也涉及用亲和基质分离VSV的方法，包含将VSV加入亲和基质产生结合VSV，洗涤结合VSV，从亲和基质洗脱VSV。本发明也包括病毒外表面包含非天然融合蛋白的修饰VSV。非天然蛋白可以是包含亲和标记和病毒被膜蛋白的融合蛋白，或者它可以源于生产细胞。
本发明也定位于分离具有编码突变VSV蛋白的序列及其互补序列的核酸分子(DNA或RNA)。这种核酸分子可以用于制备重组VSV或作为DNA疫苗。
将这里描述的病毒作为治疗病毒比其它病毒具有一些优点：
棒状病毒不是常见的人病原体。例如，VSV最多见于昆虫、啮齿类和饲养动物，所以大部分人群不会感染或对VSV感染有免疫力。另一方面，腺病毒或呼肠孤病毒属是人病原体，而且大多数普通人群感染过并获得了对这些病毒的免疫应答。预先存在的对类似于一种应用于癌症治疗中的治疗剂的病毒株的免疫应答可以减弱病毒作为治疗剂的效果。
● VSV比腺病毒或呼肠孤病毒属复制快得多，可以轻易浓集为高滴度。高滴度病毒的产生是其它潜在病毒治疗株的重要限制。
● VSV是仅包含5种基因的简单病毒，容易顺从基因操作。目前呼肠孤病毒属还没有这种系统。
● 由VSV导致的细胞感染高度应答于额外化学试剂如干扰素，这种特征增强它的治疗价值。
● VSV具有广泛的宿主范围并且可以感染大多数人细胞类型，而其它病毒更局限于它们可以感染的细胞类型。
● VSV是一种RNA病毒并在胞浆中度过其整个生命周期。所以它更少涉及不希望的整合进病人基因组的危险。
综上所述，这些VSV特征提供了相对于其它已知表现溶瘤活性的病毒的显著优点。
此发明概述并不必要描述本发明的所有必要特征，但是本发明也可以立足于描述特征的亚结合。
附图简述
通过下面参考附图的描述，本发明的这些和其它特征将更明显：
图1表示干扰素级联的简图。
图2表示在干扰素存在或不存在时VSV对正常人成纤维细胞、人黑色素瘤细胞系SK-MEL3、前列腺癌细胞系LNCaP和卵巢癌细胞A2780的作用，由改进的cpe测定判断。在12孔滴定板中以0.1pfu的moi感染单层细胞。在0和随后48小时内的每12小时用0.5mlLeukostat固定剂将一个加样孔的感染细胞固定2分钟。在实验结束时用Leukostat染色液染色单层细胞。
图3表示VSV在正常成纤维细胞(图3(a))，以及肿瘤细胞系，包括卵巢肿瘤细胞(图3(b))和KB肿瘤细胞(图3(c))中的细胞病变作用。
图4表示VSV对与293T肿瘤细胞共同培养24小时的正常人成纤维细胞的作用。在干扰素存在(IFN+)或不存在(IFN-)时以0.1pfu/细胞的moi感染共同培养物并且允许感染继续进行。用大分子T抗原(红色核)的抗体染色培养物检测293T细胞，用DAPI(蓝色核)染色所有细胞类型。
图5表示体内VSV对植入裸鼠的肿瘤的作用。将人黑色素瘤细胞植入裸鼠并进行伪注射(VSV(-))，注射野生型VSV(未提供数据)，或用注射到肿瘤位点前一小时体外感染VSV的另外的黑色素瘤细胞注射(VSV(+))。在7天的时间段中判断肿瘤大小。
图6表示在图5所描述的裸鼠中产生的肿瘤上形成的溃疡。
图7：VSV和VSV感染的细胞抑制裸鼠中人黑色素瘤异种移植物的生长。
图8A和8B：PKR-/-小鼠对鼻内VSV感染非常敏感并表现IFN介导的抵抗力的缺陷。
图9：干扰素在VSV治疗中可以保护携带异种移植物的裸鼠。
图10A和10B：感染野生型Indiana和各种突变VSV株的肿瘤细胞和正常细胞的病毒产量。
图11：在VSV(WT Indiana)感染后恶性细胞被迅速杀灭并且不受IFN-α保护。
图12：在有或无IFN-α时VSV诱导的细胞病变作用在人黑色素瘤细胞中可见，而在原代人细胞中不可见。
图13：静脉内单剂量突变VSV在治疗裸鼠中人黑色素瘤异种移植物的效力
图14：野生型和突变VSVs的N蛋白cDNA序列。
图15：野生型和突变VSVs的N蛋白氨基酸序列。
图16：野生型和突变VSVs的P蛋白cDNA序列。
图17：野生型和突变VSVs的P蛋白氨基酸序列。
图18：野生型和突变VSVs的M蛋白cDNA序列。
图19：野生型和突变VSVs的M蛋白氨基酸序列。
图20：野生型和突变VSVs的G蛋白cDNA序列。
图21：野生型和突变VSVs的G蛋白氨基酸序列。
图22：野生型和突变VSVs的L蛋白cDNA序列。
图23：野生型和突变VSVs的L蛋白氨基酸序列。
优选实施方案的描述
本发明涉及新颖的癌症治疗方法。更具体地说，本发明涉及选择性感染和抑制肿瘤细胞生长的病毒。
以下仅通过实施例对优选实施方案进行描述，并不限制结合实现本发明作用的必要特征。
癌细胞通过获得生长抑制或凋亡途径中的突变相对于它们的正常对应物得到生存益处，并且在干扰素存在下，在消耗了关键抗病毒防御机制时也会如此。由于肿瘤细胞通过干扰素应答基因的突变得到显著生长优势，它们将更易受病毒感染。
“减低肿瘤细胞生存力”表示杀灭肿瘤细胞或在一段时间限制它的生长。
“非常见人类病原体”表示主要在非人宿主，例如，但不限于昆虫、啮齿类和农业饲养动物中存在的病毒。这些病毒一般不在人群中存在。
这里用到的突变体I，突变体1，Mut1和M1是指减毒突变株T1026。突变体II，III，IV和V(和类似于突变体I的变异命名法)分别指减毒突变体T1026R，TP3，TP6和G31。
本发明的新颖癌症专利法包括使用至少一种选择性定向于靶肿瘤细胞并导致其破坏的溶瘤病毒。溶瘤病毒优选为疱疹性口腔炎病毒(VSV)，例如Indiana株，或其它株，或其衍生物。VSV的衍生物表示通过在不同生长条件下选择病毒而获得的VSV病毒，或经过一定范围选择压力的VSV病毒，或通过本领域公知的重组技术被基因修饰的VSV病毒。例如，不考虑以任何方式限制，VSV衍生物可以包括通过感染这里描述的已经干扰素处理过的人细胞选择的突变VSV，或表现出对亲和纯化有用的亲和性标记的VSV。
溶瘤病毒抑制肿瘤细胞生长的效率部分归于与正常细胞相比肿瘤细胞对病毒感染的差异易感性。尽管没有理论依据，差异易感性可以部分归因于细胞内本应该防止细胞肿瘤生长和病毒感染的因子的下调或灭活。当灭活时导致肿瘤细胞生长，并也参与介导病毒感染的因子的例子包括但不限于PKR(双链RNA依赖性激酶)和PML(早幼粒细胞白血病基因)，然而，应该理解其它因子也可能起作用。
通过各种机制包括但不限于PKR相关介质，对PKR的下调或灭活已知与肿瘤细胞生长相关，而正常细胞表现出有活性的PKR。另外，暴露于病毒感染的野生型细胞表现PKR表达升高，这导致病毒复制的抑制，而表现PKR活性减低或无PKR活性的细胞易受病毒攻击并表现癌性生长。同样，PML基因产物作为肿瘤抑制因子起作用，也已知它抑制病毒复制。
“差异易感性”表示与导致肿瘤细胞生长和细胞不能抑制病毒复制的细胞相关的属性。表现差异易感性的细胞是使用本发明的癌症治疗法处理肿瘤细胞生长的优选备选细胞。通过在处理肿瘤细胞前或过程中加入一种或更多化学试剂可以加强差异易感性。化学试剂优选增加野生型细胞对病毒感染的抵抗力，但对肿瘤细胞对病毒感染的应答作用很小或没有作用。这种化学试剂的一个例子是，但不以任何方式限制于干扰素。
“PKR”表示显示出多种功能，包括控制mRNA翻译和基因转录的丝氨酸/苏氨酸激酶(1，2)。这种激酶在其氨基末端调节部分容纳两个双链RNA(dsRNA)结合基序，在其羧基端容纳催化激酶域。dsRNA与氨基端的结合诱导酶的构象改变，显露并激活催化激酶域。PKR的表达由一些PKR介质诱导，包括但不限于干扰素。
“PKR介质”表示在基因或蛋白水平直接或间接影响PKR活性的蛋白或化合物，包括PKR激活因子和PKR抑制因子。PKR激活因子的例子包括但不限于STAT1(见图1)，干扰素调节因子(IRF-1)和干扰素。PKR抑制因子的例子包括但不限于VA RNAs，p58(IPK)，与Ras途径相关的因子，核糖体蛋白L18，或降解PKR蛋白的蛋白酶。PKR活性也可以通过编码PKR的基因的突变，或驱动PKR表达的调节区域的突变而介导。这些突变可以增加或减低PKR活性。减低PKR活性的PKR突变包括但不限于，失去PKR的dsRNA结合活性，或产生阴性催化突变体的突变。增加PKR活性的突变包括，但不限于PKR的过度表达，或产生活性更高的PKR蛋白的突变。
PKR通过一种参与蛋白翻译起始的因子eIF-2α的磷酸化而调节翻译。一旦被磷酸化，eIF-2α-GDP与eIF-2B形成无活性的复合物，导致迅速抑制蛋白合成。PKR通过激活NFκB间接妨碍基因转录。这种激活表现为通过IκB激酶(3)的PKR磷酸化而执行，这接下来磷酸化的IκB，导致它的定向破坏。
PKR的抗病毒活性
许多不同的病毒类型感染细胞导致形成dsRNA(如作为复制中间体)，导致PKR和它的后续下游效应物的激活(见图1)。具体地说，蛋白合成被迅速终止并起始凋亡级联(4，5)。作为PKR激活的结果，新病毒颗粒的产生减少，病毒通过生物体的传播受到限制。Der等(12)报道了在应答于对多种应激诱导剂的细胞凋亡的诱导过程中需要PKR。
尽管没有理论依据，恶性肿瘤的产生可能是由于控制细胞增殖和凋亡的基因的多种突变而发生的。PKR在调节蛋白合成中的作用与它的抗增殖和促凋亡特性结合使其成为致癌突变的目标，这直接或间接影响了它的活性。
如实施例中更具体的描述，用PKR-/-动物对一些病毒的初筛提示PKR缺失的动物易受疱疹性口腔炎病毒(VSV)的感染。在体外获得了相似的结果，与PKR+/+成纤维细胞相比，VSV感染在PKR-/-成纤维细胞中进展更快。这些结果说明哺乳动物细胞需要PKR以抵抗VSV感染。另外，某些细胞系，例如，但不限于原代人骨髓，抗VSV感染，而白血病细胞系易受VSV感染。
考虑到了VSV相关病毒，或其它表现出相似病毒感染机制的病毒可以被识别为表现出选择性感染PKR活性减低或无PKR活性的细胞的特征。本领域的技术人员可以轻易用这里描述的方法筛选其它病毒减低细胞存活力、或杀灭缺乏PKR活性的细胞、或PKR-/-细胞、PKR-/-动物、或PKR-/-细胞和动物的能力。
