CN111218521A

CN111218521A - 稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记及其检测方法与应用

Info

Publication number: CN111218521A
Application number: CN202010032359.2A
Authority: CN
Inventors: 杨德卫; 唐定中; 李生平
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2020-06-02

Abstract

本发明公开稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记，稻瘟病抗性基因Pib功能特异性分子标记为Pib‑InDel；所述Pib‑InDel是通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从携带有稻瘟病抗性基因Pib的水稻品种的基因组DNA中扩增出来得到与稻瘟病抗性基因Pib呈特异性带型的分子标记；其中，SEQ ID NO.1：5’‑TATGAGACTGCCTGGGAGGAA‑3’；SEQ ID NO.2：5’‑TCCATTATAATATAGGATAGT‑3’；本发明获得的稻瘟病抗病基因Pib的功能特异性分子能够应用于鉴别水稻品种中稻瘟病抗性基因。

Description

稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记及其检测方法与应用

技术领域

本发明农业生物技术领域，具体涉及稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记及其检测方法与应用。

背景技术

水稻是世界主要粮食作物之一，全世界有超过50％以上的人口以水稻为主要粮食，预计到2030年，水稻年产量要在现有基础上，再增产40％才能满足全世界人们的消费需求。由稻瘟病菌引起的稻瘟病害是对水稻稳产危害最重要的病害，在不同的水稻种植和生产国家或者地区都有不同程度的发生。在中国，几乎每年都有不同水稻产区发生中等以上稻瘟病病害，在过去20年中，稻瘟病病害还有不断增长的趋势。稻瘟病可以引起水稻大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。从粮食安全和水稻遗传育种的角度来看，培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方法之一。但由于稻瘟病生理小种致病性变异快，单一抗性品种的抗性会逐渐丧失；而传统的抗病育种策略存在工作量大，周期长等特点。因此，迫切需要改变传统抗病育种的策略。

分子标记是以生物大分子的多态性为基础而发展起来的一种遗传标记，可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质被称为广义的分子标记，而DNA分子标记被称为狭义的分子标记，DNA分子标记已经应用于基因组作图、基因定位、遗传多样性评价、功能基因组学研究、转基因植物鉴定与分子标记辅助选择育种等方面。基因功能特异性分子标记是基于目标基因内部DNA序列多态性开发的标记，与生物表型性状高度相关，在生物表型性状的鉴定中更突显出其准确性和直接性，是辅助选择育种中理想的分子标记类型。基因特性分子标记是从目标功能基因序列中功能性SNP位点或InDels开发的功能分子标记，能准确跟踪、定位功能等位基因，在作物表型性状的鉴定中更具准确性，能高效率地筛选出育种所需的有利基因。

20世纪60年代，日本率先开展了水稻品种抗稻瘟病基因分析的研究工作，鉴定了最初8个抗性位点上的14个基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鉴别体系，近几十年来，随着水稻抗病分子遗传学的发展，国际水稻研究所和中国等产稻国也逐渐开展了水稻稻瘟病抗性遗传的系统性研究，很多抗性基因得以被精细定位或克隆，并且分子标记的发展及应用大大促进了抗性基因遗传背景的鉴定以及多抗病基因聚合育种的发展，在已克隆的抗性基因中，一些抗病基因位于同一位点，这些复等位基因之间、功能型序列与非功能型序列之间高度同源，因此，直接分析功能等位基因本身的序列并开发其功能特异性分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快育种步伐。

稻瘟病抗性基因Pib，对日本大多数稻瘟病菌小种有抗性，而且对于中国的菌株ZB13和ZC15°能够表现出较强的抗病反应，因此，为了能更准去有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pib应用到水稻抗性育种工作中，有必要开发真实反映目标基因、方便易用的Pib特异性分子标记。

