CN113481161A - 一种培养基及少突胶质祖细胞的诱导培养方法以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种培养基及少突胶质祖细胞的诱导培养方法以及应用。本发明提供的培养基组合包括以下诱导分化阶段的培养基:胚胎小体→神经上皮细胞→Pre‑OPCs→hOPCs。各阶段采用特定的诱导培养基进行贴壁培养。实验结果显示,本发明可显著提高hESC和hiPSC向hOPC分化的诱导率,明显提高了hOPC的纯度,相比代替传统的悬浮培养大大缩短了诱导时间。表明本发明诱导培养方法适用于人胚胎干细胞和人诱发多能干细胞向少突胶质祖细胞分化。实验表明,本发明诱导培养获得的OPC可以明显减少受伤脑区组织的损失,并且能够改善和增进损伤脑区组织的恢复,可用于细胞移植治疗脑卒中损伤等脑神经系统疾病。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域,尤其涉及一种培养基及少突胶质祖细胞的诱导培养方法以及应用。
背景技术
脑卒中是世界上人类死亡和残疾的首要原因。目前国内外缺稀有效的治疗方法,特别是在恢复期阶段。白质损伤是绝大多数脑卒中的重要病理变化,表现为少突胶质细胞(OL)损伤、神经脱髓鞘、及神经轴突丧失。在卒中恢复中,脑内不能提供足够的少突胶质细胞祖细胞(OPC)以产生OL并形成髓鞘。因此,提供外源性OPC产生新的OL和神经髓鞘以供神经轴突结构和功能恢复就可为治疗缺血性脑卒中的新希望。我们之前使用hiPSC诱导的OPC治疗啮齿类动物脱髓鞘病变取得显著疗效。在此基础上,在大鼠的缺血性脑卒中模型中进一步验证了hESC衍生的hOPC能够治疗啮齿类动物缺血性脑卒中的白质损伤和改善动物受损伤的运动和感觉功能。为人类的缺血性脑卒中恢复期治疗提供了新方法和新思路。
目前,体外诱导产生hOPC的方法主要采用立体悬浮培养,因为在培养产生hOPC的中间的关键阶段,需要产生OPC细胞小球,并将其在悬浮中培养长达30-35天。此过程的缺点在于,(1)繁琐,耗时长,置换细胞培养液困难,生存的细胞不稳定和难以质控;(2)接下来将细胞小球需用刀片切成小的细胞团块,过程更加繁琐复杂,且不易保证质控和无菌操作,以及难以变成大规模的生产;(3)立体悬浮培养阶段中,细胞的生长状态亦无法通过免疫标记或其他形式来跟踪测试的;(4)细胞小球状态无法直接冻存传代、扩大培养,促使每一次诱导培养必须从NE细胞状态开始,加长了实验时间增加了工作量;(5)最后,在hOPCs的培养过程中,用无菌刀片切割细胞球的过程中,容易产生塑料碎片混合在细胞内,这不利于后续移植实验或细胞纯化实验的进行,也特别不利于未来hOPC大规模产业化生产。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种培养基及少突胶质祖细胞的诱导培养方法以及应用。该方法诱导率高,诱导分化出的hOPC纯度高,诱导时间短,操作便捷。而且,诱导获得的hOPC对脑缺血及再灌注引起大脑神经功能损伤具有明显的改善和修复作用,可用于细胞移植治疗脑卒中损伤等脑神经系统疾病。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供一种培养基组合,包括:
stage1培养基:mTeSR1培养基;
stage2培养基A:包括NIM培养基、20ng/ml bFGF和2μg/ml肝素;
stage2培养基B:包括NIM培养基、10μg/ml层粘连蛋白、20ng/ml bFGF和2μg/ml肝素;
stage2培养基C:含0.1μM视黄酸的NIM培养基;
stage3培养基A:包括NIM培养基、含视黄酸RA的B27补充剂和1μM嘌呤胺;所述stage3培养基A中视黄酸的浓度为0.1μM;
stage3培养基B:包括NIM培养基、1μM嘌呤胺、10ng/ml bFGF和不含视黄酸的B27补充剂;和,
stage4培养基:包括DMEM/F12培养基、1×N1营养辅剂、不含RA的2×B27营养辅剂、1×NEAA、60ng/ml T3、100ng/ml生物素、1μM二丁酰cAMP、10ng/ml PDGF-AA、10ng/ml IGF-1、10ng/ml NT3和1μM嘌呤胺;
所述NIM培养基由DMEM/F12、非必须氨基酸和N2营养辅剂组成。
本发明提供一种诱导人多能干细胞和胚胎干细胞分化为少突胶质祖细胞的培养方法,以上述的培养基组合诱导人多能干细胞和胚胎干细胞分化为少突胶质祖细胞,包括:
stage1:将hESC或hiPSC细胞以mTesR培养基培养至融合度为90%,37℃下用Dispase消化5-7min,将细胞切割成约2mm×2mm大小的细胞块,重悬,于mTeSR1培养基中悬浮培养,每天换2/3的新鲜培养基,培养3-5天;获得胚胎小体;
stage2:以stage2培养基A培养胚胎小体4-5d;然后置于多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的六孔板中,以stage2培养基B贴壁培养3d;然后以stage2培养基C贴壁培养4d,获得神经上皮细胞;
stage3:以stage3培养基A贴壁培养神经上皮细胞,每隔一天换2/3的新鲜培养基,培养10天;以stage3培养基培养B继续贴壁培养培养11天,期间每隔一天换2/3的新鲜培养基,获得Pre-OPCs;
stage4:以stage4培养基培养继续贴壁培养11天,获得OPCs。
本发明使用hESC系或hiPSC系作为资源或种子细胞。后者仅由细胞核外和无转基因/无整合的制备的hiPSC产生,因此潜在的突变将不会在种子多能干细胞(PSC)中存在,包括hESC和hiPSC。
一些实施方案中,种子细胞hiPSC、hESC还可以是改造后的细胞,如通过基因组编辑的方式对产生hOPC的种子细胞的hiPSC进行体外基因工程设计和修饰,例如,使用Crispr/Cas9敲除免疫原性基因,从而避免移植后带来的免疫排斥反应,对某些患者群体来说,能够避免免疫排斥引起的免疫缺陷或疾病突变。
一些实施方案中,所述stage4步骤之后还包括对OPCs传代培养的步骤。
一些实施方案中,所述传代培养扩增的比例为1:4~6,所述传代培养的细胞接种密度为每孔2-3×106cell。
一些实施方案中,所述传代培养为:以Accutase(1×/0.5mM EDTA)消化OPCs细胞,37℃等待7min,收集细胞后,加入1倍体积的DPBS后,使用p1000的移液枪吹打细胞20次,用DPBS溶液洗一次后,在200g的离心速度下,离心5分钟,丢弃上清液;然后将细胞重悬于新鲜的stage4培养基中;将细胞铺板在PO/laminin包被的六孔板上贴壁培养。
本发明还提供了由以上所述诱导培养方法获得的hOPC。
一些实施方案中,本发明建立脑梗死再灌注模型,考察了hOPC对MCAO/R造模后脑梗塞及再灌注所导致的神经损伤的治疗和神经功能恢复的作用和效果,结果性显示,hOPC可以明显减少受伤脑区组织的损失,并且能够改善和增进损伤脑区组织的恢复,可用于细胞移植治疗脑卒中损伤等脑神经系统疾病。
因此,本发明还提供了所述hOPC在制备治疗和或预防神经系统疾病的药物中的应用。
