CN113699140B

CN113699140B - 褐藻胶裂解酶及其应用

Info

Publication number: CN113699140B
Application number: CN202111258766.6A
Authority: CN
Inventors: 孙建安; 朱雯琪; 毛相朝; 王俊凯
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: CN113699140A

Abstract

本发明公开了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码该褐藻胶裂解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶或海藻酸钠中的应用，在制备褐藻寡糖中的应用。本法发明还公开了一种制备褐藻寡糖的方法：采用褐藻胶裂解酶降解褐藻胶制备褐藻寡糖，最适反应pH为9.0，最适反应温度为60℃，反应时间2 h，所得褐藻寡糖的聚合度为2～4。本发明的褐藻胶裂解酶，可以在温和的条件下裂解褐藻胶或海藻酸钠，酶活性高，且具有较好的温度稳定性，相较于已报道的褐藻胶裂解酶，可在底物溶解性较好的高温下进行反应，可高效降解褐藻胶制备褐藻寡糖。

Description

褐藻胶裂解酶及其应用

技术领域

本发明涉及褐藻胶裂解酶及其应用，属于功能裂解酶发掘技术领域。

背景技术

我国褐藻资源丰富，具有很高的开发应用价值。以褐藻为原料可以提取大量的褐藻胶，褐藻胶具有较强的水合性、粘结性，在食品、医药、化工行业具有广泛应用。但由于褐藻胶为长链生物多糖，直接食用难以被动植物吸收利用，限制了其在功能性产品领域的应用。将褐藻胶水解为褐藻寡糖，可大大增加其水溶性和吸收利用性，且褐藻寡糖还具有降血糖、抗炎症、调节免疫力、促进动植物生长等功能，将褐藻胶水解为褐藻寡糖可进一步提升褐藻的应用价值和经济价值，大大拓宽海藻资源的应用范围。

将褐藻胶水解为褐藻寡糖主要有酸水解法、酶水解法和氧化降解法三种方法，其中酸水解法需使用大量强酸试剂，氧化降解法需要使用过氧化氢等强氧化试剂，这两种方法都存在着反应过程剧烈、产物易受损失、环境污染隐患等问题。酶水解法主要使用褐藻胶水解酶，利用褐藻胶水解酶的高效水解作用进行褐藻胶的生物水解，水解过程条件温和、产物生物安全性高，且水解产物具有一定的聚合度范围，是使用褐藻胶生产褐藻寡糖最具开发潜力的一种方法。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶，及其在褐藻寡糖制备中的应用，使用该褐藻胶裂解酶降解大分子量褐藻胶可制备聚合度较为单一的褐藻寡糖。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其来源于噬琼脂链卵菌（Catenovulum agarivorans）。

褐藻胶裂解酶的氨基酸序列（如SEQ ID NO:1所示）：

MYKSVLIGVS LAITSLTAAA GQQVGATLNH KQSLALADIP AGVIKQIAAV RPKFVAKEAEKEFKHGKVYI DVEGLDQYGN EIEFDMLQQD GTWKIVEIQR DLEMSQCPDS VVIALTKAHP DIQPKRIIESEQATGEIIYE FYTVDSAGQE AKYEVKLANG TAELLNQEWQ H。

编码上述褐藻胶裂解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

编码褐藻胶裂解酶的基因的核苷酸序列（如SEQ ID NO:2所示）：

5-ATGTACAAAA GCGTTCTGAT CGGTGTAAGC CTGGCGATTA CCTCTCTGAC TGCTGCTGCCGGTCAGCAGG TGGGTGCGAC CCTGAACCAC AAACAGAGCC TGGCGCTGGC TGATATCCCG GCAGGTGTGATCAAGCAGAT TGCAGCAGTT CGCCCGAAAT TCGTGGCTAA AGAAGCCGAA AAAGAGTTCA AACACGGCAAAGTTTACATT GATGTGGAAG GCCTGGATCA GTACGGCAAC GAAATCGAAT TCGATATGCT GCAGCAGGATGGCACCTGGA AAATCGTAGA GATCCAGCGT GATCTGGAAA TGTCTCAATG TCCGGATAGC GTTGTCATTGCGCTGACCAA AGCCCACCCG GACATTCAGC CGAAGCGTAT CATCGAAAGC GAACAGGCGA CTGGTGAAATCATCTATGAA TTCTATACCG TGGACTCCGC TGGCCAGGAG GCCAAATACG AAGTAAAACT GGCAAATGGTACCGCGGAGC TGCTGAACCA GGAATGGCAG CAC-3。

