CN109295043A

CN109295043A - 一种新型褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN109295043A
Application number: CN201811221666.4A
Authority: CN
Inventors: 陈朋; 闫军军; 朱玥明; 曾艳; 门燕; 孙媛霞
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109295043B

Abstract

本发明公开了一种来源于海洋细菌的褐藻胶裂解酶（Alg509）及其基因。同时还公开了重组表达和制备该褐藻胶裂解酶的方法，即将alg509基因克隆到大肠杆菌表达载体上，并将该载体转化大肠杆菌宿主菌，获得可异源表达该酶的重组工程菌株。本发明公开的褐藻胶裂解酶Alg509酶活高，比酶活可达48000U/mg以上，其最适反应pH为10，最适反应温度为55℃，且酶活对各种金属离子没有依赖性。该酶对海藻酸钠、多聚古洛糖醛酸（polyG）、多聚甘露糖醛酸（polyM）均有活性，能将海藻酸钠彻底降解，产生褐藻二糖、褐藻三糖、褐藻四糖等褐藻寡糖。该酶表现出较强嗜碱性，对高pH具有一定耐受力，具备一定工业应用的潜质，可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药等领域。

Description

一种新型褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶及其编码基因、其制备方法及应用。

背景技术

我国海藻资源丰富，近几年随着海洋药物的不断发展，海藻多糖的研究日益受到重视，而褐藻便是具有广泛应用价值的海藻之一，代表植物包括海带、鹿角菜和马尾菜等。它也是海洋中含量丰富的经济类海藻植物，它含有褐藻胶(algin)、褐藻糖胶(fucoidan)及海带淀粉(laminaran)等多种多糖。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。

褐藻胶是由α-L- 古罗糖醛酸(Guluronic acid,G)和β-D- 甘露糖醛酸(Mannuronic acid,M)两种糖单元通过糖苷键链接而成的线性多糖，分子内聚M 段、聚G 段和M/G 混合段交替排列。研究发现褐藻胶的降解产物褐藻寡糖具有有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性、提高蛋白质稳定性和促进肠道内双歧杆菌生长等，最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M 段寡糖药物“971”能抑制β 淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G 寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶

降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，与化学、物理降解法相比，褐藻胶的酶法降解具有条件温和、易控制，且底物选择性强等特征，因而具有推广应用的潜质。褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶家族成员，能够催化糖醛酸单元之间的1，4 糖苷键发生水解，在断裂后新形成的非还原端生成双键。按照其底物特异性的差异，褐藻胶裂解酶可以分为三类：专一性降解聚甘露糖醛酸的聚甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3)、专一性降解聚古罗糖醛酸的聚古罗糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11) 和能降解上述两种片段的双功能褐藻胶裂解酶。因其具有专一、高效及反应温和等优点，且能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。此外，褐藻胶裂解酶可以作为工具酶用于褐藻胶精细结构的分析，海藻单细胞及原生质体的制备，治疗囊性纤维化(CF)患者的肺部感染及生产生物燃料等。

在自然界中能够产生褐藻胶裂解酶的生物分布广泛，已报到产褐藻胶裂解酶的物种有海洋软体动物、棘皮动物、细菌、真菌等,其中对细菌产褐藻胶裂解酶的研究最多。目前获得褐藻胶裂解酶大多数是专一性降解聚甘露糖醛酸的褐藻胶裂解酶，少数是具有降解古洛糖醛酸活性的褐藻胶裂解酶，而具有广泛底物特异性的褐藻胶裂解酶则非常稀少，只有来源于Pseudoalteromonas sp.的褐藻胶裂解酶Aly-SJ02(李建伟,Marine Drugs,2011,21:1374-80)，来源于白蚁肠道的Isoptericolahalotolerans的褐藻胶裂解酶AlyIH(窦文芳等,Carbohydrate Polymers,2013,98:1476-82)等具有广泛底物特异性，但酶活力较低，而且稳定性差，其中AlyIH只是获得了纯化的酶，尚未获得其编码基因，不能进行重组表达和分子改造；而且大多数褐藻胶裂解酶活性较低。因此，筛选酶活力高、稳定性强的褐藻胶裂解酶，构建产酶量高的工程菌株具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用，所述褐藻胶裂解酶活性高，耐碱性强，具有广泛底物特异性，能降解海藻酸钠、polyM、polyG。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种褐藻裂解酶，所述褐藻裂解酶包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明中，所述褐藻裂解酶活性高，比酶活达48000U/mg以上，（比酶活定义：每分钟催化底物产生1 µg还原糖所需的酶量）。该酶具有广泛的底物特异性，对海藻酸钠、多聚古洛糖醛酸（polyG）、多聚甘露糖醛酸（polyM）均有活性，能将海藻酸钠彻底降解，产生褐藻二糖、褐藻三糖、褐藻四糖等褐藻寡糖。且该酶耐碱性强，最适pH为10。