发明内容

本发明提供稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记及其方法与应用，开发真实反映稻瘟病广谱抗性基因Pib、方便易用且具有较高准确性和稳定性的Pib特异性分子标记，使得稻瘟病广谱抗性基因Pib更好的应用到水稻抗性育种中。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记，稻瘟病抗性基因Pib功能特异性分子标记为Pib-InDel；所述Pib-InDel是通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2从携带有稻瘟病抗性基因Pib的水稻品种的基因组DNA中扩增出来得到与稻瘟病抗性基因Pib呈特异性带型的分子标记；其中，

SEQ ID NO.1：5’-TATGAGACTGCCTGGGAGGAA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-TCCATTATAATATAGGATAGT-3’。

进一步地，所述携带有稻瘟病抗性基因Pib的水稻品种为水稻抗病品种IR24。

进一步地，所述稻瘟病抗性基因Pib包括部分编码NBS-LRR类蛋白的基因片段SEQID NO.3：

TATGAGACTGCCTGGGAGGAAGAGGTACAGGAAGCAAGGCGCAAGGGAGGTGAACTGAAGAGGAAAATCCGAGAACAGCTTGCTCGGAATCCAAACCAACCCATCATTACCTGAGCTCCTTTGGAGTTACTTTGCCGTGCTCCATACTATCCTACAAGTGAGATCCTCTGCAGTACTGCATGCTCACTGACATGTGGACCCGAGGGGCTGTGGGGCCCACATGTCAGTGAGCAGTACTGTGCAGTACTGCAGAGGACCTGCATCCACTATCCTATATTATAATGGA。

本发明还提供稻瘟病抗病基因Pib的功能特异性分子的检测方法，具体包含以下步骤：

A1、从公共数据库中下载得到的Pib及其同源的基因组序列以及测序品种日本晴和9311相对应区域的基因组序列，针对Pib位点进行序列比对，筛查Pib特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的插入/缺失InDel位点；

A2、利用步骤(1)获得的InDel位点信息，在所述InDel位点处设计基因特异性引物；

A3、以携带有稻瘟病抗性基因Pib的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物即为稻瘟病抗性基因Pib基因特异性分子标记Pib-InDel。

本发明还提供稻瘟病抗病基因Pib的功能特异性分子在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用。

进一步地，稻瘟病抗病基因Pib的功能特异性分子在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，具体包含以下步骤：

B1、扩增：利用SEQ ID NO.1所示的引物F1和SEQ ID NO.2所示的引物R1对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；

B2、检测：利用琼脂糖电泳检测，若检测到PCR产物中分子量大小为286bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pib；若没有检测到分子量大小为286bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种不携带稻瘟病抗性基因Pib。

一种鉴别水稻品种稻瘟病抗性的试剂盒，核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记在实际应用中，低成本、高通量；目前InDel标记检测方式简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，在电泳平台进行分型即可，该分型平台快捷经济，可操作性强。电泳分型平台有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。本发明提供的分子标记只需PCR结合琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，成本低、通量高、加上特异性高，特别适用于生产实践中。

2、本发明是针对Pib基因内部序列所开发的Pib基因特异性InDel标记。本发明能利用电泳检测的方法成功地将Pib与定位在该位点上的其他非Pib基因区分开，检测效率高；本发明所提供的Pib特异性分子标记Pib-InDel是一个显性标记，该标记存在于Pib基因内部，对Pib的筛选能力理论值可达100％，其综合性能优于已报道的与Pib连锁的分子标记和功能标记。本发明适用于任何遗传背景下的Pib的种质资源筛选，转基因育种，基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，大大提高了育种效率。

附图说明

图1是利用本发明中SEQ ID NO.1所示的引物F1和SEQ ID NO.2所示的引物R1，以9个选择出的代表性品种的总DNA为模板进行的扩增情况；

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。

实施例1

稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记及其引物设计，具体包含以下步骤：

A1、Pib插入/缺失(insertion-deletion，InDel)位点的分析：

从公共数据库中下载得到Pib水稻供体品种的部分基因组序列(GenBank：AB013448.1)，然后在水稻数据库中针对Pib位点进行序列比对，根据功能区差异位点进行特异性标记的设计，测序水稻供体品种日本晴和9311均无完整对应区域的基因组序列，其中，比对结果中缺失和具有差异的碱基部分即为鉴定到的InDel位点；