如下面的实施例中所提示的，用干扰素预处理细胞使病毒感染性减低几个数量级。尽管没有理论依据，加入干扰素可以上调PKR表达，导致对病毒感染的抵抗力增加。
由于其有力的抗病毒活性，病毒发展出防御PKR的策略。例如，HIV和丙肝病毒编码专门结合和灭活PKR的蛋白(6，7)。腺病毒编码与PKR结合但不激活它的小RNA分子(VA RNAs)(8)。流感病毒占用细胞蛋白p58(IPK)抑制PKR，而脊髓灰质炎病毒起始PKR的蛋白水解(9，10)。SV-40的大分子T抗原甚至在激活PKR存在下仍表现出在eIF-2α下游起作用而促进蛋白翻译(10)。
PKR和肿瘤抑制
NIH 3T3细胞中显性阴性PKR催化突变体的表达导致它们的恶性转化并促进它们在裸鼠模型中生长为肿瘤(13，14)。使用失去dsRNA结合活性的PKR突变体观察到了相似的现象。在啤酒酵母中PKR的诱导表达导致酵母中生长停止—此现象可以通过eIF-2α的不可磷酸化译本的共同表达而逆转。所以，PKR具有抗增殖活性并可以作为肿瘤抑制因子起作用。
有一些证据表明PKR在范围很广的人恶性肿瘤中为无活性的，不存在或表达减少。
致癌Ras突变存在于约30％的所有人肿瘤中，而上游Ras激活因子的突变甚至更常见(即EGF受体，Neu受体，PDGF受体)。Mundschau和Faller(15，16)描述了致癌Ras诱导的PKR抑制因子。此外，Strong等证明Ras途径的激活导致PKR活性的下调。
核糖体蛋白L18在原发结肠直肠癌组织中过度表达，并且最近表明它结合并灭活PKR(18)。
有5q易位的患者表现出PKR表达减少(19-21)。干扰素调节因子1(IRF-1)是一种有肿瘤抑制因子活性的转录因子，它位于人染色体5q区。PKR基因转录部分由IRF-1调节。
人PKR位于2p21-22，最近被识别为急性髓细胞白血病的情况下的易位位点。
在低分化、高度恶性的肿瘤活检中，PKR蛋白以低水平存在或检测不到(23-25)。
STAT1
STAT1是干扰素途径的必要介质，它的激活导致PKR mRNA和蛋白的上调(见图1)。
在抗干扰素黑色素瘤细胞系和原发黑色素瘤活检物质(26)，在多种人肿瘤细胞系包括髓细胞白血病、宫颈癌、卵巢癌和肺癌(27)，以及在胃腺癌(28，29)中有明显的STAT1蛋白水平/活性缺陷。此外，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)是一种一般应答于干扰素的恶性肿瘤(然而临床抵抗经常出现在病历的很大部分中)。Sun等(30)报道了STAT1蛋白不出现在CTCL细胞系中，表明对干扰素的临床抵抗可能是由于STAT1突变而产生的。
PML：早幼粒细胞白血病基因
PML是一种通常作为肿瘤抑制因子起作用的干扰素诱导基因以及Fas，TNFα和干扰素诱导的凋亡的关键调节剂。最近，Chelbi-Alix等报道了PML基因产物的另一种正常功能是抑制病毒复制。PML-RAR融合蛋白作为干扰素诱导的凋亡的显性负抑制因子起作用，我们可以预测它也使APL细胞优选易受病毒感染。
PKR蛋白或活性的下调出现在范围很广的人恶性肿瘤中。当癌细胞通过去除PKR或PKR介质获得生长优势和无约束的蛋白翻译能力时，这些细胞同时去除了细胞的主要和有力的抗病毒防御机制之一。所以，具有降低的PKR活性的肿瘤细胞与它们的正常对应物相比将更易受感染。如前面所提示的，干扰素途径的其它成分(如STAT1和PML)在人恶性肿瘤中经常突变，它们活性的丧失将导致肿瘤细胞对病毒感染敏感。这种差异易感性形成了本发明基于病毒的癌症治疗方法用于处理肿瘤细胞生长的基础。
用一些不同的病毒筛选PKR缺失小鼠株提示PKR缺失动物可以抑制许多病毒包括牛痘病毒、流感病毒和EMCV感染。然而，疱疹性口腔炎病毒(VSV)表现出感染PKR-/-动物的能力。观察到棒状病毒家族的一员VSV仅通过50个感染性病毒颗粒(或斑形成单位，pfu)鼻内感染后杀灭100％的PKR缺失动物。相对地，杀灭半数被感染的野生型同窝出生动物要求超过20,000倍的VSV颗粒。
VSV是一种有被膜的，有一个简单的五个基因的基因组的负义RNA病毒。这是一种特征非常突出的病毒家族，有一些血清型不同的实验室株和许多有特点的突变体。VSV的天然宿主包括昆虫、啮齿类和饲养动物。总的说来，极少的北美人接触过此病毒—大多数人类感染发生在实验室人员和农民。人类感染为无症状或表现为轻度“流感”。在感染人群中没有报道严重疾病或死亡的病例。
观察了VSV在野生型细胞中选择性感染肿瘤细胞的能力。在过夜感染后，肿瘤细胞系表现出比正常原代成纤维细胞中检测到的高100到1000倍的感染率。而且，在肿瘤细胞培养物中细胞病变作用(cpe)是加速的。
由于PKR是一种干扰素可诱导的基因产物，通过检验在暴露于VSV之前用干扰素预处理的细胞而判断病毒感染作用。用干扰素预处理的野生型细胞培养物抗VSV感染，而肿瘤细胞系，例如，但不限于纤维肉瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病和卵巢肉瘤易受病毒感染(见表1，实施例2；图2)。在有或无干扰素时肺癌细胞(LC80)也易受VSV感染(没有提供数据)。然而，在干扰素存在时一些肿瘤细胞系抗VSV感染。
卵巢癌细胞、纤维肉瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和白血病细胞是VSV敏感的，并且这种敏感性在干扰素存在下仍保持，所以，这些肿瘤细胞和由其衍生的癌可能特别顺从VSV治疗。然而，其它癌也可能顺从这里描述的病毒治疗。研究VSV敏感性使用的原发肿瘤物质可以轻易从腹水中得到。此外，由于肿瘤包含在腹腔内，它可以证明特别适于局部给予基于病毒的治疗法。从这一点出发，从病人腹水得到的活组织可以被用于检验肿瘤细胞在有或无干扰素存在时支持VSV感染的能力。
预计VSV将具有体内治疗活性并将具有杀灭远处(转移)肿瘤生长的能力。到目前为止还没有观察到被治疗小鼠的显著器官病理，然而，应该进一步研究VSV病毒血症的动力学。使植入了人黑色素瘤细胞的裸鼠接受VSV，或另外的体外感染VSV的黑色素瘤细胞(见实施例5)，以保证通过注射在几小时的时间段中连续产生感染性颗粒到肿瘤(图5)。在伪注射动物中(VSV(-)；仅注射载体)，肿瘤在实验过程中连续生长。仅接受纯病毒的动物起初表现为在前四天中肿瘤连续生长，此后肿瘤开始缩小其大小并在实验过程中不断进行此过程。注射了感染细胞的肿瘤停止生长并消退为类似于疤痕组织的小硬结。在一些接受注射的更大的肿瘤中，1-2天内在肿瘤上形成了溃疡(见图6)。尽管注射纯化病毒和感染的黑色素瘤细胞都导致显著消退，被感染的发生细胞更有效。
对免疫活性小鼠肿瘤模型的研究(即Strong等所描述；17)检验抗体应答对治疗性的VSV感染的影响，并判断VSV感染肿瘤细胞是否增加它们的免疫原性并促进宿主机体对肿瘤抗原的识别。
原代人骨髓在没有干扰素预处理时也表现为抗VSV感染(见表1，实施例2)，提示这些细胞对VSV感染有天然的抵抗力。相对的，也检验了两种白血病细胞系(M07E和L1210)并发现它们易受VSV感染，这是由细胞致病作用、病毒生长和细胞存活力的丧失而证实的。
尽管这里公开的结果涉及VSV，应该理解本领域的技术人员依照此文件中概括的方法将很容易筛选其它VSV株、VSV衍生物包括VSV突变体、或相关病毒选择性杀灭肿瘤细胞的能力。可以检验其他一些血清学和生物学不同的VSV株的该特性。这些VSV株包括，但不限于New Jersey，Piry，Coccal和Chandipura。如果要求用连续VSV注射完全根除肿瘤，识别其它适当的血清学无关的株可能是有用的。另外，已知小核糖核酸病毒(如鼻病毒)对人组织相对无害而在组织培养中的转化细胞中生长极佳，也可以使用这些病毒。另外，可以用这些病毒的结合而增强用VSV所观察到的细胞致病作用。
为判断正常或肿瘤细胞的存在是否可以影响其它细胞类型(正常或肿瘤细胞)并改变这些细胞中任何一种对VSV感染的抵抗力或易感性，在VSV存在下共同培养正常细胞和成纤维细胞。用moi为0.1pfu/细胞感染培养物并且允许在有或无干扰素存在下继续进行。在0，12和24小时(图4)将培养物固定并用大分子T抗原的抗体染色(红色核)而检测293T细胞，用DAPI(蓝色核)染色所有细胞类型。293T细胞(红色核)的数目在此时间段中稳定下降并表现出由病毒诱导的凋亡导致的细胞死亡的严重浓缩或成片段细胞核的特征。这种对转化细胞的选择性破坏在干扰素存在或不存在时都可以观察到。尽管293T细胞在共同培养物中产生大量病毒，正常成纤维细胞不发生反应于VSV感染的核改变，它们的数目也不减少。这提示可以用VSV处理细胞群混合物而仍然保持肿瘤细胞对VSV的敏感性以及正常细胞对VSV的抵抗力。
另外，有许多VSV的突变体，例如，但不限于在宿主蛋白合成停止时受损，或对干扰素更敏感或更不敏感，在正常和肿瘤细胞间可以表现差异感染的突变体。例如，不准备以任何方式限制，描述了其它已知定向于STAT1或PKR阴性细胞的病毒突变体，包括不能灭活PKR的流感病毒株(36)。已知缺乏PKR灭活VA基因的腺病毒突变体在没有PKR时生长更好。
如这里所描述的，分离出在干扰素应答细胞中生长很差的VSV突变体。这些突变体的选择取决于它们在单层干扰素应答细胞中形成小斑点的能力。在干扰素不应答细胞(即肿瘤细胞)中，这些突变体形成大的斑。在干扰素应答细胞中通过斑大小选择突变体允许分离在正常细胞中生长不佳的病毒。然而，在不同选择标准下可以获得其它VSV突变体。扩增用干扰素应答细胞分离的突变体并检验它们杀灭肿瘤和正常细胞的能力。这里的基本原理是可以诱导靶细胞中干扰素的VSV突变体在干扰素应答细胞群中将限制它们自身的复制。然而这些相同的病毒在缺乏干扰素应答的肿瘤细胞中将具有无限制的生长。这些突变体是有价值的，因为与野生型VSV相比，它们对正常组织的细胞致病作用甚至更小并同时保持溶瘤活性。
