CN106591193A

CN106591193A - 一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌

Info

Publication number: CN106591193A
Application number: CN201611208244.4A
Authority: CN
Inventors: 王占武; 彭杰丽; 张翠绵; 胡栋; 贾楠; 黄晓东
Original assignee: INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF AGRICULTURAL RESOURCES AND ENVIRONMENT HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: CN106591193B

Abstract

本发明提供了一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZCM18，其保藏编号为CGMCC No.12959。该菌株具有较高的溶磷，固氮，产IAA、ACCD、嗜铁素以及细胞分裂素的能力，耐盐度达到5％，对镰刀菌、丝核菌病原菌有较强的拮抗作用，适于具有防病、促生、抗盐碱等多功能生物肥料的生产，且应用广泛，适于多种土壤(盐碱地、退化土壤和常规耕地)的生物改良和多种植物(蔬菜、粮食作物以及果树)生产上，其促进根系发育，防控根部病害，提高作物产量等效果十分显著，可减少化肥农药的使用，应用前景广阔。

Description

一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及土壤生物改良领域，具体地，涉及一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

由于全球气候变暖，不合理耕作(如连茬种植)，化肥使用不当等因素，土壤盐渍化、生物障碍等问题日趋严重，这不仅使得土壤质量和生态环境进一步恶化，并且已经成为阻碍作物健康生长及高产优质的主要因素，另外，还有大面积的沿海滩涂、内陆盐碱地等土地资源待改良利用。目前，解决问题的主要途径还是抗病育种和化学农药控制病害，轮作倒茬防控连作障碍，淡水压盐、增施有机肥、使用吸附剂改良盐碱地等。这些传统措施有一定成效，但大多投资大、效益低，且随着化学物质的持续投入，会进一步加剧土壤的次生盐渍化，这迫使人们考虑采用其它措施来改良利用盐渍土壤。随着生物技术的发展，选用具耐盐碱、耐干旱的生物肥料，通过改良土壤生态和提高植物的抗逆性，可实现土壤生物和非生物障碍的有效克服，是一条经济而有效的途径。

在自然界中，由于生态环境的选择压力，如盐碱、干旱等，生活着许多耐受或适应这些极端环境的植物以及与之共生的微生物，一般生物生长和存活的极限，但却生长着能适应这种极端环境的微生物，在土壤、植物根际或植物组织内存在大量的微生物，其中具有防病、促生或提高植物抗逆功能的菌株，在提高肥料利用率，减少化学农药的使用具有广阔应用前景，因此而成为研究与开发热点，但目前开发应用的菌株大多具有植物种类或地域的偏好或特异性，应用范围受到一定限制，从而提高了开发成本，给实际应用造成了诸多不便。因此，筛选获得具有广谱特性的微生物菌株成为研发方向。

在嗜盐微生物中，中度嗜盐菌是一个对盐浓度耐受范围最广的类群，在自然界分布广泛，具有独特的基因类型、特殊的生理机制、多样化的代谢产物和潜在的应用价值。因此大量获取其基因资源，得到更好、更多的转基因材料具有重要的研究意义。

芽孢菌具有存活期长和抗逆性强等特点，广泛分布在不同的土壤和植物根际中，有的也可以侵入植物组织内部。该属中的许多菌株以其固氮能力、对致病菌的抗性和对植物的促生作用而受到了研究者的广泛关注。我国幅员辽阔，环境多样，土质情况差异很大，使得我国的芽孢杆菌资源十分丰富，开发应用潜力巨大。

发明内容

本发明的目的在于提供一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌。

本发明从海兴县盐碱土壤中分离到一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌ZCM18。通过菌株形态学特征，生理生化特征和16S rRNA序列分析将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌，该菌株于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12959，分类名为为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

