CN113862388B - 一种与桃重瓣花紧密连锁的te分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记及其应用。利用桃重瓣花分离后代作为材料，确定了与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记，利用该分子标记可以替代传统的以表型观察判断的方法，在早期即可实现对重瓣花性状的鉴定。本发明不仅为桃重瓣花基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有重瓣花基因的桃树新品种提供了高效途径。

Description

一种与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记及其应用，属于分子标记辅助选择技术领域。

背景技术

桃是世界上最重要的经济水果树种之一，二倍体(2n＝16)，由于其基因组小(～250M)、童期相对较短(2～3年)，被视为蔷薇科进化和功能基因组研究的宝贵资源和重要的模式植物 (Shulaev et al.,2008)。桃原产于中国，4,000年前已在中国驯化，随后通过丝绸之路传递到欧洲各国(Faust et al.,1995)。在我国，桃是第三大落叶果树，广泛栽培于全国各地，是农业生产的一个重要组成部分。

具有额外花瓣的重瓣花在桃等观赏植物中具有引人注目的外观和商业价值，因此是重要的人工选择的性状。已经发现2个独立的遗传位点调控桃重瓣花性状。Lammerts(1945)描述了第一个隐性遗传的重瓣花性状位点(dl/dl)，并将其定位到Pp02染色体上(Dirlewanger et al.,2004)。第二个位点被鉴定为1个显性位点(Dl2/dl2)调控，最初由Beckman et al(2012) 描述，定位到Pp06染色体的末端，其候选基因已被鉴定为TOE型AP2基因。该基因中miR172 靶位点的缺失是蔷薇科重瓣花性状呈现的主要原因(Pascal etal.,2017；Stefano et al.,2018)。然而，到目前为止，Pp02染色体上的dl基因仍未被鉴定，与桃重瓣花紧密连锁的分子标记仍未被开发，难以实现早期对桃重瓣花进行分子鉴定。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记及其应用。利用桃重瓣花分离后代作为材料，确定了与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记，利用该分子标记可以替代传统的以表型观察判断的方法，在早期即可实现对重瓣花性状的鉴定。

一种与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记，所述TE分子标记核苷酸序列如SEQ IDNO.1 所示。

进一步的，上述TE分子标记的侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，上述TE分子标记位于桃基因组V2.0(https://www.rosaceae.org)Pp02染色体的25,860,343bp处。

进一步的，检测上述TE分子标记的引物对，其核苷酸如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4 所示。

上述与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记或上述引物对在选育具有桃重瓣花性状的种质资源中的应用。

上述应用的应用方法，包括如下步骤：

1)提取待测桃树基因组的DNA；

2)以待测桃树的基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增反应；

3)对扩增产物进行Sanger测序，检测上述TE分子标记存在情况，当基因型为TE/TE对应桃重瓣花，基因型为A/A或者A/TE对应桃单瓣花。

进一步的，上述应用方法中所述的步骤2)中所述的PCR扩增反应体系为：10ng/μlDNA 模板1μl，10μlM引物各1μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，余量为双蒸水，补齐至 25μl。

进一步的，上述应用方法中所述的步骤2)中所述的PCR扩增的反应条件：95℃预变性 30min；95℃变性15s；退火15s；72℃延伸(15-30s/kb)，循环32-34次，72℃终延伸5min。

有益效果：

(1)本发明采用基于重测序技术，对桃重瓣花的基因进行了精细定位，在精细定位区域内，开发出稳定的、共显性和多态性的TE分子标记，获得了与桃重瓣花基因紧密连锁的TE 分子标记，命名为FD-TE-25.86。由于研究的对象具有重瓣花的种质，已依据获得的紧密连锁标记克隆出了目标性状的基因，应用于分子辅助选育优良桃品种。

(2)本发明不仅为桃重瓣花基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有重瓣花基因的桃树新品种提供了高效途径。

(3)本发明基于开发的分子标记引物对提供用于辅助筛选具有特定重瓣花的桃树新品种的方法。

(4)通过本发明提供的分子标记，可以实现早期对桃重瓣花形状进行分子鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。

