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CN113564065A - 一株弗氏链霉菌g-1及其应用 - Google Patents

一株弗氏链霉菌g-1及其应用 Download PDF

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CN113564065A CN202011094753.5A CN202011094753A CN113564065A CN 113564065 A CN113564065 A CN 113564065A CN 202011094753 A CN202011094753 A CN 202011094753A CN 113564065 A CN113564065 A CN 113564065A
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Abstract

本发明涉及微生物领域,具体地说是一种多功能弗氏链霉菌及其作为固态菌剂的应用，弗氏链霉菌G‑1(Streptomyces fradiae)，保藏编号为CCTCC M 2020250。该菌株在防治土传病害的同时，可产生IAA、纤维素酶、蛋白酶等活性物质促进植物生长和土壤养分利用，可降解酚酸类植物自毒物质减轻土壤连作障碍。该菌剂的制备采用优选配方，辅以契合菌株生长的发酵流程获得高活性的多功能菌剂。将此菌剂与秸秆还田结合可促进秸秆腐熟，与市售有机肥或农家肥结合可做底肥。施用后通过营养竞争、代谢产物调控等途径调节土壤生态平衡，增强土壤肥力，减少土传病害的发生。该菌剂制备方法简单，原料易得，生产成本低廉，保质期长，防病和增产效果明显。

Description

一株弗氏链霉菌G-1及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体地说是一种多功能弗氏链霉菌及其作为固态菌剂的应用，进一步其防治保护地蔬菜土传病害、改良连作土壤微生态的应用。
背景技术
随着设施栽培面积的逐渐扩大，作物病害始终是影响保护地生产的重要因素，发生严重时造成品质下降，产量减低，因此对病害的有效控制非常重要。由于农民种植同一作物的习惯性，造成某一作物的连作，特别设施生产时大量、过量使用化学药剂和肥料，破坏了土壤的生态平衡，致使土传病害和连作障碍发生严重。近年来保护地辣椒根腐病发生严重，有些年份可造成作物减产30-50％，给农民造成巨大的经济损失，土传病害的综合防治以及土壤生态修复亟待解决。开发出具有生防特性的多功能微生物菌剂已经成为一种国际化的趋势。
国内外报道的应用于土传病害的生防微生物很多，包括真菌、细菌、病毒噬菌体和放线菌等，其中部分产品用于商品化生产，且在病虫害综合防治和农业可持续发展中发挥着越来越重要的作用。大量研究发现很多微生物及其代谢产物兼有生防和营养的双重功能，或将分别具有营养和生防的微生物菌剂复配后具有明显的防病和促长等作用,这即为具有生防特性的微生物菌剂的开发提供了思路和借鉴。研究表明放线菌是抗生素的主要产生菌，生防放线菌不仅能产生活性物质抑制病原菌的生长，还会产生某些激素促进植物的生长发育，其产生的抗生素及其它次生代谢物质在农作物病害生物防控方面具有重要作用。
目前开发高效且适宜推广应用的微生物制剂需要解决的技术难点主要有以下几点：
1.选育功能多元化，适应性强，生理性能优良的高效菌株是第一要务。由于保护地蔬菜土传病害由多种病原真菌复合侵染所致，筛选的生防菌株防治谱相对较宽，在寄主根际定植能力较强，剂型适宜，保证稳定的病害防控效果。接种益生微生物菌剂具有改善植物健康和生长的巨大潜力，但田间条件多变，有益微生物的定殖效果和功能效果对其应用潜力影响巨大。因此，深入了解接种菌株的生理特性，选育生物活性高、性能优良且适应性强的多功能菌株，并考虑有益微生物菌株与目标作物的匹配性，进而有针对性的使用微生物菌剂尤为重要。
2.充分考虑物料(载体)的特性及配料成本是微生物菌剂研发的重要考量。微生物的繁殖受有机质，料水比，PH值等条件的限制，目前主要利用草炭、腐植酸、磷尾矿作为物料主成分，能满足微生物生存的条件，但这些属于矿物质，受国家资源的限制，大量开采会破坏生态，而且施在土壤中很难被作物利用，总营养成分过多而有效率低，淋溶后还会造成水资源污染，同时价格也逐年上涨，产品的生产成本逐年提高。因此，在保证微生物繁殖需求，菌数和活性达到国家标准的前提下，选择易于取得，成本低廉，便于植物利用的生态友好型物料(载体)更符合产业化需求。
3.生产工艺简单易行、产品质量易于管控、保质期长是微生物菌剂产业化的重中之重。微生物菌株的发酵需除了适宜的培养料外，还需要符合菌株生理特性的发酵条件和发酵工艺流程，发酵工艺复杂难于操控无疑将增加菌剂的生产成本，因此简单的工艺、易于操作的流程、适宜的剂型对微生物菌剂的质量保证和产业化提供巨大的便利。