在自然条件下，ZCM18菌株可定殖于多种植物根际，能分泌吲哚乙酸、玉米素、多肽抗菌素、脯氨酸等促进植物生长、抑制病原真菌和提高植物抗逆、抗病性的物质。

菌株ZCM18的扩繁方法：

菌种的制备，采用LB培养基，配方为：Tryptone 10g L^-1，Yeast Extract 5g L^-1，NaCl 10g L^-1，pH7.0。

发酵培养基为：玉米淀粉10g L-1，酵母粉20g L^-1，蛋白胨13g L^-1，KH₂PO₄ 2.0g L^-1，K₂HPO₄ 2.7g L^-1。

所述解淀粉芽孢杆菌的培养条件为：培养基的最适pH值为7.0，最适培养温度为35℃，培养15h即可到对数后期。

本发明提供了含有解淀粉芽孢杆菌ZCM18的菌剂。

本发明提供了含有解淀粉芽孢杆菌ZCM18的生物肥料。

本发明提供了解淀粉芽孢杆菌ZCM18或其发酵产物或含有其的菌剂或含有其的生物肥料在植物促生中的应用。

本发明提供了解淀粉芽孢杆菌ZCM18或其发酵产物或含有其的菌剂或含有其的生物肥料在抵抗植物病原菌中的应用。

所述的植物病原菌为镰刀菌或丝核菌。

本发明提供了解淀粉芽孢杆菌ZCM18或其发酵产物或含有其的菌剂或含有其的生物肥料在提高植物抗逆性中的应用。

具体地，将所述的解淀粉芽孢杆菌的菌悬液或发酵液喷洒在有机肥颗粒上制备成最终活菌数为2×10⁷-2×10⁸cfu/g的生物肥，用于调控蔬菜、粮食作物和果树生长。

所述的抗逆为耐寒、耐旱或耐盐。耐盐度为≤5％。

所述的植物为蔬菜、粮食作物或果树。

本发明采用多级筛选方法获得了一株可广泛应用于多种植物和多种土壤条件的解淀粉芽孢杆菌ZCM18，该菌株耐盐度为5％，具有较高的溶磷，固氮，产IAA，ACCD，嗜铁素以及细胞分裂素的能力，该菌株还可以拮抗镰刀菌、丝核菌病原菌。大量应用试验表明，该菌株在多种植物(如蔬菜、果树、中药材和粮食作物)，多种土壤条件(如盐碱地、设施蔬菜退化土壤)上应用，均表现出显著促进根系发育、防控多种根部病害，提高植物耐旱、耐盐和耐寒性，能显著改善植物生长状态，提高产量和品质，降低化肥和农药用量，具有广阔应用前景。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1解淀粉芽孢杆菌ZCM18的分离和鉴定

1、菌株的分离

取海兴县盐碱地小麦根际土壤1g到10mL无菌生理盐水中，涡旋仪震荡1min后制得根际土壤菌悬液。将菌悬液梯度稀释，涂布于LB平板，30℃培养箱中培养48h以分离菌株。

2、菌株的形态学特征

在LB平板上形成圆形、扁平、湿润有粘性的菌落，LB液体培养基中混浊生长，培养后期会形成菌膜。经革兰氏染色，镜下可见两端钝圆、长短不一、革兰阳性杆菌，有大于菌体的次末端芽胞。

3、菌株生理生化特性

实验证实该菌株可以在含盐量为5％的LB平板上生长。经实验发现，该菌株具备溶磷，固氮，产IAA、ACCD、嗜铁素以及细胞分裂素的能力。随后进行了ACCD和IAA酶活测定，最终结果分别为7.23mM·mg^-1h^-1，69.04μg/mL。与之前获得的优良解淀粉芽孢杆菌WW814、ZCM12和ZCM23比较见下表1。

表1不同优势菌株产各种促进植物生长物质能力比较

菌株	IAA(μg/mL)	ACCD(mM·mg^-1h^-1)
			ZCM18	69.04	7.23
WW814	54.12	6.32
			ZCM12	35.67	2.54
ZCM23	20.98	3.76

4、菌株鉴定与保藏

通过16S rDNA序列分析、综合菌体形态、生理生化特性和16SrDNA基因序列，可知ZCM18菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该菌株ZCM18于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12959，分类名为为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