(5)本发明方法简便、快捷，有很好的应用推广前景。

附图说明

图1 417份桃资源的系统进化树、PCA(主成分分析)、群体结构和LD(连锁不平衡)消减趋势。

图2 Pp02号染色体上的2个独立的TE是导致重瓣花表型的遗传基础。

图3重瓣花性状的单倍型和Prupe.2G237700核苷酸序列分析。

图4 TE分子标记的位置。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

一、自然品种群体中重瓣花基因标记的开发

为解决获得准确的表型关联位点，本发明结合417份覆盖各主要产区的栽培桃品种高深度重测序数据(平均深度20.3X)进行结构变异(SVs)检测，筛选到SVs位点～6.4万个，利用全基因组关联分析(GWAS)，发现一个位于桃基因组Pp02染色体25,860,343bp处的TE 与重瓣花具有强相关性，命名为FD-TE-25.86，在图4方框处。

图1中显示417份桃资源的系统进化树、PCA(主成分分析)、群体结构和LD(连锁不平衡)消减趋势，图1中的a为基于全基因组范围过滤的高质量SNP变异数据，基于临近法构建的进化树。图1中的b.为前2个成分主(PC1和PC2)的PCA图。图1中的c为k＝3的群体结构图。x轴表示品种，y轴表示祖先关系的比例。x轴上的品种与系统进化品种排列顺序方式相同。图1中的d为4个群体的基因组平均LD消减趋势图：全部、P1群体、P2群体和P3群体。

图2表示Pp02号染色体上的2个独立的LI是导致重瓣花表型的遗传基础。图2中的a. 为重瓣花性状的曼哈顿图，GWAS基于326份桃资源的LI。虚线表示基因组范围上的显著临界值。x轴代表桃基因组的8条染色体。y轴表示-log10(P)。箭头处表示关联信号最强的LI；图2中的b.为重瓣花性状的GWAS的QQ图。x轴表示-log10转换的P预期值，y轴表示–log10转换的P实际值；图2中的c为关联信号最强的LI的局部放大图。

图3表示重瓣花性状的单倍型和Prupe.2G237700核苷酸序列的序列分析。图3中的a为基于LI的3个主要单倍型。Hap.1携带参考基因组序列；Hap.2是距成熟miR172d 263bp处有～1.2kb的LI的参考基因组序列；Hap.3是距成熟miR172d 333bp有～5.5kb的转座子LI的参考基因组序列；图3中的b为Prupe.2G237700的核苷酸序列分析。2个三角形表示插入位点；黄色序列表示miR172d前体，蓝色表示成熟miR172d。

重瓣花性状的GWAS结果表明该TE为最显著信号，表明该TE与重瓣花密切相关。当将重瓣花品种的二代重测序reads比对到桃参考基因组上，产生bam文件，通过IGV软件查看比对文件，发现该位点为纯合的TE插入。而单瓣花品种为其他的基因型(A/A或者A/TE)。

SEQ ID No.2为Pp02染色体25,860,343bp处没有TE(转座子)插入序列的桃参考基因组。TE分子标记为长度为5500bp的转座子序列(SEQ ID No.1)。当两条染色体该位点均有TE插入时，桃花为重瓣花。其他情况为单瓣花。

综上，当Pp02染色体25,860,343bp位点为纯合TE/TE基因型时，则待检桃品种花瓣100％为重瓣花；该位点为A/A或者A/TE基因型时，则待测样品100％为单瓣花。

二、基因组DNA的提取

基因组DNA的提取使用DNA secure新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)。首先选取新鲜干净的桃树叶片～0.3g，在液氮环境下利用研钵充分研磨成细粉状。然后根据试剂盒内附说明书进行基因组DNA的提取，最终产物置于-20℃保存备用。

三、SNP开发的引物设计

参考桃基因组V2.0序列(https://www.rosaceae.org)，采用Primer 3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物，引物参数为退火温度在57～65℃之间，引物长度18～27bp，开发基于TE侧翼序列的分子标记，扩增片段长度约为100～1,000bp。获得引物F和引物R。

四、PCR扩增体系

总体积为25μL，具体组分如下表所示：

表1 PCR扩增体系

四、PCR扩增及电泳检测

PCR仪上的反应条件设置为：95℃预变性30min；95℃变性15sec；根据引物的Tm值(56-72℃)，退火15sec；根据基因长度于72℃延伸(15-30s/kb)；变性、退火及延伸过程共循环32-34次；72℃终延伸5min；利用1％琼脂糖凝胶对PCR结果进行凝胶电泳检测。采用天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对琼脂糖凝胶电泳产物进行回收。