根据它们在单层干扰素应答细胞细胞中形成斑的能力获得四种突变体(Mut 1-4)。这些突变体和野生型病毒(moi为1.0pfu/细胞)被用于感染黑色素瘤和正常人包皮成纤维细胞。所有的突变体都可以有效杀灭肿瘤细胞但用突变体感染的正常细胞甚至在感染后很长时间仍表现出完全未感染。在同样的moi下，野生型VSV证明了对正常细胞的细胞致病作用。这些结果提示突变病毒具有更强的治疗作用，它们更有效杀灭肿瘤细胞同时保留正常细胞，并且它们也具有产生更多病毒颗粒并增加肿瘤中的病毒传播的能力(见实施例4)。令人惊讶的是，这些突变体在HCT 116结肠癌细胞中比野生型VSV(Indiana)生长更快，而在OSF 7细胞中则不是(见实施例21和图10A和10B)。优选在感兴趣的肿瘤细胞而不是正常细胞中迅速生长的VSV突变体。
早期实验提示PKR-/-小鼠被通过一些感染途径感染的VSV杀死，然而，这些小鼠不受静脉注射病毒的影响。为判断血浆成分在接触时是否灭活病毒，用人血浆(从正常未感染供体得到)孵育从一些来源包括小鼠L细胞(从正常未感染供体得到)内得到的VSV并判断孵育后的病毒滴度(实施例6)。L细胞产生的VSV的病毒滴度降低了400倍，而人黑色素瘤产生的VSV不受血浆孵育的影响。这些结果提示为产生VSV而选择细胞系是关键的。根据此观察，可以筛选人细胞系得到产生最优量对人血浆不敏感的病毒的细胞系。
尽管没有理论支持，这两种病毒制剂的不同反应了在产生病毒的细胞表面的蛋白系列的性质。作为它的复制循环的一部分，VSV通过浆膜出芽并获得它的被膜上的细胞蛋白。当L细胞上的某些蛋白在病毒颗粒的范围内表达时可以激活补体。实际上，以前已经表明在某些小鼠细胞中产生的逆转录病毒颗粒由血清灭活而在人细胞系一种亚型中产生的相同病毒不受血浆影响。(Pensiero，M.N.，et al.Hum Gene Ther，1996.7：1095-1101)。
产生VSV的常规技术很难达到工业生产的规模。所以，使用亲和基质，如亲和层析进行VSV纯化(见实施例7)。然而也可以用本领域中公知的其它亲和纯化方案，例如，但不限于批量处理病毒溶液和亲和基质，通过离心沉淀VSV结合的基质，并分离病毒。为给病毒提供用于病毒纯化的亲和标记，可以用本领域公知的技术对病毒进行基因修饰，在它的表面表达一种或更多亲和标记，优选表达为融合病毒被膜蛋白，或者可以对生产细胞系进行加工以便在它们的浆膜上表达一种或更多亲和标记，这可以在通过膜出芽时由病毒获得，然而，也可以使用内源性病毒被膜蛋白。一种很有特点的亲和标记包括使用结合于固定的镍柱的组氨酸残基，然而，应当理解也可以使用其他亲和标记。
可以制备作为VSV或其他病毒的普遍生产细胞系，它们表达有镍结合或其它亲和标记特性的嵌合VSV蛋白。普遍生产细胞可以用于使任何有被膜的病毒(包括所有有被膜的RNA和DNA病毒)产生嵌合蛋白(亲和标记)。为纯化通过核膜出芽的病毒(如疱疹病毒)，制造了在核膜中表达的病毒被膜蛋白上表达的标记。
其它亲和标记包括抗体，优选在低盐、低温或关键阳离子/阴离子存在的条件下识别特定肽的抗体。生理盐浓度、热洗脱或螯合作用可以影响洗脱。对抗二肽或三肽产生的抗体也可以用于纯化。以这种方式，单个病毒颗粒表面的两种或更多的这些标记将允许病毒的连续亲和纯化。
为改变其特性以便体内使用，可以对VSV进行基因修饰。VSV的基因修饰方法是本领域中明确建立的。例如，为VSV建立的反向遗传体系使改变病毒的遗传特性成为可能(Roberts A.and J.K.Rose，Virology，1998.247：1-6)。此外，可以使用本领域技术人员熟知的标准技术对VSV进行基因修饰并将需要的基因引入VSV基因组，从而产生重组VSVs(如Sambrook et aL.，1989，A LaboratoryManual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
VSV可以体内定向于需要位点而增加病毒功效。例如，可以使用产生定向于特定位点的融合的VSV G蛋白修饰来增强VSV的体内功效。然而，应该理解除VSV G蛋白以外的其它蛋白目标也可以被修饰而产生这种融合蛋白。这种融合蛋白可以包含，例如，但不限于对肿瘤抗原有特异性的单链Fv片段(Lorimer，I.A.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996.93：14815-20)。这种可以用于制备VSV G融合蛋白的单链Fv片段的一个例子是定向于出现在约80％的人乳腺肿瘤细胞中的突变EGF受体的一种Fv片段。
VSV也可以被修饰为表达一种或更多可以将前体药物代谢为毒性代谢物的自杀基因从而允许被VSV感染的细胞通过给予前体药物而被杀灭。例如，包含疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因或胞嘧啶脱氨酶基因的VSV病毒编码可以分别将更昔洛韦或5-FC转化为毒性化合物的酶。然而，应该理解，也可以使用其它自杀基因。已经确定，更昔洛韦不仅杀灭表达HSV TK的细胞，也杀灭紧邻细胞，包含这些自杀基因的rVSV表现出一些优点。例如，由于一个被感染细胞杀灭10个或更多周围的肿瘤细胞，病毒的有效杀灭增加，此外，如果需要，包含自杀基因的rVSV允许从感染病毒的个体清除病毒。这在不清楚VSV如何影响个体的情况下是重要的。例如，具有免疫力的人可能出乎意料易受VSV感染。所以添加自杀基因对病毒治疗的安全性将是一种改善。
也可以通过引入哺乳动物基因产物修饰VSV。这种哺乳动物基因产物将限制正常细胞中VSV生长，但不限制VSV在肿瘤细胞或病变细胞中的生长。例如，可以表达一种或更多p53的反式激活因子的rVSV激活正常细胞中而不是肿瘤细胞中的凋亡途径。所以，这些rVSVs选择性限制正常组织中的病毒传播。然而，应该理解其它哺乳动物基因产物也可以为此目的而在VSV中表达，另一个不考虑以任何方式限制的例子是PKR基因。表达PKR基因的rVSV限制所有正常细胞中病毒的复制，然而，在表达PKR抑制因子的细胞中病毒编码的PKR被灭活。表达一种或更多PKR抑制因子的细胞的一个例子是被丙肝病毒慢性感染的细胞。由于丙肝病毒编码并表达两种已知的PKR抑制因子(即NS5A和E2)，VSV编码的PKR基因产物被中和，允许VSV自由复制。
前面的描述不准备以任何方式限制要求保护的发明，此外，所讨论的特征结合可能不是解决本发明所绝对必要的。
在下面的实施例中将进一步举例说明本发明。然而应该理解这些实施例只是用于说明目的，并不用于以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：PKR阴性细胞易受VSV感染。
体内实验
初步实验定位于识别能够感染PKR-/-动物和细胞的病毒。用同源重组策略产生PKR缺失小鼠株(35，在此引入作为参考)并检验它们抵抗病毒感染的能力。由于这些小鼠是PKR-/-，它们应该易受病毒感染。将一些病毒种以一定范围的浓度给予PKR缺失动物。
PKR缺失小鼠感染
用常规剔除技术产生PKR缺失小鼠(Abraham，N.，et al.，J BiolChem，1999.274：5953-5962)。用不同量的疱疹性口腔炎病毒(Indiana株)鼻内感染三月龄或更大的5只一组的各组雌性小鼠。平行感染年龄匹配的野生型动物并每日监测两个系列动物的感染体征。这些包括水合、立毛、活动水平、食欲、后肢瘫痪、呼吸频率、体重和其它提示动物处于窘迫的症状。
野生型动物在VSV感染复数高达105pfu时表现出很少或仅仅是短暂的症状。相对的，PKR缺失动物非常迅速地发生脱水、立毛、食欲减退、呼吸频率加快、活动减少和斜视。在高剂量VSV感染时(105pfu)动物在24小时内表现出症状并通常在48小时内死于感染。在感染剂量低至25pfu时，100％的PKR缺失动物在5天内死于VSV感染。在另外的实验中，在用VSV感染后48小时处死5只一组的野生型和PKR缺失动物，并取出器官评估病毒滴度。在PKR动物中，此时发现每毫升肺匀浆超过100万PFU的滴度，而在野生型动物中滴度为每毫升肺匀浆0到100pfu。在野生型和PKR缺失动物脑中发现了相似量的病毒。在感染后的此时间，两种小鼠株剩余组织的病毒测量不到。
棒状病毒家族的一员疱疹性口腔炎病毒仅通过50个感染性病毒颗粒(或斑形成单位，pfu)鼻内感染就可以杀灭100％的PKR缺失动物。相对地，杀灭半数被感染的正常同窝出生动物要求超过20,000倍的VSV颗粒。这些结果提示PKR缺失动物可以抑制许多病毒包括牛痘病毒、流感病毒和EMCV的感染。然而VSV表现出感染PKR-/-动物的能力。这些结果也提示哺乳动物细胞抵抗VSV感染(Indiana实验室株)需要PKR。
实施例2：用VSV选择性杀灭肿瘤细胞
体外实验
在渥太华地区癌症中心随机选择一些肿瘤细胞系并检验它们对VSV感染的易感性。用健康成人志愿者的原代成纤维细胞培养物或健康供者的原代骨髓样品作为对照细胞。
用VSV感染肿瘤细胞
作为VSV溶瘤特性的第一步检验，评估了用VSV过夜孵育后病毒的产量和细胞致病作用。用感染复数(moi)为0.1噬斑形成单位(pfu)的Indiana株VSV孵育单层细胞。允许病毒在37度下吸附30分钟后，用磷酸缓冲液(PBS)彻底冲洗培养物并在37度下另外培养18小时。此时，在显微镜下检查细胞致病作用(cpe)并拍照。去掉18小时的上清液并测定每毫升培养基中的病毒滴度。在一些实验中，在感染前用人α干扰素(100单位/ml)将培养物预孵育12小时。