已经公开的相关专利，如CN106148229，名称为“一种弗氏链霉菌固体培养基、培养方法及农用微生物菌剂的制备方法”中，弗氏链霉菌固体培养基包括3-10份玉米粉、3-18份豆粕粉、18-45份秸秆粉、10-30份草炭土、20-50磷尾矿、1-10份碳酸钙和40-50份营养液，固态发酵后可得孢子数可达7.5×109个的微生物菌剂产品。该发明中弗氏链霉菌菌株功能不明确，且发酵配方及工艺相对复杂。又如CN102329754，名称为“一种弗氏链霉菌新菌株及其应用”中，将弗氏链霉菌种子液接入到由麦麸60份、红糖5份、棉籽饼30份、硫酸镁1.5份、氯化钠1.5份、碳酸钙2份组成的原菌菌剂发酵料中，原菌菌剂再接种到配方不同的载体中，载体成分是否适合菌株存活和长期保存不明，且工艺复杂，物料成本高，造成成品菌剂质量无法保证。另外，以上两个发明中发酵菌剂单就物料成本达1000-1500 元每吨，这无疑增加了生产成本，推高了菌剂的价格，间接增大农民生产负担，不利于微生物菌剂的大规模生产和广泛应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种多功能弗氏链霉菌及其作为固态菌剂的应用，进一步其防治保护地蔬菜土传病害、改良连作土壤微生态的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一株弗氏链霉菌G-1，弗氏链霉菌G-1(Streptomyces fradiae)已于 2020年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020250，保藏地址：中国武汉武汉大学。
所述菌株G-1接种至含高氏一号培养基中，置于28-32℃恒温培养保存。
一种弗氏链霉菌G-1的应用，所述菌株在抗土传病害病原菌用于蔬菜病害防控中的应用；在产植物生长激素促进植物生长和根系发育中的应用；在产纤维素酶和蛋白酶促进秸秆腐熟和活化土壤肥力中的应用；或，在利用酚酸类自毒物质减轻作物连作障碍中的应用。
进一步的说：
1)该菌株对辣椒根腐病病原菌(Fusarium solani)、辣椒菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotium)、黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢菌黄瓜专化型 (F.oxysporiumfsp.cucumarinum)、番茄早疫病病原菌(Alternaria solani) 和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolaini)等多种保护地土传病害病原菌具有广谱抗菌性，抑菌率为44.5％-64.5％。
2)该菌株在发酵过程中可产生植物生长素吲哚乙酸，其产量通常为 7.98-10.73mg/L，添加外源营养素条件下产量可高达82.59mg/L，从而对作物的根系发育和生长具有促进作用。
3)该菌株可以利用对羟基苯甲酸、肉桂酸、没食子酸、咖啡酸和香草酸作为唯一碳源生长，进而降解连作土壤中该类自毒化合物，从而间接对作物的生长具有促进作用。
4)该菌株发酵过程中可产生纤维素酶，所生产的固体发酵菌剂纤维素酶活可达205.35U，达到国家有机物料腐熟剂(农作物秸秆)酶活的标准。
5)该菌株发酵过程中可产生蛋白酶，所生产的固体发酵菌剂中性蛋白酶酶活为65.02U，已达到国家有机物料腐熟剂(畜禽粪便类)酶活的标准。
一种防治辣椒根腐病的菌剂，菌剂含所述的弗氏链霉菌G-1 (Streptomycesfradiae)。
所述菌剂为弗氏链霉菌G-1经固体发酵获得。
所述菌株经活化后于液体培养基中培养至菌种浓度可达 1.0×109-1.0×1011CFU/ml，作为种子液；将种子液接种于固体培养基中经两次发酵，即得菌剂。
一种菌剂的制备方法，将所述菌株经活化后于液体培养基中培养至菌种浓度达1.0×109-1.0×1011CFU/ml，作为种子液；将种子液接种于固体培养基中经两次发酵，即得菌剂；其中，固体培养基为物料和水，料水质量比：1:0.3-0.5；其中，物料以重量份计，各组分包括55.9-79.3份耕田土、 10-30份稻壳粉、5-8份稻壳、5-8份麸皮、生石灰0.3-0.5份、0.4-0.6 份硫酸铵。
进一步的说
1)活化菌株：将弗氏链霉菌划线转接到高氏一号平板中，置于培养箱 28-32℃恒温培养5-7天；
2)制备种子液：将步骤1)中制备的弗氏链霉菌的菌落接种于液体培养基中，在28-32℃，160-190r/min摇床振荡培养培养72-96h，菌种浓度可达1.0×109-1.0×1011CFU/ml，即为种子液；
3)固体发酵制备菌剂：将步骤2)中制备的种子液，将种子液接种于固体培养料中，其中种子液与固体培养料的体积质量比为5-10％，在31℃条件下培养5-7d，此时菌体布满发酵料，而后再置于20-28℃(室温下)进行二次发酵(产孢发酵)4-6d，阴干即得富含孢子且适于长时间保存的微生物菌剂。
本发明微生物菌剂的有效活菌数量达9.79×109CFU/g以上，最优固体培养基发酵所得菌剂的有效活菌数可达9.67×1010CFU/g以上。
一种菌剂的应用，所述微生物菌剂在防治辣椒根腐病中的应用。
进一步的说，田间试验应用中，在辣椒定殖前将菌剂施于辣椒苗下，剂量为1.0g每株，之后按常规操作定殖栽培管理并统计产量和根腐病发病率。
所述微生物菌剂在设施蔬菜秸秆还田中的应用。进一步的说，在设施蔬菜温室秸秆还田试验中，设施蔬菜播种前，挖沟铺入玉米秸秆，将菌剂均匀撒在铺好的秸秆中，每亩用量8kg，覆土后按常规栽培管理进行并统计产量。
本发明所具有的优点：