进一步,所述神经系统疾病包括缺血性和出血性脑中风或脑卒中、脑外伤损伤,老年痴呆症,帕金森病,亨廷顿氏病,癫闲等脑白质损伤有关的中枢神经系统疾病。
更进一步,所述脑损伤为大脑神经组织损伤。
本发明还提供了所述hOPC在制备髓鞘再生和修复、白质损伤修复的药物中的应用。
一些实施方案中,本发明通过Garcia大鼠神经功能评分测试、粘除试验、转棒试验和前肢应用试验考察了hOPCs对大鼠脑缺血再灌注后神经功能的影响,结果显示,hOPC能够明显改善和恢复大鼠的感觉功能、运动协调能力、平衡和运动学习能力。因此,本发明还提供了hOPC在制备改善运动、感觉、运动协调、平衡和学习中至少一种能力的产品中的应用。
以上应用中,所述产品为药物,所述药物的剂型包括注射剂、胶囊剂、丸剂或粉剂。
根据特定情况下的脑中风大脑区域,将hOPC递送到患者大脑的中风区域。可以是一个注射部位,也可以是2-3个注射部位。hOPC可以在患者大脑中广泛分布,但是对于缺血性中风病例引起的广泛脑损伤,多个注射部位将可能更为理想。
在本发明以上应用中,hOPC可以解离成单个细胞,也可以是未解离的细胞,成为细胞簇或聚集体,以维持移植的效率。
本发明提供的培养基组合包括以下诱导分化阶段的培养基:胚胎小体→神经上皮细胞→Pre-OPCs→hOPCs。各阶段采用特定的诱导培养基进行贴壁培养。本发明提供的培养基组合及诱导培养方法至少具有如下有益效果之一:
(1)本发明提供的诱导培养方法为全平面培养法,是指全部hOPC的诱导生成过程均在平面或培养表面上进行。不但缩短了之前立体悬浮培养的时程,而且避免了用刀片将细胞小球切成小的细胞团块后,再将细胞粘帖的繁琐过程,并减少了生产过程中可能的生物污染和物理污染。由此,缩短了整个生产过程的时间。特别有利于进行中规模以及大规模的产业化生产。而不同于过去体外OPC诱导产生的方案,亦为立体悬浮培养的方案,其在培养产生OPC的特定阶段,细胞需要产生OPC小球并将其在悬浮中培养。此过程繁琐,仅仅该步骤就耗时长达50多天,而且生存的细胞不稳定和难以质控。将细胞小球切成小的细胞团块的过程更加繁琐复杂。且不易保证质控和无菌操作,以及难以变成大规模的生产。
(2)本发明诱导分化获得的hOPC是双能祖细胞,在体外和体内均可产生少突胶质细胞(OL)和星形胶质细胞(Astrocytes)。
(3)本发明提供的培养基组合以及诱导培养方法获得的hOPC能够在保持hOPC体内移植和存活能力的情况下,实现体外扩大增殖,以取得巨大和足够的产量,在大大缩短了hOPC诱导时间的前提下,实现了hOPC的规模化生产。
(4)本发明提供的诱导培养方法,尚可产生不同阶段的干细胞/前体细胞,例如神经上皮细胞(NECs),神经元祖细胞(NPC)和OPC。这些早期前体干细胞均可以被生产、分离和冷冻储存以用于后期的再解冻和扩增。确保在干细胞阶段无需从头开始生产hOPC,从而可以缩短未来的生产时间并节省开支,并确保质量更加一致。
附图说明
图1示未分化的hESC和hiPSC的免疫荧光染色验证表达SSEA4、OCT4和SOX2等多能干细胞特异标记物;
图2示体外hESCs定向分化为hOPC的实验步骤和策略;
图3示hOPC诱导生成过程中不同培养阶段的生长状态;
图4示qPCR试验验证hOPC的诱导生成;OCT4为未分化干细胞标志物,在hOPC中表达显著下降;OLIG2和NKX2.2为Pre-OPCs出现的特异标志物,在hOPCs中继续表达且显著升高;PDGFRa和SOX10为hOPCs的特异标志物,在hOPC中表达显著升高;
图5示PCA主成分分析图;干细胞及hOPC的mRNA二代基因测序后主成分分析。不同颜色代表不同分组,每个坐标轴代表一种主成分;
图6大鼠脑缺血再灌注后不同时间点的脑组织体积的变化;MCAO手术后大鼠脑组织再灌注后第1天和21天时的TTC染色结果(黄色箭头所指区域为脑损伤区域);
图7MCAO/R手术后大鼠脑缺血再灌注第1天和21天脑梗死体积的量化结果;纵坐标为脑梗死总体积占全脑体积的百分比;n=3,单因素方差分析,*P<0.05为与正常组相比;
图8移植hOPCs对大鼠脑梗塞及再灌注所导致的神经损伤及神经功能恢复的实验设计过程图;
图9在体实验第8周时不同实验组中大鼠大脑的外观表现图;
图10在体实验第8周时不同实验组中鼠脑的皮层宽度量化统计结果;散点图纵坐标为大脑中线到梗死和非梗死半球边缘的最大宽度的比值;每组n≥6,使用单因素方差进行统计学分析;
图11改良Garcia神经行为学评分结果;每组动物数n≥7;*p<0.05为MCAO/R+hOPC1/2相对于MCAO/R+HBSS在统计学上具有显著性差异;
图12利用粘除试验评估大鼠感觉功能和运动功能的能力;纵坐标为大鼠左手去除胶带所用时间(最长限时120s内),正常大鼠第一天约为35.9秒;
图13利用转棒试验转速为20rpm测定与评估大鼠前肢与后肢的运动协调、平衡和运动学习能力;纵坐标为大鼠在转棒上停留时间(最长限时360s);
图14不同处理组大鼠的转棒维持时间;
图15五组实验动物在术后第1天和56天的大鼠左右前肢的协调能力测试结果;每组动物数n≥7;*p<0.05为MCAO/R+hOPC1/2相对于MCAO+HBSS对照组在统计学上具有显著性差异。
具体实施方式
本发明提供了一种培养基、少突胶质祖细胞的诱导培养方法以及应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
术语解释:
人诱导多能干细胞:人诱发多能干细胞诱导(human induced pluripotent stemcell,hiPSC)与人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)一样,同属于人源的多能干细胞,即具有体外分化形成体内各种细胞的能力以及自身繁殖和扩增的能力。
少突胶质细胞:少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)是中枢神经系统形成神经髓鞘的主要细胞,OL对脑缺血异常敏感。OL在缺血性脑损伤中的易伤性已经在多种体内和体外实验中被验证。OL亦是成人发病的脑缺血,特别是在脑室周围白质软化的最早的和首要的位点。因此,OL被考虑为在这些病理条件下的首要治疗靶点。丧失OL及其髓鞘严重损害神经轴突的功能。与灰质卒中不同的是,缺血发病后外周白质区内发生的神经纤维的早期变化及拯救的治疗窗口期从未被确认过。而神经轴突损伤和髓鞘破坏的时间过程恰恰在估算一个适当的治疗方案中极其重要。而比神经纤维丧失范围更大的、广泛的脱髓鞘区提示了一个髓鞘再生和修复在治疗缺血性脑卒中候选靶区。目前,皮质下白质卒中的发生率正随人口老年化的增长而增加。
缺血性脑卒中损伤:是指由于脑组织血流供应障碍而引起的大脑功能损伤与障碍,在严重情况下会引起中枢神经系统功能完全丧失以至导致患者死亡。脑卒中主要分为缺血性脑卒中和血性脑卒中两大类。前者是由血管栓塞或阻塞而导致的局部脑组织的供血停止引起;而后者是由脑溢血或脑出血引起的卒中。绝大多数的脑卒中是由于重要脑动脉的血栓引起的血流阻塞,进而导致大脑灰质和白质的梗死。