为检验分类细胞类型的感染动力学，使用了改进的cpe测定(Heise，C.，et al.，Nat Med，1997.3：639-645)。基本上，在12孔滴定板上以0.1pfu的moi感染单层细胞。在0时间和48小时内的每12小时将一个加样孔的感染细胞用0.5ml leukostat固定液(Fisher Diagnostics)固定2分钟。在实验结束时按照生产商的说明用Leukostat染色液1和2染色单层细胞。由于PKR是一种干扰素可诱导基因产物，检验在感染前12小时用100单位/ml人α干扰素进行的干扰素预处理，判断在分类细胞培养物中干扰素是否可以增强保护。数据见表1和图2-3。
表1：检验VSV敏感性的细胞系
 细胞系 细胞类型 参考文献  未处理过夜病毒产量 干扰素过夜病毒产量
 OSF 16 人正常成纤维细胞 ORCC1  1×105pfu 0pfu
 AG1522 人包皮成纤维细胞 [20] 0pfu
 OSF 7 人正常成纤维细胞 ORCC  1×106 0pfu
 OSF 12 人包皮成纤维细胞 ORCC  2×105pfu 0pfu
 MN11 小鼠纤维肉瘤 [21]  1×108 1×104
 A2780 人卵巢癌 [22]  2×108 1×107
 H-1078 正常人骨髓 ORCC  0pfu(moi 10pfu) 未判断
 M07E 人白血病细胞系 [23]  2×106(moi1.0pfu) 未判断
 L1210 小鼠白血病细胞系 [24]  4×106 2×104
 SK-MEL3 人黑色素瘤 [25]  未判断：cpe测定阳性 未判断：cpe测定阳性
 LNCAP 人前列腺癌 [26]  未判断：cpe测定阳性 未判断：cpe测定阳性
 293T 用SV-40大分子T和Adeno E1A转染的纤维肉瘤 [27]  1×108 8×107
 OVCA 432 [28]  1×107 0pfu
 C13 卵巢癌 [29]  1×108 1×105
 OVCA 3 [30]  5×107 未判断
 COS 大分子T转染的猴肾细胞系 [31]  2×108 未判断
 HCT 116 结肠癌 [32]  未判断：cpe测定阳性 未判断：cpe测定阳性
 OVCA 420 [28]  1×108 3×106
1 由前臂活检得到的ORCC建立。
从表1中的数据可以看出，尽管正常人成纤维细胞可以支持病毒复制，与肿瘤细胞相比，产生的病毒量和到细胞溶解的进展被充分延迟。用干扰素预处理后甚至观察到病毒产量的更大差异。尽管干扰素完全防止正常人成纤维细胞单层受VSV溶解细胞影响，肿瘤细胞保持敏感，产生大量病毒颗粒和迅速进行溶胞。
发现其它细胞系，包括肺癌细胞系(LC 80)和白血病细胞系、AML5(急性髓细胞白血病5)细胞也可以被VSV有效杀灭。对于AML5，在1.0pfu/ml的moi下，在24小时内细胞被完全杀灭，而0.0001pfu/ml在72小时内细胞被杀灭，进一步提示了白血病细胞对VSV的敏感性。
如图2中所见，VSV感染对单层肿瘤细胞的破坏比对正常人成纤维细胞的破坏要迅速得多。人黑色素瘤细胞系SK-MEL3，LNCaP前列腺癌细胞系和卵巢癌细胞A2780早至感染后12小时都表现出大量cpe。尽管正常人成纤维细胞培养物被感染并且能够产生病毒(见表1)，感染动力学比在实验所检验的三个肿瘤细胞系中要缓慢得多。另外，对于过夜的病毒生长测定(见表1，图2)，α干扰素处理完全保护了正常人成纤维细胞，但对保护三种肿瘤细胞系不受VSV细胞致病作用影响无效。
从表1得到的结果证明，可以采用用于判断易被VSV杀灭的肿瘤类型的筛选策略，使用例如，但不限于可以从ATCC获得的肿瘤细胞系NIH/NCI标准版。这些细胞系的筛选是为了用各种初始感染复数判断完成cpe和/或病毒生长的时间。这些实验是在干扰素存在和不存在的条件下完成的，从而判断了VSV敏感及抗干扰素的抗病毒活性的肿瘤的数目和类型。
白血病的VSV治疗
VSV并不成功地感染骨髓干细胞，甚至在10pfu/细胞的高moi时也是如此(H-1078；表1)。被处理的培养物保持它们所有的干细胞特征。在过夜感染后两种白血病细胞系(M07E和L1210；表1)被杀灭并产生大量病毒。
为判断VSV是否可以杀灭癌症患者的原代白血病细胞，从AML患者得到外周血样，收集白细胞并将其平铺在加入了10％FBS的RPMI培养基中(在6孔滴定板中107/加样孔，每种感染双份)。将细胞伪感染或以10.0/细胞的moi感染。VSV选择性杀灭髓细胞白血病细胞，由母细胞(白血病母细胞)百分比的减少而提示，而细胞总数最低限度受影响(即中性粒细胞活跃)。白血病样品在感染后16小时产生超过107pfu/ml的VSV滴度。样品中的母细胞数目在感染后21小时后剧减，而正常中性粒细胞的比例增加。伪感染细胞(-VSV)在单层中几乎含70％的母细胞，而在感染VSV(+VSV)的细胞中正常细胞占绝大多数。这些结果证明VSV可以优选杀灭原代白血病母细胞而保留正常血细胞。
实施例3：在混合培养物中杀灭肿瘤细胞
以50∶50的混合共同培养人成纤维细胞和293T肿瘤细胞。由于293T细胞表达不存在于正常细胞中的大分子T抗原，两种细胞类型可以通过免疫荧光区分。
在此实验中以0.1pfu/细胞的moi感染培养物并且在干扰素存在或不存在时允许进行感染。在0，18和24小时(图4)固定培养物并用大分子T抗原(红色核)的抗体染色检测293T细胞，用DAPI(蓝色核)染色所有细胞类型。起初两种细胞类型都表现出纺锤形的形态和大的卵圆形核。18小时后293T细胞(红色核)数目减少，许多剩余的293T细胞表现出核形态改变。在感染后24小时，检测到极少数的293T细胞，保留的少数293T细胞表现出由病毒诱导凋亡而死亡的细胞的浓缩或碎片核的特征。
在干扰素存在或不存在时都观察到了转化细胞的选择性破坏。尽管293T细胞在共同培养物中产生大量病毒，正常成纤维细胞不发生反应于VSV的核改变，数目也不减少。
实施例4：作为溶瘤剂的VSV突变体
根据VSV突变体在单层干扰素应答细胞中形成与在单层干扰素不应答细胞中形成斑的大小相比为小斑的能力分离VSV突变体。选择在干扰素应答细胞中形成小斑的病毒分离物，扩增并再克隆。扩增以这种方式分离的突变体并检验它们杀伤肿瘤和正常细胞的能力。这里的基本原理是，可以诱导靶细胞中干扰素的VSV突变体可以在干扰素应答细胞群中限制它们自身的复制。然而这些相同的病毒将在缺乏干扰素应答的肿瘤细胞中具有无限制的生长。这些突变体将是有价值的，因为它们应该对正常组织具有更少的细胞致病作用而保持溶瘤活性。
根据在单层干扰素应答细胞中形成小斑的能力获得4种突变体(Mut 1-4)。这些突变体最初由Lauren Poliquin博士(魁北克大学蒙特利尔分校)识别并提供。在5轮斑纯化后，将这些突变体和野生病毒(moi为1.0pfu/细胞)用于感染黑色素瘤细胞和正常人包皮成纤维细胞，在感染后12和24小时判断释放病毒的滴度。
所有突变体都可以有效杀灭肿瘤细胞，但感染突变体的正常细胞甚至在长时间点后仍表现出完全未受感染。在同样的moi下，野生型VSV表现了对正常细胞的细胞致病作用。也观察到所有突变体在过夜感染黑色素瘤细胞后产生比野生型VSV多大约10倍的病毒。在正常细胞中，尽管突变体1-4比野生型VSV有显著更低的细胞致病作用，被感染的培养物产生了相似量的病毒。这些结果提示突变病毒具有更强的治疗作用，这在于它们有效杀灭肿瘤细胞而保留正常细胞，它们也具有产生更多病毒颗粒及增加肿瘤中病毒传播的能力。
实施例5：感染具有人肿瘤异种移植物的裸鼠
将人黑色素瘤细胞移植到裸鼠中并分组。一组接受伪注射(VSV(-))，另一组接受野生型VSV注射或将注射前1小时用VSV体外感染的另外的黑色素瘤细胞注射到肿瘤位点，以便运送在几个小时的时间段中连续产生感染性颗粒到肿瘤的细胞(VSV(+))。这些实验的结果见图5，它表示在接受治疗和伪注射的动物中肿瘤面积的平均值和时间。
在伪注射动物中(VSV(-)；仅用载体注射)，肿瘤在实验过程中连续生长。仅接受纯病毒的动物起初表现为肿瘤的连续生长，而在感染后4天肿瘤开始缩小并在实验过程中连续缩小。接受感染细胞注射的肿瘤表现最剧烈的消退。基本上，大多数肿瘤停止生长并消退为类似于瘢痕组织的小硬结。
在一些更大的接受注射的肿瘤中，1-2天内在肿瘤上形成溃疡，(见图6)，然后曾经迅速生长的恶性肿瘤连续缩小。尽管注射纯化病毒和感染的黑色素瘤细胞都导致显著消退，感染的产生细胞更有效。
实施例6：产生VSV的细胞系的选择影响病毒对血浆的敏感性
早期实验提示PKR-/-小鼠被VSV通过一些感染途径杀灭，然而，这些小鼠不受静脉注射病毒的影响。尽管没有理论依据，这可能是因为PKR-/-血管内皮细胞提供组织感染的屏障或因为在接触时血浆成分灭活病毒。为检验后面的概念，将由一些来源，包括小鼠L细胞内产生的VSV用人血清(从正常未感染供体得到)孵育并判断孵育后的病毒滴度。
在人血清中孵育VSV后，L细胞产生的VSV的病毒滴度降低了400倍。而另一方面，在人黑色素瘤细胞中产生的VSV不受在血浆中孵育的影响。
这些结果提示为产生VSV而选择细胞系是关键的。根据此观察，筛选人细胞系得到产生最优量对人血清不敏感的病毒的细胞系是可能的。
实施例7：VSV浓缩和纯化的策略
VSV生产的常规技术包括离心步骤和梯度纯化—这两种方法都很难达到工业生产的规模。所以，研究了纯化VSV的其它方案，例如，进行病毒颗粒的同步浓缩和纯化的亲和柱。
为给病毒提供用于纯化病毒的亲和标记，可以使用内源性蛋白或将病毒加工为在表面表达一种或更多亲和标记，或可以将生产细胞系加工为在它们的浆膜上表达一种或更多可以在病毒通过膜出芽时获得的亲和标记。可以用亲和层析纯化独特的病毒被膜蛋白。