本发明从设施连作辣椒土壤(辣椒根腐病抑病型土壤)中筛选获得的一株具有抗病、促生功能微生物菌株，经形态学、生理生化、分子生物学鉴定为弗氏链霉菌菌株G-1(Streptomyces fradiae)，该菌株靶向拮抗土传病害病原菌的同时，具有很强的产酶能力、促生作用和降解自毒物质能力，是集众多功能于一身的存活力超强的优良菌株。利用该菌株通过固体发酵得防治保护地土传病害的弗氏链霉菌剂，其能解决现有技术中发酵弗氏链霉菌菌剂物料成本高，发酵工艺复杂，施用后利用效率低及物料附带的不可预知生态干扰等问题。该菌剂菌体是将微生物与秸秆还田结合可促进秸秆腐熟，与市售有机肥或农家肥结合可做底肥，施入植物根域土壤，通过代谢产物拮抗、促生、促进肥料利用，以及营养竞争，分解自毒物质等途径调节土壤生态平衡，充分发挥土壤的自我恢复和生物调节能力，使土壤逐渐恢复原有的生态平衡，增强土壤肥力、减少土传病害的发生。此外,该菌剂制备方法简单，制备原料廉价易得，且保质期长，防病和增产效果明显，用途多样(菌株功能多样)，用法灵活；具体为：
1)生防作用:本发明弗氏链霉菌菌株对多种保护地土传病害病原菌具有显著拮抗作用，田间试验表明能够有效降低辣椒根腐病的发生，发病率比CK降低10.60％，从而减少化学药剂的使用，降低环境污染。
2)促生作用：施用本发明微生物菌剂后对辣椒植株的营养生长和生殖生长等有明显的促进作用，田间证明，施用本发明微生物菌剂促进根系发育，提高辣椒产量，比农家肥增产950kg/亩，增产31.04％。
3)促进秸秆降解和活化肥力作用：本发明菌剂与秸秆还田结合可促进秸秆腐熟，较单独应用秸秆还田增产6.52％。
4)物料成本低廉且无污染、无残留：本发明微生物菌剂是由弗氏链霉菌、有机物料、耕田土经发酵制备而成，未添加任何矿物质材料，无过量矿物质残留淋溶造成水污染的风险。符合我国绿色生产的要求，并且保质期长(三年活菌数12.5×109CFU/g；五年活菌数3.6×108CFU/g)，制备工艺简单,成本低,具有很好的生态和社会效益,开发应用前景广阔。
本发明菌剂功能多样，采用变温的两次发酵过程契合菌体生长和产孢的生长规律，结合经D-最优混料设计优选的培养基配方，有效保障了菌剂的活菌数量和生物活性，且本菌株制剂性能优良，是一种防病促生效果明显，造价低，保质期长的生态友好型微生物菌剂，在发展绿色健康农业的今天具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例提供的菌株G-1在高氏一号培养基上的菌落形态图；其中，图1-1为划线菌落，图1-2为单菌落。
图2是本发明实施例提供的菌株G-1显微图；其中，图2-1为菌株G-1 孢子丝，图2-2为菌株G-1孢子。
图3是本发明实施例提供的菌株G-1 16S-rDNA电泳图。
图4是本发明实施例提供的菌株G-1的的16S-rDNA的系统发育进化树。其中，加深加粗为本发明菌株，具有下划线为其他专利菌株，其他为NCBI 中近源菌株。
图5是本发明实施例提供的菌株G-1发酵液的产IAA显色图。其中，图5-1中S2+noTrp为G-1发酵液产IAA显色图；CK:S2+no Trp为空白培养基显色图。图5-2中S2+Trp为添加色氨酸的G-1发酵液产IAA显色图；CK:S2+Trp为添加色氨酸的空白培养基显色图。(每个处理三个重复)
图6是本发明实施例提供的菌株G-1对几种利用自毒物质(有机酸) 培养生长情况图；其中，1：高氏1号培养基；2：高氏一号基础培养基；3：添加0.1g/L对羟基苯甲酸；4：添加0.5g/L对羟基苯甲酸；5：添加0.1g/L 没食子酸；6：添加0.5g/L没食子酸；7：添加0.1g/L肉桂酸；8：添加0.5g/L 肉桂酸；9：添加0.1g/L咖啡酸；10：添加0.5g/L咖啡酸；11：添加0.1g/L香草酸；12：添加0.5g/L香草酸。
图7是本发明实施例提供的菌株G-1的纤维素刚果红培养基上的水解效果图。
图8是本发明实施例提供的菌株G-1大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基上的蛋白水解效果图。
图9是本发明实施例提供的菌株G-1的D最优混料设计试验中以活菌数为响应值的四种培养基主成分的响应面图；其中，1,2为耕田土、稻壳粉、麸皮与活菌数的三元相图和响应面图；3,4为耕田土、麸皮、稻壳与活菌数的三元相图和响应面图。
图10是本发明实施例提供的菌株G-1经D最优混料设计模型模拟预测的六种培养基组分含量图。
图11为本发明实施例提供的施用农家肥(CK)与施用链霉菌G-1菌剂 (1.0g/株)的辣椒根系对比图；其中，施用农家肥(CK)与施用链霉菌G-1 菌剂(1.0g/株)的辣椒根系对比(开花结果初期)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明生防性弗氏链霉菌菌株G-1，及由该菌发酵生产的微生物菌剂，其具有防治保护地土传病害，改善土壤微生态平衡，有效的增加保护地蔬菜根系，促进作物生长，进而提高蔬菜产量的一种高效微生物菌剂。
实施例1：
菌株G-1的分离筛选及分类鉴定：
1、菌株的分离筛选：
选择辽宁省朝阳县设施连作辣椒地块，拔出辣椒植株采用抖根法采集根际土壤样品。分离时取1g土样放入99mL无菌生理盐水中，振荡30min，分别将10-3、10-4、10-5的土壤悬浮液100μL涂布于含有50μg/mL-1重铬酸钾的高氏一号固体平板，32℃培养5d，从中挑选放线菌单菌落进行划线纯化，将纯化得到的菌株接种于高氏一号斜面培养基中保存备用。
吸取100μL辣椒根腐病原菌(Fusarium solani)孢子悬浮液均匀涂布于高氏一号固体培养基，在平板上放置无菌滤纸片(d＝5mm)备用。将分离获得的放线菌菌株接种于液体高氏一号培养基，32℃、180r/min培养3d，吸取6μL培养液滴于滤纸片中央，以等量无菌培养基为对照，从中筛选出一株对辣椒根腐病具有明显防治效果的放线菌菌株，编号为G-1。
