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CN106939299B - microRNA重编程体细胞为神经干细胞的制备方法及应用 - Google Patents

microRNA重编程体细胞为神经干细胞的制备方法及应用 Download PDF

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CN106939299B CN201710063908.0A CN201710063908A CN106939299B CN 106939299 B CN106939299 B CN 106939299B CN 201710063908 A CN201710063908 A CN 201710063908A CN 106939299 B CN106939299 B CN 106939299B
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Abstract

本发明提供了一种诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地,本发明涉及采用microRNA‑302、丙戊酸、polybrene、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子等组合,在正常生理环境下诱导人成纤维细胞、上皮细胞、血细胞、脂肪细胞等体细胞通过重编程技术诱导形成具有高产同时又具有良好多能性以及传代稳定性的神经干细胞。本发明方法采用单个microRNA转染体细胞,无需引入外源转录因子,制备形成克隆时间远远短于现有技术,有望开发成为治疗退行性神经系统疾病(包括脊髓损伤等病变)的治疗方法或药物,因此具有良好的临床应用前景。

Description

microRNA重编程体细胞为神经干细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术和神经发育领域,具体地,本发明涉及一种直接重编程诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用。
背景技术
随着社会老龄化程度的增加,各种神经退行性疾病的人群发病率居高不下且有上升趋势,神经系统退行性疾病以及神经系统损伤(如中风,脑缺血,脊髓损伤等)严重地威胁着人类的身体健康。帕金森病、阿尔茨海默病、脑中风等疾病均存在由于分化成熟的神经细胞不能分裂增殖以弥补损伤或死亡的细胞所造成的神经细胞丢失和功能障碍。神经系统的疾病及损伤的病理表现大都涉及到神经细胞的丢失和再生的缺陷。多种神经退行性疾病的传统内外科治疗,只能缓解症状而不能阻止疾病的进一步发展。如果损失的神经细胞得不到新生细胞的补充和修复,疾病治疗恢复的可能性将非常微小。
由于成体的神经系统再生困难,因此,神经损伤性疾病的治疗一直是困扰医学界的难题。近年来细胞替代治疗的发展,为神经系统病变的治疗带来了希望。神经干细胞在神经生物学研究和神经系统疾病细胞治疗中具有广阔的应用前景。神经干细胞不仅可以自我更新和扩增,还可以分化形成多种神经元和神经胶质细胞,用于补充和替代损伤或丢失的神经。但长期以来,神经干细胞的来源局限于流产胎儿的分离提取或胚胎干细胞/多能干细胞的定向分化。由于受到伦理和诱导效率低下等问题,严重限制了其进一步的应用。
现在存在一种直接转分化的技术,不必经过IPS阶段,可直接将分化细胞转分化形成希望的成熟细胞类型。相对于iPS,直接转分化技术降低了体外操作的复杂性,相当程度上规避了倒退回多潜能状态所需要的步骤带来的风险,如成瘤性。但只能在特定谱系细胞间进行转换,且效率低下;成熟细胞扩增能力有限,难以获得足够临床所需的细胞数量,影响了这项技术的临床应用价值。直接转分化技术不是一个具有普适性的平台,与iPS和直接转分化不同,间接谱系转换是用部分重编程技术将成熟细胞短推回至一种可塑性的中间状态,随后再进行分化。相对于iPS细胞技术,间接谱系转换缩短或绕过重编程至多能性的完整过程,提供了一种简单高效技术,体外过程从原来的将近两个月缩短至两三个星期。目前,利用不同转录因子组合诱导体细胞转分化为神经干细胞的间接谱系方法也日渐完善。但是现有的间接谱系转分化方法涉及到外源转录因子的介入,有可能发生基因插入错误导致突变,也有可能出现畸胎瘤的风险,具有一定的临床安全隐患。而且转分化时间也相对较长,无法及时应用于临床。