实施例2解淀粉芽孢杆菌ZCM18生物肥制备

解淀粉芽孢杆菌ZCM18的种子培养基为LB培养基，将甘油管保存的菌液接种到LB固体培养基上进行活化，35℃培养2d，将单菌落接种到LB液体培养基中，35℃，200r/min，培养15h到对数后期时，按百分之一的接种量再进行转接培养一次后获得的菌液即为种子液。以此种子液进行ZCM18的发酵。在35℃，200r/min，培养48h，菌数可达到1×10¹⁰cfu/mL。

解淀粉芽孢杆菌ZCM18的种子培养基为LB培养基，将甘油管保存的菌液接种到LB固体培养基上进行活化，35℃培养2d，将单菌落接种到LB液体培养基中，35℃，200r/min，培养15h到对数后期时，按百分之一的接种量再进行转接培养一次后获得的菌液即为种子液。最后进行ZCM18的发酵，最终获得的发酵液菌数为1×10¹⁰cfu/mL。将1×10¹⁰cfu/mL菌液喷洒在有机肥颗粒上，可制备成活菌含量大于2×10⁷cfu/g的生物肥。

实施例3解淀粉芽孢杆菌ZCM18抗镰刀菌、丝核菌试验

取菜田表层至20cm以上土壤，风干，粉碎，过筛，高压灭菌后作为基础栽培基质。以实施例2制得的ZCM18粉剂生物肥进行盆栽试验。以同样方法得解淀粉芽孢杆菌WW814菌株生物肥，该菌株是之前筛选出来已经开发成微生物肥，登记证号：微生物肥(2016)准字(1915)号。将病原镰刀菌(Fusarium.sp)、丝核菌(Rhizoctonia.sp)活化后接入高压灭菌的麸皮培养物上，25℃培养7-10天。将长满病原菌菌丝的麸皮培养物风干、捣碎。

不同处理栽培基质的制备。处理1：灭菌土：ZCM18生物肥：病原接种物＝8.5:1:0.5(体积比，下同)，使ZCM18在栽培基质中的活菌含量为2×10⁶cfu/g；处理2：灭菌土：ZCM18生物肥：病原接种物＝9.3：0.2：0.5，ZCM18在栽培基质中的活菌含量为4×10⁵cfu/g；处理3：灭菌土：WW814生物肥：病原接种物＝8.5:1:0.5，WW814在栽培基质中的活菌含量为4×10⁶cfu/g；处理4：灭菌土：WW814生物肥：病原接种物＝9.3:0.2:0.5，WW814在栽培基质中的活菌含量为4×10⁵cfu/g；处理5为对照组：按灭菌土：有机肥(生物肥载体)：病原接种物＝8.5:1:0.5的比例混合制备栽培基质。

试验植物为四叶期的黄瓜苗，挑选生长一致的栽培苗，进行移栽，然后浇透水一次。每处理30株。各处理置于25℃光照培养室培养。25天观察发病情况，对结果进行统计分析，结果见表2。可见ZCM18对由镰刀菌、丝核菌病害的相对防效十分显著，在4×10⁵cfu/g低菌量水平上，相对仿效仍达到了80％以上，显著优于WW814的防效。

表2 ZCM18生物肥防控镰刀菌和丝核菌病害效果

实施例4解淀粉芽孢杆菌ZCM18发酵产品在番茄上的应用

本试验使用的是实施例2制得的生物肥。田间试验的地点设在河北省农林科学院大棚。本试验设4个处理，4次重复，采用长方形，完全随机区组设计，小区面积10.0米×3.0米＝30.0平方米。

试验处理：

处理1：ZCM18生物肥+常规施肥减量20％

处理2：WW814生物肥+常规施肥减量20％

处理3：常规施肥

处理4：空白对照

其中供试肥料为按实施例2中生产的分别含ZCM18和WW8142×10⁷cfu/g的生物肥(其中氮磷钾含量5.2％)。常规施肥为施用化学复混肥(氮磷钾含量42％)每亩40kg，其它田间管理措施相同。