优选地，所述褐藻胶裂解酶包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供一种重组载体，所述重组达载体含有至少一个拷贝的如第一方面所述的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有如第二方面所述的表达载体。

优选的，第二方面所述质粒为pet-21a。

优选的，第三方面所述宿主菌为大肠杆菌BL21。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的褐藻裂解酶的纯化方法，包括如下步骤：

（1）制备浓缩粗酶液

优选的，制备步骤（1）所述的浓缩粗酶液包括以下步骤：将褐藻胶裂解酶Alg509表达菌株Escherichia coli BL21进行活化后接到发酵培养基中，收集菌体，用缓冲液重悬，破碎离心取上清，即得所述浓缩粗酶液；

具体地，（a）取-80℃保存的Alg509表达菌株Escherichia coli BL21，在固体平板培养基上划线，37℃培养箱静置培养；

（b）挑取单菌落，接种至含5 mL发酵培养基的30 mL试管中，37℃震荡培养12 h左右；

（c）以0.5%的接种量接种至含100mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，37℃、200 r/min条件下培养3-4 h；

（d）待菌液OD600长至0.6-0.8时，加入IPTG（终浓度0.5mmol/L）于16℃诱导20-24h左右；

（e）收集步骤（d）培养的菌体，4℃、6000 r/min离心30 min，收集菌体，用2mL pH为9的缓冲液（20mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）重悬菌体，用超声波细胞粉碎机破碎菌体，4℃下15000rpm离心30min,上清即为浓缩粗酶液。

优选的，如第四方面所述浓缩粗酶液纯化方法具体包括如下步骤：

（a）向填充柱中添加10cm深的Ni-NTA填料，加入10倍柱体积的Binding buffer平衡镍柱；

（b）取处理好的粗酶液加入平衡镍柱，反复上样2-3次，取少量穿透液做样进行SDS-PAGE检测；

（c）上样完成后分批加入10倍柱体积的Binding buffer充分洗脱未结合的杂蛋白，向镍柱中缓缓加入适量Elution buffer 洗脱目的蛋白；

（d）超滤浓缩；用超滤管将洗脱液脱盐浓缩，在4℃高速冷冻离心机中4500rpm离心，可重复添加缓冲液，目的在于洗净多余的盐离子；

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的褐藻裂解酶在制备褐藻寡糖的应用。

优选的，如第五方面所述褐藻胶裂解酶Alg509在分解褐藻胶、褐藻胶寡糖或制备不饱和寡糖及海藻肥、及生物能源中的应用。

与现有技术相比，本发明有如下有益效果：

本发明褐藻胶裂解酶来自于海洋杆菌，属于多糖裂解酶家族14，该酶活性高，比酶活可达48000U/mg以上，以海藻酸钠为底物时，在55℃、pH 10的条件下具有最高酶活性，表现出较强嗜碱性。该酶对金属离子没有依赖性，且具有广泛的底物特异性，对于海藻酸钠、polyM和polyG均具有较高活性,属于双功能褐藻胶裂解酶，该酶较稳定，尤其对碱性pH环境具有较强耐受性，可广泛用于化工、农业、食品和饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。