这种亲和标记的一种可以涉及使用与固定镍柱结合的组氨酸残基，然而，应该理解，也可以使用其它亲和标记。用噬菌体M13检验了这种方法。使用噬菌体肽显示系统(Koivunen，E.，et al.，J.NucIMed，1999.40：883-888)，选择了与镍柱结合，但可以用咪唑洗脱的表达含组氨酸的肽的病毒颗粒，包括：
CTTHRHHTSNC(SEQ ID NO：1)；CLNAHRTTHHHC(SEQ ID NO：2)；
CHGLHSNMRHC(SEQ ID NO：3)；CHHHHRLNC(SEQ ID NO：4)；CHSHHHRGC(SEQ ID NO：5)；CWDHHNHHC(SEQ ID NO：6)；CDNNHHHHC(SEQ ID NO：7)；CHHHRISSHC(SEQ ID NO：8)。这些肽在M13噬菌体表面的表达导致这些病毒在镍树脂上的纯化浓缩，以及用低浓度咪唑的洗脱。
一个或更多的这些序列可以被整合到VSV G蛋白而导致镍残基上携带这些肽的病毒颗粒浓度增加。被洗脱的病毒预计将保持它的感染性。
以这种方式生产了可以是VSV或其它表达具有镍结合特性的嵌合VSV蛋白的病毒的通用生产者的细胞系。这种通用生产者细胞可以用于为任何有被膜病毒(包括所有有被膜的RNA和DNA病毒)生产这种嵌合蛋白(亲和标记)。为纯化通过核膜出芽的病毒(如疱疹病毒)，制造了在核膜表达病毒被膜蛋白上表达的标记。
其它亲和标记包括抗体，优选在低盐、低温或关键阳离子/阴离子存在条件下识别特定肽的抗体。生理盐浓度、热洗脱或螯合可以影响洗脱。产生的抗二肽或三肽的抗体也可以用于纯化。以这种方式，单个病毒颗粒表面的两种或更多标记将允许病毒的连续亲和纯化。
实施例8：用VSV治疗慢性感染
一些人类疾病是由于慢性病毒感染而产生的，包括潜伏疱疹感染、肝炎、AIDS和宫颈癌。在每种情况下，致病病毒介质发展了灭活干扰素应答途径中的成分的机制，这些成分包括PKR(如Chelbi-Alix，M.K.and H.De，The Oncogene，1999.18：935-941；Gale，M.J.，Jr.，et al.，Virology，1997.230：217-227；Gale，M.J.，et al.，Clin Diagn Virol，1998.10：157-162；Gale，M.，Jr.andM.G.Katze，Methods，1997.11：383-401；Barnard，P.and N.A.McMilIan，Virology，1999.259：305-313)。所以，给予有这些疾病的个体VSV，或诱导VSV突变体的干扰素，或其结合，选择性消除慢性感染的细胞。进一步的治疗效果可以由通过细胞和病毒受体仅仅定向于慢性感染细胞而发现。
实施例9：VSV的基因修饰
为VSV建立了反向基因系统(Roberts A.and J.K.Rose，Virology，1998.247：1-6)，使它可以改变病毒的基因特征。
体内将VSV定向于需要位点
尽管曾在细胞内部的复制可以受到限制(即通过包括PKR的干扰素应答基因产物)，目前VSV可以与大多数哺乳动物细胞类型结合。所以可以实际找到靶细胞(即肿瘤细胞)而产生感染的病毒的有效剂量可以仅通过其它正常组织提供的“sink”而受到很大程度的限制。所以，VSV可以被基因修饰而仅仅结合并感染肿瘤细胞。
用本领域中熟知的重组DNA技术(如Sanibrook et al.，1989，A Laboratory Manual.New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress)修饰VSV G蛋白。将对肿瘤抗原特异性的单链Fv片段(Lorimer，I.A.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996.93：14815-20)与VSV G蛋白融合。这种单链Fv片段的一个例子是定向于存在于约80％的人乳腺肿瘤细胞中突变EGF受体的单链Fv片段。
VSV内自杀基因的表达
修饰VSV基因组使其包含疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因或胞嘧啶脱氨酶基因。这些基因编码可以将前体药物转化为毒性化合物的酶(如更昔洛韦或5-FC)。以这种方式修饰的病毒表达这些自杀基因，因此允许通过给予前体药物杀灭被VSV感染的细胞。这提供了两个优点，因为(1)已经确定更昔洛韦代谢物不仅杀灭表达HSV TK的细胞，也可以杀灭在紧邻处的细胞。这种“旁观者(by-stander)效应”可以增加病毒的有效杀灭(即一个感染细胞可以导致10个或更多周围肿瘤细胞的杀灭)；及(2)如果需要从感染病毒的个体中去除病毒，使VSV具有自杀基因可以允许去除病毒。
体内控制VSV生长
将哺乳动物基因产物引入VSV而限制正常细胞中的VSV生长，但此基因产物不影响肿瘤或患病细胞中的VSV生长。
重组VSVs(rVSV)包含一种或更多p53的反式激活因子，激活正常细胞而不是肿瘤细胞中的凋亡途径。这些rVSVs限制正常组织中的病毒传播但允许肿瘤细胞中的病毒生长。
包含PKR基因的rVSV限制所有正常细胞中的病毒复制，然而，在表达PKR抑制因子的细胞中，病毒编码的PKR被灭活。表达一种或更多PKR抑制因子的细胞的一个例子是慢性丙肝感染的细胞。由于丙肝编码并表达两种已知的PKR抑制因子(即NS5A和E2)，编码PKR基因产物的VSV被中和，允许VSV自由复制。
实施例10：随致癌转化逐渐丧失干扰素应答
用WT Indiana VSV在0.1pfu/细胞的MOI下感染用100单位α干扰素预处理或未处理的处于各种转化阶段的鼠成纤维细胞。在感染后18小时通过标准斑测定测量病毒产量。MEF：从Balb/C小鼠胚胎分离的小鼠成纤维细胞原代培养物。NIH 3T3细胞：永生的小鼠胚胎成纤维细胞。PVSrc：用病毒src基因转化的NIH 3T3细胞。MOP8：用多瘤病毒大分子T抗原转化的NIH 3T3细胞。结果见表2。
在此实施例中，干扰素应答的丧失与VSV感染的易感性和恶性表型的进展相关。MEF细胞为致死的(即在培养物中具有有限的生命周期)和完全干扰素应答的。NIH 3T3细胞尽管不是致癌的却是永生的，对干扰素的应答比MEFs低一万倍左右。PVSrc和MOP 8细胞是完全致癌的，支持强大的VSV复制并最低程度受干扰素处理的保护。
表2
细胞系                     病毒滴度    (pfu/ml)
                           未处理的    IFN-α
MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)    4×106      ＜10
NIH3T3                     8×107      1×104
PVSrc                      3×109      2×107
MOP 8                      1×108      5×106
实施例11：过夜感染各种未经IFN处理或经IFN处理的细胞系的病毒产生
以MOI为0.1pfu/ml的野生Indiana VSV感染各种未经IFN-α处理或经100单位IFN-α预处理的正常和转化细胞系并在37℃下孵育18小时。滴定每种样品的培养基测定VSV产量。结果见表3。
此样品表明病毒产生效率在一些肿瘤细胞类型中比正常原代组织中高10到10,000倍。在α干扰素存在下，正常原代细胞中的病毒产生基本完全被阻断，而在肿瘤细胞中，干扰素对VSV复制作用很小或没有作用。
表3
细胞系                               病毒滴度  (pfu/ml)
                                       未处理    IFN-α
OSF7(原代正常人成纤维细胞)             1×106    ＜10
OSF12(原代正常人成纤维细胞)            2×105    ＜10
OSF16(原代正常人成纤维细胞)            1×105    ＜10
PrEC(原代正常人卵巢表面上皮)           8×106    ＜10
HOSE(原代正常人卵巢表面上皮)           1×107    ＜1000
A2780(人卵巢癌)                        2×108    1×107
OVCA 420(人卵巢癌)                     1×108    3×106
C13(人卵巢癌)                          1×108    1×105
LC80(人肺癌)                           2×109    6×107
SK-MEL3(人黑色素瘤)                    1×109    1×109
LNCAP(人前列腺癌)                      4×109    5×109
HCT116(人结肠癌)                       1×109    2×109
293T(用T抗原和Ad病毒E1A转化的HEK细胞)  1×108    8×107
实施例12：鼻内运送到PKR+/-(129×Balb/c)小鼠的野生和突变VSV的LD50
麻醉8-10周龄的雌性小鼠并将50μl磷酸缓冲液(PBS)稀释的病毒加入每只动物的鼻孔进行鼻内感染(PKR+/-129×Balb/c株)。用Korler-Spearman法计算半数致死量。结果见表4。
此实施例证明，特别是突变体I，II和III与野生型病毒Indiana株相比在129×Balb/c小鼠中的毒性减弱。