脑白质损伤:脑卒中的发生不但累及到大脑的运动和感觉神经元细胞集中的灰质区,而且损伤神经轴突和神经纤维通过的白质区。白质损伤是绝大多数脑卒中的重要病理变化和组成部分。而单纯皮质下白质卒中,如内囊区脑卒中,亦占所有脑卒中的30%左右。皮质下白质卒中的病理变化主要是梗死性白质疏松外周区发生的局部水肿、神经纤维损伤、脱髓鞘、少突胶质细胞(OL)丧失和功能紊乱、及局部星形细胞和小胶质细胞的激活。
细胞移植治疗:指缺失受损细胞的替代治疗。与传统的药物治疗不同,当组织或细胞受到损伤,给予相应的细胞替代,可达到治疗的目的。许多药物临床试验的失败提示,仅仅使用神经保护剂的缺血性脑卒中治疗方案是不够的。因此,临床上急需一种或多种能够促进受损神经细胞结构与功能恢复的治疗方案和策略,进而促进受损伤的大脑功能的康复,从而最终达到治疗脑卒中的目的。为了解决这个难题,我们提出使用由hiPSC诱导产生的OPC和OL治疗啮齿类动物的缺血性脑卒中的白质病变,以促进和增加缺血性脑卒中OL及其形成髓鞘功能的恢复,从而改善被严重损害的神经轴突的功能。我们希望本研究成果能为缺血性脑卒中恢复期治疗提供一个新方法和新思路。
在本发明一些具体实施方案中,本发明提供的诱导培养方法包括stage1阶段~stage4阶段,具体为:
stage1阶段:
1)将hESC或hiPSC在Vitronectin XF(10μg/ml/每孔)包被的六孔板中含有mTeSR1培养液中培养,每天更换全部mTeSR1培养液。当孔板内细胞融合度达到90%时,传代或进行胚胎小体的诱导分化。
2)胚胎小体(embryonic body,EB)的生成:当hESC或hiPSC细胞达到诱导分化阶段时,在37℃下用Dispase(1U/ml)消化5-7min,然后用5ml移液吸管水平与垂直将孔板上培养的细胞切割成约2mm×2mm大小的细胞片块。收集全部细胞片块,用DPBS洗涤一遍,重悬于7ml的mTeSR1,培养于T25培养瓶内。通常六孔板的每3孔的细胞量可以产生一个T25培养瓶的EB量,即1个六孔板培养的hESC或hiPSC可以生成2个T25培养瓶的EB量。EBs在mTeSR1培养基中悬浮培养,每天换2/3的新鲜培养基,培养3-5天。
stage2阶段:
3)神经上皮细胞(Neural Epithelia,NE)的分化培养:在第4-6天,将含有EB培养瓶内培养基更换为神经诱导培养基NIM(DMEM/F12、非必需氨基酸和1倍的N2营养辅剂配制),添加有bFGF(20ng/ml)和肝素(2μg/ml),继续培养4-5天,每天换1/2的新鲜培养基。于第11天,将NE-EBs粘附培养在多聚鸟氨酸/层粘连蛋白(PO/laminin)包被的六孔板上,在添加有层粘连蛋白(10μg/ml)、bFGF(20ng/ml)和肝素(2μg/ml)的NIM培养基中培养3天。于第14天将培养基更换成添加视黄酸(RA,0.1μM)的NIM培养基培养4天。NE的分化过程共为12天。
stage3阶段:
4)NE转化为Pre-OPCs的培养:在第18天时,将培养基更换为添加有B27(含RA)、视黄酸(RA,0.1μM)和嘌呤胺(Purmorphamine,purm,1μM)的NIM培养基,每隔一天换2/3的新鲜培养基。此过程为10天。
5)Pre-OPCs发育的培养:在第28天时,将培养基更换为添加有B27营养辅剂(不含RA)、嘌呤胺(1μM)和bFGF(10ng/ml)的NIM培养基,每隔一天换2/3的新鲜培养基。此过程为9天。在补充有B27营养辅剂(不含RA)、嘌呤胺(1μM)和bFGF(10ng/ml)的NIM培养基内继续培养,每隔一天换2/3的新鲜培养基。此步骤共需11天,且停止继续使用视黄酸。
stage4阶段:
6)Pre-OPCs转化为hOPCs的培养:在全程的第39天,将上一阶段培养基更换为神经胶质诱导培养基(Glial Medium,GM),其配方和成分为:DMEM/F12、N1营养辅剂(1×)、B27营养辅剂(不含RA,2×)、NEAA、T3(60ng/ml)、生物素(100ng/ml)、二丁酰cAMP(1μM)、PDGF-AA(10ng/ml)、IGF-1(10ng/ml)和NT3(10ng/ml)和嘌呤胺(1μM)。
一些实施方案中,本发明诱导培养方法还包括OPCs的传代培养,包括步骤7~9):
7)在全程的第50天,将粘附培养的早期hOPCs进行传代扩增一次(1:3)。传代时使用Accutase(1×/0.5mM EDTA)消化细胞,37℃等待7min,收集细胞后,加入1倍体积的DPBS后,使用p1000的移液枪吹打细胞20次,用DPBS溶液洗一次后,在200g的离心速度下,离心5分钟,丢弃上清液。然后将细胞重悬于新鲜的含有嘌呤胺(1μM)的GM培养基中。将细胞铺板在PO/laminin包被的六孔板上贴壁培养。传代扩增的比例是1:3-4,是以传代前细胞的密度而定。细胞计数后,约为每孔2-3百万(2-3x106)。每隔一天换2/3的新鲜培养基。
8)在全程的第80天,将粘附培养的已分化发育的hOPCs进行第二次传代扩增(1:4-6)。传代时使用Accutase(1×/0.5mM EDTA)消化细胞,过程如7)所述。收集到细胞后,将细胞重悬于新鲜的不含有嘌呤胺的GM培养基中。将细胞铺板在PO/laminin包被的六孔板上贴壁培养。传代扩增的比例是1:4-6,或以传代前细胞的密度而定。细胞计数后,约为每孔2-3百万(2-3×106)细胞。每隔一天换2/3的新鲜培养基。
9)此后,每25-30天进行一次细胞传代。传代扩增的比例可为1:3-6。
如无特殊说明,本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1人源少突胶质祖细胞hOPC诱导产生和培养方法
1)hESC或hiPSC细胞系在卵黄连蛋白(VitronectinXF,10μg/ml/每孔)包被的六孔板上培养于mTeSR1培养液内。当细胞融合度达到90%时,传代或进行诱导分化。未分化的干细胞可经过ICC验证人多能干细胞标记物的表达来鉴定,如SSEA4、TRA-1-60、OCT4、NANOG和SOX2,或通过qPCR验证OCT4、NANOG、SOX和hTERT等基因的表达来鉴定。每代hESC或hiPSC细胞系的扩增时间平均为5-7天。
2)胚胎小体(embryonic body,EBs)的生成:当hESC或hiPSC细胞可以诱导分化时,在37℃下用Dispase(1U/ml)消化5-7min,用5ml移液吸管将细胞切割成约2mm×2mm大小的细胞片块。收集全部细胞片块,重悬于7ml的mTeSR1,培养于T25培养瓶内。每天置换2/3体积的新鲜培养基,培养3-5天。
3)神经上皮细胞(Neural Epithelia,NE)的分化培养:在第4-6天,将含有EB培养瓶内培养基更换为神经诱导培养基NIM(DMEM/F12、非必需氨基酸和N2添加物配制),再添加bFGF(20ng/ml)和肝素(2μg/ml),继续培养4-5天,每天换1/2体积的新鲜培养基。于第11天,将NE-EBs粘附培养在聚鸟氨酸/层粘连蛋白(PO/laminin)包被的六孔板上,在添加有层粘连蛋白(10μg/ml)、bFGF(20ng/ml)和肝素(2μg/ml)的NIM培养基中培养3天。于第14天将培养基更换成添加视黄酸(RA,0.1μM)的NIM培养基培养4天。NE的分化过程共为12天。在NE分化过程的结尾时期,可通过NE的特异标记物PAX6和SOX1评估此神经上皮细胞分化状况。鉴定方法可以使用免疫细胞荧光染色,qPCR和细胞流式学方法等。
