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CN113382716A - 通过将药物物质和药物产品过程整体化的生物制剂制造的连续制造过程 - Google Patents

通过将药物物质和药物产品过程整体化的生物制剂制造的连续制造过程 Download PDF

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CN113382716A CN202080011002.4A CN202080011002A CN113382716A CN 113382716 A CN113382716 A CN 113382716A CN 202080011002 A CN202080011002 A CN 202080011002A CN 113382716 A CN113382716 A CN 113382716A
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Abstract

本发明提供了一种生物制剂制造过程，所述过程将药物物质和药物产品过程连接成一个整体化、连续的过程。

Description

通过将药物物质和药物产品过程整体化的生物制剂制造的连 续制造过程
本申请要求2019年1月28日提交的美国临时申请号62/797,445的权益，将其通过引用特此并入。
技术领域
一种生物制剂制造过程，所述过程将药物物质(drug substance)和药物产品(drug product)过程连接成一个整体化、连续的过程。
背景技术
从药物物质(drug substance)到药物产品(drug product)的填充/精加工通常是两部分的过程，一般在通过冷冻/解冻步骤将药物物质转化为药物产品时分开。纯化的生物制药目的蛋白向药物物质(DS)并且然后向药物产品(DP)的转化通常涉及通过超滤和渗滤(UFDF)单元操作，在合适的配制品缓冲液中将目的蛋白浓缩至所需水平。在UFDF之后，通过一个或多个降低生物负载的过滤器处理浓缩的、配制的蛋白，通常进入贮存容器中。将一种或多种另外的赋形剂(通常是增强蛋白稳定性的赋形剂)添加到浓缩的、配制的蛋白中，成为药物物质，再通过一种或多种降低生物负载的过滤器在无菌容器中处理所述药物物质。通常在此时对所述药物物质进行采样，以根据释放规格测试某些药物物质属性。然后将所述药物物质冷冻以储存或易于转移到另一个制造设施。当需要时，将药物物质材料解冻、集中到配制品容器中，通过一个或多个降低生物负载的过滤器进行混合和处理，得到过滤的原料药物产品(bulk drug product)。然后将过滤的原料药物产品进行无菌过滤，并转移到无菌设施中进行填充/精加工操作。在此填充/精加工步骤中，重复进行另一轮属性和/或释放测定，以针对释放规格评估属性，并确认在经过药物产品制备过程后药物产品的质量/特征未发生变化，所述过程中的一些是药物物质已完成的属性测试所共有的。
此过程涉及重复的工作，从而导致制造成本和材料浪费的增加；与连续制造平台不兼容的多个贮存/储存步骤；多余的过滤步骤以及冷冻和解冻单元操作，所有这些都有可能导致药物物质损失和/或不稳定。因此，需要一种更具成本效益的、连续的、整体化转化将纯化的生物制药目的蛋白转化为药物物质并且然后转化为药物产品，这允许减少所需和所使用的设备和材料的尺寸和数量；这样做的益处是减少了制造设施的空间占用(footprint)，或允许使用制造吊舱(pod)或其他紧凑系统，减少建立和操作制造设施的时间和成本以及属性测试的合并。本文描述的发明通过提供用于生物制剂制造的完全整体化的、连续的制造过程来满足此需求，所述制造过程通过消除和/或组合从UFDF到药物产品填充/精加工的过程步骤将药物物质和药物产品过程整体化。
发明内容
本发明提供了一种用于生产重组生物治疗剂的整体化、连续的方法，所述方法包括提供纯化的重组目的蛋白；通过超滤来浓缩或稀释所述纯化的重组蛋白；通过渗滤对所述纯化的重组蛋白进行缓冲液交换至所需配制品；通过超滤进一步稀释或浓缩配制的重组蛋白，直到达到目标浓度；一旦达到所述目标浓度，就添加或组合至少一种增强稳定性的赋形剂；对所得的原料药物物质(bulk drug substance)进行过滤以减少生物负载；对所得的原料药物产品进行无菌过滤；以及对无菌的原料药物产品进行填充和精加工操作；其中所述纯化的重组蛋白和所述原料药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。在一个实施例中，将所述增强稳定性的赋形剂同时添加(added in-line)到所述配制的重组蛋白中。在一个实施例中，将所述增强稳定性的赋形剂直接添加到超滤和渗滤(UFDF)滞留物加料槽中。在相关的实施例中，一旦达到所述目标浓度，就将所述增强稳定性的赋形剂直接同时添加到所述UFDF滞留物加料槽中。在另一个实施例中，所述增强稳定性的赋形剂是非离子型洗涤剂或表面活性剂。在一个实施例中，所述增强稳定性的赋形剂是基于聚氧乙烯(PEO)的表面活性剂。在一个实施例中，所述增强稳定性的赋形剂选自聚山梨酯80和聚山梨酯20。在一个实施例中，至少一种增强稳定性的赋形剂的浓度为从0.001％至0.1％(重量/体积)。在一个实施例中，将所述原料药物产品收集在储存容器中。在一个实施例中，将所述原料药物产品递送到无菌处理设施。在相关的实施例中，所述无菌处理设施包括至少一个填充站。在另一个相关的实施例中，所述无菌处理设施包括至少一个不戴手套的无菌隔离器。在另一个实施例中，将所述原料药物产品收集在储存容器中，并直接递送到所述无菌处理设施。在相关的实施例中，将所述储存容器连接到所述无菌处理设施。在另一个相关的实施例中，将含有所述原料药物产品的储存袋、或处理所述原料药物产品的过滤器的输出连接到不戴手套的无菌隔离器。在另一个相关的实施例中，所述无菌处理设施具有与含有所述原料药物产品的储存容器、或处理所述原料药物产品的过滤器单元的输出的连接。在一个实施例中，用无菌的原料药物产品填充初级药物产品容器。在相关的实施例中，将所述初级药物产品容器密封、贴标签和包装。在一个实施例中，在一个或多个步骤之间存在连续流。在一个实施例中，将来自UFDF和/或减少生物负载过滤的池收集到储存容器中。在一个实施例中，将所述配制的重组蛋白稀释，直到达到目标浓度。在一个实施例中，将所述配制的重组蛋白通过超滤浓缩，直到达到目标浓度。在一个实施例中，使用稳定的纤维素基亲水性膜进行所述超滤，所述膜负载高达72g/m2膜面积。在一个实施例中，在目标浓度小于或等于3.20mg/ml下，使用稳定的基于亲水性膜进行所述超滤。在一个实施例中，使用稳定的纤维素基亲水性膜进行所述超滤，所述膜的目标过量浓度(overconcentration)为初始浓度的1.1x至2.5x。在一个实施例中，使用再生纤维素、碱稳定的膜进行所述超滤和渗滤，所述膜负载高达170g/m2膜面积。在一个实施例1中，使用再生纤维素、碱稳定的膜进行所述超滤和渗滤，所述膜的中间目标过量浓度小于或等于9g/L、具有高达13个渗滤体积(diavolume)。在一个实施例中，本文描述的方法进一步包括至少一个病毒过滤操作。在一个实施例中，在所述UFDF操作之后进行至少一个病毒过滤操作。在相关的实施例中，在将所述增强稳定性的赋形剂同时添加到所述配制的重组蛋白中或在将所述增强稳定性的赋形剂增强稳定性的赋形剂添加到UFDF滞留物槽中后，进行至少一个病毒过滤操作。在一个实施例中，对具有5g/L或更小的配制品浓度的双特异性T细胞衔接子进行所述病毒过滤操作。在一个实施例中，病毒过滤器选自亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纤维过滤器、铜铵再生纤维素中空纤维过滤器、或聚醚砜(PES)细小病毒滞留过滤器。在另一个相关的实施例中，至少一个病毒过滤操作还包括预过滤器。在另一个相关的实施例中，所述预过滤器是深层过滤器(depth filter)。在一个实施例中，在无菌过滤之前，添加一种或多种另外的纯化的重组目的蛋白或药物物质。在一个实施例中，所述纯化的目的蛋白是抗原结合蛋白。在一个实施例中，所述抗原结合蛋白是多特异性蛋白。在一个实施例中，所述多特异性蛋白是双特异性抗体。在一个实施例中，所述双特异性蛋白是双特异性T细胞衔接子。在一个实施例中，所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。在相关的实施例中，所述双特异性T细胞衔接子的一个结合结构域对选自EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、CD19、CD33、CD38、FLT3、CDH3、BCMA、PSMA、MUC17、CLDN18.2、或CD70的靶细胞上的肿瘤相关表面抗原具有特异性。在相关的实施例中，所述双特异性T细胞衔接子选自博纳吐单抗(blinatumomab)、帕妥昔珠单抗(pasotuxizumab)、AMG103、AMG330、AMG212、AMG160、AMG420、AMG-110、AMG562、AMG596、AMG427、AMG673、AMG675、或AMG701。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含来自本文描述的方法的药物产品。
本发明还提供了一种用于生产重组蛋白药物产品的方法，所述方法包括将表达目的蛋白的细胞扩增到N-1期；用所扩增的细胞接种和/或加料生物反应器，并培养所述细胞以表达重组目的蛋白；通过收获单元操作回收所述重组蛋白；通过至少一个捕获色谱单元操作纯化所述收获的重组蛋白；通过至少一个精制色谱单元操作纯化所述重组蛋白；对所述纯化的重组蛋白进行超滤和渗滤单元操作，所述超滤和渗滤单元操作包括通过超滤来浓缩或稀释所述纯化的重组蛋白；通过渗滤对所述纯化的重组蛋白进行缓冲液交换至所需配制品；通过超滤进一步稀释或浓缩配制的纯化的重组蛋白，直到达到目标浓度，将一种或多种增强稳定性的赋形剂直接添加到含有所述配制的纯化的重组蛋白的UFDF滞留物加料槽中，得到配制的药物物质；对所述配制的药物物质进行单一单元操作以降低生物负载，得到过滤的原料药物产品；无菌过滤所述原料药物产品；用无菌的原料药物产品填充初级药物产品容器；以及对所述初级药物产品容器进行密封、贴标签和包装；其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文描述的方法的重组蛋白药物产品。
本发明还提供了一种用于减少药物产品生产过程的制造空间占用的方法，所述方法包括对纯化的重组目的蛋白进行超滤和渗滤(UFDF)单元操作直至达到目标浓度；将至少一种增强稳定性的赋形剂直接添加到所述UFDF滞留物加料槽中；对所述原料药物物质进行单一单元操作以降低生物负载，然后进行无菌过滤；对无菌的原料药物产品进行填充和精加工单元操作；其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。在一个实施例中，将含有所述原料药物产品的储存容器连接到无菌处理设施。在一个实施例中，无菌处理设施具有与含有所述原料药物产品的储存容器、或处理所述原料药物产品的过滤器的输出的连接。在一个实施例中，在一个或多个步骤之间存在连续流。在一个实施例中，在所述UFDF单元操作之后进行至少一个病毒过滤单元操作。
本发明还提供了一种用于在重组治疗蛋白制造期间减少药物物质损失和/或不稳定的方法，所述方法包括对纯化的重组目的蛋白进行UFDF单元操作；一旦达到目标浓度，就将至少一种增强稳定性的赋形剂添加到UFDF滞留物加料槽中；对UFDF池进行单一过滤以降低生物负载，得到原料药物物质；其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。
本发明还提供了一种用于减少包含重组双特异性T细胞衔接子的组合物中病毒污染物的方法，所述方法包括提供样品，所述样品包含小于7.0g/L的重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH小于或等于6.0、具有23-45mS/cm的电导率；对所述样品进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括单独的病毒过滤器、或与深层过滤器或表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器；以及在池中或作为流收集包含所述重组双特异性T细胞衔接子的病毒过滤器洗脱液。在一个实施例中，所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。在一个实施例中，所述样品包含色谱柱池或流出物流。在一个实施例中，池或流的pH是4.2-6。
本发明还提供了根据本文描述的方法生产的纯化的、重组半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
本发明还提供了一种用于在制造重组双特异性T细胞衔接子期间减少高分子量种类的方法，所述方法包括提供样品，所述样品包含小于7g/L重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH小于或等于6.0、具有23-45mS/cm的电导率；对所述样品进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括与深层过滤器组合的病毒过滤器；以及在池中或作为流收集所述病毒过滤器洗脱液；其中与使用包括单独的病毒过滤器、或与表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器的病毒过滤单元操作相比，过滤器洗脱液池中高分子量种类的百分比降低。在一个实施例中，所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
本发明还提供了一种用于在制造重组双特异性T细胞衔接子期间在病毒过滤单元操作中减少通量衰减和降低高分子量种类的方法，所述方法包括提供样品，所述样品包含小于或等于1.75g/L的重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH为4.2-6.0，电导率为23-45mS/cm；对所述纯化的重组双特异性T细胞衔接子进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括与深层过滤器组合的病毒过滤器；以及在池中或作为流收集所述过滤器洗脱液；其中与包括单独的病毒过滤器、或与表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器的病毒过滤单元操作相比，过滤器洗脱液池或流中高分子量种类的百分比降低。在一个实施例中，所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