2、分类鉴定：
(1)形态特征鉴定
参照《链霉菌鉴定手册》，将G-1接种于高氏一号固体培养基上31℃培养3d，形成圆形或近似圆形的白色菌落，菌落致密、干燥、不透明、菌丝难以挑取，气生菌丝粉白色，基内菌丝浅黄色，无可溶性色素。菌落随培养时间延长逐渐增大，直径4-7mm表面粗糙，扁平，不规则，培养5d后孢子丝逐渐变为孢子覆盖于菌落表面，形成粉末状菌落，白色至肉粉色，接菌环易于挑取(图1-2)，划线培养形态参见图1-1。孢子丝柔曲，呈分枝丝状，直径约0.6μm(图2-1)，孢子卵圆形或椭圆形(图2-2)。
(2)生理生化鉴定
生理生化鉴定采用放线菌鉴定的常规方法进行(参照《链霉菌鉴定手册》)，对G-1菌株分别进行石蕊牛乳试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、纤维素分解试验、硝酸盐还原试验、产H2S试验、黑色素形成试验、碳源利用试验。
结果显示菌株G-1能使明胶液化，无色素；牛奶凝固并迅速胨化；使淀粉水解；分解纤维素；能还原硝酸盐；不产生H2S和黑色素；利用D-葡萄糖、 D-果糖、乳糖，不能利用L-阿拉伯糖、蔗糖、L-鼠李糖、棉子糖、肌醇和 D-甘露醇。
(3)分子鉴定
PCR扩增菌株G-1的16S rDNA，扩增引物的核苷酸序列如下：引物F：5’-AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3’，引物R：5’-TAC GGG TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。经上海生工生物技术公司进行测序，并于2015年7月上传至NCBI核酸数据库，菌株G-1的16S rDNA序列如下所示。
菌株G-1的16S rDNA
>S2621 61 1424bp
ATGCAGTCGAACGATGAACCCGCTTCGGTGGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGG ACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACCACTTCAGGCATCTGATGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAG CCCGCGGCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTG GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCG TGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAA CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCCTGTCAC GTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTG GTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCC GTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA GCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACACCCAGAGATGGGTGC CCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGA CGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGC GAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCA TTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAAC CCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGACGAAG
全长为1424bp，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3，根据菌株G-1的16S rDNA序列进行同源性比较，选取BLAST比对相似性较高的部分菌株，另外在NCBI核酸数据库中下载与相关两个专利弗氏链霉菌的核酸序列，并构建系统发育树如图4所示，结合形态学和生理生化测定，鉴定菌株G-1为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)，系统发育树如图4，其中字体加粗加重的为本发明菌株G-1,具有下划线的菌株为已授权专利的菌株，其他为NCBI 数据库中近源的菌株。
实施例2：
菌株G-1的生理特性：
(1)该菌株对多种蔬菜土传病害病原菌具有拮抗作用：