因此,本领域迫切需要开发一种不需要外源转录因子介入的诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法,解决安全性和定向分化效率低下的问题,同时作为一个新的移植神经细胞来源,具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种利用重编程技术制备哺乳动物和人神经干细胞的方法。
本发明第一方面,提供了一种microRNA组合物,所述的microRNA组合物,包括mir-302、丙戊酸(VPA)、polybrene和维生素C(VC),其中microRNA所含载体为慢病毒、腺病毒、质粒等的药学上可接受的载体,以及mimics。
本发明第二方面,提供了一种microRNA组合物,所述的microRNA组合物以mir-302为主的,其它任意一个、两个或三个组分组合构成,如
(a) mir-302 ;
(b) mir-302和VPA ;
(c) mir-302、VPA和polybrene;
(d)mir-302、VPA、polybrene和VC;但不仅限于上述四种。
本发明第三方面,提供了第一或第二方面所述的组合物的用途,用于在玻璃基底培养板上诱导体细胞转分化为神经干细胞。
在另一优选例中,所述的体细胞包括人成纤维细胞、上皮细胞、血细胞和脂肪来源的细胞等。
在另一优选例中,所述的体细胞来源于哺乳动物,较佳的为人、啮齿动物 ( 小鼠、大鼠 )、猪、猴等。
在另一优选例中,所述的成纤维细胞包括小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠尾尖成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞。
在另一优选例中,所述的上皮细胞可分离自人口腔。
在另一优选例中,所述的血细胞分离自人和鼠的血液。
本发明第四方面,提供了一种体外诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法,在玻璃基板的培养板或皿以及本发明第一或第二方面所述的microRNA组合物存在的培养条件下,培养体细胞。
在另一优选例中,所述的培养条件还包括神经干细胞培养基。
在另一优选例中,所述的神经干细胞培养基含有表皮生长因子 EGF、碱性成纤维细胞生长因子 bFGF、肝素、或其组合。
在另一优选例中,所述的诱导条件还包括使用丙戊酸钠 (VPA)和polybrene。
在另一优选例中,所述的玻璃基板上包被有胶原、明胶或层粘连蛋白或其组合。
上述方法中,所述承载microRNA的载体为慢病毒、腺病毒和质粒载体或microRNA的mimics。
上述方法中,所述表达 mir-302的慢病毒载体或mimics,在组合物一起作用下,将mir- 302导入哺乳动物体细胞中。
上述方法中,所述用microRNA诱导培养所述转分化细胞包括如下步骤 :
1)将所述体细胞接种在包被有包被有胶原、明胶或层粘连蛋白或其组合的玻璃基质培 养板上,在哺乳动物体细胞培养基中培养 ;
2)将所述哺乳动物体细胞培养基中加入所述microRNA组合物进行基因转染;
3)将所述含有EGF、FGF的神经干细胞培养基加入到上述哺乳动物培养基中,培养至得 到克隆样细胞 ;
4)将所述克隆样细胞在神经干细胞培养基中继续培养,得到哺乳动物神经干细胞。
上述方法中,步骤 1)中,所述培养为连续培养,所述培养的时间为 1-2 天。
步骤 2)中,所述培养的时间为 1 天。
步骤 3)中,所述继续培养的时间为 2天。
步骤 4)中,所述继续培养的时间为 2-3 天。
在另一优选例中,用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物组合物。
在另一优选例中,所述的神经系统疾病包括神经退行性病变、由于基因突变引起的神经系统疾病,以及因脑外伤或脑溢血等导致的神经系统病变。
在另一优选例中,所述的神经系统疾病包括阿尔兹海默病、帕金森症、或亨廷顿舞蹈症。
本发明的另一个目的是提供上述方法制备的神经干细胞。
在另一优选例中,所述的组合物包括药物组合物。
本发明的实验证明,本发明利用慢病毒载体将mir-302转染到体细胞,利用包被胶原等的玻璃基质培养板进行培养,将体细胞转分化形成神经干细胞,进一步可分化形成有生理活性的神经元和神经胶质细胞,为神经系统的发育与疾病基础研究和临床应用提供了广阔的前景。