4)NE转化为Pre-OPCs的培养:在第18天时,将培养基更换为添加有B27添加物(含RA,2×)、视黄酸(RA,0.1μM)和嘌呤胺(Purmorphamine,1μM)的NIM培养基,每隔一天换2/3体积的新鲜培养基。此过程为10天。
5)Pre-OPCs发育的培养:在第28天时,停止使用视黄酸而添加bFGF,将培养基更换为补充有B27添加物(不含RA,2×)、嘌呤胺(1μM)和bFGF(10ng/ml)的NIM培养基,每隔一天换2/3体积的新鲜培养基。每隔一天换2/3体积的新鲜培养基。此步骤共需11天。在Pre-OPCs的分化过程的结尾第21天,即分化全过程的第38天,收集少量细胞样品,使用ICC或qPCR鉴定OLIG2和NKX2.2的表达来评估Pre-OPCs的出现生成。
6)Pre-OPCs转化为hOPCs的培养:在全程的第39天,将上培养基更换为神经胶质诱导培养基(Glial Medium,GM),其配方和成分为:DMEM/F12、N1添加物(1×)、B27(不含RA,2×)、NEAA(1×)、T3(60ng/ml)、生物素(100ng/ml)、二丁酰cAMP(1μM)、PDGF-AA(10ng/ml)、IGF-1(10ng/ml)和NT3(10ng/ml)和嘌呤胺(1μM)。
7)在全程的第50天,将粘附培养的早期hOPCs进行传代扩增一次(1:3)。传代时使用Accutase(1×/0.5mM EDTA)消化细胞,37℃孵育7min,收集细胞后,加入1倍体积DPBS后,使用p1000的移液枪吹打细胞20次,用DPBS溶液洗涤一次后,在200xg的离心速度下,离心5分钟,丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜的含有嘌呤胺(1μM)的GM新鲜培养基中。将细胞铺板在PO/laminin包被的六孔板上贴壁培养。传代扩增的比例是1:3-4,是以传代前细胞的密度而定。细胞计数后,约为每孔2-3百万个细胞(2-3×106)。每隔一天换2/3的新鲜培养基。在OPCs的分化全过程的第50天,收集少量细胞样品,通过ICC或qPCR鉴定OLIG2、NKX2.2和PDGFRa、SOX10的表达来评估OPCs的出现
8)在全程的第80天,将粘附培养的已分化发育的hOPCs进行第二次传代扩增(1:4-6)。传代时使用Accutase(1×/0.5mM EDTA)消化细胞,过程如7)所述。收集到细胞后,将细胞重悬于新鲜的不含有嘌呤胺的GM培养基中。将细胞铺板在PO/laminin包被的六孔板上贴壁培养。传代扩增的比例是1:4-6,是以传代前细胞的密度而定。细胞计数后,约为每孔2-3百万个细胞(2-3×106)。每隔一天换2/3的新鲜培养基。
经第二次传代后,OPC可以大幅度扩增、增殖。新生成的hOPC出现新的特异的标记物PDGFRa和SOX10,同是也共表达OLIG2或NKX2.2。在传代同时做好爬片以便免疫染色鉴定OLIG2、NKX2.2、PDGFRa和SOX10的表达。
9)此后,每25-30天进行一次细胞传代。传代扩增的比例可为1:3-6。并将产生的多余OPC冻存储备及制备为爬片进行后续实验,鉴定细胞生长状态或进行体内外实验。
实施例2hOPC诱导产生及验证试验
1)hESCs可高效快速诱导生成hOPCs:
hESC细胞系,可经免疫荧光染色(ICC)证实其表达干细胞特异标记物SSEA4、OCT4和SOX2的特性,如图1所示。将hESC有效诱导分化为hOPC的整个实验过程的培养方案须经历5个阶段,体外培养耗时80-100天(图2-3)。从未分化的hESC与诱导分化出至100天的hOPC1和hOPC2中提取mRNA进行转录及qPCR鉴定;qPCR结果显示,在分化的hOPC1和hOPC2中,未分化干细胞的代表标志物OCT4表达显著下降,而Pre-OPCs的标志物OLIG2和NKX2.2出现且表达明显增加,OPCs的标记物PDGFRa和SOX10亦逐渐增加表达,如图4所示。结果亦显示,用hOPC1和hOPC2诱导生成的hOPC转录后的hOPC特异标志物的则表达量无明显差异。方案培养中的hOPC2贴壁细胞在诱导发育的第4阶段中即可进行细胞扩增、冻存和ICC鉴定。移植所需的hOPC可直接从冻存细胞复苏培养。因此,hOPC2培养方案既可缩短了诱导时间同时也能保证了细胞质量。上述实验结果表明hESCs可高效快速诱导分化出hOPC。
2)二代基因测序与其结果分析以验证优化诱导方案的可行性和优越性:
为了全面和深入地了解体外使用优化诱导方案能成功从hESCs诱导生成OPC过程的特异性,对未分化的HN4 hESC、100天的hOPC1和hOPC2三种培养细胞进行了分离出总RNA、mRNA转录物的提取和基因文库的建立后,进行了二代表达基因测序与后续结果分析。
干细胞及hOPC的mRNA二代基因测序后的主成分PCA分析发现,所获得的样本在hOPC1和hOPC2实验组与hESC对照组之间的直观分布状况和样本集合,以及hOPC1和hOPC2实验组mRNA样品之间的高度相似性的样本集合和它们与hESC对照组之间的明显不同。测试分析结果显示,不同分组的基因表达谱的PCA结果表明了样本间表达谱数据的分类情况。未分化的hESC的基因表达状况明显不同于诱导分化后的hOPC1和hOPC2的表达方式,如图5所示。
不同细胞间分化基因差异表达亦表现来自未分化的hESC的基因表达方式明显不同于诱导分化的hOPC1和hOPC2的基因表达方式。而hOPC1和hOPC2之间的差异则较小,见表1。结果显示,hOPC2比较未分化的hESC在FC>2,p<0.05条件下,总差异基因数为4845,其中上调基因为2714,下调基因为2131;而在同样条件下比较hOPC1比较未分化的HN4 hESC,总差异基因数为4195,其中上调基因为2446,下调基因为1749。但是,在同样条件下比较hOPC1和hOPC2时,总差异基因数仅为194,其中上调基因为101,下调基因为93;两组比较差异均小于5%。此结果表明,hOPC1和hOPC2之间的差别非常小,几无不同,见表1。
表1细胞差异基因表达量
进一步二代测序的生物信息分析GO(gene ontology,基因功能分类)和通路(pathway)富集分析结果表明,在hOPC1和hOPC2中的上调基因富集的通路中,表现有许多与神经系统发育密切相关的生物分子通路,如轴突导向(Axon guidance),多巴胺能神经突触(Dopaminergic synapse),GABA神经突触(GABAergic synapse)等,特别还是富集了多达30多种与神经胶质细胞和少突胶质细胞发育相关的生物分子通路。