将生长良好的辣椒根腐病病原菌(Fusarium solani)、辣椒菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotium)、黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢菌黄瓜专化型(F.oxysporiumfsp.cucumarinum)、番茄早疫病病原菌(Alternaria solani)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)5种病原菌制备成1.0× 107cfu/mL的病菌孢子悬浮液，用无菌滤纸片(d＝5mm)分别在孢子悬浮液浸泡后成为病原菌菌片，同样制作浸泡G-1菌株的菌片后放在高氏一号平板上进行对峙培养，对照组为病原菌菌片单独培养，每个实验重复3次。31℃培养5d，测定处理组直径对照组直径，并计算抑菌率。
抑菌率＝(对照菌落直径-处理组直径)/(对照组直径-菌饼直径)× 100％
该菌株对上述5种保护地土传病害病原菌均具有良好的抗性，统计抑菌率为44.5％-64.7％(参见表1)。
表1弗氏链霉菌对常见保护地病原真菌的抑菌效果及抑菌率
Figure RE-GDA0002853973990000081
注：抑菌带宽，指拮抗菌的菌落边缘到病原菌的距离。抑菌带0-4mm表示为“+”；抑菌带4-6mm 表示为“++”；抑菌带6-10mm表示为“+++”；不抑制表示为“-”。
(2)该菌株具有产生植物生长素吲哚乙酸(IAA)的能力：
将G-1接种于高氏一号液体培养基中培养，分别于3d、7d、10d、14d 取发酵液50uL置于瓷反应板中，加入50uL Salkowski试剂反应5分钟后观察比色液颜色(图5)。另将发酵液置于50mL离心管中10000r/min离心 10min，取上清液按照Glickmannetal(1995)的方法测定吸光值。同时以分析纯IAA绘制吸光度－浓度标准曲线，计算发酵液中中IAA含量(参见表 2)。
表2弗氏链霉菌产IAA显色试验及IAA产量
Figure RE-GDA0002853973990000082
注：“-”不变色；“+”浅粉色；“++”粉色；“+++”深粉色
由图5和表2可见，G-1通过发酵可以产生植物生长素IAA,其产量通常为6.79-10.73mg/L，添加外源营养素条件下产量可高达80.69-82.59mg/L，在同等营养条件下其产量优于同类菌株，可达其产量的2-4倍。因此，G-1 是一株产IAA性能强的优异菌株，能够对作物的根系发育和生长具有促进作用。
(3)该菌株能够利用多种酚酸类植物自毒物质：
将G-1划线接种于表3各培养基中，其中，高氏一号基础培养基为高氏一号培养基中不加可溶性淀粉，其他各培养基为对羟基苯甲酸、肉桂酸、没食子酸、咖啡酸和香草酸替代可溶性淀粉。结果显示G-1可以分解利用上述5种土壤自毒化合物作为唯一碳源生长(参见图6和表3)。
表3弗氏链霉菌在添加自毒化合物的培养基上的生长情况
Figure RE-GDA0002853973990000083
Figure RE-GDA0002853973990000091
注：“+”生长较差；“++”生长一般；“+++”生长正常
以肉桂酸为例，其浓度在0.25mmol/L(0.037g/L)时便可显著抑制抑制胚根的伸长，本试验所测浓度(0.1g/L和0.5g/L)均高于连作自毒物质的作用浓度。说明在G-1菌株在高浓度的自毒物质条件下可以正常生长，并且分解利用这些酚酸类物质。因此，本菌株能够调控植物自毒物质的积累，从而将对减轻连作障碍起到重要作用。
(4)该菌株具有较强的产纤维素酶能力：
将G-1点接种于纤维素刚果红培养基平板上进行产纤维素酶的定性测定，结果显示G-1菌株在该培养基上可产生透明圈(参见图7和表4)，说明该菌株发酵过程中可产生纤维素酶。
表4弗氏链霉菌在刚果红纤维素培养基上的透明圈直径
Figure RE-GDA0002853973990000092
另外将G-1接种于高氏一号液体培养中，31℃培养72h，依据有机物料腐熟剂纤维素酶活测定标准测定发酵液纤维素酶酶活，同时以羧甲基纤维素为标准品绘制吸光度－浓度标准曲线，计算发酵液中纤维素酶活，G-1发酵液上清液纤维素酶酶活为139.90U。因此G-1是一株具有较强产纤维素酶能力的菌株，使用该菌能够促进土壤中纤维素、半纤维素的分解和利用。
(5)该菌株具有较强的产蛋白酶能力：
将G-1点接种于大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基平板上进行产蛋白酶的定性测定，结果显示G-1菌株在该培养基上可产生透明圈(参见图8和表5)，说明该菌株发酵过程中可产生蛋白酶。
表5弗氏链霉菌在TSA培养基上的透明圈直径
Figure RE-GDA0002853973990000093
另外将G-1接种于高氏一号液体培养中，31℃培养72h，依据有机物料腐熟剂纤维素酶活测定标准测定发酵液蛋白酶酶活，同时以干酪素为标准品绘制吸光度－浓度标准曲线，计算发酵液中蛋白酶活，G-1发酵液上清液蛋白酶酶活为41.28U。因此，G-1是一株具有较强产蛋白酶能力的菌株，应用该菌株能够促进土壤中氮素的转化和利用。
实施例3
弗氏链霉菌固体培养基的制备：
以重量份数计，称取10-30份稻壳粉、5-8份麸皮、5-8份稻壳、 55.9-79.3份耕田土、0.3-0.5份生石灰、0.4-0.6份硫酸铵，通过Design-expert10.0.3软件进行D-最优混料设计，以活菌数为响应值确定最优配方，培养基配方与活菌数结果详见表6(方差分析见表7)。其中，稻壳粉的粒径为20目，耕田土为日常大田土壤，过筛使其粒径为10目。
按表6记载的混料将各物料充分混合均匀，为了使生石灰和硫酸铵分布更均匀，将生石灰和硫酸铵放入水中制成悬浮液，将上述混合的物料与水，按料水质量比：1:0.3-0.5，充分搅拌后装入聚丙烯食用菌菌种袋中，每袋500g左右，并在121℃1.2kg/cm2压力灭菌40分钟，得到弗氏链霉菌固体培养基(参见图9和10)。