附图说明

图1显示本发明纯化后褐藻裂解酶的蛋白电泳图谱(SDS-PAGE)；

图2显示本发明褐藻胶裂解酶在不同温度下的相对酶活力；

图3显示本发明褐藻胶裂解酶在不同pH下的相对酶活力；

图4显示本发明褐藻胶裂解酶在不同NaCl浓度下的相对酶活力；

图5显示本发明褐藻胶裂解酶在不同金属离子下的相对酶活力；

图6显示本发明褐藻胶裂解酶在不同温度下保存后的剩余相对酶活力；

图7显示本发明褐藻胶裂解酶在不同pH下保存后的相对酶活力；

图8显示本发明褐藻胶裂解酶对不同底物的特异性；

图9显示本发明褐藻胶裂解酶酶解产物的液相色谱图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内，发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性( 例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。

实施例1 褐藻胶裂解酶的基因挖掘

用RAST软件分析的结果显示，海洋杆菌菌株基因组DNA上携带褐藻胶裂解酶的编码基因alg509,用生物学软件DNAMAN进行分析，显示该基因编码蛋白质的理论分子量约为61kD。用信号肽在线预测软件SignalP4.1Server预测分析，结果显示的氨基酸序列中含有分泌型信号肽。

实施例2 褐藻胶裂解酶Alg509异源表达工程菌株的构建

使用细菌基因组提取试剂盒提取海洋杆菌基因组，设计引物扩增得到褐藻胶裂解酶alg509基因。PCR条件为：95℃预变性3min，随后以95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 2min进行32个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示在1.70kb左右一条特异性条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，采用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。

上游引物：5'-AAGAAGGAGATATACATATGAAAATCAACAGG

TTACTTCCTTTC-3'

下游引物：5'-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATCGTGGGTGTG

CTCAAGGG-3'

将纯化的DNA片段连接到克隆载体pet-21a上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在LB固体培养基(含有氨苄青霉素)中培养后，挑取单菌落使用扩增引物进行PCR验证。将出现特异性条带所对应的重组菌株大量培养，使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，进行测序分析。

实施例3 褐藻胶裂解酶的异源表达与纯化

褐藻胶裂解酶异源表达方法如下：

（a）将测序分析正确的质粒转表达菌株EscherichiacoliBL21中进行诱导表达，涂板37℃培养箱静置培养；

（b）挑取单菌落，接种至含5 mL发酵培养基的30 mL试管中，37℃震荡培养12h左右；

（c）以0.5%的接种量接种至含100mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，37℃、200 r/min条件下培养3-4h；

（d）待菌液OD600长至0.6-0.8时，加入IPTG（终浓度0.5mmol/L）于16℃诱导20-24h左右。

褐藻胶裂解酶纯化方法如下：

（c）上样完成后分批加入10倍柱体积的Binding buffer充分洗脱未结合的杂蛋白，向镍柱中缓缓加入适量Elution buffer 洗脱目的蛋白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测褐藻胶裂解酶Alg509的纯化情况，结果如图1 所示，纯化后的褐藻胶裂解酶Alg509 在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4 温度对褐藻胶裂解酶的影响

将纯化的褐藻裂解酶稀释适当的倍数，取0.1 mL稀释好的酶液加入1.9mL浓度为1%的底物中（pH9 20mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），分别置于25、30、35、40、45、50、55、60、65温度下反应20 min，测定酶活力，判断最适反应温度。以酶反应最适温度下所测得的酶活力为100%，其它温度下酶活力与最高酶活力的比值为该温度下的相对酶活力，作温度—相对酶活力曲线，结果如图2所示。结果显示，褐藻胶裂解酶Alg509的最适反应温度为55℃。

实施例5 pH对褐藻裂解酶的影响

用不同pH的缓冲液配制1%的褐藻胶底物（所选用缓冲液为：pH为4.0、5.0、6.0的20mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为6.0、7.0、8.0、9.0的20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为9.0、10.0、11.0的20 mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）。加入适当稀释的褐藻胶裂解酶的纯酶，40℃下反应20 min，测定酶活力，判断最适反应pH值。以酶反应最适pH值下所测得的酶活力为100%，其它pH值下酶活力与最高酶活力的比值为该pH值下的相对活性，作pH—相对酶活力曲线，结果如图3所示。结果显示，褐藻胶裂解酶Alg509的最适反应pH为10。