所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶或海藻酸钠中的应用；在制备褐藻寡糖中的应用。

一种制备褐藻寡糖的方法：采用上述褐藻胶裂解酶降解褐藻胶或海藻酸钠制备褐藻寡糖，酶解条件为：pH 6.0～10.0，温度30～80℃；所得褐藻寡糖的聚合度为2～4。

优选的，最适反应pH为9.0，最适反应温度为60℃，反应时间2 h。

一种含有褐藻胶裂解酶的酶制剂，其含有上述褐藻胶裂解酶。

所述含有褐藻胶裂解酶的酶制剂在降解褐藻胶或海藻酸钠中的应用；在制备褐藻寡糖中的应用。

本发明的褐藻胶裂解酶,在pH 6.0-10.0之间时，酶活可保持最高酶活的60%以上，且在pH 7.0-10.0之间具有良好的pH稳定性，在100 h内可保持70%以上酶活。在30-80℃之间，酶活可保持在最高酶活的60%以上，且在50℃和60℃下具有较好的温度稳定性，在此温度范围内保温12 h，仍然能保留80%以上的酶活。Fe³⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺可促进该酶的酶活（在制备褐藻寡糖时，可向底物中加入适量的Fe³⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺，以金属盐的形式加入即可，比如氯化铁、硫酸锰、氯化钡，硝酸锌等），Mg²⁺、Cu²⁺、K⁺、Ni²⁺、SDS可抑制该酶的酶活，Ca²⁺对该酶的酶活几乎没有影响，Na₂EDTA可以使该酶失去酶活。

本发明的褐藻胶裂解酶，可以在温和的条件下裂解褐藻胶，酶活性高，且具有较好的温度稳定性，相较于已报道的褐藻胶裂解酶，可在底物溶解性较好的高温下进行反应，可高效降解褐藻胶制备褐藻寡糖。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：褐藻胶裂解酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，1为标准蛋白Marker；2为纯化后的褐藻胶裂解酶。

图2：褐藻胶裂解酶的最适反应温度与温度稳定性测定结果示意图，其中，图2A、最适反应pH；图2B、最适反应温度；图2C、pH稳定性；图2D、温度稳定性。

图3：金属离子对褐藻胶裂解酶酶活的影响示意图。

图4：褐藻胶裂解酶降解褐藻胶产物的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1褐藻胶裂解酶的来源及序列分析

为寻找褐藻胶裂解酶新酶基因，研究人员从噬琼脂链卵菌（Catenovulum agarivorans）编码蛋白中发掘到一段含有171个氨基酸的潜在褐藻胶裂解酶蛋白。据文献报道该菌分离自海洋生物九孔螺肠道，可高效降解海洋藻类多糖，研究人员猜测该菌中所含有的潜在褐藻胶裂解酶可能具有较高的褐藻胶水解活性。其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，将其命名为Alca-171。经Blast分析，与已报道的褐藻胶裂解酶相比，最高序列相似性仅为54%，表明其为一个新型褐藻胶裂解酶。

实施例2 含褐藻胶裂解酶基因的表达载体构建、表达与酶蛋白纯化

将Alca-171酶基因进行密码子优化，所得核苷酸序列入SEQ ID NO:2，人工合成该序列，使用无缝连接将其装载入pET-28a载体。将载体采用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。使用含有氨苄青霉素的LB培养基平板进行筛选，挑取生长出的阳性克隆子进行PCR验证并送测序验证，测序结果与原序列比对一致，表明该褐藻胶裂解酶基因序列已克隆至表达载体中，将此重组质粒命名为pET-Alca-171。

将重组质粒pET- Alca-171热激法转化至宿主大肠杆菌BL21感受态细胞中，转化细胞在含有氨苄青霉素抗性的平板上筛选并鉴定，鉴定成功的阳性转化子即为构建成功的异源表达宿主。

将该异源表达宿主在含氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养活化，菌液活化后按照1%（v/v）接种量接种至含氨苄青霉素抗性的ZYP-5052培养基中，于20℃、200 r/min培养48h，表达褐藻胶裂解酶Alca-171。