本发明还提供了一种用于生产纯化的、配制的重组双特异性T细胞衔接子的方法，所述方法包括；通过一种或多种色谱单元操作纯化收获的重组双特异性T细胞衔接子；对所述纯化的重组双特异性T细胞衔接子进行超滤和渗滤单元操作，得到浓度≤5g/L的配制的双特异性T细胞衔接子，并且对所述配制的双特异性T细胞衔接子进行病毒过滤单元操作；获得纯化的、配制的重组双特异性T细胞衔接子。在一个实施例中，所述配制的双特异性T细胞衔接子的浓度为≤3.2g/L。在一个实施例中，所述配制的双特异性T细胞衔接子的浓度为≤1.79g/L。在一个实施例中，所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。在一个实施例中，用稳定的纤维素基亲水性膜或再生纤维素膜进行超滤渗滤单元操作。在一个实施例中，用稳定的纤维素基亲水性膜进行所述超滤渗滤单元操作，所述膜在初始超滤目标浓度高达3.20g/L下负载高达71.4g/m2膜面积。在一个实施例中，用再生纤维素膜进行所述超滤渗滤单元操作，所述膜负载高达170g/m2膜面积、具有高达9g/L的中间目标过量浓度、具有高达13个渗滤体积。在一个实施例中，用亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纤维过滤器、铜铵再生纤维素中空纤维过滤器、或聚醚砜(PES)细小病毒滞留过滤器进行所述病毒过滤单元操作。在一个实施例中，使用铜铵再生纤维素中空纤维过滤器和浓度≤3.2g/L的配制的双特异性T细胞衔接子进行所述病毒过滤单元操作。在一个实施例中，所述配制的双特异性T细胞衔接子的浓度为≤1.79g/L。在一个实施例中，使用亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纤维过滤器和浓度≤1.79g/L的配制的双特异性T细胞衔接子进行所述病毒过滤单元操作。
附图说明
图1：(A)显示了从DS过程中的UFDF操作到DP填充的典型常规处理步骤。常规过程可分为十个步骤或阶段。如(B)所示，本文描述的发明将步骤或阶段的数量减少到五个。
图2：与回收％最小值相比，进行多运行中心点运行1至3后的NWP恢复％。黑色条是多运行中心点运行。灰色斑点柱是回收％最小值。
图3：在配制品缓冲液基质-铜铵再生纤维素过滤器中运行的通量衰减与载量，pH4.2-高浓度[空心黑色圆]、pH 4.2-高容量[黑色空心三角形]、pH 4.2-延长贮存(Extendedhold)[黑色空心方形]、pH 4.2-中心点[灰色实心圆]、pH 4.2-PVDF过滤器[黑色实心圆]、和pH 5.0-低浓度[图案填充菱形]
图4：产品质量数据铜铵再生纤维素过滤器，pH 4.2中心点[黑色条]、pH 4.2高浓度[灰色条]、pH 4.2延长贮存[白色无填充条]、pH 4.2高容量[实心菱形网格条]、pH4.2PVDF过滤器[有圆图案的条]、pH 5.0低浓度[方形网格条]。A：HMW％；B：片段％；C：碱性D％酸性。
图5：0.001-m2 20N过滤铜铵再生纤维素过滤器的通量与负载挑战，1.77g/L的产品[空心黑色三角形]、3.15g/L[灰色实心菱形]、和6.82g/L[空心黑色圆]、[实心黑色方形]。所有负载材料以19PSI过滤。
图6：色谱缓冲液基质运行中分子A的产品质量数据-1.77g/L、pH 5、23高压[黑色条]，3.2g/L、pH 5、23[灰色条]，1.77g/L、pH 5、28[白色无填充条]，1.77g/L、pH 5、23低压[有虚线圆的条]，6.82g/L、pH 5.3、28[方形网格条]，6.82g/L、pH 4.5、28[浅灰色条]，1.77g/L、pH 5、23中压[实心菱形网格条]。
图7：
Figure BDA0003180349690000091
A在中点pH、低浓度、低电导率条件下的水力性能(pH 5.0、23mS/cm、1.75g/L)。单独VPro[实心黑色圆]、VPro+Shield[实心黑色三角形]、VPro+Shield H[空心方形]、VPro+VPF[实心灰色圆]、和VPro+X0SP[空心黑色三角形]。
图8：BiTE
Figure BDA0003180349690000092
在低pH、高和低的浓度以及电导率条件下的水力性能(pH 4.2、23或28mS/cm、1.75或7g/L)。VPro[实心黑色圆]，VPro+X0SP低pH[空心黑色三角形]，VPro+Shield低pH[实心黑色三角形]，VPro+X0SP高浓度、低pH[实心灰色三角形]，VPro+Shield H高浓度、低pH[空心圆]，VPro+Shield高浓度、低pH[黑色空心方形]
图9：BiTE
Figure BDA0003180349690000093
在高pH、低和高的浓度以及电导率条件下的水力性能(pH 6.0、23或28mS/cm、1.8或7g/L)。VPro[实心圆]，VPro+Shield H高pH、低浓度[实心三角形]，VPro+X0SP[灰心实心三角形]高pH、高浓度，VPro+Shield H[空心圆]高pH、高浓度，VPro+Shield[空心方形]高pH、高浓度。
图10：A：分子A的HMW％产品质量数据-1.75g/L，pH 5[黑色条]、pH 4.2[灰色条]和pH 6.0[有图案的条]。
B：分子A的HMW％产品质量数据-7g/L，pH 6[黑色条]和pH 4.2[灰色条]。
C：分子A的Rce(剪切物％)Rce(片段％)产品质量数据-1.75g/L，pH 5[黑色条]、pH4.2[灰色条]和pH 6.0[有图案的条]
D：分子A的Rce(片段％)产品质量数据-7g/L，pH 6.0[黑色条]和pH 4.2[灰色条]
E：分子A的CEX酸性(％)产品质量数据-1.75g/L，pH 5[黑色条]、pH 4.2[灰色条]和pH 6.0[有图案的条]。
F：分子A的CEX碱性(％)产品质量数据-1.75g/L，pH 5[黑色条]、pH 4.2[灰色条]和pH 6.0[有图案的条]。
G：分子A的CEX酸性(％)产品质量数据-7g/L，pH 6[黑色条]和pH 4.2[灰色条]。
H：分子A的CEX碱性(％)产品质量数据-7g/L，pH 6[黑色条]和pH 4.2[灰色条]。
图11：mAb[实心方形]和1)
Figure BDA0003180349690000101
A X0SP/VPro[灰色三角形]、2)
Figure BDA0003180349690000102
A VPF/VPro[空心黑色圆]在中点pH和浓度的水力性能。
图12：mAb[实心方形]和
Figure BDA0003180349690000103
A X0SP/VPro[灰色三角形]在高pH和高浓度的水力性能。
图13：
Figure BDA0003180349690000104
B在pH 5.9、31mS/cm、1.8g/L、单独VPro[实心黑色圆]、VPro+Shield[实心黑色三角形]、VPro+Shield H[空心方形]、和VPro+VPF[实心灰色圆]、和VPro+X0SP[空心黑色三角形]的水力性能。
图14：
Figure BDA0003180349690000105
B在pH 5.9、45mS/cm、1.81g/L、VPro+Shield H[空心黑色方形]、VPro+X0SP[实心灰色三角形]的水力性能。在pH 4.2、31mS/cm、VPro+Shield H[实心黑色方形]、VPro+X0SP[实心黑色三角形]的水力性能。
图15：
Figure BDA0003180349690000106
B产品质量HMW％定位点pH 5.9[黑色条]、低pH 4.2[灰色条]、和高电导率-45mS/cm[有图案的条]。
具体实施方式
本文描述的是用于生物制剂制造的过程，所述过程的优点在于消除或组合了制造药物物质(DS)和药物产品(DP)所需的步骤，从而实现用于生物制剂生产的完全整体化、端到端、连续制造过程。通过药物产品填充/精加工，在UFDF操作之后，此过程仅需要一个降低生物负载的过滤步骤和一个无菌过滤步骤。现在将稳定化赋形剂(如通常在UFDF池的第一次降低生物负载的过滤之后添加的聚山梨酯80(PS80))直接组合到UFDF操作中，从而消除了专门用于赋形剂添加和第二次降低生物负载的过滤的整个单元操作。然后将过滤的原料药物产品转移到填充位置，在此处将其无菌过滤并用于填充初级药物产品容器，然后对所述初级药物产品容器进行密封、贴标签和包装。材料从药物物质制造位置到药物产品处理位置的转移和随后的药物产品填充发生在过程操作范围所支持的贮存时间和贮存温度内。这消除了费时的冷冻和解冻单元操作。
如图1所示，本发明将典型制造过程中的步骤或阶段的数量从十个减少到五个。本文描述的本发明还消除了对来自多个冷冻容器中的药物物质的集中、配制品稀释、赋形剂添加和药物物质解冻之后的类似操作的需要。还消除了对无菌过滤之前的配制品贮存槽(hold tank)的需要。本发明允许使用相同的药物物质收集容器或直接转移，以递送至和/或连接至药物产品填充/精加工位置，并在收集原料药物产品样品以进行释放测定时使用。
本发明还允许消除对配制的蛋白和/或药物物质和药物产品的多余释放采样，并允许对两者共有属性的测定仅进行一次，如在药物产品填充/精加工阶段，在此阶段可以将它们与其他药物产品属性测试组合。
本发明还通过消除多余的单元操作、不必要的收集和/或储存容器、以及冷冻和对冷冻的原料药物物质解冻和储存的需要，降低了与人工和设备相关的成本。本发明支持模块化和灵活的设施设计以及小型设备的使用。上游和下游单元操作能以连续或半连续的方式在较小规模上完成。本发明还使得即时制造(制造活动的更大灵活性)可用于其中产品具有低库存需求或受季节性或其他需求变化影响的情况。本发明由于消除、组合和/或连接各种单元操作、减少所需设备尺寸、消除对单元操作的物理隔离需要、免除设施设计、消除对分开的净化空间(gowning space)和空气处理器(导致病毒过滤前后制造空间)的需要，能够使过程空间占用最小化。本发明提供了将产品从细胞培养物转移到药物物质的连续制造过程，所述过程可以利用无菌的单次使用组分。所述连续制造过程可以是封闭过程。
本发明提供了一种用于生产重组生物治疗剂的整体化、连续的方法，所述方法包括提供纯化的重组目的蛋白；通过超滤来浓缩或稀释所述纯化的重组蛋白；通过渗滤对所述纯化的重组蛋白进行缓冲液交换至所需配制品；通过超滤进一步稀释或浓缩配制的重组蛋白，直到达到目标浓度；一旦达到所述目标浓度，就添加或组合至少一种增强稳定性的赋形剂；对所得的原料药物物质进行过滤以减少生物负载；对所得的原料药物产品进行无菌过滤；以及对无菌的原料药物产品进行填充和精加工操作；其中所述纯化的重组蛋白和所述原料药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。
本发明提供了一种用于生产重组蛋白药物产品的方法，所述方法包括将表达目的蛋白的细胞扩增到N-1期；培养表达重组蛋白的细胞；通过收获单元操作回收所述重组蛋白；通过至少一个捕获色谱单元操作纯化所述收获的重组蛋白；通过至少一个精制色谱单元操作纯化所述重组蛋白；通过超滤来浓缩或稀释所述纯化的重组蛋白；通过渗滤对所述纯化的重组蛋白进行缓冲液交换至所需配制品；通过超滤进一步浓缩或稀释配制的纯化的重组蛋白，直到达到目标浓度，然后添加一种或多种增强稳定性的赋形剂；对配制的药物物质进行单一单元操作以降低生物负载，得到过滤的原料药物产品；无菌过滤所述原料药物产品；用无菌的原料药物产品填充初级药物产品容器；以及对所述初级药物产品容器进行密封、贴标签和包装；其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。
如本文所用，“药物物质”是指纯化的重组蛋白，其旨在为疾病的诊断、治愈、减轻、治疗或预防提供药理活性或其他直接作用或旨在影响人体任何部分的结构或任何功能。通常，药物物质包含来自其中添加一种或多种增强稳定性的赋形剂的UFDF单元操作的(配制蛋白。“纯化的重组蛋白”或“纯化的蛋白”可互换使用，并且是指从会干扰其治疗、诊断、预防或其他用途的不合需要的蛋白、多肽、杂质和/或其他污染物中纯化出来的重组蛋白。
如本文所用，“药物产品”是指可以含有一种或多种药物物质联合一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的最终剂型。“原料药物产品”或“过滤的原料药物产品”可互换使用，并且用于指降低生物负载过滤后的药物物质。
在一个实施例中，本发明提供了通过本文描述的方法制得的药物物质和药物产品。
纯化的重组蛋白通常在转化为药物物质之前要经过UFDF单元操作。通常将超滤分为两部分：初始超滤步骤，其中重组蛋白被部分浓缩或稀释，然后通过使用渗滤的缓冲液交换将重组蛋白与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起配制；以及第二超滤步骤，使配制的重组蛋白达到最终药物产品所需的目标浓度。
对于其中通常需要将重组蛋白浓缩以达到最终药物产品所需的目标浓度的模式，例如对于单克隆抗体，在初始超滤步骤中的浓缩程度取决于药物产品所需的目标值。通常，初始超滤步骤使浓度达到所需最终目标值的约一半。在该第一步骤中的浓缩程度可以根据情况、所需的最终目标剂量、重组蛋白的性质和/或其他因素或大或小。对于第二超滤步骤，目标浓度可以为20mg/ml至40mg/ml或高于药物产品的所需最终浓度，以考虑第二超滤系统中的任何滞留；例如，滞留量越高，设定的浓度越高；滞留量越低，设定的浓度越低或越接近所需药物产品浓度。
对于其中重组蛋白浓度可能高于药物产品的所需最终浓度的高效模式(如双特异性T细胞衔接子)，可以在UFDF单元操作期间将重组蛋白稀释至所需最终浓度。
UFDF过滤器是本领域熟知且常见的，并且可以从许多来源商购获得。有许多可获得的材料类型：再生纤维素Pellicon(马萨诸塞州丹弗斯的密理博西格玛公司(MilliporeSigma，Danvers，MA))、稳定纤维素、
Figure BDA0003180349690000141
Slice、
Figure BDA0003180349690000142
ECO
Figure BDA0003180349690000143
(德国戈廷根的赛多利斯公司(Sartorius，Goettingen，Germany))、聚醚砜(PES)膜、Omega(纽约华盛顿港的颇尔公司(Pall Corporation，Port Washington，NY))。根据净化规模，典型的过滤器尺寸范围从小于0.11m2面积到1.14m2面积及以上。可以使用多个过滤器，达到UFDF系统的贮存器、橇(skids)或物理设置将允许实现生产过程的所需目标或被实现生产过程的所需目标所需要的生产能力。例如，在临床生产情况下，过滤器组合的范围为11.4m2面积或更大，而对于商业生产规模，所述范围可以达到>40m2面积。
双特异性T细胞衔接子
Figure BDA0003180349690000144
是高效的，且在纯化过程期间易于聚集。
Figure BDA0003180349690000145
易于聚集，这会影响在UFDF操作期间的浓度。已经发现，在具有13个渗滤体积、浓度高达170g/m2膜面积下，再生纤维素膜负载半衰期延长的
Figure BDA0003180349690000146
仍在产品特征内。此外，每次循环负载高达71.4g/m2的HLE
Figure BDA0003180349690000147
后，用缓冲液冲洗稳定的纤维素基膜足够干净，并且至少在三个循环中、无论在更高的负载和高初始浓度下都不会影响未来的膜性能。这允许在不使用腐蚀性化学清洗溶液(氢氧化钠)的情况下、在两次循环之间用缓冲液冲洗来实现TFF过滤器的最佳回收利用，并允许更快的处理。