实施例6 NaCl浓度对褐藻裂解酶的影响

以不同浓度的NaCl配制1%的褐藻胶底物，使得NaCI终浓度为0、20、40、80、120、160、200、300、400、500 mmol/L。加入适当稀释的褐藻胶裂解酶的纯酶，40℃下反应20 min，检测酶活力，以酶反应最适NaCl浓度下所测得的酶活力为100%，其它NaCl浓度下酶活力与最高酶活力的比值为该NaCl浓度下的相对活性，作NaCl浓度-相对酶活力曲线，结果如图4所示。结果显示，NaCl浓度对褐藻胶裂解酶Alg509的活性没有影响，即该褐藻胶裂解酶对NaCl没有依赖性。

实施例7 不同金属离子及EDTA对褐藻胶裂解酶的影响

以纯水配制1%的海藻酸钠底物，在此基础上测定不同金属离子对褐藻裂解酶的影响。配制1 mol/L的各种金属离子母液，金属离子包括：Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni² ⁺、Mn²⁺、K⁺、Ba²⁺和EDTA。在Alg509纯酶液中加入各种金属离子，使金属离子终浓度为5mmol/L,向其中加入各种金属离子母液，使金属离子终浓度为5mmol/L，4℃放置12h,使金属离子与酶分子充分结合，在最适温度与最适pH值条件下，测定酶活。以未添加金属离子的反应液作为对照组，其酶活力设定为100%，测定结果如图5所示。结果显示，以上各种金属离子对褐藻胶裂解酶没有促进作用，而Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺和EDTA均会对褐藻裂解酶的酶活产生抑制作用。

实施例8 褐藻裂解酶的温度稳定性

将褐藻裂解酶Alg509纯酶分别放入25、30、35、40、45℃水浴保温2h，测定样品的剩余酶活力，以未经水浴保温处理的酶反应活力为对照，测定结果如图6所示。结果显示，褐藻裂解酶在35℃时酶活几乎维持不变，而在40℃时，2h后酶活降到原来的5%左右，基本失活。

实施例9 褐藻裂解酶的pH稳定性

将褐藻胶裂解酶Alg509与不同pH的缓冲液充分混匀，4℃放置24h，测定其剩余酶活力，以不进行pH放置处理的酶活为对照，测定结果如图7所示。结果显示，褐藻裂解酶Alg509在pH 4的缓冲液中放置24h基本失活，pH为9时酶活最高。

实施例10 褐藻裂解酶的底物特异性

分别配制1%的果胶、卡拉胶、透明质酸、琼脂、淀粉、羧甲基纤维素钠、菊粉、壳聚糖、琼脂糖、木聚糖、海藻酸钠、polyM、polyG的底物，探究Alg509的底物特异性，结果如图8所示。结果显示，褐藻胶裂解酶Alg509的最适底物为海藻酸钠，对polyG、polyM也有一定活性，而对果胶、卡拉胶、透明质酸、琼脂、淀粉、羧甲基纤维素钠、菊粉、壳聚糖、琼脂糖、木聚糖等均无活性。

实施例10 褐藻裂解酶的酶解产物分析

用20mM pH 9的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，配制1%的褐藻胶底物，在2mL的褐藻胶底物中加入过量的纯酶40℃反应12h，得到酶解产物。

采用高效液相色谱法对酶解产物进行分析。将酶解产物用0.22 μm膜过滤后，采用高效液相色谱系统（HPLC），利用凝胶过滤色谱柱Superdex peptide10/300GL在235nm条件下进行检测，流动相流速为0.4 mL/min，上样后，用ddH₂O 冲洗30 min，以便除去酶解产物中的金属离子，之后用0.2 mol/L NH₄HCO₃线性洗脱120 min，结果如图9所示。结果显示，褐藻裂解酶Alg509可以彻底降解褐藻酸钠，得到以褐藻二糖、褐藻三糖、褐藻四糖为主的褐藻寡糖产物。

综上所述，本发明褐藻裂解酶活性高，最适反应温度为55℃，最适反应pH为10，对金属离子没有依赖性，且对polyM和polyG均具有活性，能充分降解褐藻酸钠，产物为具有生物学活性的小分子褐藻寡糖，具有良好的研究与应用潜力。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 天津工业生物技术研究所

<120> 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用

<141> 2018-10-19

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 576

<212> PRT

<213> Marinimicrobium

<400> 1

Met Lys Ile Asn Arg Leu Leu Pro Phe Ser Ile Ser Leu Leu Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Leu Ala Ser Leu Thr Asn Pro Gly Phe Glu Asn Gln Phe