重组菌表达后，于8000 r/min、4℃条件下离心10 min，收集菌体沉淀。菌体沉淀使用 50 mM pH 8.0 Tris-HCl缓冲液超声破碎。破碎液于8000 r/min、4℃条件下离心10min，收集上清液为粗酶液。粗酶液使用镍柱亲和层析纯化，使用不同浓度梯度咪唑溶液平衡与洗脱柱子，收集80 mM咪唑溶液洗脱组分，将该组分使用截留分子量5 kDa超滤膜浓缩后，得褐藻胶裂解酶酶液，使用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，结果如图1所示，可以看出蛋白条带大小约为19 kDa，与预测分子量相近，表明该酶纯化成功。

实施例3 褐藻胶裂解酶的酶学性质研究

酶活测定方法：配制0.3%（w/v，单位g/ml）海藻酸钠溶液作为反应底物，取380 μL海藻酸钠底物溶液加20 μL酶液，反应温度为50℃、体系pH 9.0，反应时间20 min，反应结束后沸水浴10 min灭酶，使用DNS法测定体系中还原糖生成量，根据D-半乳糖标准曲线计算酶活性。

测定最适反应pH时，取等量的酶液，设定反应体系温度为50℃，分别选用pH 5.0-10.0的不同体系缓冲液调节体系pH，测定该褐藻胶裂解酶在不同pH下的酶活力；测定最适反应温度时，取等量的酶液在缓冲液pH 9.0条件下，分别将反应体系置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下反应，测定该褐藻胶裂解酶在不同温度下的酶活力；测定pH稳定性时，将酶分别存放在4℃条件下的pH 7.0-10.0缓冲液中，在不同间隔时间取样测定酶活力；测定温度稳定性时，将酶液置于pH 9.0缓冲液中，分别于50℃、60℃、70℃、80℃条件下存放，在不同间隔时间取样测定酶活力。测定金属离子及化学试剂对酶活性的影响时，分别在反应体系中加入终浓度为1 mM的各种金属离子及化学试剂，置于pH 9.0，60℃条件下反应，取样测定酶活力。

测定结果如图2和图3所示，由图2A可知，该酶的最适反应pH为9.0，在pH 6.0-10.0之间时，酶活可保持最高酶活的60%以上。由图2B可知，该酶的最适反应温度为60℃，在30-80℃之间，该酶的酶活均可保持在最高酶活的60%以上。由图2C可知，该酶在pH 7.0-10.0之间均具有良好的pH稳定性，在100 h内均可保持70%以上酶活。由图2D可知，该酶在50℃和60℃下具有较好的温度稳定性，在此温度范围内保温12 h，仍然能保留80%以上的酶活。由图3可知，所进行实验的各种金属离子和化学试剂中，Fe³⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺可促进该酶的酶活，Mg²⁺、Cu²⁺、K⁺、Ni²⁺、SDS可抑制该酶的酶活，Ca²⁺对该酶的酶活几乎没有影响，Na₂EDTA可以使该酶失去酶活。

褐藻胶裂解酶作用底物为海藻酸钠，海藻酸钠溶液呈黏稠状态且溶解性较低，随着温度的升高其溶液的黏度有所降低，溶解性有所升高，因此高温下反应更有利于海藻酸钠底物的降解。但根据文献报道，大部分已发掘的褐藻胶裂解酶的最适温度为40℃以下（Cheng et al., International Journal of Biological Macromolecules,2020,164:1304-1320）。最适温度为高温的褐藻胶裂解酶也有报道，如来源于Sphingomonas sp. A1的褐藻胶裂解酶A1-Ⅱ，其最适反应温度为70℃,水解产物为聚合度3-4的褐藻寡糖，但其在50℃条件下保温10 min后即失去50%活性（Yoon et al., Protein Expression andPurification, 2000, 19:84-91）；来源于Nitratiruptor sp. SB155–2的褐藻胶裂解酶NitAly，其最适反应温度也为70℃，水解产物为聚合度3-5的褐藻寡糖，其在67℃条件下保温30 min后失去50%活性；来源于Deﬂuviitalea phaphyphila的褐藻胶裂解酶DP0100，其最适反应温度为65℃，水解产物为聚合度2-3的褐藻寡糖，但其在65℃条件下保温45 min后失去50%活性。可见已报到的在高温下活性较高的褐藻胶裂解酶其在高温条件下的稳定性却较差，限制了其在高温条件下的使用。本发明的褐藻胶裂解酶Alca-171在60℃条件下保温12 h仍可保留80%以上酶活性，在70℃条件下保温4 h也可保留70%以上酶活性，表明其可在高温条件下保留较高的酶活性，可用于高温条件下的褐藻寡糖制备。