表6 D-Optimal混料设计各试验配方活菌数表
Figure RE-GDA0002853973990000101
表7 D-Optimal混料设计方差分析
Figure RE-GDA0002853973990000102
Figure RE-GDA0002853973990000111
弗氏链霉菌菌剂的发酵：
1)将上述获得菌种G-1斜面孢子转接至茄瓶斜面，31℃条件下培养5d，斜面加入适量无菌生理盐水，孢子在无菌生理盐水内均匀分散，制成孢子悬液；
2)液体发酵：将孢子悬液接种到液体发酵培养基中，所述液体发酵培养基的成分以重量计算，包括可溶性淀粉10g，玉米粉10g，酵母膏10g， K2HPO41.2g，MgSO40.8g，NaCl0.8g，自来水补足至1000ml，PH调节至7.2-7.6， 500ml三角瓶培养基装液量100ml。接种量为液体发酵培养基体积的1％，在温度31℃，振荡频率180r/min的条件下，装恒温振荡摇床培养72小时进行液体发酵，即闻到菌液有一股特殊抗生素味道时，得到液体发酵种子液；
3)固体发酵：将液体发酵种子液接种于上述各固体培养料中(参见表 6)，液体发酵种子液与固体培养料的体积质量比为5％。第一阶段在31℃下培养5d，在此过程中观察培养基质表面是否出现白色孢子丝，孢子丝长满后，将固体培养基从菌袋倒入曲盘，第二阶段在20-28℃培养5d进行产孢发酵，此过程产生大量孢子，物料表面颜色变粉白色。固体发酵结束后，得到固体弗氏链霉菌菌剂，并测定菌剂活菌数。
弗氏链霉菌活菌数的测定：菌剂的活菌数通过系列稀释涂板确定，分别取10-7、10-8、10-9梯度悬浮液使用高氏一号培养基测定活菌数；测定上述培养基配方活菌数在9.79×109-95.92×109CFU/g，杂菌率低于1％。
由表6、表7、图9、图10分析结果可见根据混料模型确定的最优混料配方为耕田土72.46、稻壳粉15.53、麸皮5、稻壳5.96、生石灰0.43、硫酸铵0.6(详见附图10)，按照该配方配置培养基模型模拟预测活菌数为 98.64×109CFU/g。
实施例4
弗氏链霉菌固体培养基的配置：按照上述实施例3记载的过程，以重量份数计，称取16份稻壳粉、5份麸皮、6份稻壳、72份耕田土、0.4份生石灰、0.6份硫酸铵，料水比为1：0.35，充分混匀后在121℃1.2kg/cm2压力灭菌40分钟，即为固体培养基，进行3次重复试验。
弗氏链霉菌菌剂的获得：将实施例3获得液体发酵种子液接种于上述的培养基中，于31℃下培养5d后，转移至20-28℃下培养5d，即得弗氏链霉菌菌剂。
弗氏链霉菌菌剂活菌数的测定：菌剂活菌数通过系列稀释涂板确定，使用高氏一号培养基，稀释梯度为分别取10-7、10-8、10-9；3次验证试验活菌数分别为96.72×109CFU/g、102.13×109CFU/g、99.87×109CFU/g，在误差均在允许范围内，且杂菌率均低于1％。表明配方稳定，重复性好，以后固体培养基配方均采用此配比。
弗氏链霉菌菌剂营养指标和酶活的测定：为了便于与其他肥料共同施用，测定方法采用有机物料腐熟剂标准NY 609-2002，菌剂中营养指标为：有机质含量22.65％，全氮含量0.87％，全磷含量0.35％，酶活性指标为：纤维素酶酶活205.35U，蛋白酶酶活65.02U。
弗氏链霉菌菌剂保质期：将上述3个重复试验获得菌剂混合后室温保存，该菌剂于2015年5月制备，之后每半年测定混合菌剂中活菌数，一年后菌数稍有下降，可达85.2×109CFU/g，三年后(2018年)菌数仍在 12.5×109CFU/g；五年(2020年)活菌数3.6×108CFU/g，仍可达到有机物料腐熟剂国家标准的活菌数之上。
实施例5
弗氏链霉菌固体培养基的配置：按照实施例4中记载培养基配方以重量份数计，称取16份稻壳粉、5份麸皮、6份稻壳、72份耕田土、0.4份生石灰、0.6份硫酸铵，料水质量比为1：0.35，混匀后即为固体培养基。
弗氏链霉菌粗菌剂的获得：将实施例3中所述发酵种子液接种于上述固体培养基中，接菌量为10％。于31℃下培养5d后，转移至20-28℃下培养5d，即得弗氏链霉菌粗菌剂。
弗氏链霉菌固体发酵粗菌剂活菌数的测定：上述制备的粗菌剂活菌数可达2.2*109CFU/g，杂菌率低于10％，已达到有机物料腐熟剂标准NY 609-2002。此方法适用于无高温高压灭菌条件的情况下就地取材进行粗菌剂的制备，大大降低了微生物菌剂的制备成本和运输费用，为菌剂的推广应用提供了巨大的便利。
实施例6
弗氏链霉菌固体培养基的配置：按照实施例四中记载以重量份数计，称取16份稻壳粉、5份麸皮、6份稻壳、72份耕田土、0.4份生石灰、0.6 份硫酸铵，料水质量比为1：0.5，充分混匀后在121℃1.2kg/cm2压力灭菌 40-60min分钟，即为固体培养基。
弗氏链霉菌菌剂的获得：按上述过程配置的固体培养基灭菌后转移至发酵隧道中，装料高度2m，其中发酵隧道(发酵隧道规格详见申请号为CN 201511030820.6)长宽高分别为20、4、4.5m。将实施例3所述液体发酵种子液接种于发酵隧道的固体培养基，接种量为5％，31℃条件下进行发酵， 10h后开始采用适度通风方式控制物料温度不高于37℃，在此条件下发酵 5d后，即白色孢子丝长满后降低发酵室温度至20-28℃进行产孢发酵，此过程可适度增大通风量，提高供氧促产孢的同时降低物料湿度，发酵4d，最终物料产生大量孢子，物料表面颜色变白色至肉粉色。再经阴干至彻底干燥后即得弗氏链霉菌固体发酵菌剂。