20 25 30

Ser Gly Trp Ser Asp Thr Asp Pro Ser Ala Ile Ser Gly Asp Ala Ala

35 40 45

Ser Gly Ser Tyr Ser Ala Lys Ile Thr Gly Ser Ser Gly Arg Val Asp

50 55 60

Gln Gln Val Ala Leu Asp Thr Asn Thr Gln Tyr Arg Leu Thr Ala Glu

65 70 75 80

Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly Ile Asn Ile Gly Gly Thr Val His

85 90 95

Asp Glu Arg Val Asn Thr Ser Ser Trp Thr Thr Val Thr Val Glu Phe

100 105 110

Asp Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Glu Val Phe Ala Lys Tyr Asn Asp

115 120 125

Gly Thr Gly Arg Phe Asp Asp Phe Thr Leu Ser Val Ile Gly Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Glu Cys Val Asn Gly Glu Ala Ile Asp Ile Val Ser

145 150 155 160

Ala Ser Asp Asp Gly Thr Asn Asp Gly His Thr Pro Asp Leu Ala Ile

165 170 175

Asp Gly Asn Leu Ala Asp Ser Ser Arg Trp Ser Ser Leu Gly Asp Gly

180 185 190

Lys Ala Ile Thr Leu Asp Leu Gly Ser Val Ser Thr Ile Asp Thr Ile

195 200 205

Arg Thr Ala Trp Tyr Lys Ala Asp Glu Arg Thr Ala Tyr Phe Asp Val

210 215 220

Glu Val Ser Glu Asp Gly Ser Asn Trp Ser Ser Val Leu Thr Asn Thr

225 230 235 240

Gln Ser Gln Gly Thr Glu Gly Phe Ala Ser Asn Ser Phe Asn Glu Ala

245 250 255

Asp Ala Arg Tyr Val Arg Ile Val Gly His Gly Asn Ser Ser Asn Glu

260 265 270

Trp Asn Ser Leu Ile Glu Val Gln Val Gly Cys Gly Asp Phe Ala Asp

275 280 285

Asp Thr Ser Thr Pro Pro Pro Ala Ser Gly Ser Leu Asp Pro Asn Leu

290 295 300

Ala Pro Ser Gly Asn Phe Asp Leu Ser Arg Trp Tyr Leu Ser Val Pro

305 310 315 320

Thr Asp Thr Asp Asn Ser Gly Thr Ala Asp Ser Ile Lys Glu Asn Glu

325 330 335

Leu Asn Ser Gly Tyr Glu Asp Ser Glu Tyr Phe Tyr Thr Gly Ser Asp

340 345 350

Gly Gly Met Val Phe Lys Cys Pro Ile Asp Gly Phe Lys Thr Ser Thr

355 360 365

Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Leu Arg Ala Gly

370 375 380

Asp Thr Ser Ile Ala Thr Gln Gly Val Asn Lys Asn Asn Trp Val Phe

385 390 395 400

Gly Ser Ala Pro Ser Ser Asp Arg Asn Asp Ala Gly Gly Val Asp Gly

405 410 415

Asn Met Thr Ala Thr Leu Ala Val Asn His Val Thr Thr Thr Gly Ser

420 425 430

Asn Ser Gln Val Gly Arg Val Ile Ile Gly Gln Ile His Ala Asn Asp

435 440 445

Asp Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Gly Asn Ser Lys

450 455 460

Gly Ser Ile Tyr Phe Ala His Glu Pro Asn Gly Gly Ser Asp Ser Trp

465 470 475 480

Tyr Glu Leu Ile Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ala Ser Asp Pro Ser Asp