在基因表达的数据中,hOPC1和hOPC2比较未分化的HN4 hESC之间的上调表达的基因(高表达基因)结果显示,在两组数据中的最高表达的基因中,许多都与早期神经生长发育有关,如FOXG1,DLX2,SOX1等。而且发现了一些与OPC和OL生成发育相关的基因表现出高表达,如OLIG2,NKX2-2,SOX9,PDGFRA。在对比分析中未发现GFAP基因的高表达存在,结果说明当前的细胞状态,为比较早期的OPC,尚未有星型胶质细胞的出现。另外,在hOPC1和hOPC2高表达的基因组中无明显的未分化和致瘤基因的表达,如OCT4,hTERT,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog等。而后二基因恰好在未分化hESC中高表达。此结果亦说明我们的分化产生的hOPC1和hOPC2的方法学缺乏可能的致瘤性,至少基因表达层面上。
3)结论分析
结果显示,本发明提供的诱导培养方法从hESCs诱导生成pre-OPC和OPC,且逐渐增加表达Pre-OPCs和OPCs的生物标志物OLIG2、NKX2.2、PDGFRa和SOX10。而对hOPC1和hOPC2和未分化hESCs进行的二代基因测序分析和检验,主成分分析PCA和基因差异表达(Differential expression)分析均表明hOPC1和hOPC2与未分化hESCs之间差异明显,而hOPC1和hOPC2之间无明显差异。生物信息分析GO和通路富集分析结果结果表明,在hOPC1和hOPC2中的上调基因富集的通路中,富集了有与神经系统发育密切相关,以及与神经胶质细胞和少突胶质细胞发育相关的生物分子通路的生物分子通路。分化产生的hOPC1和hOPC2无明显致瘤基因表达,为安全使用提供了可靠依据。
实施例3本发明诱导培养获得的人源少突胶质祖细胞hOPC在大鼠缺血性脑卒中中的治疗作用
本发明使用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)模型后,应用多种神经行为学评分,以及TTC染色等组织方法来判断梗死面积与神经损伤部位和程度,进而对大鼠缺血性脑卒中神经损伤进行评估,确定细胞注射的部位。在注射hOPC前,开始使用免疫抑制剂FK506(1mg/kg,腹腔注射)从而减少或避免大鼠机体对人细胞的异体免疫排斥。将hOPC注射入脑卒中模型的缺血区及周围的脑白质区域。注射的方式为脑卒中同侧前脑皮层两点注射,每点注射25-40万个细胞,即50-80万个细胞/只鼠。移植的hOPC可以明显改善缺血性脑卒中引起的包括运动和感觉以及运动协调等神经症状和损伤。大鼠脑神经损伤部位的组织方法检测亦表现了hOPC能够在损伤区域生存、分化、扩增、迁移的状态变化。
(一)实验方法
1.大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型
(1)大鼠大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)模型的建立:
1)使用含2%异氟烷的O2/N2O(30/70%)混合气体麻醉大鼠,麻醉机流量维持在600ml/min。大鼠颈部剔毛后固定在操作台,碘伏消毒皮肤。
2)在大鼠颈正中偏右剪开长约1.5-2cm的皮肤切口。逐层分离肌肉和筋膜,找出右侧颈总动脉(CCA),再逐渐分离出颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)、翼腭动脉(PA)。
3)结扎颈外动脉、翼腭动脉,动脉夹夹闭颈总动脉、颈内动脉,在颈外动脉近心端剪一破口,将多聚耐氨酸包被的线栓(直径为0.26mm)经颈外动脉进入颈内动脉阻塞大脑中动脉(约进入18-22mm)。连同线栓一起结扎破口,松开颈总动脉夹观察血流状况。
4)当动物生命体征稳定,临时闭合伤口,在颈部伤口处盖上生理盐水浸湿的纱布。将实验动物移至37℃的恒温毯复苏,观察;
5)缺血40min后,打开手术切口拔出线栓,使血流再灌注(R,Reperfusion),结扎颈外动脉破口,缝合伤口;
6)术后将动物放置在恒温毯复苏直至动物苏醒。放回鼠笼,自由进水进食。
(2)MCAO/R造模成的标准:在造模大鼠苏醒后12-24小时进行评分。神经行为学检查评估使用Longa评分法,神经学检查分5个等级:
0分:行为正常,即无神经功能缺损;
1分:左侧前爪无法完全伸展,即轻度神经功能缺损;
2分:行走时,大鼠向左侧(瘫痪侧)转圈,即中度神经功能缺损;
3分:行走时,大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒,即重度神经功能缺损;
4分:不能自发行走,有意识丧失。
0分为行为学正常大鼠,4分为损伤最严重大鼠。选造模后评分为1-3分的大鼠进行后续hOPC微量注射实验。
若大鼠出现脑出血,体重过轻(体重减轻超过手术前体重的40%)或取样前死亡皆需排除在外。
2.氯化三苯基四氮唑染色
氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色可用于测定缺血性脑卒中后大鼠脑梗死的状态和严重程度。
1)取出保存于-80℃冰箱内的脑组织样品,置于-20℃复温15min;
2)将脑组织放置在冰上,去除小脑,从前脑至后脑方向均匀切取脑组织切片,厚度为2-3mm,共5片;
3)将脑切片浸泡在37℃的2%TTC溶液中15min,使其均匀染色,直至脑片正常区域呈现深红色,而梗死区域为白色;
4)取出脑片,4%多聚甲醛固定5min。置脑片于黑色不反光背景上拍照记录结果。
5)使用Image Pro Plus系统计算梗死面积。脑梗死率等于脑梗死总面积与脑总面积的百分比。即((A1+A2+…+An)/(B1+B2+…+Bn))×100%,A为梗死面积,B为全脑面积。
3.移植hOPC的制备
将培养于GM培养基内的hOPC机械刮取,在不含Ca2+/Mg2+的HBSS内重悬,使用p1000移液枪吹打hOPC20次左右使之成为细胞小球。实验前检测移植细胞活力(>90%)并计数,置于冰上备用。给予造模后有神经症状表现的大鼠右前脑(卒中侧)实施两点细胞注射,每孔细胞注射量约为2.5-4×105/4ml,对照组动物注射同体积的HBSS。细胞移植试验完成后将剩余细胞回收培养在24孔板上。观察注射实验后,细胞活力状态以及注射细胞是否被污染。
4.大鼠脑立体定位注射
大鼠MCAO/R模型造模成功后24h进行脑立体定位注射细胞,过程如下:
1)诱导麻醉实验动物:使用含2%异氟烷的O2/N2O(30/70%)混合气体中麻醉大鼠。
2)动物脑立体固定:压紧耳杆确保左、右耳杆的位置刻度相同,鼻杆压紧,保持颅面水平。
3)脑部开颅手术:大鼠头部剃毛,碘伏消毒皮肤。剪开头皮,去除骨膜,棉球清理颅表面。
4)定位钻孔:用注射针尖来校正前囟点(bregma),针尖定位后手动做好标记,将其设定为坐标原点。在右侧半脑找准两注射点坐标:点1(前囟点+1.2mm,正中线外侧-3.0mm,背腹侧-4.0mm),点2(前囟点-1.4mm,正中线外侧-4.0mm,背腹侧/-4.5mm),注意定好位,手动做标记,将颅钻速度调小,谨慎钻孔,注意不要造成脑出血。
5)脑部微量注射:调节控制微量注射泵(瑞沃德)注射速度(0.4ml/min)和注射体积(3.5-4ml/孔)参数。进针前开启注射泵,待针尖可看到明显液滴时开始下针。到达坐标深度后继续下针0.1mm,随后上升至指定深度。
6)注射完细胞后,留针10min,随后缓慢拔针,注意针尖上升与下降要缓慢。
7)皮肤缝合与动物苏醒:紧密缝合好伤口,在缝合处用碘酒消毒。将大鼠放在恒温复苏毯上,待其苏醒后放回鼠笼恢复。自由进水进食。
5.免疫抑制剂