对于双特异性T细胞衔接子，可以将稳定的纤维素基膜负载至初始目标浓度，所述初始目标浓度是目标浓度的2.5x。在一个实施例中，目标过量浓度是1.1x至2.5x。在一个实施例中，目标过量浓度是1.1x至1.5x。在一个实施例中，目标过量浓度是1.5x至2.5x。
通常在进行第二超滤步骤之前，通过渗滤进行缓冲液交换成所需的配制品缓冲液。将包含来自第一超滤浓度的纯化的重组蛋白的缓冲液交换为包含一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的缓冲液，这是药物产品配制品所需的并将作用以实现最终药物产品中的某些所需结果，如在随后的步骤(包括但不限于过滤、填充、冻干、冷冻、包装、储存、运输、递送、解冻和/或施用)期间维持产品质量、稳定性和/或完整性。缓冲液也可以用于调节属性，如最终药物产品的渗透压、电导率和/或蛋白浓度。配制品的组分可以提供对药物产品的保护，并且可能需要增强和/或减少药物产品的特定属性，如针对降解途径进行保护；促进水溶性；降低毒性和/或反应性；提供快速清除；降低免疫原性；充当冷冻保护剂或冻干保护剂；稳定天然构象以维持功效、效力、安全性；保护免受化学和物理降解；蛋白稳定化以减少表面张力、蛋白表面和蛋白之间的相互作用；减少疏水相互作用；优化条件，如pH、离子强度；以及缓冲和稳定。赋形剂通常以一种或多种缓冲溶液的形式制备。
药学上或生理上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂可包括但不限于以下一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水；盐溶液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠；固定油，如合成的单或双甘油酯，可以用作溶剂或悬浮介质；聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸或谷胱甘肽；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；非离子型表面活性剂；洗涤剂；乳化剂；多肽或氨基酸，如甘氨酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。可以在第二超滤步骤期间或在UFDF单元操作后添加对于浓缩或过滤敏感、或出于任何其他原因可能需要特殊处理或考虑的赋形剂。
通常，在UFDF单元操作之后，对UFDF池进行过滤以降低生物负载、并且然后收集到外部贮存槽中，在所述贮存槽中进行向UFDF池中添加增强稳定性的赋形剂的单元操作并且然后再次过滤以减少配制的药物物质的生物负载。
如本文描述，本发明消除了对单独的单元操作的需要，所述单独的单元操作将增强稳定性的赋形剂(例如聚山梨酯80)添加至含有降低生物负载的UFDF池的外部贮存槽，并再次过滤。本发明提供了将此类增强稳定性的赋形剂直接添加或组合到UFDF滞留物槽中。将赋形剂添加到UFDF滞留物槽中时，不需要通过UFDF过滤器。可以关闭过滤器的入口，使得赋形剂不与UFDF过滤器相互作用。在一个实施例中，将一种或多种增强稳定性的赋形剂添加到配制的重组蛋白中或与其组合。在一个实施例中，将一种或多种增强稳定性的赋形剂同时添加到配制的重组蛋白中。在相关的实施例中，将一种或多种增强稳定性的赋形剂直接添加到超滤和渗滤(UFDF)滞留物槽中。在一个实施例中，一旦达到目标浓度，就将一种或多种赋形剂添加到配制的重组蛋白中或与其组合。在一个实施例中，一旦达到目标浓度，就将一种或多种赋形剂同时添加到配制的重组蛋白中。所述一种或多种赋形剂也可以与直接流入贮存容器的UFDF池同时添加。在一个实施例中，将增强稳定性的赋形剂和UFDF池分别添加到储存容器中。
增强稳定性的赋形剂包括但不限于非离子型表面活性剂、洗涤剂和/或乳化剂。非离子型表面活性剂包括但不限于基于聚氧乙烯(PEO)的表面活性剂、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷的嵌段共聚物；聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯；聚山梨酯20和80，
Figure BDA0003180349690000161
20和
Figure BDA0003180349690000162
80；聚乙二醇(PEG)，普朗尼克(pluronics)；泊洛沙姆，如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407。
在一个实施例中，所述增强稳定性的赋形剂是非离子型洗涤剂或表面活性剂。在一个实施例中，增强稳定性的赋形剂是基于聚氧乙烯(PEO)的表面活性剂。在一个实施例中，增强稳定性的赋形剂选自聚山梨酯80或聚山梨酯20。
增强稳定性的赋形剂的量取决于药物产品的所需最终配制品。例如，聚山梨酯80的典型范围是0.001％至0.1％(重量/体积)。在一个实施例中，在药物物质配制品缓冲液中聚山梨酯80的浓度为0.01％(重量/体积)。对于溶液可能很粘稠的赋形剂(如聚山梨酯80)，在配制品缓冲液中稀释至0.01％可以降低粘度，并简化冲洗管线和降低生物负载的过滤器。
在本发明的一个实施例中，可以在降低生物负载的过滤和/或无菌过滤之前添加一种或多种另外的配制的重组蛋白和/或药物物质，以最终形成组合药物产品。
在UFDF单元操作并添加任何增强稳定性的赋形剂后，将药物物质过滤以降低生物负载，并将池收集到贮存容器(如已消毒的单次使用储存袋)中。在将药物物质添加到降低生物负载的过滤器中之前，可以用含有目标浓度的稳定化赋形剂的配制品缓冲液冲洗将UFDF单元连接到降低生物负载的单元的管线，然后用相同的缓冲液使降低生物负载的过滤器饱和。这有助于在配制的重组蛋白中达到稳定化赋形剂的准确浓度。如本文所用，降低生物负载是指使药物物质不含最终药物产品中不需要的微生物。合适的过滤器是已知的并且广泛用于降低生物负载如SHC和PVDF过滤器以及通用0.2微米过滤器，并且可以从许多来源商购获得。
在典型的生物制剂制造过程中，药物物质将被冷冻以用于储存或易于运输到药物处理设施。本发明消除了冷冻和解冻的单元操作，药物物质向药物产品的转化是立即且连续的。这可用于连续的、整体化、端到端的治疗性生物制剂制造平台，自动化平台，以最少或无需操作员介入操作的平台，即时制造平台、其中药物产品需求可变或有限、或不需要或不可能维持冷冻药物物质库存的生产平台。这还减少了属性测试的数量和时间，因为在药物产品填充/精加工阶段只能进行一次药物物质和药物产品之间的共有属性。还消除了在转换为原料药物产品所需的冷冻/解冻后的药物物质的任何另外的处理。
在UFDF单元操作之后，可以进行一个或多个另外的单元操作，如病毒过滤。多特异性模式(部分由于其高度特异性的设计和功能)可以在低浓度下达到所需的治疗效力，这与需要高得多的浓度才能达到所需效力的单克隆抗体不同。特别地，一些双特异性抗体(如双特异性T细胞衔接子)在非常低的浓度下即可达到所需效力，并且因此可以具有<10g/L的药物物质配制品浓度，而对于大多数治疗性单克隆抗体而言，药物物质配制品的浓度要高得多，为70g/L或更高。在如此高浓度下，配制的抗体溶液可以迅速堵塞病毒过滤器。
由于病毒过滤器的孔径很小，高浓度配制品(如包含单克隆抗体的那些)会以低得多的体积污染过滤器。对于>10g/L的高浓度抗体配制品，处理此类溶液所需的过滤器或膜面积将使其不适于制造用途。在单克隆抗体处理的典型操作顺序中，病毒过滤通常在精制步骤之后进行，即在制造过程中抗体池处于最稀薄状态处进行。随后的UFDF操作浓缩抗体配制品。对于在UFDF之前和之后均处于低浓度的效力高效双特异性T细胞衔接子，已经发现，如本文描述，无论病毒过滤器和UFDF操作的顺序如何，处理配制的双特异性T细胞衔接子所需的过滤器或膜面积对于病毒过滤都是合理的，并且配制的
Figure BDA0003180349690000181
的病毒过滤是可能的。
本发明还提供了一种用于减少包含重组双特异性T细胞衔接子的组合物中病毒污染物的方法，所述方法包括提供样品，所述样品包含小于7.0g/L的重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH小于或等于6.0、具有23-45mS/cm的电导率；对所述样品进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括单独的病毒过滤器、或与深层过滤器或表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器；以及在池中或作为流收集包含所述重组双特异性T细胞衔接子的病毒过滤器洗脱液。
本发明还提供了一种用于在制造重组双特异性T细胞衔接子期间减少高分子量种类的方法，所述方法包括提供样品，所述样品包含小于7g/L重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH小于或等于6.0、具有23-45mS/cm的电导率；对所述样品进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括与深层过滤器组合的病毒过滤器；以及在池中或作为流收集所述病毒过滤器洗脱液；其中与使用包括单独的病毒过滤器、或与表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器的病毒过滤单元操作相比，过滤器洗脱液池中高分子量种类的百分比降低。
本发明还提供了一种用于生产纯化的、配制的重组双特异性T细胞衔接子的方法，所述方法包括；通过一种或多种色谱单元操作纯化收获的重组双特异性T细胞衔接子；对所述纯化的重组双特异性T细胞衔接子进行超滤和渗滤单元操作，得到浓度≤5g/L的配制的双特异性T细胞衔接子，并且对所述配制的双特异性T细胞衔接子进行病毒过滤单元操作；获得纯化的、配制的重组双特异性T细胞衔接子。
如本文描述，通过病毒过滤操作成功地处理了包含双特异性T细胞衔接子药物物质的低浓度药物物质配制品。具有<10g/L、优选地≤5g/L的浓度的配制的双特异性T细胞衔接子在本发明之内。优选地，具有≤0.10g/L、≤0.5g/L、≤1g/L、≤2g/L、≤3g/L、≤4g/L的浓度的配制的双特异性T细胞衔接子。在一个实施例中，浓度≤3.5g/L。在一个实施例中，浓度是≤1.79g/L。在一个实施例中，浓度是1.59g/L-3.16g/L。是在一个实施例中，配制的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.59g/L-1.79g/L。在一个实施例中，配制的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.79g/L-3.16g/L。在一个实施例中，配制的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.59g/L。在一个实施例中，配制的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.79g/L。在一个实施例中，配制的双特异性T细胞衔接子的浓度是3.2g/L。
在一个实施例中，本发明提供了对配制的多特异性蛋白、包括稳定性增强剂的配制的多特异性蛋白、包含多特异性蛋白的原料药物物质、和/或包含多特异性蛋白的原料药物产品进行病毒过滤。在一个实施例中，多特异性蛋白是双特异性抗体。病毒过滤步骤之后可以进行降低生物负载和/或无菌过滤。稳定性增强剂可以添加至病毒过滤池。任选地，病毒过滤池可以短期储存在2℃-8℃或长期储存在-70℃。
单元操作可以通过病毒过滤步骤、降低生物负载过滤或无菌过滤步骤、或通过填充/精加工操作连续或半连续地连接。病毒过滤和病毒后过滤步骤可以在与病毒前过滤步骤相同的空间中进行。
非包膜的病毒很难灭活而不对所制造的蛋白治疗剂产生风险，但是可以通过基于尺寸的过滤方法除去此类病毒，其中使用小孔径的过滤器去除病毒颗粒。病毒过滤可以使用微米或纳米过滤器(如从
Figure BDA0003180349690000201
(伊利诺伊州芝加哥的旭化成株式会社(AsahiKasei，Chicago，IL))、
Figure BDA0003180349690000202
(德国戈廷根的赛多利斯公司(Sartorius，Goettingen，Germany))、
Figure BDA0003180349690000203
Pro(马萨诸塞州柏林顿的密理博西格玛公司(MilliporeSigma，Burlington，MA))、PegasusTMPrime(纽约华盛顿港的颇尔生物技术(Pall Biotech，PortWashington，NY))、CUNO Zeta Plus VR，(明尼苏达州圣保罗(St.Paul，Mn)的3M公司)获得的那些)进行，并且可以发生在生物制造过程的下游操作中一个或多个步骤中。通常，病毒过滤在UFDF操作之前进行，但也可以在UFDF之后进行。
双特异性T细胞衔接子(如
Figure BDA0003180349690000204
)是高效的，且在纯化过程期间易于聚集。双特异性T细胞衔接子可能对纯化条件敏感，并且易于聚集，这可能导致病毒过滤操作期间载量降低和通量衰减增加。预过滤器可以与病毒过滤器组合使用，以帮助消除产品池或洗脱液流中的某些污染物，然后再将池或洗脱液应用于病毒过滤器，从而在病毒过滤操作期间保持连续流动并延长过滤器的使用寿命。预过滤器可商购获得，并且包括表面改性聚醚砜膜过滤器，如
Figure BDA0003180349690000205
Pro Shield、
Figure BDA0003180349690000206
Pro Shield H)，以及深层过滤器，如
Figure BDA0003180349690000207
预过滤器和
Figure BDA0003180349690000208
HC Pro X0SP，所有都来自密理博西格玛公司(马萨诸塞州伯灵顿)。如本文描述，已经发现深层过滤器预过滤器对于双特异性T细胞衔接子的病毒过滤操作特别有效。
与双特异性抗体的下游处理相关的信息不是很多，因此经常应用为单克隆抗体开发的平台(Shulka和Norman,第26章Downstream Processing of Fc Fusion Proteins,Bispecific Antibodies,and Antibody-Drug Conjugates[Fc融合蛋白、双特异性抗体和抗体药物缀合物的下游处理],在第二版Process Scale Purification of Antibodies[抗体的生产规模纯化]中,Uwe Gottswchalk编辑,p559-594,John Wiley&Sons[约翰威立父子公司],2017)。然而，这些过程对双特异性蛋白(如重组双特异性T细胞衔接子)的执行方式不一定与对单克隆抗体的相同。如本文描述，当处理重组半衰期延长的双特异性T细胞衔接子蛋白(特别是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子蛋白)时，仅向病毒过滤器中添加预过滤器并不能完全改善性能。已经发现，通过将半衰期延长的双特异性T细胞衔接子蛋白的浓度限制在小于7.0g/L，pH小于或等于6.0，具有23-45mS/cm的电导率，对所述蛋白进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括单独病毒过滤器、或与深层过滤器预过滤器或表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器，性能得到改善。特别地，与使用单独病毒过滤器或与表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器相比，使用与病毒过滤器组合的深层过滤器预过滤器可减少通量衰减和/或降低HMW％。