弗氏链霉菌固体发酵菌剂活菌数的测定：应用发酵隧道生产的弗氏链霉菌菌剂经检测菌剂中活菌数可达5.6×109CFU/g，杂菌率低于5％，已达到有机物料腐熟剂标准NY609-2002。此方法适用于大规模菌剂生产。
实施例7
弗氏链霉菌微生物菌剂在防治设施温室辣椒根腐病中的应用。
采用实施例4中制备的微生物菌剂，试验前测定活菌数为 93.55×109CFU/g，为了试验的准确规范，用耕田土调节微生物菌剂活菌数浓度至2.0×108CFU/g(农用微生物菌剂活菌数标准)，保护地辣椒定殖前根系底部施用农家肥200g，另设置菌剂施用量为0.5g/株，1.0g/株，1.5g/ 株三个处理，空白对照为仅施用农家肥200g，每个处理3畦，上述所有处理设置三次重复。管理期间按常规管理进行，统计一个生长季(5个月)的产量，和辣椒根腐病的发病率，数据采用邓肯氏差异显著性分析(参见表8)。
表8施用G-1菌剂对设施温室辣椒产量及根腐病发病率的影响
Figure RE-GDA0002853973990000131
注：同列数据后没有相同小写字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
由表8可见，设施温室辣椒田间试验应用中，在施用菌剂的处理根系较对照CK发达(详见图11)，且产量明显提高，辣椒产量平均可达 3680-4010kg/亩，比农家肥CK增产620-950kg/亩，增产20.26％-31.04％；辣椒根腐病发病率5.20％-9.60％，比农家肥CK发病率低6.20％-10.60％。
实施例8
弗氏链霉菌微生物菌剂在设施蔬菜温室秸秆还田的应用。
采用实施例4中制备的微生物菌剂，试验前测定活菌数为 86.62×109CFU/g，为了试验的准确规范，用秸秆粉调节微生物菌剂活菌数浓度至0.5×108CFU/g(有机物料腐熟剂活菌数标准)，在设施辣椒温室秸秆还田试验中，将菌剂均匀撒在铺好的秸秆中，每亩用量8kg，设置单独秸秆还田(不加菌剂)CK1和不使用秸秆还田的对照CK，每个处理10畦，相同试验设计在三个棚室进行重复。肥水管理按常规管理进行，试验周期内统计各处理辣椒产量，数据采用邓肯氏差异显著性分析(参见表9)。
表9设施蔬菜秸秆还田对辣椒产量的影响
Figure RE-GDA0002853973990000132
注：同列数据后没有相同小写字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
设施温室秸秆还田试验应用中，一个辣椒生长季结束后，能够显著促进秸秆降解，比空白对照CK综合增产32.51％以上，较单独应用秸秆还田对照CK1增产6.52％。
序列表
<110> 辽宁省微生物科学研究院
<120> 一株弗氏链霉菌G-1及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcagtcga acgatgaacc cgcttcggtg ggggattagt ggcgaacggg tgagtaacac 60
gtgggcaatc tgccctgcac tctgggacaa gccctggaaa cggggtctaa taccggatac 120
gaccacttca ggcatctgat ggtggtggaa agctccggcg gtgcaggatg agcccgcggc 180
ctatcagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga 240
gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300
ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct 360
tcgggttgta aacctctttc agcagggaag aagcgaaagt gacggtacct gcagaagaag 420
cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttgtccggaa 480
ttattgggcg taaagagctc gtaggcggcc tgtcacgtcg gatgtgaaag cccggggctt 540
aaccccgggt ctgcattcga tacgggcagg ctagagttcg gtaggggaga tcggaattcc 600
tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag gcggatctct 660
gggccgatac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 720
tagtccacgc cgtaaacgtt gggaactagg tgtgggcgac attccacgtc gtccgtgccg 780
cagctaacgc attaagttcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga 840
attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgtggctta attcgacgca acgcgaagaa 900