脑立体定位注射人源细胞后,对大鼠经腹腔注射给予免疫抑制剂FK506(1mg/kg),每天给药直至取材完实验结束。FK506溶解在含DMSO(5%)、PEG300(40%)、Tween80(5%)的无菌ddH20中,现配现用。
6.实验动物分组
SPF级雄性SD大鼠,7-8周龄,270g-310g,随机分为以下五组,每组10只。在实验结束前若有死亡或者发现大鼠无梗死,则需补充实验动物以确保每组实验动物数量。具体分组:1)正常未手术组;2)MCAO/R组,仅MCAO/R手术造模后无注射;3)MCAO/R+HBSS组,MCAO/R手术+FK506+脑注射HBSS;4)MCAO/R+hOPC1组,MCAO/R手术+FK506+脑注射hOPC1;5)MCAO/R+hOPC2组,MCAO/R手术+FK506+脑注射hOPC2。
7.鼠脑皮层宽度测试
试验结束后,将实验大鼠用4%多聚甲醛灌注固定,取出大脑后,使用体视显微镜连接的显微数码相机系统捕获全脑图像。通过Image Pro Plus系统对图像进行分析。将梗死半球中线到大脑边缘的距离(x)除以对侧非梗死半球中线到大脑侧边缘的距离(y)来计算皮层宽度指数(x/y)。
8.神经功能行为学检查
所有实验大鼠在术后的第1、7、14、21、28、35、42、49、56天均进行如下各项行为学检查,用于评估神经功能损害和恢复情况。神经功能行为学检查采用单盲法,以保证检查的公正性。本实验采取4种神经功能行为学检查:Garcia评分、粘除试验(Adhesive removaltest)、前肢应用试验(Forelimb use asymmetry test)和转棒试验(Rotarod test)。
8.1Garcia神经功能评分
采用改良的Garcia大鼠神经功能评分标准,共包含六项检测:自主运动,肢体对称性,前肢对称伸展,铁网攀爬能力,钝棒触碰躯体反应,钝棒触碰胡须后反应。每项实验单独计分,依据动物行为表现评分0-3分,总分为各实验分数之和,范围为3-18分。分数越高表示大鼠神经功能损伤越小,即正常大鼠最高得18分,神经功能损伤最严重得3分。本实验中,大鼠MCAO/R造模阻塞了右侧大脑中动脉,造成大鼠右脑缺血损伤,可以引起左侧肢体感觉和运动功能受损。
1)自主运动试验:将大鼠放入观测箱内,观察大鼠5min内自主活动及活动中身体触及箱壁次数并记录。评分标准如表所示:
表1自主运动评分评分标准
2)肢体对称试验:用手指夹住大鼠尾巴将大鼠倒立提起,观察大鼠四肢屈曲或伸直状况并记录。评分标准如表所示:
表2肢体对称试验评分标准
3)前肢伸展试验:用手指夹住大鼠尾巴将大鼠提起,让大鼠前肢接触地面,后肢悬空,观察大鼠依靠前肢行走情况并记录。评分标准如表所示:
表3前肢伸展试验评分标准
4)网屏试验:将大鼠放至90cm长45°的网屏上,观察大鼠攀爬和抓持铁网的能力并记录。评分标准如表所示:
表4网屏试验评分标准
5)躯体触碰试验:将大鼠放在观测箱内,实验者分别从左右两侧用钝棒轻轻从后向前抚触大鼠皮毛,观察大鼠对刺激反应情况并记录。评分标准如表所示:
表5侧身轻触试验评分标准
6)触须试验:在观测箱内,实验者分别从左右两侧用钝棒轻轻从后向前抚触大鼠胡须,观察大鼠对刺激反应情况并记录。评分标准如表所示:
表6侧身轻触试验评分标准
8.2粘除试验
粘除试验(Adhesive removal test)评估大鼠感觉功能缺陷和运动协调能力,试验步骤如下:
1)大鼠适应观察箱:试验测定前,先将大鼠从鼠笼中移出放入观察箱,使其至少适应周围环境60秒;
2)粘贴胶带:将动物从观察箱中拿出,并在大鼠两只前爪上以相同的压力覆盖两条胶带,胶带粘贴在爪垫的无毛部位。每天更换左右爪粘贴顺序确保试验随机。实验者应熟练掌握动物抓取操作,尽可能缩短操作时间,以便获得更准确试验结果。
3)试验测定:胶带粘好后,将大鼠放回观察箱。然后启动多通道计时器,让其运行120秒,给予大鼠充分时间去除胶条。
4)发现胶带时间:在观察箱中观察大鼠行为,发现胶带的时间,标准为大鼠对胶条的反应。大鼠摇动前肢或直接将前肢放到嘴边。这两种行为均表明大鼠已感觉到胶带即为胶带发现时间,左右前肢发现胶带时各记一次时。大鼠左侧肢体感觉功能受损,因此左前肢更难发现胶带。
5)去除胶带时间:在观察箱中继续观察大鼠的行为。大鼠可能用嘴或是用另一只前肢协助尝试去除胶带,大鼠左右前肢胶带去除时各记一次时。大鼠左测运动功能受损,难以将左前肢移到嘴边去除胶带,因此左前肢去除胶带时间会更长;
6)试验结束后,将大鼠放回鼠笼。
8.3转棒试验
转棒试验(Rotarod test)用于评估大鼠的运动功能,包括大鼠前肢和后肢的运动协调、平衡和运动学习的能力。
1)试验前训练:在造模前对所有动物进行转棒试验训练。将大鼠放置在旋转的转棒上不同通道,转棒加速到10rpm(每分钟转数),大鼠在旋转杆上向前走并保持平衡2min。重复该操作,总共进行3次试验,每次间隔10min。
2)测试实验:在进行测试之前,以4rpm的转速运行转棒。将试验大鼠放置在旋转的杆上的单独通道中,让转棒加速到20rpm或25rpm。转棒开始加速时计时开始,大鼠落杆时试验结束,最长试验时间为6min。重复此试验三次,每次间隔15min,记录每只大鼠的三次测试时间。
8.4前肢应用试验
前肢应用试验(Forelimb use asymmetry test),亦称为圆筒试验或爪伸试验。用来评估大鼠左右前肢使用的不对称性。将大鼠放在透明圆筒中(直径20cm,高度30cm),录像10-15min来分析探索活动中大鼠前肢的使用情况。观察并记录大鼠使用受损前肢、对侧或双侧前肢探索圆筒壁的次数。实验过程中使用具有慢放和清晰的停帧功能的相机对动物进行计分。评分标准如下:1)独立使用左前肢(A)或右前肢(B)触碰圆筒壁,垂直方向运动或者侧向运动发生重心转移或者恢复重心;2)同时使用左前肢和右前肢(C)接触圆筒壁或是横向运动。肢体使用不对称得分=(B-A)×100%/(A+B+C)。
MCAO/R手术后大鼠左前肢受到不同程度的损伤,在触壁时更倾向使用右前肢。因此,大鼠损伤越严重,左右前爪更加不协调,得分越接近100%,正常大鼠得分接近于0。
9.冰冻切片
1)灌注固定大鼠:沿大鼠腹中线剪开皮肤后打开胸腹腔,充分暴露心脏,从左心室心尖处插入针头,经左心室向主动脉缓慢灌入0.1M PB溶液,直到肝脏颜色变白且右心房流出液体澄清,后再灌注4%多聚甲醛。液体用量为每1ml/1-2g体重液体。
2)取材与后固定:小心剥离获取脑组织后,于4%多聚甲醛中进行后固定,大鼠全脑需固定4-8小时;
3)固定后冲洗组织:每1-2小时更换PBS溶液,共3次以去除多余的多聚甲醛;
4)蔗糖脱水:脑组织先于6%的蔗糖(0.1M PB配制)中脱水至脑组织沉底;然后换至30%的蔗糖溶液中继续脱水。全程于4℃冰箱中的摇床上缓慢摇动至脑组织沉底;
5)脑组织包埋和冻存:在脱水完成后进行脑组织包埋。首先用OCT包埋剂将脑组织完全包埋。以内层异戊烷、中间层干冰乙醇浴、外层干冰的三层密闭体系进行低温操作,在冷冻包埋脑组织之前需要先将密闭体系预冷30min。每个大鼠全脑组织冷冻包埋时间为20min。冻存完毕后,将脑组织用锡箔纸包好并贴好标签,于-80℃冰箱中进行长期存放。