本发明还提供了一种用于在制造重组双特异性T细胞衔接子期间在病毒过滤单元操作中减少通量衰减和降低高分子量种类的方法，所述方法包括提供样品，所述样品包含小于或等于1.75g/L的重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH为4.2-6.0，电导率为23-45mS/cm；对所述纯化的重组双特异性T细胞衔接子进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括与深层过滤器组合的病毒过滤器；以及在池中或作为流收集所述过滤器洗脱液；其中与包括单独的病毒过滤器、或与表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器的病毒过滤单元操作相比，过滤器洗脱液池或流中高分子量种类的百分比降低。
在一个实施例中，池或流的pH是4.0至6.0。在一个实施例中，池或流的pH是4.2至6.0。在相关的实施例中，池或流的pH是4.2至5.9。在相关的实施例中，池或流的pH是4.2至5.0。在一个实施例中，池或流的pH是5.0至6.0。在一个实施例中，池或流的pH是5.0至5.9。在一个实施例中，池或流的电导率是23至45。在一个实施例中，池或流的电导率是23至32。在一个，池或流的电导率是23至28。在一个实施例中，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.75至7.0g/L。在一个实施例中，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度是7.0g/L。在一个实施例中，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.75g/L。在相关的实施例中，所述半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.75至1.18g/L。
在一个实施例中，pH是5.0，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度的浓度是1.75g/L。在相关的实施例中，pH是6.0，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度是7.0g/L且电导率是28mS/cm。在一个实施例中，pH是5.9，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.81g/L且电导率是31.36至45mS/cm。在一个实施例中，pH是4.2至5.9，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度是1.75至1.81g/L且电导率是23至45mS/cm。在一个实施例中，pH是4.2至5.0，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度的浓度是1.75g/L且电导率是23mS/cm。在一个实施例中，pH是5.9，半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的浓度的浓度是1.81g/L且电导率是31.36至45mS/cm。在一个实施例中，纯化的重组半衰期延长的双特异性T细胞衔接子小于或等于7.0g/L，并且pH小于或等于6.0，具有23至45mS/cm的电导率
在一个实施例中，病毒过滤单元操作包括与深层过滤器预过滤器组合的病毒过滤器。在相关的实施例中，所述深层过滤器预过滤器是吸收式深层过滤器或合成式深层过滤器。在一个实施例中，病毒过滤单元操作包括与表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器。在相关的实施例中，所述病毒过滤单元操作包括与表面改性聚醚砜膜预过滤器组合的病毒过滤器。在一个实施例中，所述病毒过滤单元操作仅包括病毒过滤器。
还对过滤的原料药物产品进行降低生物负载过滤和/或无菌过滤，以确保不含活微生物，并且然后引入无菌处理设施，在其中用于填充初级药物产品容器，然后对所述初级药物产品容器进行密封、贴标签和包装。
无菌处理设施是指维护有可能影响药物产品无菌性的污染物来源最小的设施。这种设施可以是具有一个或多个用于药物产品填充/精加工的填充站的专用洁净室，每个填充站包括一个或多个带有多个针头的自动填充机，以同时填充多个药物产品容器。无菌处理设施也可以是独立的不戴手套的无菌隔离器站。这种站可以位于开放式大厅制造设施(open ball-room manufacturing facility)中，特别地，这种站可以位于药物物质制备区域处或在其附近。用于液体和冻干药物产品的此类模块化不戴手套的无菌隔离器包括但不限于Vanrx(加拿大不列颠哥伦比亚省的巴纳比(Barnaby，British Columbia，Canada))。此类系统允许开发不需要操作员介入的连续系统。在完全封闭的隔离器内进行机械化材料处理、填充和封闭活动的小规模模块化工作站可以允许减小制造工厂的规模，并且还可以使用模块化和可重构空间使用的更大的灵活性，但可能需要一些操作员介入。本发明允许利用现有的单次使用组件来创建完全机械化的新流程，其中在不戴手套的隔离器内部无菌填充，空间占用比低成本费用的传统内置设施小。
本发明提供了一种用于减少药物产品生产过程的制造空间占用的方法，所述方法包括对纯化的重组目的蛋白进行UFDF单元操作直至达到目标浓度；将至少一种增强稳定性的赋形剂直接添加到UFDF滞留物槽中；对所述原料药物物质进行单一单元操作以降低生物负载，然后进行无菌过滤；对原料药物产品进行填充和精加工单元操作；其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。病毒过滤单元操作可以在UFDF操作之前或之后进行。
在本发明的一个实施例中，将原料药物产品递送到无菌处理设施，在填充/精加工之前在所述无菌处理设施中进行无菌过滤。在一个实施例中，所述无菌处理设施包括至少一个填充站。在一个实施例中，过滤的原料药物产品在储存容器中，所述容器可以递送到无菌处理设施。在另一个实施例中，所述储存容器可以直接连接到所述无菌处理设施。在一个实施例中，药物产品被过滤到直接递送和/或连接到无菌处理设施的储存袋中。在一个实施例中，原料药物产品可以经由管道或其他连接从降低生物负载过滤中直接递送到无菌处理设施。
在一个实施例中，将原料药物产品递送到无菌处理设施，所述无菌处理设施可以是机械化单元，例如像不戴手套的无菌隔离器。在一个实施例中，机械化单元具有与含有或处理原料药物产品的储存容器或过滤器的连接。将药物物质处理与药物产品处理直接互连(特别是通过直接连接到机械化填充器上)的能力提供了减少过程空间占用的机会。通过压缩过程、去除多余的或不必要的设备或过程步骤、消除药物物质的冷冻/解冻，允许设计和实现具有3,000平方英尺或更小空间占用的过程。
在本发明的一个实施例中，用无菌的原料药物产品填充初级药物产品容器。在另一个实施例中，将所述初级药物产品容器密封、贴标签和包装。在一个实施例中，初级药物产品容器是小瓶，安瓿瓶，药筒，注射器或含有注射器的装置，或其他合适的储存或递送装置、仪器或系统。
本发明提供了一种用于在重组治疗蛋白制造期间减少药物物质损失和/或不稳定的方法，所述方法包括对纯化的重组目的蛋白进行UFDF单元操作；一旦达到目标浓度，就将至少一种增强稳定性的赋形剂添加到UFDF滞留物槽中；对UFDF池进行单一过滤以降低生物负载，得到原料药物物质；其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。病毒过滤单元操作可以在UFDF操作之前或之后进行。
构成药物物质的蛋白是各种相互作用之间微妙的平衡的结果，所述相互作用包括形成并维持其折叠的三维结构的共价键、疏水相互作用、静电相互作用、氢键、范德华力。蛋白的折叠状态仅比未折叠状态稍稳定一点，并且蛋白环境的变化可能会触发降解或失活，这直接影响到产品的质量。
本发明减少了消除生物负载过滤步骤的数量，这有利于减少由于过滤期间的体积滞留而造成的产品损失，以及避免由于可能由多次过滤导致的剪切诱导的PQ变化而对产品质量和蛋白结构造成任何影响。这样做的益处还在于它简化了制造过程，使其与连续制造平台更加兼容；减少了药物物质制造设施的空间占用，并可能减少制造时间线，使更快地获得包装好的药物产品。与典型的生物制剂制造平台相比，还节省成本和减少浪费，在所述平台上，从UFDF单元操作到药物产品填充/精加工，可以使用三个或多个降低生物负载的过滤器和相关联的贮存槽或收集容器。
本发明的方法消除了解冻的药物物质的冷冻、冷冻储存、解冻、混合和集中，即“冷冻和解冻单元操作”。制造期间原料药物物质的冷冻和解冻可能不利于蛋白稳定性并影响产品质量。冰-液界面、低温浓缩(液体冷冻时蛋白的浓缩会导致蛋白结构的变化)、赋形剂结晶、ph变化(由于缓冲液组分的选择性沉淀，蛋白的不稳定)、蛋白浓度增加可能导致聚集或沉淀、冷变性(在低温下自发展开)、容器表面相互作用，来自容器的可滤出物和可浸出物。(Rathore和Rajan,Biotechnol.Prog.[生物技术进展]24：504-514,2008)。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”在全文中可互换使用，并且包括单链和双链核酸，并且包括基因组DNA、RNA、mRNA、cDNA或合成来源的或与通常在自然界中发现的序列无关的一些其组合。术语“分离的多核苷酸”或“分离的核酸分子”具体是指合成来源的序列或自然界中通常不存在的序列。包含规定序列的分离的核酸分子除表达目的蛋白的序列以外还可以包括针对高达十种或甚至高达二十种其他蛋白或其部分的编码序列，或可以包括控制所叙述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调节序列，和/或可以包括载体序列。包含核酸分子的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者任一类型核苷酸的经修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修饰，如2',3'-二脱氧核糖；及核苷酸间键修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯氨基硫代磷酸酯、苯氨基磷酸酯及氨基磷酸酯。
如本文所用，术语“分离的”意指(i)不含至少一些通常与其一起被发现的蛋白或多核苷酸，(ii)基本上不含来自相同来源的其他蛋白或多核苷酸，例如来自相同物种，(iii)与至少约50％的在自然界与其相关的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离，(iv)可操作地与在自然界与其不相关的多肽相关(通过共价或非共价相互作用)，或(v)在自然界中不存在。
术语“多肽”或“蛋白”在全文中可互换使用，并且是指包含通过肽键彼此连结的两个或更多个氨基酸残基的分子。多肽和蛋白还包括具有天然序列的氨基酸残基的一个或多个缺失、插入和/或取代的大分子，即包括由天然存在细胞和非重组细胞产生的多肽或蛋白；或通过基因工程化细胞或重组细胞产生，并且包括具有天然蛋白的氨基酸序列的氨基酸残基的一个或多个缺失、插入和/或取代的分子。多肽和蛋白还包括如下氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸为相应天然存在的氨基酸和聚合物的化学类似物。多肽和蛋白还包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP核糖基化。术语“分离的蛋白”，“分离的重组蛋白”或“纯化的重组蛋白”可以互换使用，并且是指从会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白或多肽或其他污染物中纯化出来的目的多肽或蛋白。特别地，由使用如本文描述的本发明处理的重组目的蛋白制成的药物物质和药物产品可以被称为“重组蛋白药物产品”、“重组生物治疗剂”。
多肽和蛋白可能具有科学意义或商业意义，包括蛋白治疗剂。目的蛋白尤其包括分泌型蛋白、非分泌型蛋白、胞内蛋白或膜结合蛋白。目的蛋白可以使用本文描述的方法通过重组动物细胞系生产，并且可以被称为“重组蛋白”或“重组蛋白治疗剂”。所表达的一种或多种蛋白可以在细胞内产生或被分泌到培养基中，从培养基中可以回收和/或收集所述蛋白。目的蛋白可以包括例如通过结合靶、特别是下面列出的那些中的靶而发挥治疗作用的蛋白，包括从其衍生的靶、与其相关的靶及其修饰。
目的蛋白可以包括“抗原结合蛋白”。“抗原结合蛋白”是指包括抗原结合区或抗原结合部分的蛋白或多肽，所述抗原结合区或抗原结合部分对与其结合的另一分子(抗原)具有强亲和力。抗原结合蛋白涵盖抗体、肽体、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物、融合蛋白(包括单链可变片段(scFv)和双链(双价)scFv、
Figure BDA0003180349690000271
突变蛋白(muteins)、多特异性蛋白、双特异性蛋白、xMAb、和嵌合抗原受体(CAR或CAR-T)以及T细胞受体(TCR))。
“多特异性”、“多特异性蛋白”和“多特异性抗体”在本文用于指重组工程化以同时结合和中和同一抗原上的至少两个不同抗原或至少两个不同表位的蛋白。例如，多特异性蛋白可以被工程化以靶向与针对肿瘤的靶向细胞毒性剂或感染剂组合的免疫效应子。已发现这些多特异性蛋白可通过将免疫效应子细胞重定向至肿瘤细胞、通过阻断信号传导途径修饰细胞信号传导、靶向肿瘤血管生成、阻断细胞因子、以及作为药物的预靶向递送媒介物(如递送化学治疗剂、放射性标记(以改善检测灵敏度)和纳米颗粒(定向到特定的细胞/组织，如癌细胞))而用于多种应用，如在癌症免疫疗法中。