表2与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记分布、序列和命名

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记及其应用

<130> 2021

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5500

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

cattaataaa agggtaatgc tagggagacc atctagttgt accatatttt tgtaccaact 60

gatgtggctg atgagttggc tataattttt taatttttaa tttgtaccat attaaatgag 120

cttttaattt ttaatttttt aattttatta tctcttcact ttacagaaac ctaagcggtg 180

taggaagttt tgtttcacgt atattcaact ggttcttcct tacctcttcc ccttcctcat 240

ccttatcttc tctctaattt gccaacgacg ataaatcata ccagagtttt tcctgacgcc 300

tgtgacgacg gtaagttcat ctctatttca ctcttaggtt ttctcttgtt gggtgatgat 360

tgaaattttt ggattgattc tttgaatcat tgagatattt gtattactct tacgatcagt 420

attgaatact ttcatactaa ttgtatatca tgttcaatat ttgttttggg tctcataact 480

agccgttttt ggttctttct acagatggct tgacatgcct ccctccatac ttgaagtctt 540

tgattttttt tttttcttgt tttgagtaat cttatgttac tgggagtttt gttttctcct 600

atccgtattc cctttttgtg tcttgtgtgt tgtgtttgtt ttctcctatg catatggcac 660

tcatgcaatt ttgcaagttc aaataaaata ccatggctat aatattacaa tggttgctgt 720

gttgaaacct ctttttcctt gcttgtatgg atatgggtct ttgtaattta tgttggttgc 780

tgttttgaaa tctctttttc catgccttcc attactatgc agatcctatt ttattttgta 840

atcatgtctt cgagtagctt tacgagttca tatattaatc aagaagaaga tggggttcaa 900

atggaaaaga atgatggtga agcagtaagt gaggagcctg aattggagaa tagagagaat 960

gtggaagagc ctcgagttgg gatgactttt aacaacattg atgatatagt tgtctattat 1020

agagaatatg ggaagcaatt agggtttccc gtgaggaaga gaacatcaca aaagggagat 1080

gaaggagaat tgaaatatgt gactatttca tgtggtcgag aaggcaaata taagagtaaa 1140

tcaagtaatg tcctaaagcc acatccaagt ataaaaattg gttgcaaagc tagagtaaga 1200

gcaggtataa tcttagatgg aaggtggcag atcaactcta tcaaccttga tcataaccat 1260

gatatgagtc caaccaaggc tcgttatttt cgatgtcatc ggacaataag ttcatatatg 1320

aaaaggagga ttgagttaaa tgatagagct ggaataaggt taaacaagag ctataattca 1380

ttagtggttg aagctggggg ccatgagaat atctcctttt tggaaaagga ttgtagaaat 1440

tatattgaaa atgtgagacg attacggctt ggggaaggcg atgctactgc aatccaaact 1500

tattttctga atatgcaagc tcaaaattca aatttcttct atgcaattga tttagatcaa 1560

gatggtcggt taagaaatgt attttgggca gatgcaagaa gtagggcggc atataaggaa 1620

tttggagatg ttgttacatt tgatacaacc tacttgacga ataagtatga catgccattt 1680

gctccatttg tgggggtaaa tcatcatggg caatcaattt tacttggatg tgggctgatt 1740

tcaagtgaag atactgatgc ttttatttgg ttgtttaagt cttggctcac atgtatgcat 1800

gagcacgctc ctaggggaat aattactgat caagataaag ccatgaaaaa tgccattgag 1860

attatttttc ctaatactag acatcgttgg tgcttgtggc acataatgaa caagtttcct 1920

agtaagttga accgttacaa gcaatatgaa gctatcatgt atgccttgca aagtattgtg 1980

tatggctcat tggagaaggt tgagtttgaa gaaggttggg atgaaataat tgagaaatat 2040

gagttacaag acaatgaatg gttggctgga ctatataatg agagacaacg ttgggtacca 2100