6)脑组织切片:将脑组织取出放在冰冻切片机复温(-20℃),切片厚度12μm。从大脑靠近绣球端开始切片,切片范围为前囟点前1.2mm到前囟点后1.4mm;
7)脑组织贴片:将脑组织切片直接粘贴在带静电吸附能力的防脱玻片上,尽量避免褶皱和气泡。自然风干2-3小时后,置于密封盒-20℃冰箱中保存存放备用。
10.免疫组织化学染色
取出脑组织冰冻切片,室温下放置复温20min,1×PBS清洗三遍,每次5min。
1)透膜:加入穿透试剂(含1%驴血清,0.1%皂苷的PBS溶液),室温30min;
2)封闭抗原:添加封闭试剂(含5%驴血清,0.05%皂苷的PBS溶液),室温避光孵育30min;
3)去掉封闭液,加入合适浓度的一度抗体稀释液,小鼠抗人核抗体nuclei(1:200)、大鼠抗MBP(1:200)、兔抗OLIG2(1:1000)、山羊抗SOX2(1:1000)、小鼠抗GFAP(1:500)、兔抗Ki67(1:400),4℃过夜,注意保持孵育盒湿润;
4)从冰箱内取出切片,置于室温30min复温。用1X PBS洗片,每次5min重复三次;
5)封闭:再次加入封闭试剂,室温放置30min;
6)加入带有荧光标记的合适浓度二抗稀释液,使用Alexa Fluor二抗,包括与488和594nm荧光团偶联的驴抗小鼠、大鼠和兔抗,避光室温孵育30min。清洗切片,每次5min重复三次;
7)封片:略微干燥脑组织贴片,滴加适量含DAPI染色剂的抗荧光淬灭封片油,盖上载玻片,密封好避免产生气泡;
8)封存好的玻片做好样品信息标记,使用正置荧光显微镜拍照,-20℃保存。
11统计学分析
所有数据分析使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0进行。每组实验样本量n≥6,数据用Mean±SEM表示。采用重复测量方差分析和LSD检验以及Dunnett T3检验进行多重分析。评估参数数据的差异,显著性差异设置为p<0.05。
(二)实验结果
1大鼠脑缺血再灌注后引起脑梗死损伤
大鼠大脑中动脉缺血40min后再灌注(MCAO/R),可引起明显大鼠前脑皮质和皮质下脑组织的损伤,缺血侧脑组织体积发生明显变化,如图6所示。MCAO/R实验组大鼠前脑缺血再灌注1天后梗死皮层出现明显肿胀和水肿,体积增大;而在21天后表现出梗死皮层水肿组织发生液化,体积较术后第1天有所萎缩减小,但仍然比正常脑组织肿胀和水肿(图6)。TTC染色后量化统计分析结果显示,在术后第1天脑梗死面积/全脑面积为10.25%;第21天时,脑梗死体积仍有5.97%。这些结果表明,大鼠大脑中动脉缺血40min后再灌注可以引起严重地脑梗死和脑损伤,并可延续到造模后21天,如图7所示。
2hOPCs移植可改善大鼠脑缺血再灌注引起的前脑神经组织的损伤
为检验和评估移植新诱导方案生成的hOPC对MCAO/R造模后脑梗塞及再灌注所导致的神经损伤的治疗和神经功能恢复的作用和效果,实验方案设计如图8所示。MCAO/R手术后24小时进行细胞移植,脑立体定位注射hOPC或HBSS对照溶剂。实验大鼠每天接受腹腔注射免疫抑制剂FK506(1mg/kg)。在术后每周(于1、7、14、21、28、35、42、49、56天)进行大鼠神经功能行为学评分(包括Garcia评分、粘除实验、前肢应用试验和转棒实验)。在第8周末(56天)行为学评分完成后,终止大鼠在体实验,将动物处死,获取整个大脑组织进行固定、拍照计算皮层宽度、切片、荧光染色,或进行TCC染色以计算脑梗死体积。动物实验共分为5组,正常对照组、MCAO/R组、MCAO/R+HBSS组、MCAO/R+hOPC1组和MCAO/R+hOPC2组。
当MCAO/R手术后第8周(56天)终止大鼠在体实验时,取脑后直接对大脑双侧和受损侧进行观察、测量和计算,并观察有明显无瘤体存在。实验结果表明,包括各MCAO/R组在内的所有分组中的大鼠左侧前脑(正常侧)的体积均无明显差异;比较正常大鼠的同侧前脑,无明显体积变化。然而,在不同的实验组中,大鼠右侧前脑的外观和体积则表现明显不同和变化,见图9。进一步的大鼠脑皮质的宽度定量统计表明,于实验的第8周时,在未治疗的MCAO/R和MCAO/R+HBSS组中,右侧受损大脑体积明显缩小,脑组织发生液化和萎缩,见图10,其皮层宽度指数(CWI)分别为0.60和0.72,与正常对照组(0.92)比较显著减少,并具有统计学差异(p<0.0001)。而在hOPC1和hOPC2治疗组中,治疗后的大鼠右侧前脑的液化和萎缩得到了明显的改善,其CWI分别为0.84和0.91,显著大于MCAO/R对照组和MCAO/R+HBSS组,且具有显著的统计学意义(p<0.05),见图10。因此,两种hOPC(hOPC1和hOPC2)均表现了明显的改善治疗大鼠MCAO/R引起的脑部组织损伤的作用,表现了明显的治疗作用。而两种hOPC(hOPC1和hOPC2)治疗组之间比较,治疗作用无明显差异,表明其治疗效果相近。本实验结果充分表明,局部脑微量注射hOPC至大鼠MCAO/R损伤区可以明显减少受伤脑区组织的损失,并且能够改善和增进损伤脑区组织的恢复。
3hOPCs移植可促进大鼠脑缺血再灌注后神经功能的长期恢复
为了进一步检测和评价脑注射hOPC至大鼠MCAO/R损伤区后对大鼠神经行为学的改善作用,我们进行了如下多种行为学检测和评估:
1)Garcia大鼠神经功能评分测试:采用改良Garcia大鼠神经功能评分标准对各实验组的大鼠进行测试,每周测试一次,包含六项亚检测:自主运动,肢体对称性,前肢对称伸展,铁网攀爬能力,钝棒触碰躯体的反应,钝棒触碰胡须后反应。每项实验单独计分,依据动物行为表现评分0-3分,总分为各实验分数之和,范围为3-18分。分数越高表示大鼠神经功能损伤越小,即正常大鼠最高得18分,神经功能损伤最严重得3分。实验中,大鼠MCAO/R造模阻塞右侧大脑中动脉,造成大鼠侧脑缺血损伤,结果造成左侧肢体感觉和运动功能受损。
结果表明,在MCAO/R造模和细胞注射后8周内,明显可见移植的hOPC有助于大鼠的感觉功能和运动协调能力恢复逐渐。首先,在术后第1天,除正常对照组外,所有组大鼠均表现出了不同程度的神经功能缺损,均表现出Garcia评分明显降低(图11)。在此后的8周内,MCAO/R组和MCAO/R+HBSS组在Garcia评分上持续表现明显降低,且无明显改善。但与MCAO/R+HBSS组相比,MCAO/R+hOPC1和MCAO/R+hOPC2两治疗组则在第2周(14天)开始表现出Garcia神经学评分的改善作用。此改善作用和效果一直延续至实验结束的第8周(56天),且统计学上具有显著意义(P<0.05,图11)。本实验结果进一步说明,局部脑微量注射hOPC至大鼠MCAO/R损伤区不但可以明显改善和有助损伤脑组织的恢复,而且可以明显促进大鼠感觉功能和运动协调能力的改善和恢复。
2)粘除试验:试验开始时和实验第1周,比较正常对照组,四组MCAO/R手术后动物去除胶带时间均明显延长(>120秒,图12)。而自手术第2周(14天)开始,hOPC1(76.42秒)和hOPC2(91.52秒)治疗组比较HBSS溶剂治疗组(120秒)表现其去除胶带时间的开始缩短加快,且统计学上具有显著意义(p<0.05,图12)。此后,hOPC1和hOPC2治疗组的去除胶带时间的继续缩短加快,直至实验结束时的第8周。且在所有测试时间点上与对MCAO/R未治疗照组相比,均表现有显著地统计学意义(p<0.05,图12)。特别是从第5周开始,两治疗组的去除胶带时间(hOPC2,36.96秒和hOPC1,43.79秒)已经恢复到几近无手术正常对照组的水平(28.90秒),如图12所示。粘除实验与去除胶带时间结果显示,hOPC的治疗具有改善和恢复大鼠感觉和运动功能的作用和能力。