最常见和最多样化的多特异性蛋白是结合两种抗原的蛋白，在本文中称为“双特异性”、“双特异性蛋白”和“双特异性抗体”。双特异性蛋白可分为两大类：免疫球蛋白G(IgG)样分子和非IgG样分子。IgG样分子保留Fc介导的效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，Fc区有助于改善溶解性和稳定性并且促进一些纯化操作。非IgG样分子较小，可增强组织穿透力(参见Sedykh等人,Drug Design,Development and Therapy[药物设计、开发与疗法]18(12),195-208,2018；Fan等人,J Hematol&Oncology[血液与肿瘤学杂志]8:130-143,2015；Spiess等人,Mol Immunol[分子免疫学]67,95-106,2015；Williams等人,第41章ProcessDesign for Bispecific Antibodies in Biopharmaceutical Processing Development[生物制药处理开发中双特异性抗体的过程设计],Design and Implementation ofManufacturing Processes[制造过程的设计与实现],Jagschies等人编辑,2018,第837-855页。双特异性蛋白有时被用作具有对不同抗原或表位数目的结合特异性的另外组分的框架，增加了分子的结合特异性。
包括双特异性抗体的双特异性蛋白的形式正在不断发展，并且包括但不限于四源杂交瘤(quadromas)、杵臼结构(knobs-in-holes)、交叉单克隆抗体(cross-Mabs)、双可变结构域IgG(DVD-IgG)、IgG-单链Fv(scFv)、scFv-CH3 KIH、双功能Fab(DAF)、半-分子交换、κλ-体、串联scFv、scFv-Fc、双抗体、单链双抗体(sc双抗体)、sc双抗体-CH3、三抗体、微型抗体、微型体、TriBi微型体、串联双抗体、sc双抗体-HAS、串联scFv-毒素、双亲和重定向分子(dual-affinity retargeting molecules，DARTs)、纳米抗体、纳米抗体-HSA、对接和锁定(DNL)、链交换工程化结构域SEED体(SEEDbody)、三功能抗体(Triomab)、亮氨酸拉链(LUZ-Y)、
Figure BDA0003180349690000281
Fab-臂交换、DutaMab、DT-IgG、电荷对(charged pair)、Fcab、正交Fab、IgG(H)-scFv、scFV-(H)IgG、IgG(L)-scFV、IgG(L1H1)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFV-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zy体、DVI-Ig4(四位一体)、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFV、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、sc双抗体-Fc、双抗体-Fc、胞内抗体、ImmTAC、HSA体(HSABody)、IgG-IgG、Cov-X-体、scFv1-PEG-scFv2、双特异性T细胞衔接子
Figure BDA0003180349690000282
和半衰期延长的双特异性T细胞衔接子(HLEBiTEs)(Fan,同上；Spiess,同上；Sedykh,同上；Seimetz等人,Cancer Treat Rev[癌症治疗评论]36(6)458-67,2010；Shulka和Norman,第26章Downstream Processing of Fc FusionProteins,Bispecific Antibodies,and Antibody-Drug Conjugates[Fc融合蛋白、双特异性抗体和抗体药物缀合物的下游处理],在第二版Process Scale Purification ofAntibodies[抗体的生产规模纯化]中,Uwe Gottswchalk编辑,p559-594,John Wiley&Sons[约翰威立父子公司],2017；Moore等人,MAbs 3:6，546-557，2011)。
在一些实施例中，包括双特异性T细胞接合物
Figure BDA0003180349690000291
抗体构建体，其是由两个柔性连接的抗体衍生的结合结构域制成的重组蛋白构建体(参见WO 99/54440和WO 2005/040220)。构建体的一个结合结构域对靶细胞上选定的肿瘤相关表面抗原(如EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、CD19、CD33、CD38、FLT3、CDH3、BCMA、PSMA、MUC17、CLDN18.2、或CD70)具有特异性；第二结合结构域对CD3(T细胞上的T细胞受体复合物的亚基)具有特异性。
Figure BDA0003180349690000292
构建体还可以包括在CD3链的N末端处结合背景无关表位(context independent epitope)的能力(WO 2008/119567)，以更特异性地激活T细胞。半衰期延长的
Figure BDA0003180349690000293
构建体是
Figure BDA0003180349690000294
抗体构建体，所述构建体包括小双特异性抗体构建体与较大蛋白的融合物，其优选地不会干扰
Figure BDA0003180349690000295
抗体构建体的治疗效果。双特异性T细胞衔接子的实例包括双特异性Fc-分子，例如US 2014/0302037、US 2014/0308285、WO 2014/151910和WO 2015/048272中所描述的。替代性策略是使用与双特异性分子融合的人血清白蛋白(HAS)或者仅人白蛋白结合肽的融合物(参见例如WO 2013/128027、WO 2014/140358)。另一种HLE
Figure BDA0003180349690000296
策略包括融合与靶细胞表面抗原结合的第一结构域、与人和/或猕猴CD3e链的胞外表位结合的第二结构域以及作为特异性Fc模式的第三结构域(WO 2017/134140)。
在一些实施例中，双特异性蛋白可能包括博纳吐单抗、卡妥索单抗(catumaxomab)、厄妥玛索单抗(ertumaxomab)、索利托单抗(solitomab)、targomiRs、鲁吉珠单抗(lutikizumab)(ABT981)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)(RG7221)、壬托鲁单抗(remtolumab)(ABT122)、ozoralixumab(ATN103)、floteuzmab(MGD006)、帕妥昔珠单抗(AMG112、MT112)、lymphomun(FBTA05)、(ATN-103)、AMG103(抗-CD19 x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000301
抗体)AMG211(MT111、Medi-1565)(抗-癌坯抗原x抗-CD3抗体)、AMG330(抗-CD33 x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000302
抗体)、AMG212(抗-PSMA x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000303
抗体)、AMG160(抗-PSMA x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000304
抗体)、AMG420(B1836909)，(抗-BCMA x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000305
抗体)、AMG-110(MT110)、AMG562(抗-CD19 x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000306
抗体)、AMG596(抗-EGFRvIII x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000307
抗体)、AMG427(半衰期延长的抗-FLT3 x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000308
抗体)、AMG673(半衰期延长的抗-CD33 x抗-CD3
Figure BDA0003180349690000309
抗体)、AMG675(半衰期延长的抗-DLL3x抗-CD3
Figure BDA00031803496900003010
抗体)、AMG701(半衰期延长的抗-BCMA x抗-CD3
Figure BDA00031803496900003011
抗体)、AMG 424(抗-CD38抗-CD3 Xmab)、MDX-447、TF2、rM28、HER2Bi-aATC、GD2Bi-aATC、MGD006、MGD007、MGD009、MGD010、MGD011(JNJ64052781)、IMCgp100、铟标记的IMP-205、xm734、LY3164530、OMP-305BB3、REGN1979、COV322、ABT112、ABT165、RG-6013(ACE910)、RG7597(MEDH7945A)、RG7802、RG7813(RO6895882)、RG7386、BITS7201A(RG7990)、RG7716、BFKF8488A(RG7992)、MCLA-128、MM-111、MM141、MOR209/ES414、MSB0010841、ALX-0061、ALX0761、ALX0141；BII034020、AFM13、AFM11、SAR156597、FBTA05、PF06671008、GSK2434735、MEDI3902、MEDI0700、MEDI7352、以及其分子或变体或类似物，和上述任何一种的生物仿制药。
双特异性蛋白还包括三特异性抗体、四价双特异性抗体、不含抗体组分多特异性蛋白(如双抗体、三抗体或四抗体、微型体)、和能够结合多个靶标的单链蛋白。Coloma,M.J.等人,Nature Biotech[自然生物技术].15(1997)159-163
scFv是单链抗体片段，它具有连接在一起的抗体重链和轻链的可变区。参见美国专利号7,741,465和6,319,494以及Eshhar等人,Cancer Immunol Immunotherapy[癌症免疫学免疫疗法](1997)45：131-136。scFv保留了亲本抗体与靶抗原特异性相互作用的能力。
术语“抗体”包括任何同种型或亚类的糖基化免疫球蛋白和非糖基化免疫球蛋白，或者其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合区。除非另外说明，否则抗体包括人的、人源化的、嵌合的、多特异性的、单克隆的、多克隆的、特异性IgG(heteroIgG)、双特异性的抗体、及其寡聚物或抗原结合片段。抗体包括lgG1型、lgG2型、lgG3型或lgG4型。还包括具有抗原结合片段或抗原结合区的蛋白，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、双抗体、Fd、dAb、最大抗体(maxibody)、单链抗体分子、单结构域VHH、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体和至少包含足以使特异性抗原与靶多肽结合的免疫球蛋白的一部分的多肽。
还包括人的、人源化的和其他抗原结合蛋白，如人抗体和人源化抗体，所述抗原结合蛋白当施用于人时不会产生明显有害的免疫反应。
还包括经修饰的蛋白，如经非共价键、共价键或者共价键和非共价键两者化学修饰的蛋白。还包括进一步包含一种或多种译后修饰的蛋白，其可以通过细胞修饰系统或由酶和/或化学方法离体引入或以其他方式引入的修饰制得。
目的蛋白还可以包括重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括例如多聚化结构域，如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、免疫球蛋白的Fc部分等。还包括包含分化抗原的全部或部分氨基酸序列的蛋白(称为CD蛋白)或其配体或与这些中的任一个基本上相似的蛋白。
在一些实施例中，蛋白可以包括集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。此类G-CSF试剂包括但不限于
Figure BDA0003180349690000321
(非格司亭)和
Figure BDA0003180349690000322
(培非格司亭)。还包括红细胞生成刺激剂(ESA)，如
Figure BDA0003180349690000323
(依伯汀α)、
Figure BDA0003180349690000324
(达贝泊汀α)、
Figure BDA0003180349690000325
(依伯汀δ)、
Figure BDA0003180349690000326
(甲氧基聚乙二醇-依伯汀β)、
Figure BDA0003180349690000327
MRK-2578，INS-22，
Figure BDA0003180349690000328
(依伯汀ζ)、
Figure BDA0003180349690000329
(依伯汀β)、
Figure BDA00031803496900003210
(依伯汀ζ)、
Figure BDA00031803496900003211
(依伯汀α)、依伯汀αHexal、
Figure BDA00031803496900003212
(依伯汀α)、
Figure BDA00031803496900003213
(依伯汀θ)、
Figure BDA00031803496900003214
(依伯汀θ)、
Figure BDA00031803496900003215
(依伯汀θ)、依伯汀α、依伯汀β、依伯汀ζ、依伯汀θ和依伯汀δ、依伯汀ω、依伯汀ι、组织纤溶酶原激活剂、GLP-1受体激动剂、以及前述任何内容的分子或其变体或类似物和生物仿制药。
在一些实施例中，蛋白可以包括与一种或多种CD蛋白、HER受体家族蛋白、细胞粘附分子、生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子、骨诱导因子、胰岛素和胰岛素相关蛋白、凝血蛋白和凝血相关蛋白、集落刺激因子(CSF)、其他血液和血清蛋白血型抗原特异性结合的蛋白；受体、受体相关蛋白、生长激素、生长激素受体、T细胞受体；神经营养因子、神经营养蛋白、松弛素(relaxin)、干扰素、白介素、病毒抗原、脂蛋白、整联蛋白、类风湿因子、免疫毒素、表面膜蛋白、转运蛋白、归巢受体、地址素、调节蛋白和免疫粘附素。