本发明所含技术将在转化医学和临床应用等方面产生重要的意义。本发明可结合疾病模型,建立筛选神经系统疾病药物的药物筛选平台和相关神经系统疾病基础研究平台。同时可在将来用于神经系统疾病和神经系统损伤导致的疾病细胞治疗的一个重要细胞来源。
附图说明
图1 本发明的总体技术方案
图2 诱导的神经干细胞的表面标志鉴定
图3 诱导的神经干细胞的相关分子标志物鉴定
图4诱导的神经干细胞分化形成的神经元和神经胶质细胞标志物
图5 诱导的神经干细胞小鼠脑内移植存活和神经整合能力鉴定
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明,均为 37 摄氏度,5%CO2。
下述实施例中的细胞培养基配方如下 :
人包皮成纤维细胞培养基配方 :
DMEM (HyClone,SH30022.01)
1%青链霉素混合液 (Solarbio,P1400)
10% 胎牛血清 (gibco,10099-141)
神经干细胞诱导培养基:
DMEM/F12(HyClone,SH30023.01)
Neurobasal Medium (gibco,21103-049)
2% B27添加剂 (gibco,17504-044)
20ng/ml bFGF(Thermo,13256-029)
10ng/ml EGF(Thermo,236-EG-01m)
L-谷氨酰胺(国药集团,62010834)
D0xycycline(HMK,D045301)
1% 青链霉素混合液 (Solarbio,P1400)
神经干细胞培养基配方 :
DMEM/F12(HyClone,SH30023.01)
Neurobasal Medium (gibco,21103-049)
1% 青链霉素混合液 (Solarbio,P1400)
1%N-2 添加剂 (gibco,17502-048)
2% B27添加剂 (gibco,17504-044)
神经元分化培养基 :
DMEM/F12(HyClone,SH30023.01)
Neurobasal Medium (gibco,21103-049)
1%青链霉素混合液 (Solarbio,P1400)
0.5%N-2 添加剂 (gibco,17502-048)
1% B27添加剂 (gibco,17504-044)
100uM cAMP(Solarbio,C8860)
20ng/ml bFGF(Thermo,13256-029)
星形胶质细胞培养液:
DMEM/F12(HyClone,SH30023.01)
10% 胎牛血清 (gibco,10099-141)
1%青链霉素混合液 (Solarbio,P1400)
microRNA序列
Gene 名称及ID: LV3-has-mir-302a
序列(5’ to 3’): TAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGA
下述实施例中的抗体 :
抗人 OCT-4 抗体 (bs-0830R),Bioss
抗人 NANOG 抗体 (BM1944),BOSTER
抗人 NESTIN 抗体 (BA1289),BOSTER
抗人 β-Tubulin III/Tuj1 抗体 (ZM-0439),中山金桥
抗人 PAX6 抗体 (bs-11204R),Bioss
抗人 GFAP 抗体 (ZA-0117),中山金桥
抗人OLIG2抗体(ZA-0561),中山金桥
抗人NeuN抗体(ZM-0352),中山金桥
抗人Tubulinβ抗体(ZM-0439),中山金桥
抗人GFAP抗体(ZA-0117), 中山金桥
抗人MBP抗体(BA0094),BOSTER
抗人MAP2抗体(BM1243), BOSTER
抗人Synapsin 1抗体(BA1421-2), BOSTER
抗人VIM抗体(PB0378),BOSTER
抗鼠CY3抗体(BA1031), BOSTER
抗兔Dylight549抗体(A23320),Abbkine
抗兔Dylight649抗体(A23620),Abbkine
下述实施例中的慢病毒载体构建 :
重组穿梭质粒和包装质粒 pGag/Pol、 pRev、 pVSV-G 由上海吉玛构建制备。病毒包装 过程是制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其三种辅助包装原件载体质粒,三种质粒 载体分别进行高纯度无内毒素抽提,用本公司的转染试剂 RNAi-Mate 进行 共转染293T 细胞,转染后 6 h 更换为完全培养基,培养 72 h 后,收集富含慢病 毒颗粒的细胞上清液, 对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在 293T 细胞中 测定并标定病毒滴度(滴度 5x108TU/ml (注:此病毒侵染时间均为72h。))。