tattttgtga aagatagttt ttgggcagga atgtctacca cacaacgaag tgaaagtatg 2160

aatgcatttt ttgatgacca tgtaaattct aagactactt taaaacagtt tgtggagcaa 2220

tatgaaaatg cattgaaagt taaggtggaa aaggagaagc aagaagattt taagtcttca 2280

tccattggtt ttgattgtgg aactcattat aacatggaga aacaggctca agaggtttac 2340

actatttcca aatataaaga atttcatgaa gaattaatag gcaaaatgta ttgcgactat 2400

gtttcacata aagtgaatgg tgcaaatttt gagtaccaaa tatctgagga tttcatgatg 2460

gaagggaaaa aaaagaggct ttatttcaag gtttggctta atgaagatga caatgaagtc 2520

cagtgcaatt gtcgcatgtt tgagtttaga ggcatattat gccgtcatac aatatatgtt 2580

tttcttcgcc acaacattga cttgattcca gaaaaatata taatgcgaag atggaggaag 2640

gatgtgaaaa gatgtcacac aaggattgaa atcaattatg aaagctatag tctcgcacct 2700

gaagcacaac gatgtcataa gatgcaaaag gcttttgatg agattaagga attggcaaat 2760

gattctgaca ataagtgcat gattgtgatg acttggatgg ataatgtaaa ggaggaactc 2820

tccaaacata atgttgtttg tggtagtgat caaccaaatc ctcagtcacc tattggcagg 2880

aacattgaga atgatgttag ttcaattccg aatgcaagtc aatgtattct tactccctta 2940

gcagctagaa agaaaggccg tccaccattt aaaaggagga aatctcagtt ggaacaagca 3000

gttaggaaga aacaagatag taaaaagaag aaacaagaga gtaacaagaa gatcaaatct 3060

tgtggaaaca acactaatgg agagaaagaa ctgaatgtat gcaattaaaa tggatacatt 3120

ttttattatt attttctaat gtattattca atcaataaag tattttattg tgactgtcct 3180

tgagttttta tgcaggattt gcagccaaca gaatttgatg atattggcca tattgttggt 3240

tcatctactt ctaaaggtga tggtgtagtt ggaacacaag agagcattgc tatgcaggta 3300

tgacatgaat gttttgtttt gattgattgt ttttgtttgt taaaattcat tattagtcat 3360

ttgctctagt actgatgatt cgctaattgt aacgaccaat attatggaaa cattgcagga 3420

aaatatgacc acatttatgg gttttactca aactggtcaa ttaaatcagt tgtatagaga 3480

gtatgagata ggacatatgg ctcatccaat ccttcatgac aatcattttc tggtaataga 3540

aaagaagttt aatttcagaa ctttccgtac tttttattta ttttatatta aaatgttgaa 3600

tttatatatt gtttcctctt cccttttttt tttttttttt ttcatattta ggatcatcaa 3660

tatcaatatt ggaatgaaga ctacaatata tacatgccta gctttagttc tggaggaagt 3720

ggtggccaac gaaactgatc attggaagca aaagaattgc aattgcagaa gttgttgaca 3780

cttttgaact taaaaattcc tttttttttt gttaatgtag acattttgct gttagtgttg 3840

taattgaaac gaccatattg cacttgagat tgaatggttg tagtttgaga ttggattaag 3900

gttgctacaa cctctgattg aattagggtg ccaccctttt agtttgagat tggacctgtt 3960

gtcttgttgc cagaaatcat ttttagaggt ttgttcatat ccgtcaatcc ctgttaaatc 4020

agcccattat gatcagaatt agtcaaaaag caagaaacct catttgaaat caaatacatt 4080

ctatatatca tagaagtgaa gcatacaacg gaaacaaatc cagtttgcaa caggtcccca 4140

aaagtgagtc gtttttggac caactggaca ttcaagaata cttggaatga tgccatatca 4200

cagctgctta gaatctctgt aaagtcagaa gaagaaaaag accattcact aatgacaaga 4260

tacataaggg caaaatctaa acatagccct cgtttgccat gaaaactttc atttgcacaa 4320

caagaattca actttcatgt gttggaattg taaacaacga atgcactaaa gcatcaaatg 4380

catgattaag ataatgattt taattgctta gatgaacatc agaaatcatt gaagcacttc 4440