3)转棒试验:在转棒试验测试中,当使用转棒转速为20rpm(每分钟转数)的条件下进行测试,试验开始时和试验的第1-2周,比较正常对照组(>320秒),所有MCAO/R手术的四组动物的转棒时间均明显缩短(<100秒),表明了MCAO/R手术对大鼠运动功能、前肢和后肢的运动协调、平衡和运动学习能力的损伤。自第3周起,hOPC1(162.97秒)和hOPC2(145.90秒)治疗组大鼠的转棒维持时间开始改善增加,比较HBSS溶剂对照组(97.98秒)在统计学上具有显著意义(p<0.05),见图13。此后,hOPC1和hOPC2两治疗组中大鼠的转棒维持时间持续改善、增加,直至实验结束的第8周,且比较HBSS溶剂对照组相比均表现有显著地统计学意义(p<0.05,图13)。
当转棒试验测试的难度进一步增加,即转速(每分钟转数)增加至25rpm时,虽然hOPC1(166.83秒)和hOPC2(154.15秒)两治疗组的转棒维持时间开始明显改善、增加的时间与HBSS溶剂对照组(63.16秒)的差异推迟至第4周,即比较转棒转速为20rpm的测试条件晚了一周,但在之后时间中,两治疗组均的转棒维持时间均有持续改善和明显增加(图14)。在第4-8周的所有测试点中,hOPC1和hOPC2两治疗组的转棒维持时间与比较HBSS溶剂对照组均有持续改善和明显增加,且均表现有显著的统计学意义(p<0.05,图14)。两种不同难度的转棒实验结果显示,hOPC的治疗具有良好的改善和恢复大鼠的运动功能,包括大鼠前肢和后肢的运动协调、平衡和运动学习能力的作用。
4)前肢应用试验中,我们观察到hOPC细胞治疗组,包括hOPC1和hOPC2治疗组,在实验的第8周(56天),大鼠左右前肢应用协调性比较自身在术后第一天(1天)时的状况具有明显好转和恢复。在实验的第8周(56天)时,hOPC1和hOPC2治疗组肢体使用不对称得分结果分别为hOPC1(34.35%)和hOPC2(39.06%),比较HBSS溶剂组对照组(71.69%)具有明显减少和改善,且在统计学上具有显著意义(p<0.05),如图15所示。结果说明了大鼠左右前肢协调能力的改善和恢复。
综上四项神经功能学实验的结果表明,hOPC细胞治疗在脑缺血及再灌注引起大脑神经功能损伤中可以表现出明显的修复和治疗作用,其中包括运动、感觉和运动协调、平衡和运动学习等能力。局部微量注射hOPC至MCAO/R损伤区周围可以明显改善和有助损伤脑组织的恢复。这些动物实验的结果亦为我们未来使用hOPC治疗脑缺血及再灌注引起大脑神经功能损伤的病人提供了坚实和可靠的理论和实验依据。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种培养基组合,其特征在于,包括:
stage1培养基:mTeSR1培养基;
stage2培养基A:包括NIM培养基、20ng/ml bFGF和2μg/ml肝素;
stage2培养基B:包括NIM培养基、10μg/ml层粘连蛋白、20ng/ml bFGF和2μg/ml肝素;
stage2培养基C:含0.1μM视黄酸的NIM培养基;
stage3培养基A:包括NIM培养基、含视黄酸RA的B27补充剂和1μM嘌呤胺;所述stage3培养基A中视黄酸的浓度为0.1μM;
stage3培养基B:包括NIM培养基、1μM嘌呤胺、10ng/ml bFGF和不含视黄酸的B27补充剂;和,
stage4培养基:包括DMEM/F12培养基、1x N1营养辅剂、不含RA的2×B27营养辅剂、1×NEAA、60ng/ml T3、100ng/ml生物素、1μM二丁酰cAMP、10ng/ml PDGF-AA、10ng/ml IGF-1、10ng/ml NT3和1μM嘌呤胺;
所述NIM培养基由DMEM/F12、非必须氨基酸和N2营养辅剂组成。
2.一种诱导人多能干细胞和胚胎干细胞分化为少突胶质祖细胞的培养方法,其特征在于,以权利要求1所述的培养基组合诱导人多能干细胞和胚胎干细胞分化为少突胶质祖细胞,包括:
stage1:将hESC或hiPSC细胞以mTesR培养基培养至融合度为90%,37℃下用Dispase消化5-7min,将细胞切割成约2mm×2mm大小的细胞块,重悬,于mTeSR1培养基中悬浮培养,每天换2/3的新鲜培养基,培养3-5天;获得胚胎小体;
stage2:以stage2培养基A培养胚胎小体4-5d;然后置于多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的六孔板中,以stage2培养基B贴壁培养3d天;然后以stage2培养基C贴壁培养4d天,获得神经上皮细胞;
stage3:以stage3培养基A贴壁培养神经上皮细胞,每隔一天换2/3的新鲜培养基,培养10天;以stage3培养基培养B继续贴壁培养培养11天,期间每隔一天换2/3的新鲜培养基,获得Pre-OPCs;
stage4:以stage4培养基培养继续贴壁培养11天,获得OPCs。
3.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述stage4步骤之后还包括对OPCs传代培养的步骤。
4.根据权利要求3所述的培养方法,其特征在于,所述传代培养扩增的比例为1:4~6,所述传代培养的细胞接种密度为每孔2-3×106cell。
5.根据权利要求3所述的培养方法,其特征在于,所述传代培养为:以Accutase-EDTA消化OPCs细胞,37℃等待7min,收集细胞后,加入1倍体积的DPBS后,使用p1000的移液枪吹打细胞20次,用DPBS溶液洗一次后,在200g的离心速度下,离心5分钟,丢弃上清液;然后将细胞重悬于新鲜的stage4培养基中;将细胞铺板在PO/laminin包被的六孔板上贴壁培养。
6.权利要求2~5任一项所述培养方法获得的hOPC。
7.权利要求6所述的hOPC在制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述神经系统疾病为白质损伤有关的中枢神经系统疾,包括:缺血性和出血性脑中风或脑卒中、脑外伤损伤、老年痴呆症、帕金森病、亨廷顿氏病和癫闲痫脑病。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述脑损伤为大脑或脊髓神经组织损伤。
10.权利要求6所述的hOPC在制备髓鞘再生和修复、白质损伤修复的药物中的应用。
11.权利要求6所述的hOPC在制备改善运动、感觉、运动协调、平衡和学习中至少一种能力的产品中的应用。
12.根据权利要求7~11任一项所述的应用,其特征在于,所述产品为药物,所述药物的剂型包括注射剂、胶囊剂或冻干粉。
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