实施例4 利用褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖

利用实施例2中制备得到的褐藻胶裂解酶水解海藻酸钠制备褐藻寡糖。配制0.3%浓度的海藻酸钠溶液，在19 mL底物溶液中加入稀释后的1 mL Alca-171酶酶液（50 U/mL），于pH 9.0、60℃条件下反应2 h，反应结束后将反应液于10000 r/min离心10 min，取上清液冻干，冻干物即为褐藻寡糖。将褐藻寡糖利用质谱进行产物鉴定，分析结果如图4，可以看出产物为聚合度2-4的寡糖，其他聚合度褐藻寡糖非常少，产物纯度较高。本发明的褐藻胶裂解酶最适反应温度为60℃，且在该温度下具有较好的稳定性，在高温下反应有利于底物的充分溶解以及保持反应过程中的无菌性，反应过程不产生环境污染，为绿色法制备褐藻寡糖提供了一种性质良好的工具酶，具有生产褐藻寡糖的工业化应用潜力。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 褐藻胶裂解酶及其应用

<141> 2021-10-19

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 171

<212> PRT

<213> Catenovulum agarivorans

<400> 1

Met Tyr Lys Ser Val Leu Ile Gly Val Ser Leu Ala Ile Thr Ser Leu

1 5 10 15

Thr Ala Ala Ala Gly Gln Gln Val Gly Ala Thr Leu Asn His Lys Gln

20 25 30

Ser Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Ala Gly Val Ile Lys Gln Ile Ala

35 40 45

Ala Val Arg Pro Lys Phe Val Ala Lys Glu Ala Glu Lys Glu Phe Lys

50 55 60

His Gly Lys Val Tyr Ile Asp Val Glu Gly Leu Asp Gln Tyr Gly Asn

65 70 75 80

Glu Ile Glu Phe Asp Met Leu Gln Gln Asp Gly Thr Trp Lys Ile Val

85 90 95

Glu Ile Gln Arg Asp Leu Glu Met Ser Gln Cys Pro Asp Ser Val Val

100 105 110

Ile Ala Leu Thr Lys Ala His Pro Asp Ile Gln Pro Lys Arg Ile Ile

115 120 125

Glu Ser Glu Gln Ala Thr Gly Glu Ile Ile Tyr Glu Phe Tyr Thr Val

130 135 140

Asp Ser Ala Gly Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Val Lys Leu Ala Asn Gly

145 150 155 160

Thr Ala Glu Leu Leu Asn Gln Glu Trp Gln His

165 170

<210> 2

<211> 513

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgtacaaaa gcgttctgat cggtgtaagc ctggcgatta cctctctgac tgctgctgcc 60

ggtcagcagg tgggtgcgac cctgaaccac aaacagagcc tggcgctggc tgatatcccg 120

gcaggtgtga tcaagcagat tgcagcagtt cgcccgaaat tcgtggctaa agaagccgaa 180

aaagagttca aacacggcaa agtttacatt gatgtggaag gcctggatca gtacggcaac 240

gaaatcgaat tcgatatgct gcagcaggat ggcacctgga aaatcgtaga gatccagcgt 300

gatctggaaa tgtctcaatg tccggatagc gttgtcattg cgctgaccaa agcccacccg 360

gacattcagc cgaagcgtat catcgaaagc gaacaggcga ctggtgaaat catctatgaa 420

ttctataccg tggactccgc tggccaggag gccaaatacg aagtaaaact ggcaaatggt 480

accgcggagc tgctgaacca ggaatggcag cac 513

Claims

1.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：采用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶或海藻酸钠制备褐藻寡糖，酶解条件为：pH 6.0～10.0，温度60～80℃；所述褐藻寡糖的聚合度为2～4。

2.根据权利要求1所述的制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：酶解时向底物中加入Fe³⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺中的任意一种或两种以上。