表4
病毒                   鼻内LD50(pfu)
WT Indiana                1×108
突变体I                   1×1010
突变体II                  ＜1×1010
突变体III                 3×108
突变体IV                  ＜1×105
实施例13：与各种PKR+/+小鼠株相比PKR-/-小鼠对VSV精确敏感
以各种剂量鼻内感染PKR-/-和PKR+/+小鼠，随时间监测它们的存活。所有PKR-/-小鼠取决于剂量在2到5天之间死亡，而对照组小鼠在超过此时间点仍保持存活。结果见表5。
此实施例证明PKR基因产物在小鼠对VSV感染的抵抗力中的重要性。
表5
         基因背景            剂量(pfu)    在第5天的存活
PKR+/+    Balb/c              5×104         5/5
          CD-1                5×104          5/5
          Balb/c×129         5×104          5/5
PKR-/-    Balb/c×129         5×104         0/5
                              5×103          0/4
                              5×102          0/3
                              5×101          0/3
实施例14：VSV感染后的凋亡导致AML3细胞死亡
以MOI为3.0pfu/细胞的VSV感染OCI/AML3(急性髓细胞白血病)细胞。在感染后14和20小时分析未固定样品。用使用膜联蛋白-V-生物素-X/中性亲和素-PE红色荧光蛋白(分子探针)的流式细胞仪检测有磷脂酰丝氨酸膜易位的凋亡细胞。用使用JC-1电势敏感染料(分子探针)的流式细胞仪分析早期凋亡细胞中的线粒体膜去极化。通过极化线粒体的荧光发射从绿色改变到红色光谱而聚集JC-1。用乙锭(EthD-1)同二聚体-1红色荧光活体染料(分子探针)识别非存活AML3细胞。按照生产商的详细说明进行测定。结果见表6。
此实施例证明VSV至少部分通过病毒诱导的凋亡途径杀灭AML细胞
表6
      实验     MOI 0.0      MOI 3.0    净阳性率(死亡)
    阳性率     阳性率
  14 hrs p.i.  EthD-1     6.6     32.3     25.7
 Annexin V     14.3     52.7     38.4
 JC-1     7.5     21.4     13.4
  20 hrs p.i.  EthD-1阳性     6.4     58.5     52.1
 Annexin-V阳性     10.8     79.6     68.8
 JC-1     3.9     43.2     39.3
实施例15：突变VSV株感染并杀灭AML细胞
以1.0的MOI感染OCI/AML3(急性髓细胞白血病)细胞并孵育23小时。按生产商的说明用EthD-1(乙锭二聚体，分子探针)染色未固定细胞从而检测非存活细胞。用每10,000个计数的被染色细胞数计算死亡率。结果见表7。
此实施例证明使用的突变VSV株与野生Indiana株对杀灭AML细胞同样有效。
表7
   伪感染   WT IND    Mut I   Mut II     Mut III   Mut IV     Mut V
死亡率    30.0     64.7     60.7     86.7     72.1     74.4     82.8
实施例16：VSV和VSV感染细胞表现出对裸鼠中人黑色素瘤异种移植物的抗肿瘤活性
在8-10周龄的雌性Balb/c无胸腺小鼠中培养源于SK-MEL3(黑色素瘤)的肿瘤。在第0天，不处理肿瘤或在培养基中用108pfu的野生Indiana VSV或2.5×106的野生Indiana VSV感染的SK-MEL 3细胞(产生VSV的细胞)感染肿瘤。在每个数据点，计算处理和未处理组之间的统计学差异，置信值如下(b：p＜0.01；c：p＜0.001；d：p＝0.007)。结果见图7。在第3天，只有用产生VSV的细胞处理的肿瘤比未处理的肿瘤显著更小(a：p＜0.001)。从第0天到第2天，组间的肿瘤体积没有统计学的显著差异。数据点表示多种肿瘤的平均值+/-SEM(未处理组n＝8；产生VSV的细胞n＝8；单独VSV组n＝4)。
此实施例证明单次将VSV直接注射到实体肿瘤很大程度影响肿瘤生产，部分导致完全消退。将被感染肿瘤细胞用作运送病毒的载体也是有效的。
实施例17：PKR-/-小鼠对鼻内VSV感染非常敏感并显示IFN介导的抵抗力的缺陷
用5×104pfu的VSV鼻内感染(A & B)PKR-/-和对照小鼠(Balb/c×129)并在14天的阶段中监测死亡和存活，认为14天后保留的动物从感染中存活。结果见图8A和8B。PKR-/-小鼠与对照小鼠(WT)相比表现出存活严重减少，在第3或第4天内死亡，而所有对照小鼠从感染中存活。用2×104IU(图8A)或2×105IU(图8B)的IFN-α/β预处理(感染前18小时)对PKR-/-动物无保护作用。
此实施例证明干扰素途径的单个缺陷(缺乏PKR基因产物)足以使小鼠不能抗VSV感染。这种缺陷不能被干扰素挽救。
实施例18：干扰素可以在VSV治疗中保护携带异种移植的小鼠
将SK-MEL 3黑色素瘤细胞皮内注射到CD-1无胸腺裸鼠。在第0天，将活野生Indiana VSV(1×109pfu)或等量UV灭活的VSV注射到肿瘤并每日测量。结果见图9。在提示的时间(黑箭头)将干扰素给予动物亚组(VSV IFN)。(UV-VSV n＝4；VSV IFN n＝6；VSV n＝6)。在这些实验中，单次肿瘤内注射VSV在所用情况下都是肿瘤抑制性的。所有肿瘤至少部分消退而且在12只被治疗的小鼠中有3只的肿瘤完全消退。接受UV灭活病毒的肿瘤继续不减弱地生长，直到在第11天处死这些动物。不接受干扰素并接受活病毒注射的裸鼠在第10天开始死亡并且到第15天6只中仅有两只存活。相反地，所有干扰素处理过的感染裸鼠被保护不受VSV毒性影响并在45天以上保持无症状。
此实施例证明单次肿瘤内注射活VSV对抗肿瘤是有效的。另外干扰素注射可以挽救感染的、携带肿瘤的裸鼠，使其不受VSV毒性影响。
实施例19：VSV感染并杀灭白血病和骨髓瘤细胞
用VSV Indiana HR株以每个细胞1个噬斑形式单位的感染复数感染提到的细胞系。在感染后(p.i.)24、48和72小时将样品从被感染的培养物中取出并按照生产商的说明直接用碘化丙锭(分子探针)染色。然后用使用FACSsort WinMDI 2.7版程序的流式细胞仪分析样品。表8表示在所提到的感染后时间的每种白血病细胞类型的细胞死亡率。
此实施例表明VSV可以感染并杀灭多种白血病类型。从慢性髓细胞白血病(CML)患者分离K-562细胞，而MOLT-4为T细胞白血病，SR和H929为骨髓瘤。
表8
 细胞系 感染后24小时 感染后48小时 感染后72小时
 K-562(CML) 15.38％ 52.36％ N/D
 MOLT-4(T细胞白血病) 53.94％ 48.80％ N/D
 SR(骨髓瘤) 32.10％ 46.38％ N/D
 H929(骨髓瘤) 10.73％ 17.35％ 64.41％
实施例20：包括野生型Indiana和5种减毒VSV突变体的疱疹性口腔炎病毒(VSV)株显示与正常人成纤维细胞相比对人前列腺癌细胞的选择性细胞毒
从魁北克大学蒙特利尔分校的Lauren Poliquin博士处得到包括野生型Indiana和减毒突变株I(TR1026)，II(TR1026R)，I11(TP3)，IV(TP6)和V(G31)的疱疹性口腔炎病毒株。在用于本实验前，将这些病毒株的每一种进行5次噬斑纯化。
使人前列腺癌细胞(LNCAP)和正常人细胞(OSF 7前臂成纤维细胞)在96孔组织培养板上生长到密度为每个加样孔约5×104个细胞。将从5×105pfu到5pfu的病毒加入10倍稀释液中。每个滴定板上包括没有病毒的对照加样孔。在37℃下5％的CO2中孵育滴定板。用检测线粒体酶活性的比色MTS((3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羧基甲氧苯基]-2-[4-磺苯基]-2-氢-四唑，内盐)测定(CellTiter 96 Aqueous，catalog #G 1112，Promega Corporation，Madison WI 53711-5399)对细胞毒性进行定量，在490nm下监测。通过在病毒处理过的加样孔相对于未处理的加样孔中的病毒活力的丧失判断病毒处理过的加样孔中的细胞杀灭量。将数据描绘为pfu/细胞与相对于对照组的细胞杀灭百分比的图形。将这些细胞的TC50计算为以pfu/细胞表示的导致可存活细胞量减少50％的病毒量。更低的TC50值反映细胞对病毒裂解作用敏感性的增加。每种VSV株的体外治疗指数计算为OSF7细胞的TC50与LNCAP细胞TC50的比值。
结果见表9。野生型VSV-Indiana和五种突变体的每一种都表现了对人前列腺癌细胞的高度细胞毒性，这是由均低于0.01pfu/细胞的低TC50所反映的。正常人成纤维细胞对所有六种VSV株细胞毒的抵抗力高1到3个以上数量级。所有5种突变体对正常OSF7成纤维细胞的毒性更小并且具有比野生型Indiana VSV更高的体外治疗指数。