施用方法：处理1：ZCM18生物肥100千克/亩+底施复混肥(42％，NPK＝22:10:10)32千克/亩；

处理2：WW814生物肥100千克/亩+底施复混肥(42％，NPK＝22:10:10)32千克/亩；

处理3：底施复混肥(42％，NPK＝22:10:10)40千克/亩；

处理4：不施肥。

直接观察可见，处理1地块的番茄植株长势最佳，表现为根多茎粗，处理1、处理2和处理3均比处理4长势好，叶色深绿，茎粗。处理4叶片最小、茎最细、叶色浅绿，生长势最弱。

表3小区产量统计表(产量单位：千克)

试验地番茄在减施复混肥20％基础上，施用ZCM18生物有机肥比常规施肥分别亩增产477.62公斤，增产率为10.70％，增产效果极显著；比施用WW814生物有机肥亩增产为386.63公斤，增产率为8.49％，增产效果极显著；比空白对照亩增产为848.30公斤，增产率为20.73％，增产效果极显著。

实施例5解淀粉芽孢杆菌ZCM18提高番茄耐寒耐旱试验

按实施例2方法制得ZCM18和WW814生物肥料，以菜田土为栽培基质，进行番茄盆栽试验。处理设置如下：

处理1：栽培基质+ZCM18生物肥料，比例9:1(体积比，下同)

处理2：栽培基质+WW814生物肥料，比例9:1

处理3：栽培基质

处理：将长到三个复叶、均匀一致的番茄苗移栽于不同处理的花盆中，定量浇透水。每处理20盆。在日光温室培养一个月。

耐寒试验：每处理各取5盆放入0℃培养箱中，处理12小时。取相同部位叶片检测相对电导率。

相对电导率的测定方法：分别剪取不同处理番茄同叶位叶片，超纯水冲洗5遍，用洁净滤纸吸干叶片表面水分。用干净的剪刀将叶片剪成1cm左右均匀等重条块，分别放入刻度试管中，用超纯水冲洗3遍，然后用超纯水定容至20mL，室温放置1h，期间可摇匀几次，到时间后，摇匀，用DDS-11A型电导率仪测定其初始电导值C1。将试管至沸水浴中15min，取出自然冷却至室温，摇匀后测定其最终电导值C2。每个处理重复三次。

相对电导率(％)＝C1/C2×100

将冷处理番茄苗移至20℃室温下，恢复24小时，观察受冻害叶片恢复情况。检测结果见表4。

耐旱性能试验：(1)干旱胁迫法：每处理取5盆，进行缺水处理5天以上，待叶片打蔫，有植株顶尖含水率不足20％时，浇透水，24小时后观察叶片恢复情况，检测相对电导率。(2)测定叶片相对含水量法：取相同部位叶片检测叶片相对含水量，该数值越高说明叶片保水性能越好，越耐旱。检测方法：剪取叶片2份，迅速放入已知重量的铝盒中，称出鲜重Wf；其中一份连同铝盒一并放入烘箱中，先105℃杀青，然后80℃烘干至恒温，称取重量Wd；另一份放入蒸馏水中浸泡6-7小时，取出用滤纸吸干表面水分，称重Wt。

相对含水量％＝(Wf-Wd)/(Wt－Wd)×100

结果见表5。

表4不同处理耐寒情况比较

处理	相对电导率％	受冻害叶片恢复率％
			对照	60.4	32.5
WW814生物肥	35.4	83.5
			ZCM18生物肥	21.5	98.2

表5不同处理耐旱情况比较

处理	相对电导率％	相对保水率％	干旱叶片恢复率％
				对照	42.3	21.5	43.8
WW814生物肥	25.9	26.4	79.2
				ZCM18生物肥	16.8	35.7	85.3