下述实施例中间接免疫荧光染色的方法如下:
细胞用PBS洗2遍,4%多聚甲醛室温固定15 min;PBS洗3次,每次5 min;0.3%Triton-100避 光打孔10 min;PBS洗3次,每次5min;山羊血清封闭液37℃,30 min;一抗孵育(一抗稀释液稀 释,一抗稀释液为用3% BSA和0.02% Triton-100以及10%血清封闭液的PBS液)4℃ 过夜(注意 保湿);PBS洗3次,每次5 min;二抗孵育室温1h;PBS洗3次,每次5min;hochest33342(1:500) 染核,室温5 min;PBS洗2遍,最后封片镜检。
下述实施例中 qPCR 检测方法如下 :提取待测细胞 RNA,并将其反转录为 cDNA,再用对应分子标志物的扩增引物进行扩增,同时以 GAPDH 为内参。
下述实施例中电生理检测方法参照《实用膜片钳技术》,刘振伟,军事医科出版社,2006
实施例 1、利用重编程由人成体包皮成纤维细胞获得人神经干细胞
一、皮肤成纤维细胞的分离培养:
制备方法参照Ding 等的方法。无菌取包皮环割术遗弃的包皮,置于盛有PBS液的培养 皿内,洗2次除去血迹。取出再置于盛有PBS液培养皿内。将其剪成lmm3的碎块,转移到离心 管中,加入0.25%胰蛋白酶,置于4°C冰箱过夜消化。第二天取出加入含胎牛血清的培养基 终止消化离心收集细胞,加入DMEF生长培养基(高糖DMEM,体积分数10%胎牛血清,2mmol/L 谷氨酰胺)制成单细胞悬液,以4×104个/cm2的密度接种至培养瓶中,放入37°C ,体积分数 5% C02温箱内孵育。每天或隔天换液,细胞长满后即传代或冻存,冻存按常规方法进行。接 种前24,将玻璃片包被0.1%胶原12 h,将细胞置于玻璃片放置在底部的六孔板中进行过夜培 养。在细胞达到融合度60%左右,更换成纤维细胞培养液,进行病毒转染。
二、神经干细胞的重编程诱导制备:
将外源mir-302的cDNA序列分别克隆到慢病毒载体上。得到重组载体,再将重组载体进 行测序,测序无误的克隆进行质粒抽提。然后将重组载体转入293T细胞进行病毒包装,并利 用超滤/超速离心进行病毒浓缩。感染293T细胞,利用倍比稀释法进行病毒滴度测试。
利用GFP病毒转染皮肤成纤维细胞,转染效率高达86.7%。
三、 神经干细胞的获得
每20000个细胞,加入病毒液4微升,同时加入6微升polybrene(终浓度为6 μg/ml)。同 时添加VPA 10微升。感染72小时,中间24小时后加入VC 50 ng/ml。48小时后,补加神经干细胞诱导液500微升。诱导液中添加有bFGF(20 ng/ml)和EGF(10 ng/ml)。mir-iNSC会在感染 的第二天出现少量克隆,第三天会出现大量克隆。第三天撤去含有病毒的培养液,转入低粘附板培养,每两天换液,2-3周内可获得大量的mir-iNSC细胞。
四、检测
1)克隆样细胞的验证
为了验证产生的克隆样细胞的细胞特性,本发明进一步鉴定了其细胞标志物表达。
将克隆样细胞进行间接免疫荧光染色,结果如图 2 所示,2天获得的克隆样细胞表达胚胎干细胞标志物 OCT3/4 蛋白 ( 图 2A).在3天获得的克隆样细胞弱表达OCT3/4和 SSEA 蛋白(图2B),强表达神经干细胞标志物 Nestin 蛋白。
2)神经干细胞鉴定
(1)细胞标志物鉴定
将上述 1 得到的神经干细胞进行间接免疫荧光染色,结果如图 2C 所示,发现其能够 表达神经干细胞的另一种标志物 Pax6,同时表达SOX2标志物。
将上述 1 得到神经干细胞进行 qPCR,结果如图 2D所示,与人包皮成纤维细胞相比,克隆样细胞中的神经干细胞的分子标志物 Nestin、Pax6 以及 Sox2 的基因表达均显著升高,说明其具有神经干细胞的特性,即为人神经干细胞。
(2)诱导的人神经干细胞具有体内存活和神经整合能力
为了鉴定本发明制备的人神经干细胞是否具有体内存活和整合的能力,进行如下实验:
将表达 GFP 的慢病毒载体标记人神经干细胞,然后将其定向移植进入小鼠(C57,购自 北京维通利华实验动物技术有限公司)大脑的海马区域,移植 2 周后分离小鼠大脑,并实 施冰冻切片术观察移植部位。