在一些实施例中，单独或以任何组合结合以下中的一种或多种的蛋白：CD蛋白(包括但不限于CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171和CD174)、HER受体家族蛋白(包括例如HER2、HER3、HER4和EGF受体)、EGFRvIII、细胞粘附分子(例如LFA-1、Mol、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白)、生长因子(包括但不限于例如血管内皮生长因子(“VEGF”))；VEGFR2、生长激素、促甲状腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、米勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、促红细胞生成素(EPO)、神经生长因子(如NGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(包括例如aFGF和bFGF)、表皮生长因子(EGF)、Cripto、转化生长因子(TGF)(尤其包括TGF-α和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5))、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)和骨诱导因子、胰岛素和胰岛素相关蛋白(包括但不限于胰岛素、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素原和胰岛素样生长因子结合蛋白)；(凝血蛋白和凝血相关蛋白，尤其如，VIII因子、组织因子、范威尔邦德(vonWillebrand)因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、纤溶酶原激活剂(如尿激酶和组织纤溶酶原激活剂(“t-PA”))、邦巴辛(bombazine)、凝血酶、血小板生成素和血小板生成素受体、集落刺激因子(CSF)(尤其包括以下物质：M-CSF、GM-CSF和G-CSF)、其他血液和血清蛋白(包括但不限于白蛋白、IgE和血型抗原)、受体和受体相关蛋白(包括例如flk2/flt3受体、肥胖(OB)受体、生长激素受体和T细胞受体)；(x)神经营养因子，包括但不限于骨源性神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)；(xi)松弛素A链、松弛素B链和松弛素原、干扰素(包括例如干扰素α、干扰素β和干扰素γ)、白介素(IL)(例如IL-1至IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23、IL-12/IL-23、IL-2Ra、IL1-R1、IL-6受体、IL-4受体和/或IL-13受体、IL-13RA2或IL-17受体、IL-1RAP；(xiv)病毒抗原，包括但不限于AIDS包膜病毒抗原、脂蛋白、降钙素、胰高血糖素、心钠素、肺表面活性剂、肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β、脑啡肽酶、BCMA、IgKappa、ROR-1、ERBB2、间皮素、RANTES(受激活调节的正常T细胞表达与分泌因子)、小鼠促性腺激素相关肽、DNA酶、FR-α、抑制素和激活素、整联蛋白、蛋白A或D、类风湿因子、免疫毒素、骨形态发生蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶、表面膜蛋白、衰变加速因子(DAF)、AIDS包膜、转运蛋白、归巢受体、MIC(MIC-a、MIC-B)、ULBP 1-6、EPCAM、地址素、调节蛋白、免疫粘附素、抗原结合蛋白、生长激素、CTGF、CTLA4、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)-1、MUC1、CEA、c-MET、密蛋白(Claudin)-18、GPC-3、EPHA2、FPA、LMP1、MG7、NY-ESO-1、PSCA、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GM2、BAFF、ICOS、OPGL(RANKL)、肌生成抑制素、Dickkopf-1(DKK-1)、Ang2、NGF、IGF-1受体、肝细胞生长因子(HGF)、TRAIL-R2、c-Kit、B7RP-1、PSMA、NKG2D-1、程序性细胞死亡蛋白1和配体、PD1和PDL1、甘露糖受体/hCGβ、丙型肝炎病毒、间皮素dsFv[PE38缀合物、嗜肺军团菌(lly)、IFNγ、γ干扰素诱导蛋白10(IP10)、IFNAR、TALL-1、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)、干细胞因子、Flt-3、降钙素基因相关肽(CGRP)、OX40L、α4β7、血小板特异性(血小板糖蛋白Iib/IIIb(PAC-1)、转化生长因子β(TFGβ)、透明带精子结合蛋白3(ZP-3)、TWEAK、TSLP、血小板衍生的生长因子受体α(PDGFRα)、硬化蛋白(sclerostin)、Jagged-1、以及任何前述内容的生物活性片段或变体。
AMG506(FAPx4-1BB靶向
Figure BDA0003180349690000341
)、AMG592(IL2突变蛋白Fc融合物)、AMG890(干扰RNA Lp(a))、AMG 119(DLL3 CART)。
在另一个实施例中，蛋白包括阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿柏西普、阿仑单抗、阿利库单抗、阿那白滞素、阿塞西普、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、生物素单抗(biosozumab)、博纳吐单抗、本妥昔单抗、布罗达单抗、莫坎妥珠单抗、康纳单抗、西妥昔单抗、塞妥珠单抗、可那木单抗、达利珠单抗、迪诺舒单抗(denosumab)、依库丽单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、依帕珠单抗、埃仑单抗、依那西普、维卡塞肽(etelcalcetide)、依伏库单抗、加利昔单抗、盖尼塔单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、易普利姆玛、左旋单抗(ixekizumab)、乐地单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗、磷酸莫特沙尼(motesanibdiphosphate)、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奈西立肽、尼妥珠单抗、纳武单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、奥普瑞白介素、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、培克珠单抗、兰尼单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、罗米司亭、洛莫索珠单抗、沙格司亭、特折鲁单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥单抗、tratuzumap、优特克单抗、维多珠单抗、维西珠单抗、伏洛昔单抗、扎木单抗、扎鲁木单抗、以及前述任何内容的生物仿制药。
根据本发明的蛋白涵盖所有前述内容，并且进一步包括包含上述任何抗体的1、2、3、4、5或6个互补决定区(CDR)的抗体。还包括这样的变体，其包括与目的蛋白的参考氨基酸序列具有70％或更高、特别是80％或更高、更特别是90％或更高、再更特别是95％或更高、具体是97％或更高、更具体是98％或更高、再更具体是99％或更高同一性的氨基酸序列的区。在这方面的同一性可以使用多种熟知的且容易获得的氨基酸序列分析软件来确定。优选的软件包括实施史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法的那些软件，所述软件被认为是搜索和比对序列问题的令人满意的解决方案。还可以采用其他算法，特别是在速度是重要考虑因素的情况下。可以用于此方面的用于DNA、RNA和多肽的比对和同源性匹配的常用程序包括FASTA、TFASTA、BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN、PROSRCH、BLAZE和MPSRCH，后者是用于在MasPar制造的大规模并行处理器上执行的史密斯-沃特曼算法的实施方式。
本文中还提供包含如上文所述的至少一种核酸分子的呈质粒、表达载体、转录盒或表达盒形式的表达系统和构建体，和包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。如本文所用，“载体”意指适合用于将信息编码蛋白转移和/或转运至宿主细胞和/或特定位置和/或宿主细胞内的区室的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒衣壳、病毒体、裸DNA、复合DNA等)。载体可以包括病毒和非病毒载体、非附加型哺乳动物载体。载体通常被称为表达载体，例如，重组表达载体和克隆载体。可以将载体引入宿主细胞以允许载体自身的复制，并从而扩增其中包含的多核苷酸的拷贝。克隆载体可含有序列组分，所述序列组分通常包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和选择性标记物。这些元件可以由本领域普通技术人员适当选择。
一种或多种“细胞”包括任何原核或真核细胞。细胞可以是离体细胞、体外细胞或体内细胞，可以是单独的或作为高级结构(如组织或器官)的一部分。细胞包括“宿主细胞”，也称为“细胞系”，它们经基因工程化以表达具有商业或科学意义的多肽。宿主细胞典型地源自来自原代培养物的谱系，其可在培养中维持无限时间。基因工程化宿主细胞涉及用重组多核苷酸分子转染、转化或转导细胞，和/或以其他方式改变(例如，通过同源重组和基因激活或重组细胞与非重组细胞的融合)以引起宿主细胞表达所需的重组多肽。用于遗传工程细胞和/或细胞系以表达目的多肽的方法和载体是本领域技术人员熟知的；例如，各种技术在Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]，Ausubel等人编辑(Wiley&Sons[约翰威立父子公司],纽约,1990，和季度更新)；Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](Cold Spring Laboratory Press[冷泉实验室出版社],1989)；Kaufman,R.J.，Large Scale Mammalian Cell Culture[大规模哺乳动物细胞培养],1990,第15-69页。
宿主细胞可以是任何原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫或动物细胞(例如CHO细胞))。可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。
在一个实施例中，所述细胞是宿主细胞。宿主细胞当在适当条件下培养时表达目的蛋白，所述目的蛋白随后可以自培养基收集(若宿主细胞将其分泌至培养基中)或直接由产生它的宿主细胞收集(若其并非分泌的)。适当宿主细胞的选择将取决于多种因素，如所需表达水平、活性所需要或必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易性。
“培养”(“culture”或“culturing”)是指细胞在多细胞生物体或组织外部的生长和繁殖。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的。细胞培养基和组织培养基可互换地用于指在体外细胞培养期间适合宿主细胞生长的培养基。典型地，细胞培养基含有缓冲液、盐、能源、氨基酸、维生素和痕量必需元素。可以使用能够支持适当宿主细胞在培养中生长的任何培养基。可以将细胞培养基进一步补充其他组分以最大化特定培养的宿主细胞中的细胞生长、细胞活力和/或重组蛋白生产，所述细胞培养基是可商购的，并且包括RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、伊格尔最低必需培养基、F-12K培养基、哈姆F12培养基、伊思考夫改良的杜尔贝科培养基、麦考伊5A培养基、Leibovitz L-15培养基和无血清培养基如EX-CELLTM300系列等，所述培养基可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)或SAFC生物科学公司(SAFCBiosciences)和其他供应商处获得。细胞培养基可以是无血清、无蛋白、无生长因子和/或无蛋白胨的培养基。还可以通过添加营养来富集细胞培养物，并以高于其通常的、推荐的浓度使用。
在培养过程中可以使用各种培养基配方，例如，以促进从一个阶段(例如，生长阶段或生长期)过渡到另一阶段(例如，生产阶段或生产期)和/或优化细胞培养期间的条件(例如在灌注培养过程中提供的浓缩培养基)。生长培养基配制品可用于促进细胞生长并使蛋白表达最小化。生产培养基配制品可用于促进目的蛋白的生产和细胞的维持，同时使新细胞的生长减至最少。饲料培养基，典型地是包含在细胞培养物生产期过程中消耗的较高浓度组分(如营养素和氨基酸)的培养基，可用于补充和维持活性培养物，特别是分批加料、半灌注或灌注模式的培养物。这种浓缩的饲料培养基可以包含大多数细胞培养基组分，例如，其正常量的约5×、6×、7×、8×、9×、10×、12×、14×、16×、20×、30×、50×、100×、200×、400×、600×、800×或甚至约1000×。
生长期可以在比生产期更高的温度下进行。例如，生长期可以在约35℃至约38℃的第一温度下进行，并且生产期可以在约29℃至约37℃，任选地约30℃至约36℃或约30℃至约34℃的第二温度下进行。此外，可以在温度变化之前和/或之后的同时添加蛋白产生的化学诱导剂，如像咖啡因、丁酸酯和六亚甲基双乙酰胺(HMBA)。如果在温度变化后添加诱导剂，则可以在温度变化后1小时至5天，任选地在温度变化后1至2天添加诱导剂。
宿主细胞可以悬浮或粘附形式培养，附着在固体基质上。可以在带有或不带有微载体的流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌式生物反应器中建立细胞培养
细胞培养能以分批、分批加料、连续、半连续或灌注模式进行。哺乳动物细胞(如CHO细胞)可以在生物反应器中以小于100ml至小于1000ml的小规模培养。可替代地，可以使用含有1000ml至20,000升以上培养基的大规模生物反应器。大规模细胞培养，如用于蛋白治疗剂的临床和/或商业规模生物制造的细胞培养，可维持数周甚至数月，在此期间细胞产生所需的一种或多种蛋白。
然后可以从细胞培养基中收获所产生的表达的重组蛋白。从悬浮细胞中收获蛋白的方法是本领域已知的，并且包括但不限于酸沉淀、加速沉降(如絮凝)、使用重力分离、离心、声波分离、过滤(包括使用超滤器、微滤器、切向流过滤器、替代切向流过滤器、深度过滤器和冲积过滤器的膜过滤)。通过本领域已知的氧化还原折叠过程的方法，从细胞质中的包涵体中回收由原核生物表达的重组蛋白。