表9.VSV株(野生型Indiana和突变体I到V)对前列腺癌细胞和正常成纤维细胞的细胞毒测定结果
    突变体I     突变体II     突变体III     突变体IV     突变体V     野生型Indiana
    LNCAP前列腺癌TC50(pfu/细胞)     0.0064     0.0048     0.0014     0.0006     0.0012     0.0017
    OSF7正常成纤维细胞TC50(pfu/细胞)     ＞42     22     4.3     0.031     9.8     0.022
    治疗指数(TC50 OSF7/TC50 LNCAPP)     ＞6562     4583     3071     52     8167     13
实施例21：从感染野生型Indiana和各种突变VSV株的肿瘤细胞和正常细胞产生病毒
使HCT 116结肠癌细胞和OSF 7前臂成纤维细胞在35mm的组织培养皿中生长至汇合。去除培养基加入体积为30μl，对HCT 116细胞的感染复数为0.1pfu/细胞，对OSF 7细胞的感染复数为1.5pfu/细胞的病毒。在37℃、5％CO2下孵育1小时后，将1ml组织培养基加入培养皿。结果见图10A和B。在指出的时间点，从培养皿中取出10μl培养基样品。这些样品的病毒滴度通过噬斑测定而判断。
此实施例表明了在HCT 116结肠癌细胞中野生型和突变VSV株的快速复制动力学。所有四种突变VSV株在116结肠癌细胞中比野生型VSV的生长更迅速。注意在正常OSF-7细胞培养物中，为获得相似的复制动力学要求高10倍的病毒输入。
实施例22：恶性细胞在VSV(野生型Indiana)感染后被迅速杀灭并且不受IFN-α保护
不用IFN-α处理或用IFN-α(100单位)预处理单层正常原代人成纤维细胞(AG 1522)，然后用VSV以0.1pfu/ml的MOI感染。在12小时增长后，通过细胞固定终止感染并染色，从而判断细胞杀灭动力学。在实验过程中使对照(CNTL)单层继续生长，不受感染，因此染色更强。结果见图11。LNCAP为人前列腺癌；A2780为人卵巢上皮细胞癌，Sk MEL3为人黑色素瘤。
此实施例表明甚至在α干扰素存在下VSV Indiana对肿瘤细胞杀灭的快速动力学。尽管正常细胞也被VSV杀灭，其动力学更缓慢，正常细胞可以被α干扰素完全保护。
实施例23：在有或无IFN-α时人黑色素瘤细胞中可以见到VSV诱导的细胞致病作用但在原代人细胞中不能见到
用野生型Indiana VSV以0.1pfu/ml的MOI感染IFN-α(100U/ml)未处理或预处理过的正常人细胞和SK-MEL3细胞的明胶包被的盖玻片。结果见图12。人黑色素瘤细胞(SK-MEL3)在感染后12小时甚至在干扰素存在时也表现出cpe。在感染后24小时，这些恶性细胞死亡并将其从盖玻片取出。人原代细胞，包括包皮成纤维细胞(AG1522)，卵巢表面上皮细胞(HOSE)和前列腺上皮细胞(PrEC)在没有干扰素时直到36小时还没有表现出CPE(细胞致病作用)，并且在干扰素存在时时完全保护作用超过了感染后72小时。
此实施例证明即使在α干扰素存在时VSV Indiana也可以迅速破坏黑色素瘤细胞，而杀灭正常成纤维细胞和上皮细胞更慢，它们可以被α干扰素完全保护。
实施例24：VSV选择性杀灭与正常成纤维细胞共同培养的转化细胞
将相同数目的293T细胞(用腺病毒E1A和大分子T抗原转化的人胚胎肾细胞)和正常人包皮成纤维细胞平铺在明胶包被的盖玻片上并且在有或无干扰素时以0.1的MOI感染(WT Indiana YSV)。在感染后12(未表示)，24和36小时固定细胞。用抗TAg抗体和DAPI染色固定细胞。不管是否有干扰素处理，在感染后早至12小时红染的293T细胞被迅速杀灭，少量剩余细胞显示浓缩或成片段的核。在干扰素不存在时，感染后36小时正常成纤维细胞表现出核改变，但在干扰素存在时超过此时间点后被保护不受病毒侵袭。
此实施例证明在正常和肿瘤细胞的混合培养物中，VSV Indiana优选复制并杀灭肿瘤细胞。被感染共同培养物中的正常细胞死亡更缓慢并可以完全被干扰素处理挽救。
实施例25：静脉内单剂量突变VSV在治疗裸鼠中人黑色素瘤异种移植物的效力
在5-6周龄的CD-1无胸腺小鼠中建立SK-Me13人黑色素瘤异种移植物。在第0天，按提示不处理或用5×109pfu的突变VSV静脉内处理肿瘤。结果见图13。
此实施例证明突变体II和III在单次静脉注射后可以抑制肿瘤生长。因此不需要将病毒给予肿瘤位点而在抑制肿瘤生长中起作用。另外，尽管突变体在正常小鼠组织中生长时被减毒，它们仍然可以体内定向于肿瘤细胞。
实施例26：选择性杀灭与正常骨髓共同培养的AML细胞
将不依赖于生长因子的细胞系OCI/AML3以1∶9与正常骨髓混合并且在用野生型Indiana VSV感染24小时。然后将各种细胞稀释液平铺在有和无生长因子的甲基纤维素中，14天后进行集落计数。表10表示接受104个细胞的培养皿的数据。星号(*)表示在无生长因子培养皿中甚至在每个培养皿平铺105个细胞时也没有检测到白血病集落。
此实施例证明在正常骨髓干细胞存在时对白血病细胞的迅速和选择性杀灭。另外，它证明了与多数其它常规癌症治疗不同，骨髓不是VSV溶瘤治疗的剂量限制目标。
表10
             感染复数
集落类型     0.0     1.0     5.0
白血病     172     0*     0*
中性粒细胞     12     7     5
混合的     6     3     4
单核细胞     10     7     5
实施例27：VSV测序
VSV基因组包含编码病毒蛋白N，P，M，G和L的基因。判断从野生型耐热VSV(HR)和三种突变VSV得到的这些蛋白的开放读码框(ORF)的cDNA序列(根据每种的5次测序)并与GenBank编号No.NC001560的序列比较(源于VSV Colorado和San Juan株)。突变体为M2(TR 1026R)，M3(TP3)和M4(TP6)。核酸序列见图14，16，18，20和22。对应的推断氨基酸序列分别见图15，17，19，21和23。它们的差异用突出的字母表示。虚线表示不完整序列。
氨基酸序列间的一些差异见表11，根据列标题使用了符号(即，对于列标题“GenBank和HR的差异”，符号K155R表示第155位的氨基酸在GenBank中为K，在HR中为R)。在还没有HR序列的情况下，只能在GenBank和特定突变体之间进行对比。M3*表示突变体3和HR之间的差异，但在此情况下，此位置的氨基酸与GenBank保藏物匹配(即突变体3和Genbank序列在此位置一致而HR不同)。
此数据证明HR株和GenBank保藏物之间的许多序列差异(主要源于San Juan株)。它也证明了突变体和产生这些突变体的HR之间的一些差异。这些基因差异与表型差异相关。
表11
 基因  GenBank和HR的差异 HR和突变体的差异 Genbank和突变体#2的差异  GenBank和突变体#4的差异
    N  D10A，K155R，N353S A10D(M3*)无(M4)
    P  K50R，A76V，Q77P，E99DP110Q，S126L，S140LY151H，M168I，E170KD237N 无(M2，M3和M4)
    M  S32N，Y54H，N57H，T133A，I171V，1226V M51R(M3)无(M4)
    G  H24Y，157L，Q96H，V141A，Y172D，G132DH242R，S4378T，L453FH487Y Q26R，R242H，S431A(均为M3)E254G(M4) A331V
    L  T367A，T689S，T2026IR2075K 无(M4)  I202L，K296R
在此引入所有引用作为参考。
对本发明的描述是关于优选实施方案。然而，对本领域中的技术人员应该很明显的是，可以进行许多改变和修饰而不离开这里描述的本发明的范围。
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Claims (80)

1.一种减低肿瘤细胞存活力的方法，包含将病毒给予肿瘤细胞，其中所述病毒不是常见人病原体并且所述肿瘤细胞为癌、造血肿瘤细胞、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤或神经内分泌肿瘤。
2.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞选自卵巢癌、白血病、肺癌和结肠癌。
3.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞为癌。
4.权利要求3的方法，其中癌为肺癌。
5.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞为造血癌细胞。
6.权利要求5的方法，其中造血癌细胞为白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
7.权利要求6的方法，其中造血癌细胞为白血病。
8.权利要求7的方法，其中白血病为急性髓细胞白血病。
9.权利要求7的方法，其中白血病为慢性髓细胞白血病。
10.权利要求7的方法，其中白血病为早幼粒细胞白血病。
11.权利要求7的方法，其中白血病为T细胞白血病。
12.权利要求6的方法，其中造血癌细胞为淋巴瘤。
13.权利要求6的方法，其中造血癌细胞为骨髓瘤。