ttcaaacgat atacccaatt gcagtcataa acatttaaac actaaaagga ccaagcgttg 4500

tcaaggagat acgttatggc atggtgcttg ctttggctac tggaaagctt tggaaaatgc 4560

atcattggaa tgagcagagg aaagtgaggg tgttccatga cttgcttgaa aaaggtgaaa 4620

ttagagttgt tgctagggaa tagatagttt ccatcatgat ttgatggacg gcttcatcag 4680

tctctccttt ccatggctct tgaacttgag atgagcttag tttgggtttg aaataataag 4740

tttatcgtac tattgtgccc tacagtatta tttcaactaa tcagtctctt cttcaaacgt 4800

tatacccaat tgcagtcacg gacatttaaa cactgcaaag aatgacccat gatttatcct 4860

aaccaaaaag aatctcatat cttcacgatg aaagaaaagc actgaaggag acacactgac 4920

catagaagaa tcaattatga cgaacaagtc ccagaaaaga aataagagat cagagatgac 4980

atggtttgag ccagagcaga gatgggtggg cttcgctatc gctggaaaca gagtcaacaa 5040

ttacaagtca ctccagacaa gtgagtcgaa ttggagagcg agcatgaatc cgaaggagta 5100

ggctgacgaa tcaaccgatt gatgatccga gttgtaggaa aaactctggt atgatttatc 5160

gttgttggcg gattagagag aagataagga tgaggaaggg gaagaggtag ggaagaacca 5220

attgaatata cgtgaaacaa aacttcctac accgcttagg tttctgtaaa gtgaagagat 5280

aataaaatta aaaaattaaa aattaaaagc tcatttaata tggtacaaat taaaaattaa 5340

aaaattatag ccaactcatc agccacatca gttggtacaa aaatatggta caactagatg 5400

gtctccctag cattaccctt aataaaaaaa aacaaacatg gcatggatag aaagcacgtc 5460

gtaaacaata taagaaaaaa ttcatttaca gcgtgcaaaa 5500

<210> 2

<211> 560

<212> DNA

<213> 序列

<400> 2

gccctccaac cctcaccagt ctctcaatct tcttcaacct cctcctctac ttctacttcc 60

ctgtgaatcc cttcctttcc cctttttcac tttttcatag tcggtttaac cacagagaaa 120

caactatata caaggccagc ttttcccttt ctttatccgt tttaccatgt ggtccctggg 180

tcctttatat aattattcat aaatatatgt agacctacac atggtgatgg tggtttcaac 240

tttcattttg ggcttttctt ttatgtcttt cgttttcagc cttaataact tgtatagagt 300

cctcctccct ccctcccctt ttctgtcctt tacttttctc tcttgcgtta tatcatgaga 360

tttagggtta gatcatcagc tagctagggt ttccttgtcc ttgtttcgat tcgatctatt 420

tcgctttaat ctctcttttt gcatgggcgt gatgatatca tgaggatgga gatggcaaag 480

acaaagagat ccacacaaaa gaaagacaaa aaccagtcat tgtttgcgga tggagcatca 540

tcaagattca caatttcttg 560

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggccagcttt tccctttctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atatcatcac gcccatgcaa 20

Claims (3)

1.一种与桃重瓣花紧密连锁的TE分子标记的应用，其特征在于，所述分子标记在选育具有桃重瓣花性状的种质资源中的应用，所述应用包括如下步骤：

1）提取待测桃树基因组的DNA；

2）以待测桃树的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增反应，所述引物对的核苷酸如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

3）对扩增产物进行Sanger测序，检测TE分子标记存在情况，所述TE分子标记位于桃基因组V2.0 的Pp02染色体的25,860,343 bp处，当基因型为TE/TE对应桃重瓣花，基因型为A/A或者A/TE对应桃单瓣花；

其中，所述TE分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2）中所述的PCR扩增的反应体系为：10ng/μl DNA模板1μl，10μlM引物各1μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，余量为双蒸水，补齐至25μl。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2）中所述的PCR扩增的反应条件：95℃预变性30 min；95℃变性15s；退火15s； 72℃延伸，15-30 s/kb，循环32-34次，72 ℃终延伸5min。