然后，可以使用一个或多个单元操作从任何杂质，如剩余的细胞培养基、细胞提取物、不需要的组分、宿主细胞蛋白、表达不正确的蛋白等中纯化或部分纯化收获的蛋白。术语“单元操作”是本领域的术语，并且意指可以在从液体培养基中纯化的重组蛋白的过程中进行的功能步骤。例如，一个操作单元可以涉及过滤(例如，从包括重组蛋白的流体中去除污染物细菌、酵母、病毒或分枝杆菌和/或颗粒物质)、捕获、表位标签去除、纯化、贮存或储存、精制、病毒灭活、调节包括重组蛋白的液体的离子浓度和/或pH、以及去除不需要的盐。
例如，单元操作可包括，例如但不限于捕获、纯化、精制、病毒灭活、病毒过滤、和/或调节含有重组目的蛋白的浓度和配制品。单元操作还可以包括处理步骤之间的贮存或存储步骤。可以将单一单元操作设计为在同一操作中完成多个目标，如捕获和病毒灭活。
捕获单元操作包括利用树脂和/或含有与重组目的蛋白结合的试剂的膜进行捕获色谱，例如亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、固相金属亲和色谱(IMAC)等。此类材料是本领域已知的并且可以是商购的。亲和色谱可以包括蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L结合捕获机制等，例如，底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适配子结合捕获机制、和辅助因子结合捕获机制。特别地，WO 2019118426中描述了使用蛋白L的双特异性T细胞衔接子的连续上游制造过程。重组目的蛋白可以用聚组氨酸标签标记随后使用咪唑通过IMAC纯化，或者使用表位(诸如
Figure BDA0003180349690000391
)标记随后使用针对所述表位的特异性抗体进行纯化。
一个或多个捕获单元操作包括病毒灭活和/或病毒过滤。为了确保患者安全，在制造蛋白治疗剂时，病毒灭活和病毒过滤是纯化过程的必要部分。可以从流出物流、洗脱液、池、贮存或储存容器中获得要进行病毒灭活和病毒过滤的流体。
包膜的病毒易受灭活方法(如热灭活/巴氏消毒法、pH灭活、UV和γ射线照射、使用高强度广谱白光、添加化学灭活剂、表面活性剂、和溶剂/洗涤剂处理)的影响，使它们不再感染细胞、复制和/或繁殖。一种用于实现病毒灭活的方法是在低pH或其他溶液条件下孵育以实现病毒灭活。在低pH病毒灭活之后，可以进行中和单元操作，所述操作将重新调节经过病毒灭活的溶液至更符合后续单元操作要求的pH值。随后还可以进行过滤，如深层过滤，以除去任何产生的浑浊或沉淀。
术语“精制”在本文用于指进行一个或多个色谱步骤以从包括接近最终所需纯度的重组蛋白的流体中去除残留的污染物和杂质，如DNA、宿主细胞蛋白；产物特异性杂质、变体产物和聚集体和病毒吸附。例如，可以通过使包括重组蛋白的流体流过一种或多种色谱柱或一种或多种膜吸收剂，使其选择性结合目标重组蛋白或存在于包括重组蛋白的流体中的污染物或杂质，以结合和洗脱模式进行精制。在此实例中，一种或多种色谱柱或膜吸收剂的洗脱液/滤液包括重组蛋白。
精制色谱单元操作使用的树脂和/或膜含有能以“流通模式”(其中目的蛋白包含在洗脱液中并且污染物和杂质结合到色谱介质上)或“结合并洗脱模式”使用的试剂，其中目的蛋白结合到色谱介质上并且在污染物和杂质流过色谱介质或从色谱介质上洗掉后洗脱。此类色谱方法的实例包括离子交换色谱(IEX)，如阴离子交换色谱(AEX)和阳离子交换色谱(CEX)；疏水相互作用色谱(HIC)；混合模式或多模式色谱(MM)、羟基磷灰石色谱(HA)；反相色谱和凝胶过滤。
可以测量关键属性和性能参数，以更好地指导有关制造期间每个步骤性能的决策。这些关键属性和参数可以实时监测、近实时监测和/或事后监测。可以测量主要的关键参数，如消耗的培养基组分(如葡萄糖)、累积的代谢副产物(如乳酸和氨)的水平、和与细胞维持和存活相关的参数，如溶解氧含量。关键属性，如比生产率、活细胞密度、pH、摩尔渗透压浓度、外观、颜色、聚集、产率百分比和滴度，可在过程中和过程后进行监测。可以使用已知技术和可商购的设备进行监测和测量。
本发明消除了对浓缩的、配制的药物物质和药物产品的多余释放采样的需要，并允许对两者共有属性的测定仅进行一次，如在药物产品填充/精加工阶段，在此阶段可以将它们与其他药物产品属性测试组合。
尽管在本申请中使用的术语是本领域中的标准术语，但是本文提供了某些术语的定义以确保权利要求的含义的清楚性和确定性。单位、前缀和符号可能会用它们的国际单位制(SI)接受形式表示。本文列举的数字范围包括定义范围的数字，并且包括并支持所定义范围内的每个整数。除非另外指示，否则本文所述的方法及技术可根据本领域中熟知的常规方法且如贯穿本说明书所引用及论述的各种通用及更特定参考文献中所描述来进行。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],ColdSpring Harbor,N.Y.[纽约州冷泉港](2001)和Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology[分子生物学实验指南],Greene Publishing Associates[格林出版公司](1992)，以及Harlow和Lane Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor,N.Y[纽约州冷泉港](1990)。在本申请中所引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍、和专著，都通过引用清楚地并入本文。在本发明的一个实施例中描述的内容可以与本发明的其他实施例组合。
本发明在范围上不受本文所述的特定实施例的限制，这些特定实施例旨在作为本发明各个方面的单个说明，并且功能上等效的方法和组分也在本发明的范围内。实际上，除了本文中显示和描述的那些之外，根据前述描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这类修改旨在包含在所附权利要求的范围内。
实例
实例1连接DS-DP操作
进行50L生物反应器运行以产生重组单克隆抗体，并通过一系列纯化单元操作进行正向处理，直到获得病毒过滤池。UFDF使用的是Akta flux 6橇(新泽西皮斯卡塔韦的通用电气医疗集团(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。使用Millipore Pellicon盒式贮存器来容纳30kD UFDF膜，所述膜的总面积为1.14m2(马萨诸塞州伯灵顿的密理博西格玛公司(Millipore Sigma，Burlington，MA)。Opticap XL600无菌高容量过滤器(马萨诸塞州伯灵顿的密理博西格玛公司)用作降低生物负载的过滤器。将最终药物物质收集在Mobius单次使用混合袋(马萨诸塞州伯灵顿的密理博西格玛公司)中。
将病毒过滤池用作UFDF操作、添加聚山梨酯80(PS80)和最终0.2微米过滤的起始材料。在开始操作之前，将橇和其他与产品接触的组件保持在0.2N氢氧化钠中过夜。用于渗滤的配制品缓冲液和最终的蛋白配制品的组成为272mM脯氨酸、pH 4.1的10mM乙酸盐。在配制品缓冲液中制备1％PS80储备液，并将其添加到最终UFDF冲洗缓冲液和滞留物槽中的最终蛋白池中，以使最终DS中的PS80重量/体积达到0.01％。
在开始UFDF操作之前，先进行DIW冲洗，然后检查渗透侧流体的pH值以确保将氢氧化物被冲掉。用DIW冲洗后，测量归一化水渗透率(NWP)以确保过滤器符合通过标准。将病毒过滤池装入UFDF橇中，并且以70mg/mL浓度为目标进行超滤1(UF1)操作。用等于10渗滤体积(DV)的配制品缓冲液以70mg/mL进行渗滤(DF)。DF后，将渗滤池重新循环大约10分钟，并使用Solo VPE从滞留物槽中测试样品的蛋白浓度。在UF2操作中，使用蛋白浓度和数量来计算实现蛋白池浓度提高至175mg/mL所需的体积减少量。在浓缩期间，加料压力、TMP和通量以将TMP维持在约15psi的方式进行控制。在获得175mg/mL的UF2目标后，计算最终DS浓度为145mg/mL时要达到的目标体积。添加所需量的冲洗缓冲液以达到140mg/mL的目标最终浓度
计算在滞留槽中达到0.01％w/v PS80所需的PS80储备液的量，并将其直接添加到滞留槽中的蛋白溶液中。出于此目的，使用在配制品缓冲液中制备的1％PS 80储备溶液。
制备了配制品缓冲液中的0.01％重量/体积的PS80储备溶液，并以约80L/m2冲洗降低生物负载的过滤器(Opticap XL 600)，以用PS80饱和了过滤器上的电荷位。过滤器的出口与Y相连，方式为将Y的一个臂连接到冲洗缓冲袋以收集冲洗缓冲液，并将另一臂与Mobius袋连接以收集最终DS。通过将空气泵入过滤器，去除了SHC过滤器外壳中剩余的痕量缓冲液。从过滤器中去除剩余的缓冲液后，将冲洗缓冲液收集袋夹紧，并开始在产品收集袋中进行DS过滤。过滤之前，直接从滞留物槽获得最终DS浓度样品，并获得三个浓度测量值。
将两个病毒过滤池(子批次)组合在一起，以成为一个UFDF/DS/DP批次。DS和DP之间常见的产品质量测定仅进行一次测试。比较了药物物质和药物产品过程的质量目标产品特征，均在规格范围内。
然后使用0.2μ降低生物负载的过滤器对UFDF/DS/DP批次进行过滤，然后收集到储存袋中。将袋连接到Vanrx SA25单元(加拿大不列颠哥伦比亚省本拿比(Burnaby，BritishColumbia，Canada))，并且在填充/精加工药物产品之前对原料药物产品进行无菌过滤。实例2缓冲液清洁后UFDF膜循环
本实验使用按比例缩小的单次使用稳定化纤维素基亲水性膜对超滤-渗滤性能进行了评估，并在制造中的单次使用UFDF橇的平衡缓冲液清洗代表后重复使用了膜，以确定循环和加料条件对UFDF过程和产品质量性能的影响，其中使用了半衰期延长的双特异性T细胞衔接子加料流。
在处理之前，将包含半衰期延长的双特异性T细胞衔接子HLE
Figure BDA0003180349690000431
的多模式阴离子(MMA)柱中的冷冻洗脱液池材料解冻。然后将洗脱液池材料负载到三个平衡的、稳定的、纤维素基的亲水性膜上，Sartocon Slice 200ECO(10kD MWCO截留)(德国戈廷根的赛多利斯公司(Sartorius，Goettingen，Germany))，柱(A，B，C)，膜面积为0.018m2，加料压力在20-36psi范围内，首次运行时负载71.4g/m2。将样品浓缩(UF1)到0.5g/L到4g/L范围内的中间目标，初始浓度目标参见表1，将样品用10体积的配制品缓冲液、10mM乙酸盐、180mM NaCl、在pH 5.0下进行渗滤。在池容器中回收样品，然后进行系统追踪(chases)以将池回收到足够在回收容器中进行混合和采样的体积。然后根据需要用配制品缓冲液将TFF池稀释至1-2g/L的目标浓度。
在第一循环后，将膜用平衡缓冲液、100mM乙酸盐、180mM NaCl在pH 5.0下冲洗，并在每个膜上进行归一化水渗透率(normalized water permeability)[NWP]测试以确定膜的一致性。归一化水渗透率(NWP)是清洁后膜清洁度的确定。在标准压力和温度条件下测量干净水通过膜的通量。通过每个膜的干净水通量速率以每小时每个膜面积的升数来测量(L/m2-h)。水通量除以跨膜压力即为归一化水渗透率或NWP(L/m2-h-巴)。将NWP值与初始(预处理)水平进行比较，并可以分析其随时间的趋势。
将UFDF洗脱液收集为所有运行的原料池，并分析产品质量。在病毒滤液中评估产品质量属性：使用尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)确定高分子量(HMW)杂质，使用毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS或r-CE)分析在还原条件下确定片段(clips)，并且使用阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)确定电荷特征、酸性和碱性变体。
然后，对膜B和C进行两个以上的循环，如表1所概述。
在高负载下，所有膜均受到挑战，负载了71.4g/m2膜面积，而不是典型的55g/m2。运行1是在单一Sartocon膜(A)上进行的一个完整循环，而对所述膜没有进行任何另外的循环。运行2-4是在单一Sartocon膜(B)上进行的，没有腐蚀性化学清洗，仅在循环之间进行缓冲液冲洗，每次运行在三天的时间段内连续进行一天，每天一个循环(运行之间暂停10到12个小时)。运行5-7是在单一Sartocon膜(C)上进行的，没有腐蚀性化学清洗，仅在循环之间进行缓冲液冲洗，并且快速连续的、在循环之间没有任何暂停的进行所述运行。所有实验均使用AKTA横流UF/DF橇(伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗集团(GE Healthcare，Chicago，Ill))进行。
表1：膜运行的实验细节。
Figure BDA0003180349690000451
图2显示了从多运行中心点1[运行5]开始的每次运行后Sartocon膜的NWP回收百分比值。还显示了，在过程表征期间在类似的膜上进行的20个循环后观察到的最小NWP回收％。多运行中心点3[运行7]后NWP回收％高于最低回收％。此观察结果表明，在三个循环之间，在运行之间仅进行缓冲液清洗就足以保持NWP回收％远高于20个循环中观察到的最小值。这进一步提供了数据，即使不进行任何类型的腐蚀性化学清洗[例如，不使用氢氧化钠CIP]，膜也不会损失渗透性并且足以在仅进行缓冲液冲洗后再用于处理，至少持续三个循环。
表2汇总了所有进行的运行的负载和最终池的产品质量值(HMW％、片段％、酸性％、碱性％)。所有运行的最终池HMW％，无论较高的负载和较高的初始浓度都是相当的。总体而言，如在这些实验中建模的稳定化纤维素基亲水性膜的产品质量性能满足了临床和商业过程的需求和规格。从过程性能的角度来看，用平衡缓冲液冲洗膜也足以进行另外的循环负载，直至71.4g/m2。
表2：所有运行的产品质量数据：HMW％、片段％、酸性％和碱性％
Figure BDA0003180349690000461
Figure BDA0003180349690000471
实例3UFDF的高膜负载和增加的渗滤体积
本实验使用半衰期延长的双特异性T细胞衔接子分子加料流，使用再生纤维素膜评估了超滤-渗滤性能，所述再生纤维素膜特别受到高膜负载和增加的渗滤体积量对产品质量性能的挑战。
在处理之前，将包含半衰期延长的双特异性T细胞衔接子的多模式阴离子(MMA)色谱柱的冷冻洗脱液池材料解冻。然后将洗脱液池材料负载到再生纤维素膜(Pellicon 3(10kD MWCO截留)(马萨诸塞州丹佛斯的EDM密理博公司(EDM Millipore，Danvers，MA))上，膜面积为0.0088m2。实验条件总结在表3中。所有实验均使用AKTA横流UF/DF橇(伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗集团(GE Healthcare，Chicago，Ill))进行。