其中，加方框为比对后检测到的具有差异的Pib基因单碱基部分，空格为比对后检测到的缺失的Pib基因单碱基部分；

A2、设计引物：

根据InDel标记的设计原理，在所述InDel差异位点处进行引物设计，引物对碱基序列如下所示：SEQ ID NO.1(F1)：5’-TATGAGACTGCCTGGGAGGAA-3’；

SEQ ID NO.2(R1)：5’-TCCATTATAATATAGGATAGT-3’；

A3、选择水稻代表品种：

本发明中选择9个代表性水稻品种，依次为：9311、宜香A、BL1、CO39、日本晴、丽江新团黑谷、苏秀863、宜优3009和中花11；

A4、PCR扩增，获得含有抗性基因Pib特异性InDel的片段：

利用上述引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以上述9个水稻品种的总DNA为模板，进行常规PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

其中，PCR扩增反应体系如下：

2x Reaction Mix:16μL；

引物SEQ ID NO.1(F1)(10μΜ)：1μL；

DNA模板(20-50ng/μL):2μL；

ddH₂O：补足至25μL；

PCR温度循环条件如下：94℃ 5分钟；94℃ 30秒；55℃ 30秒；72℃ 30秒；35个循环；72℃ 7分钟；10℃保存；

PCR反应结束后，取适量样品在3％的琼脂糖上进行电泳检测，电泳条件为110V，40分钟。

实施例2

稻瘟病抗病基因Pib的功能特异性分子标记在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，具体包含以下步骤：

参见附图1是利用本发明中SEQ ID NO.1所示的引物F1和SEQ ID NO.2所示的引物R1，以9个选择出的代表性品种的总DNA为模板进行的扩增情况；参见图1，泳道1为DNAladder，泳道2为Pib供体品种水稻品种IR24基因组为模板PCR得到的片段，与稻瘟病抗性基因Pib呈特异性带型，即泳道2为Pib基因特异性分子标记Pib-InDel，其片段大小为286bp；泳道3-11的DNA模板依次为9311、宜香A、BL1、CO39、日本晴、丽江新团黑谷、苏秀863、宜优3009、中花11；如图1所示，凡是携带有Pib的水稻品种，其PCR扩增产物的电泳检测条带以286bp呈现，而不含有该位点的功能基因以电泳检测不到286bp条带。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记，其特征在于：稻瘟病抗性基因Pib功能特异性分子标记为Pib-InDel；所述Pib-InDel是通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从携带有稻瘟病抗性基因Pib的水稻品种的基因组DNA中扩增出来得到与稻瘟病抗性基因Pib呈特异性带型的分子标记；其中，

SEQ ID NO.1：5’-TATGAGACTGCCTGGGAGGAA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-TCCATTATAATATAGGATAGT-3’。

2.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记，其特征在于：所述携带有稻瘟病抗性基因Pib的水稻品种为水稻抗病品种IR24。

3.如权利要求2所述的稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记，其特征在于：所述稻瘟病抗性基因Pib包括部分编码NBS-LRR类蛋白的基因片段SEQ ID NO.3：

4.权利要求1至3任一项所述的稻瘟病抗病基因Pib的功能特异性分子的检测方法，其特征在于，具体包含以下步骤：

5.权利要求1至3任一项所述的稻瘟病抗病基因Pib的功能特异性分子在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用。

6.如权利要求5所述的稻瘟病抗病基因Pib的功能特异性分子在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，其特征在于，具体包含以下步骤：

B2、检测：利用琼脂糖电泳检测，若检测到分子量大小为286bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pib；若没有检测到分子量大小为286bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种不携带稻瘟病抗性基因Pib。

7.一种鉴别水稻品种稻瘟病抗性的试剂盒，其特征在于：核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。