485 490 495

Gly Ile Ala Leu Asp Glu Val Phe Ser Tyr Glu Ile Asp Val Thr Tyr

500 505 510

Asp Thr Leu Thr Val Thr Ile Tyr Arg Asp Gly Lys Asn Pro Val Ser

515 520 525

Glu Ser Val Asn Met Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Tyr

530 535 540

Met Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn Asn Ser Gly Asn Ser

545 550 555 560

Asp Asp Tyr Val Gln Ala Thr Phe Tyr Ser Leu Glu His Thr His Asp

565 570 575

<210> 2

<211> 1731

<212> DNA

<213> Marinimicrobium

<400> 2

atgaaaatca acaggttact tcctttcagc atttcccttc tgttcagcgc ctcggcactg 60

gcaagcttga ccaacccggg ctttgaaaac cagttcagcg gctggagcga tacggaccca 120

tccgccatct caggcgatgc cgccagtggc agttactcgg ccaaaattac cggttcttca 180

ggacgagtgg atcaacaggt cgctttggac actaacaccc aataccggct gaccgccgag 240

gtactgggta gtggcgtgat tggcatcaac attggcggca ccgtgcacga cgaacgggta 300

aacacctcca gctggacaac ggtgaccgtg gagtttgact ccggctccgc gagcagcggc 360

gaggtgttcg caaagtacaa cgacggtacc ggccggttcg acgacttcac tctctcggtg 420

atcggctctt ctggaggctc cggagaatgt gtaaacggag aagccatcga tatcgtttcg 480

gccagcgatg acggaaccaa tgacggccac acgcccgatc ttgccataga cggcaatctg 540

gccgactcct cccggtggtc ctccttgggc gacggaaagg ctatcactct ggacctaggc 600

tctgtctcca ccatcgacac catccgaacc gcctggtaca aagccgatga acgcaccgcc 660

tatttcgacg ttgaagtatc ggaagatggc agcaactggt cttcggtcct aacgaatacc 720

caatcccagg gaaccgaagg gttcgcctca aattcattca acgaggctga tgctcgctat 780

gtccgtatcg tcggccatgg aaattcgagc aatgaatgga acagtctgat cgaagtgcag 840

gtgggttgcg gcgattttgc cgatgacacg agcacccctc ccccggcctc tggaagtctt 900

gaccccaacc ttgccccctc gggaaacttt gacttgagtc gatggtacct gagtgtgccc 960

actgacactg acaatagtgg tacggcggac agcatcaaag aaaacgagct aaactccggt 1020

tatgaggaca gtgagtactt ctatacgggc tctgatggag gcatggtatt caagtgtcct 1080

atcgatggtt ttaaaacctc taccaacacc agctatactc gcaccgaact gcgggagatg 1140

ttgcgcgccg gcgacaccag tatcgcgact cagggggtaa ataaaaataa ctgggtattt 1200

gggagtgcac cgtcctccga tcggaatgat gcgggtggcg tagacggcaa tatgacagcg 1260

actctcgcag tgaatcacgt cactacgacg ggaagcaata gccaggtggg acgcgtcatc 1320

atcggtcaaa ttcacgccaa cgatgatgaa ccactgcgcc tgtactatcg aaagcttccc 1380

gggaatagta aaggctcaat ctactttgct catgaaccca acggcggtag cgactcctgg 1440

tacgagctga tcggcagccg gtcgagcagc gcctcagacc ctagtgacgg gattgcactt 1500

gatgaagttt tcagctacga aatcgacgtt acttatgaca ctctgacggt cactatttac 1560

cgcgacggca aaaaccctgt ctcagagtcg gtgaatatga gcagcagcgg ctatagtagc 1620

ggtggccagt atatgtactt taaagcgggc gtatataacc agaacaactc tggtaacagc 1680

gacgactacg tccaagccac attctactcc cttgagcaca cccacgatta a 1731

Claims

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于,所述褐藻胶裂解酶包含如SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列，优选为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.包含上述褐藻胶裂解酶的基因工程菌,其特征在于，该菌株中导入了褐藻胶裂解酶基因，其编码的褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的核苷酸序列；

优选地，所述表达载体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母中的任意一种。

5.一种重组的宿主细胞，其特征在于，在宿主细胞中含有权利要求4所述的表达载体；

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母中的任意一种。

6.一种如权利要求1或2所述的褐藻胶裂解酶、如权利要求3所述的基因工程菌、如权利要求4所述的表达载体、如权利要求5所述的宿主细胞在生产褐藻胶裂解酶中的应用。

7.如权利要求6所述的褐藻胶裂解酶在制备褐藻寡糖、海藻肥、及生物能源中的应用。