14.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞为肉瘤。
15.权利要求14的方法，其中肉瘤为骨肉瘤。
16.权利要求14的方法，其中肉瘤为纤维肉瘤。
17.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞为神经内分泌肿瘤。
18.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞基本无PKR活性。
19.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞为PKR-/-；STAT1-/-；或同时PKR-/-和STAT1-/-。
20.权利要求1的方法，其中病毒为棒状病毒或小核糖核酸病毒。
21.权利要求20的方法，其中病毒为棒状病毒。
22.权利要求5的方法，其中棒状病毒为疱疹性口腔炎病毒。
23.权利要求22的方法，其中肿瘤细胞为白血病。
24.权利要求23的方法，进一步包含在给予VSV前将干扰素给予肿瘤细胞。
25.权利要求22的方法，其中病毒不能在肿瘤细胞中灭活PKR活性。
26.权利要求22的方法，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒的减毒株。
27.权利要求26的方法，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒M1株。
28.权利要求26的方法，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒M2株。
29.权利要求26的方法，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒M3株。
30.权利要求26的方法，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒M4株。
31.权利要求26的方法，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒M5株。
32.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞在哺乳动物受试者中并且通过静脉内、鼻内、腹膜内或肿瘤内给药至受试者而将病毒给予肿瘤细胞。
33.权利要求32的方法，其中哺乳动物受试者为人或非人哺乳动物。
34.权利要求32的方法，其中病毒被包含在病毒感染的细胞系中，给药包含通过选自肿瘤内、静脉内或腹膜内的途径将病毒感染的细胞系给予受试者。
35.一种在一群肿瘤细胞和非肿瘤细胞中减低病毒存活力的方法，包含将疱疹性口腔炎病毒给予细胞群，其中病毒能够选择性感染并杀灭肿瘤细胞。
36.权利要求35的方法，其中病毒不能在肿瘤细胞中灭活PKR活性。
37.权利要求36的方法，进一步包含在给予病毒前用干扰素处理细胞群。
38.一种识别易感于病毒处理的肿瘤的方法，包含：
(a)将含肿瘤细胞的样品分为第一部分和第二部分；
(b)用病毒处理第一部分；以及
(c)判断第一部分中的死亡细胞百分比是否高于第二部分，
其中如果第一部分中的死亡细胞百分比高于第二部分，则肿瘤易感于病毒处理。
39.权利要求38的方法，其中病毒为棒状病毒。
40.权利要求39的方法，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒。
41.权利要求38的方法，其中使用流式细胞仪判断死亡细胞百分比。
42.权利要求38的方法，其中肿瘤为实体肿瘤且通过活检从受试者获得样品。
43.权利要求42的方法，进一步包含在步骤(b)之前处理肿瘤样品以便分离细胞。
44.权利要求38的方法，其中肿瘤为白血病，并且通过从血样中分离白细胞而获得样品，从而获得含肿瘤细胞的样品。
45.一种识别易感于病毒处理的肿瘤的方法，包含：
(a)将含肿瘤细胞的样品分为第一部分和第二部分；
(b)用病毒和一定量的干扰素处理第一部分，干扰素的含量足够改善病毒存在时干扰素应答细胞的存活，并在无干扰素存在时用病毒处理第二部分。
(c)判断第一部分中的死亡细胞百分比是否高于第二部分，
其中如果第一部分中的死亡细胞百分比高于第二部分，则肿瘤易感于病毒处理。
46.权利要求45的方法，其中病毒为棒状病毒。
47.权利要求46的方法，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒。
48.权利要求45的方法，其中使用流式细胞仪判断死亡细胞百分比。
49.权利要求45的方法，其中肿瘤为实体肿瘤且通过活检从受试者获得样品。
50.权利要求49的方法，进一步包含在步骤(b)之前处理肿瘤样品以便分离细胞。
51.权利要求45的方法，其中肿瘤为白血病，并且通过从血样中分离白细胞而获得样品，从而获得含肿瘤细胞的样品。
52.一种纯化疱疹性口腔炎病毒的方法，包含将含病毒的样品加入亲和基质从而产生与亲和基质结合的病毒；洗涤结合的病毒；从亲和基质洗脱结合的病毒。
53.权利要求52的方法，其中亲和基质定位于在VSV被膜上表达的蛋白。
54.权利要求53的方法，其中在VSV被膜上表达的蛋白为嵌合蛋白。
55.权利要求53的方法，其中嵌合蛋白包含组氨酸标记，并且亲和基质为镍树脂。
56.一种在表面表达非天然蛋白的修饰疱疹性口腔炎病毒。
57.权利要求56的修饰疱疹性口腔炎病毒，其中非天然蛋白为包含亲和标记和病毒被膜蛋白的融合蛋白。
58.权利要求56的修饰病毒，其中非天然蛋白来源于生产细胞。
59.一种分离核酸分子，具有的序列包含：
(a)一种编码包含选自图15所示HR和M3的VSV株的N蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或
(b)选自图14所示HR，M2和M3的VSV株的N基因cDNA序列；
或
(c)与(b)对应的RNA序列；或
(d)与(a)，(b)或(c)互补的序列。
60.一种分离核酸分子，具有的序列包含：
(a)一种编码包含选自图17所示HR，M3和M4的VSV株的P蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或
(b)选自图16所示HR，M3和M4的VSV株的P基因cDNA序列；
或
(c)与(b)对应的RNA序列；或
(d)与(a)，(b)或(c)互补的序列。
61.一种分离核酸分子，具有的序列包含：
(a)一种编码包含选自图19所示HR，M3和M4的VSV株的M蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或
(b)选自图18所示HR，M3和M4的VSV株的M基因cDNA序列；
或
(c)与(b)对应的RNA序列；或
(d)与(a)，(b)或(c)互补的序列。
62.一种分离核酸分子，具有的序列包含：
(a)一种编码包含图21所示VSV M3株的G蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或
(b)图20所示VSV M3株的G基因cDNA序列；或
(c)与(b)对应的RNA序列；或
(d)与(a)，(b)或(c)互补的序列。
63.一种分离核酸分子，具有的序列包含：
(a)一种编码包含图23所示VSV M4株的L蛋白的氨基酸序列的蛋白的序列；或
(b)图16所示VSV M4株的L基因cDNA序列；或
(c)与(b)对应的RNA序列；或
(d)与(a)，(b)或(c)互补的序列。
64.一种病毒在生产减低肿瘤细胞存活力的药物中的用途，该病毒不是常见的人病原体，肿瘤细胞选自癌、造血肿瘤细胞、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤和神经内分泌肿瘤。
65.权利要求64的用途，其中肿瘤细胞选自卵巢癌、白血病、肺癌和结肠癌。
66.权利要求64的用途，其中肿瘤细胞为癌，例如肺癌。
67.权利要求64的用途，其中肿瘤细胞为造血癌细胞，例如白血病，如急性髓细胞白血病，慢性髓细胞白血病，早幼粒细胞白血病，或T细胞白血病；淋巴瘤；或骨髓瘤。
68.权利要求64的用途，其中肿瘤细胞为肉瘤，如骨肉瘤或纤维肉瘤。
69.权利要求64的用途，其中肿瘤细胞为神经内分泌肿瘤。
70.权利要求64到69的任意一项的用途，其中肿瘤细胞基本无PKR活性。
71.权利要求64到69的任意一项的用途，其中肿瘤细胞为PKR-/-；STAT1-/-；或同时PKR-/-和STAT1-/-。
72.权利要求64到71的任意一项的用途，其中病毒选自棒状病毒和小核糖核酸病毒。
73.权利要求72的用途，其中病毒为棒状病毒。
74.权利要求73的用途，其中棒状病毒为疱疹性口腔炎病毒。
75.权利要求74的用途，其中肿瘤细胞为白血病，其中在给予VSV前将干扰素给予肿瘤细胞。
76.权利要求74或75的用途，其中病毒为疱疹性口腔炎病毒的减毒株，例如M1，M2，M3，M4或M5。
77.权利要求74到76的任意一项的用途，其中肿瘤细胞在肿瘤细胞和非肿瘤细胞组成的一群细胞中并将病毒给予细胞群。
78.权利要求64到77的任意一项的用途，其中肿瘤细胞在哺乳动物受试者中，通过静脉内、鼻内、腹膜内或肿瘤内给药至受试者将病毒给予肿瘤细胞。
79.权利要求64到78的任意一项的用途，其中哺乳动物受试者为人或非人哺乳动物。
80.权利要求64到79的任意一项的用途，其中病毒被包含在病毒感染的细胞系中，给药包含通过选自肿瘤内、静脉内或腹膜内的途径将病毒感染的细胞系给予受试者。
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