可见，ZCM18处理显著提高了植株对寒、旱胁迫的耐受性，优于WW814处理。

实施例6解淀粉芽孢杆菌ZCM18发酵产品在0.3％NaCl基质盆栽小麦试验

将ZCM18和WW814按照实施例2的方法进行菌液发酵，最终获得的发酵液菌数为1×10¹⁰cfu/mL。盆栽实验采用的基质含0.3％NaCl。试验组将菌液接种到小麦种子周围，每颗小麦种子50μL。对照组接种无菌水到小麦种子周围，每颗小麦种子50μL。重复10次。光照室培养25d后统计小麦的株高，地上干重，根干重。最终试验组的株高，地上干重，根干重分别比对照组增加12.2％，19.1％，26.8％。

表6解淀粉芽孢杆菌ZCM18在0.3％NaCl基质盆栽小麦上的试验

处理	平均株高(cm)	平均地上干重(g)	平均根干重(g)
				对照	24.5	4.8	1.4
WW814	26.3	5.5	1.7
				ZCM18	27.5	5.7	1.8
WW814较对照提高％	7.3	14.6	14.3
				ZCM18较对照提高％	12.2	19.1	26.8

实施例7解淀粉芽孢杆菌ZCM18生物肥在盐碱地小麦田间试验

采用实施例2的方法，分别制得ZCM18和WW814生物肥，活菌含量1×10⁸cfu/g。田间试验地点设在河北省沧州市海兴县盐碱地，含盐量0.26％。施肥方式：旋耕1遍，撒施复混肥(39％)18kg/亩，再旋耕1遍，找平。采用常用的施肥一体播种机，对照组肥槽里放2kg/亩的复混肥(39％)，播种，处理组槽里放15kg/亩的生物肥(5％)，播种。最终统计小麦的根干重和产量。最终处理组的根干重和产量分别比对照组增加12.7％和16.9％。

表7解淀粉芽孢杆菌ZCM18生物肥在盐碱地小麦应用效果

处理	平均根干重(g)	平均产量(kg)
			对照	8.2	124.8
WW814	8.9	140.8
			ZCM18	9.5	147.3
WW814较对照提高％	8.5	12.8
			ZCM18较对照提高％	12.7	16.9

实施例8解淀粉芽孢杆菌ZCM18发酵产品在梨树上的应用试验

本试验选用的梨树来自于赵县谢庄乡小郝庄村张小英家果园。本果园内的树龄都在30年以上，行株距约为4m×5m，品种为黄冠，普遍患有黄叶病、小叶病，树势较弱。本试验使用的是按实施例2制得的ZCM18为2×10⁷cfu/g的生物肥。在土壤性状、长势较为一致的弱树区，选择处理和对照组。选择三行共9棵为实验组，施用生物肥料。在间隔10米以外，取另外三行病弱树9棵，作为对照组，施用未添加功能菌的载体。其它田间管理措施相同。于2015年4月初开花前施生物肥或载体一次，在2015年的10月中下旬落果后、落叶前再施一次，每棵树用量为4kg，采用沟施方法，即在树冠垂直投影处围绕树体挖圆形沟，沟深约20cm，将ZCM18生物肥或载体与根系周围的土壤完全混合均匀后，填埋。其他管理措施与常规一致。在4月初，每棵树施用含量45％(15-15-15)的氮磷钾三元素复合肥3kg；生长期浇水5次。

全年对试验区的果树进行观察比较，发现，处理组果树树势得到了恢复，叶片由黄转绿，有新生枝长出，挂果较多。特别是表层根系发生较大变化，主根上有新生根长出，毛细根数量多。而对照组，虽然也有一定变化，但与处理组差异较大。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZCM18，其保藏编号为CGMCCNo.12959。

2.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ZCM18的菌剂。

3.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ZCM18的生物肥料。

4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZCM18或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物肥料在植物促生中的应用。

5.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZCM18或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物肥料在防控植物病害中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，植物病害的病原菌为镰刀菌和丝核菌。

7.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZCM18或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物肥料在提高植物抗逆性中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抗逆为耐盐、耐寒和耐旱。

9.如权利要求4-8任一所述的应用，其特征在于，所述的植物为蔬菜、粮食作物或果树。