ccttaccaag gcttgacata caccggaaac acccagagat gggtgccccc ttgtggtcgg 960
tgtacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1020
aacgagcgca acccttgtcc cgtgttgcca gcaggccctt gtggtgctgg ggactcacgg 1080
gagaccgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta 1140
tgtcttgggc tgcacacgtg ctacaatggc cggtacaaag agctgcgata ccgcaaggtg 1200
gagcgaatct caaaaagccg gtctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa 1260
gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1320
tacacaccgc ccgtcacgtc acgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cccaacccct 1380
tgtgggaggg agctgtcgaa ggtgggactg gcgattggac gaag 1424

Claims (10)

1.一株弗氏链霉菌G-1，其特征在于：弗氏链霉菌G-1(Streptomyces fradiae)已于2020年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020250。
2.按权利要求1所述的弗氏链霉菌G-1，其特征在于：所述菌株G-1接种至高氏一号培养基中，置于28-32℃恒温培养保存。
3.一种权利要求1所述的弗氏链霉菌G-1的应用，其特征在于：所述菌株在抗土传病害病原菌用于蔬菜病害防控中的应用；在产植物生长激素促进植物生长和根系发育中的应用；在产纤维素酶和蛋白酶促进秸秆腐熟和活化土壤肥力中的应用；或，在利用酚酸类自毒物质减轻作物连作障碍中的应用。
4.一种防治辣椒根腐病的菌剂，其特征在于：菌剂含有权利要求1所述的弗氏链霉菌G-1(Streptomyces fradiae)。
5.按权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为弗氏链霉菌G-1经固体发酵获得。
6.按权利要求5所述的菌剂为，其特征在于：所述菌株经活化后于液体培养基中培养至菌种浓度可达1.0×109-1.0×1011CFU/ml，作为种子液；将种子液接种于固体培养基中经两次发酵，即得菌剂。
7.一种权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述菌株经活化后于液体培养基中培养至菌种浓度达1.0×109-1.0×1011CFU/ml，作为种子液；将种子液接种于固体培养基中经两次发酵，即得菌剂；其中，固体培养基为物料和水，料水质量比：1:0.3-0.5；其中，物料以重量份计，各组分包括55.9-79.3份耕田土、10-30份稻壳粉、5-8份稻壳、5-8份麸皮、生石灰0.3-0.5份、0.4-0.6份硫酸铵。
8.按权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
1)活化菌株：将弗氏链霉菌划线转接到高氏一号平板中，置于培养箱28-32℃恒温培养5-7天；
2)制备种子液：将步骤1)中制备的弗氏链霉菌的菌落接种于液体培养基中，在28-32℃，160-190r/min摇床振荡培养培养72-96h，菌种浓度可达1.0×109-1.0×1011CFU/ml，即为种子液；
3)固体发酵制备菌剂：将步骤2)中制备的种子液，将种子液接种于固体培养料中，其中种子液与固体培养料的体积质量比为5-10％，在31℃条件下培养5-7d，此时菌体布满发酵料，而后再置于20-28℃(室温下)进行产孢发酵4-6d，阴干即得富含孢子且适于长时间保存的微生物菌剂。
9.一种权利要求4所述的菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂在防治辣椒根腐病中的应用。
10.一种权利要求4所述的菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂在设施蔬菜秸秆还田中的应用。
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Assignee: Liaoning Hongyang Biological Co.,Ltd.

Assignor: LIAONING SCIENTIFIC ACADEMY OF MICROBIOLOGY

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Denomination of invention: A Streptomyces freundii G-1 strain and its application

Granted publication date: 20230307

License type: Common License

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