用间接免疫荧光染色方法检测,结果如图 4 所示,脑内移植神经干细胞 3周后,在小鼠大脑的海马齿状回区域,仍有大量表达绿色荧光蛋白的细胞存活,并且已表现出明显的神经细胞分化状态,同时其神经突起也表现出向周边脑区伸展的形态,说明本发明制备的人诱导神经干细胞具有良好的体内存活和神经整合能力。
实施例 2、利用重编程由鼠胚胎成纤维细胞获得神经干细胞
一、原代MEF的分离和培养:
制备方法参照McElroy SL等[12]的方法。
取怀孕13.5d的孕鼠,颈椎脱臼法处死,浸入75%酒精中消毒;取出整个子宫,置于盛有PBS液的培养皿内,清洗3次除去血迹,转移入新的培养皿中,取出胎鼠,放在新的培养皿中清洗3次;释放胚胎,依次去除胚胎头、尾、四肢和内脏,清洗3次后将剩余躯干部置于新的培养皿内,用无菌剪将组织充分剪碎;加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA轻轻吹打均匀,放于37°C二氧化碳培养箱中孵育10-20 min,每隔5min拿出轻轻摇晃,使其充分消化;加入含 胎牛血清的培养基终止消化;1200rpm,离心5 min,弃去上清液,加入MEF生长培养基制成单 细胞悬液,以4×104个/cm2的密度种至培养瓶中,放入37°C ,体积分数5%的饱和湿度C02 培养箱内培养。每天或隔天换液,细胞长满后即传代或冻存,冻存按常规方法进行。接种前 24 h,将玻璃片包被0.1%胶原12h,将细胞置于玻璃片放置在底部的六孔板中进行过夜培养。 在细胞达到融合度60%左右,更换成纤维细胞培养液,进行病毒转染。
二、神经干细胞的重编程诱导制备:
将外源mir-302的cDNA序列分别克隆到慢病毒载体上。得到重组载体,再将重组载体进 行测序,测序无误的克隆进行质粒抽提。然后将重组载体转入293T细胞进行病毒包装,并利用超滤/超速离心进行病毒浓缩。感染293T细胞,利用倍比稀释法进行病毒滴度测试。
利用GFP病毒转染人成纤维细胞,转染效率高达86.7%以上。
三、 神经干细胞的获得
每10000个细胞,加入病毒液4微升,同时加入6微升polybrene(终浓度为6 μg/ml)和 VPA 10微升(终浓度)。感染72小时,中间24小时后加入VC 50 ng/ml。48小时后,补加神经干 细胞诱导液500微升。诱导液中添加有bFGF(20 ng/ml)和EGF(10ng/ml)。mir-iNSC会在感染 的第二天出现少量克隆,第三天会出现大量克隆。第三天撤去含有病毒的培养液,转入低粘 附板培养,每两天换液,2-3周内可获得大量的mir-iNSC细胞。
四、检测
1)克隆样细胞的验证
为了验证产生的克隆样细胞的细胞特性,本发明进一步鉴定了其细胞标志物表达。
将克隆样细胞进行间接免疫荧光染色,结果如图 2 所示,2天获得的克隆样细胞表达胚胎干细胞标志物 OCT3/4 蛋白,.在3天获得的克隆样细胞弱表达OCT3/4 和 SSEA蛋白,强表达神经干细胞标志物 Nestin 蛋白。
2)神经干细胞鉴定
(1)细胞标志物鉴定
将上述 1 得到的神经干细胞进行间接免疫荧光染色,结果如图 2C 所示,发现其能够 表达神经干细胞的另一种标志物 Pax6,同时表达SOX2标志物。
将上述 1 得到神经干细胞进行 qPCR,结果如图 2D所示,与成纤维细胞相比,克隆样细胞中的神经干细胞的分子标志物 Nestin、Pax6 以及 Sox2 的基因表达均显著升高,说明其具有神经干细胞的特性,即为神经干细胞。
(2)诱导的神经干细胞具有体内存活和神经整合能力
为了鉴定本发明制备的神经干细胞是否具有体内存活和整合的能力,进行如下实验 :
将表达 GFP 的慢病毒载体标记神经干细胞,然后将其定向移植进入小鼠(C57,购自北 京维通利华实验动物技术有限公司)大脑的海马区域,移植 2 周后分离小鼠大脑,并实施 冰冻切片术观察移植部位。
用间接免疫荧光染色方法检测,结果如图 4 所示,脑内移植神经干细胞 3 周后,在小鼠大脑的海马齿状回区域,仍有大量表达绿色荧光蛋白的细胞存活,并且已表现出明显的神经细胞分化状态,同时其神经突起也表现出向周边脑区伸展的形态,说明本发明制备的诱导神经干细胞具有良好的体内存活和神经整合能力。

Claims (4)

1.一种制备神经干细胞的方法,包括如下步骤:
将外源mir-302的cDNA序列克隆到慢病毒载体上,得到重组载体,再将重组载体进行测序,测序无误的克隆进行质粒抽提,然后将重组载体转入293T细胞进行病毒包装,并利用超滤或超速离心进行病毒浓缩,感染293T细胞,利用倍比稀释法进行病毒滴度测试;每20000个人成体包皮成纤维细胞,加入病毒液4微升,同时加入6微升polybrene,使polybrene终浓度为6μg/ml,同时添加VPA 10微升,使VPA的终浓度为0.5mMol/L,感染72小时,中间第24小时后加入VC 50ng/ml,中间第48小时后,补加神经干细胞诱导液500微升,所述诱导液中添加有20 ng/ml bFGF和10 ng/ml EGF,感染结束后撤去含有病毒的培养液,转入低粘附板培养,每两天换液,2-3周内获得神经干细胞。
2.一种制备神经干细胞的方法,包括如下步骤:
将外源mir-302的cDNA序列克隆到慢病毒载体上,得到重组载体,再将重组载体进行测序,测序无误的克隆进行质粒抽提,然后将重组载体转入293T细胞进行病毒包装,并利用超滤或超速离心进行病毒浓缩,感染293T细胞,利用倍比稀释法进行病毒滴度测试;每10000个鼠胚胎成纤维细胞,加入病毒液4微升,同时加入6微升polybrene,使polybrene的终浓度为6μg/ml,同时添加VPA 10微升,使VPA的终浓度为0.5mMol/L,感染72小时,中间第24小时后加入VC 50 ng/ml,中间第48小时后,补加神经干细胞诱导液500微升,所述诱导液中添加有20 ng/ml bFGF和10 ng/ml EGF,感染结束后撤去含有病毒的培养液,转入低粘附板培养,每两天换液,2-3周内获得神经干细胞。
3.一种神经干细胞,其特征在于所述的神经干细胞是由权利要求1或2所述的方法制备的。
4.权利要求3所述神经干细胞的用途,其特征在于用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物组合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110090207A (zh) * 2019-06-11 2019-08-06 苏州大学 丙戊酸钠在制备抑制胶质瘢痕形成的药物中的应用及其药物组合物
CN112608904B (zh) * 2020-12-30 2023-02-07 滨州医学院 一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2202309A1 (en) * 2008-12-08 2010-06-30 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
CN102625837A (zh) * 2009-08-07 2012-08-01 国立大学法人京都大学 有效建立诱导的多能干细胞的方法
CN102782122A (zh) * 2010-02-16 2012-11-14 国立大学法人京都大学 有效建立经诱导的多能干细胞的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8716017B2 (en) * 2010-12-06 2014-05-06 San Diego Regenerative Medicine Institute Technologies, methods, and products of small molecule directed tissue and organ regeneration from human pluripotent stem cells
WO2014148646A1 (ja) * 2013-03-21 2014-09-25 国立大学法人京都大学 神経分化誘導用の多能性幹細胞

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2202309A1 (en) * 2008-12-08 2010-06-30 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
CN102625837A (zh) * 2009-08-07 2012-08-01 国立大学法人京都大学 有效建立诱导的多能干细胞的方法
CN102782122A (zh) * 2010-02-16 2012-11-14 国立大学法人京都大学 有效建立经诱导的多能干细胞的方法

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