将过滤器用100mM乙酸盐、180mM NaCl、pH 5.0平衡。膜平衡后，将洗脱液池材料浓缩至所需的初始浓度，参见表3，加料流量为≥10L/m2。浓缩后，将池材料用10或13个渗滤体积的配制品缓冲液、10mM谷氨酸、9％蔗糖、pH 4.2进行渗滤，参见表3。将产品回收到池容器中，然后进行系统追踪，以将池回收到足够的体积，以在回收容器中进行和采样。然后用配制品缓冲液将TFF池稀释至目标浓度。
表3：高负载和高渗滤体积的实验细节(DV)
Figure BDA0003180349690000481
与其他运行相比，运行4具有最高的MHW％，但低于可接受的质量目标<5％，表4。
表4：所有运行的产品质量数据：HMW％、片段％、酸性％和碱性％
Figure BDA0003180349690000482
Figure BDA0003180349690000491
实例4配制的双特异性T细胞衔接子的病毒过滤
本实验证明了在配制品缓冲液中对半衰期延长的双特异性T细胞衔接子
Figure BDA0003180349690000492
进行了病毒过滤。
在恒定压力下，使用过滤器系列中的亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纤维过滤器(PlavonaTM，生物实验公司(BioEx))和铜铵再生纤维素中空纤维过滤器(Planova 20N)、0.001m2病毒去除过滤器(伊利诺伊州格伦维尔的旭化成生物处理公司(Asahi KaseiBioprocesses，Glenville，Ill))，在配制品缓冲液(9％蔗糖，10Mm谷氨酸，pH 4.2)中，以不同浓度对半衰期延长的双特异性T细胞衔接子针对过程和产品质量性能进行评估。过滤器系列包括压力调节器，所述压力调节器连接到压力储存器，所述压力储存器具有与病毒去除过滤器连接的阀。病毒去除过滤器可直接至连接到天平的收集容器。将过滤器系列连接到计算机进行数据收集，并连接到压缩空气源以进行压力调节。
通过测量预定时间间隔收集的滤液量[mL或L]，然后除以所使用的过滤器的有效过滤表面积来确定体积载量。根据瞬时通量除以初始通量，然后从1中减去所述值来确定通量衰减(通量衰减＝1-通量损失＝1-[J/J0])。初始通量-J0是缓冲液渗透率，因此通量衰减相对于-J0进行了归一化，并以百分比表示。将病毒滤液收集为原料池用于所有运行，并分析产品质量。特别地，在病毒滤液中评估产品质量属性：使用尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)确定高分子量(HMW)杂质，使用毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS或r-CE)分析在还原条件下确定片段(clips)，并且使用阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)确定电荷特征、酸性和碱性变体。
使用等分试样的加料材料(解冻的或新鲜的)进行实验，并在表5中提供的运行1-6中每一个的条件下运行。加料材料为含有用10mM谷氨酸、9％蔗糖、pH 4.2配制的双特异性T细胞衔接子的纯化的洗脱液池。
表5：配制品缓冲液基质的实验运行细节
Figure BDA0003180349690000501
表6显示了按加料条件分开的每个运行的水力性能。结果显示为归一化通量衰减(与缓冲液渗透率相比)随体积载量(L/m2)的变化。
表6：配制品缓冲液基质-过滤总结结果
Figure BDA0003180349690000502
图3显示了不同加料条件对体积载量的影响。对于所有运行，除了高浓度和高pH运行外，加料条件(新鲜、延长贮存和高容量)对通量衰减均无影响。
产品质量
在较高浓度(运行1)和pH值增加(运行6)下，HMW增加，导致分别73％和78％的通量衰减。PVDF过滤器在200L/m2时的过滤性低于通量衰减更高的铜铵再生纤维素过滤器，参见图4A HMW％、4B片段％、4C碱性％和4D酸性％。
在第二个实验中，在色谱池缓冲液(100mM乙酸盐，180mM氯化钠，pH 5.0)中，配制了半衰期延长的双特异性T细胞衔接子，并针对过程和产品质量性能进行了评估。在过滤器系列中使用了0.001m2(伊利诺伊州格伦维尔的旭化成公司(Asahi，Glenville，Ill))的铜铵再生纤维素中空纤维病毒去除过滤器(PlavonaTM20N)。使用等分试样的加料材料、在如表7中提供的运行7-13中每一个的条件下进行实验。
表7：色谱池缓冲液基质的实验细节
Figure BDA0003180349690000511
图5显示了色谱缓冲液基质中浓度、pH和电导率的影响。在pH 5.0时，两种浓度(1.77g/L和3.15g/L)的通量衰减都在13％以内(表8在pH 5.3时，浓度为6.82g/L时，通量衰减最小(3％)，而在pH 4.5下，通量衰减显著(32％)。这可能归因于聚集体的增加(>20％，在低pH下，图6A。在测试条件下，电导率对病毒过滤没有影响。无论压力(14、17或19psi)如何，通量衰减最小(表8)。
表8：色谱缓冲液基质的过滤结果
Figure BDA0003180349690000521
尽管与色谱缓冲液中的运行相比，配制品缓冲液基质中的通量较差，但仍在可接受的使用范围内。
实例5在病毒过滤期间双特异性T细胞衔接子的过程和产品质量性能
病毒过滤器通常在两种模式中的一种下运行，第一种是恒定压力模式，在这种模式下，通过使用压力调节器使进入的压力保持恒定。在这种模式下，通量随时间而下降，并且体积载量增加[L/m2]并以通量衰减与体积载量[L/m2]的关系绘制。在第二种恒定流量模式中，通过使用泵以恒定流速推动加料负载使通量保持恒定。在这种模式下，压力会随时间而增加，同时体积载量增加[L/m2]。通常将其以阻力[渗透率的倒数]与体积载量[L/m2]的关系绘制。
本实验评估了在恒定压力模式下正常流动过滤中的病毒过滤，并会扩展到在恒定流量模式下进行，以及在有和没有各种预滤器的情况下，加料条件[pH、电导率和浓度]对病毒过滤器水力性能和产品质量属性的影响，针对半衰期延长的双特异性T细胞衔接子(
Figure BDA0003180349690000531
A)加料流。
已对
Figure BDA0003180349690000532
Pro(VPro)(一种聚醚砜(PES)(3.1cm2细小病毒滞留过滤器)病毒过滤器)进行单独测试，以及与以下四种过滤器组合测试：两种表面改性预过滤器：
Figure BDA0003180349690000533
Pro Shield(Shield)(3.1cm2)和
Figure BDA0003180349690000534
Pro Shield H(Shield H)(3.1cm2)，表面改性聚醚砜膜过滤器；以及两个深层过滤器：
Figure BDA0003180349690000535
Prefilter(VPF)(5cm2)(一种吸附式深层过滤器)和Millistak+
Figure BDA0003180349690000536
Pro X0SP(X0SP)(5cm2/3.1cm2)(一种合成式深层过滤器，由双层硅胶助滤剂和聚丙烯腈纤维组成)，均来自密理博西格玛公司(马萨诸塞州伯灵顿)。
针对这些过滤器组合的过程和产品质量性能评估了半衰期延长的双特异性T细胞衔接子
Figure BDA0003180349690000537
A。
使用通过压力调节器连接的压缩空气源进行实验，所述压力调节器连接到具有阀的加压加料容器，所述阀连接到表面改性的膜预过滤器或深层过滤器，所述过滤器又连接到病毒过滤器。作为对照，将加料容器阀直接连接到单独病毒过滤器装置上。所述病毒过滤器可直接至连接到天平的收集容器。将过滤器系列连接到计算机进行数据收集，并连接到压缩空气源以进行压力调节。
将病毒过滤器的加料侧压力设置为恒定的30psi，并以预定的时间间隔测量滤液体积。在过滤器设置期间，病毒过滤器装置和表面改性的膜预过滤器或深层过滤器装置分别在30psi下用水冲洗。然后连接病毒过滤器装置和预过滤器或深层过滤器装置，并在30psi下进行缓冲液冲洗。每个病毒过滤器和预过滤器或深层过滤器装置的平均水和缓冲液流速以及渗透率都被记录，且在建议的限值之内。
通过测量预定时间间隔收集的滤液量[mL或L]，然后除以所使用的过滤器的有效过滤表面积来确定体积载量(VPro装置为3.1cm2)。根据瞬时通量除以初始通量，然后从1中减去所述值来确定通量衰减(通量衰减＝1-通量损失＝1-[J/J0])。初始通量-J0是缓冲液渗透率，因此通量衰减相对于-J0进行了归一化，并以百分比表示。将病毒滤液收集为原料池用于所有运行，并分析产品质量。特别地，在病毒滤液中评估产品质量属性：使用尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)确定高分子量(HMW)杂质，使用毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS或r-CE)分析在还原条件下确定片段，并且使用阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)确定电荷特征、酸性和碱性变体。
将加料材料(含有
Figure BDA0003180349690000541
A的纯化的洗脱液池)在处理前解冻。解冻后，将加料材料的等分试样调节至如表9中所描述的目标条件(pH、电导率、浓度)。表10中提供了运行1-16中每一个的条件。
表9：加料设计条件
Figure BDA0003180349690000542
表10：实验运行条件基于表10
Figure BDA0003180349690000543
Figure BDA0003180349690000551
图7-9显示了按加料条件分开的每个运行的水力性能。结果显示为归一化通量衰减(与缓冲液渗透率相比)随体积载量(L/m2)的变化。表11和图7-9给出了过滤结果的总结。表12给出了产品质量属性HMW％(SEC)、片段％(rCE)和酸性和碱性电荷特征(CEX)的总结。
表11：所有
Figure BDA0003180349690000561
A运行的体积载量数据
Figure BDA0003180349690000562
产品质量结果：
表12.
Figure BDA0003180349690000563
A的产品质量[SEC、CEX和rCE测定]
Figure BDA0003180349690000564
Figure BDA0003180349690000571
结果
1)
Figure BDA0003180349690000572
A的中点pH、低浓度、和低电导率(pH 5、电导率23mS/cm、1.75g/L)
水力性能
对于
Figure BDA0003180349690000581
A(pH 5，电导率23mS/cm，1.75g/L)运行1-3、6和9(表10)，在中点pH、低浓度和低电导率条件下对单独的病毒过滤器以及与表面改性的膜预过滤器和深层过滤器(Shield、Shield H、VPF和X0SP)组合的病毒过滤器进行了测试。与深层过滤器(VPF或X0SP)组合的病毒过滤器在通量衰减约10％时达到稳态。与表面改性膜过滤器(Shield或ShieldH)组合的病毒过滤器显示出更多的初始污染，但在通量衰减约25％-30％时也达到了稳态。无表面改性的膜预过滤器或深层过滤器的单独的病毒过滤器具有250L/m2的载量，并且观察到通量衰减为40％。参见表11(运行1-3、6和9)，图7。
产品质量
在测试的组合中，与深层过滤器(X0SP)组合的病毒过滤器对产品质量的影响最大，将聚集体水平(HMW％)降低至0.9％。参见表12(运行1-3、6和9)，图10A、10C、10E、10G、负载质量，表12(行(A))。
2)低pH、低浓度、低电导率条件(pH 4.2，23mS/cm，1.75g/L)
水力性能
在低pH、低浓度和低电导率条件下(pH 4.2、23mS/cm，1.75g/L)，测试单独的病毒过滤器或与深层过滤器(X0SP)和表面改性的预过滤器(Shield)组合的病毒过滤器(表10，运行4、5和10)。低pH条件对病毒过滤器和深层过滤器的组合影响不大，在300L/m2时通量衰减降至约15％，并显示出轻微的污染。单独的病毒过滤器和与表面改性的预过滤器组合的病毒过滤器都经历了80％的通量衰减，并在低pH条件下显示出显著的污染。参见表11(运行4、5和10)，图8。
产品质量
由于具有更好的聚集体去除能力，与单独的病毒过滤器或与表面改性的预过滤器组合的病毒过滤器(分别具有80％的通量衰减)相比，病毒过滤器与深层过滤器组合的通量衰减仅为15％。各种组合的片段和电荷特征相似，参见表12(运行4、5和10)，图10A、10C、10E和10G。
3)高pH、低浓度、低电导率(1.75g/L，pH 6，23mS/cm)
水力性能
在低浓度、高pH、低电导率条件下(1.75g/L，pH 6，23mS/cm)测试了单独的病毒过滤器或与表面改性的预过滤器(Shield H)组合的病毒过滤器，表10(运行7和8)。单独的病毒过滤器或与表面改性的预过滤器组合的病毒过滤器都具有约为20％的通量衰减。
产品质量
与表面改性的预过滤器组合的病毒过滤器在去除聚集体方面没有比单独的病毒过滤器更好。两种组合的电荷特征和片段均相似。参见表12(运行7和8)，图10A、10C、10E、10G。
4)低pH、高电导率、高浓度(7g/L，pH 4.2，23mS/cm)
水力性能
在低pH和高浓度条件下(7g/L，pH 4.2，23mS/cm)测试了与深层过滤器(X0SP)和两个表面改性的预过滤器(Shield和Shield H)组合的病毒过滤器，参见表10(运行11、12和14)。所有这三种组合的通量衰减都超过80％，参见表11(运行11、12和14)，图8。
产品质量
没有一种组合能够更有效地去除在这些条件下产生的聚集体的增加，在这三种中，病毒过滤器和预过滤器的组合在去除聚集体方面是最好的，参见表12(运行11、12和14)。在三种预过滤器条件下，电荷特征和片段相似，参见表12(运行11、12和14)，图10B、10D和10F，表12(行(B)和(D))。
5)高pH、高电导率、高浓度(7g/L，pH 6，28mS/cm)
水力性能
在高pH、高电导率和浓度条件下(7g/L，pH 6，28mS/cm)测试了与合成式深层过滤器(X0SP)和两个表面改性的预过滤器(Shield和Shield H)组合的病毒过滤器，参见表10(运行13、15和16)。所有这三种组合的通量衰减都超过90％，参见表11，图9，运行13、15和16。
产品质量
病毒过滤器和合成式深层过滤器的组合将聚集体水平降低到显著低的水平，即0.07％，将聚集体水平降低到非常低的水平，即0.07％，参见表12(运行13、15和16)，图10B、10D、10E、10H、表12(行(C))。
观察到，在中点pH 5.0和低电导率(pH 5，23mS/cm，聚集体水平3.8％)下7g/L浓缩的加料被滴定到pH 6.0，和高电导率(28mS/cm)时，与滴定至低pH 4.2、高和高电导率(28mS/cm)相比，聚集体的水平更低。在pH 6.0时，负载聚集体水平为2.92％，而在低pH(pH4.2)条件下为4.4％。可能存在最大阈值聚集体水平，与深层过滤器(X0SP)组合的病毒过滤器可从所述阈值降低，这可能是在高pH值时过滤器仍可降低聚集体水平的原因，尽管通量仍然很高。但是在低pH值时，它超出了理论上的最高水平。
实例6病毒过滤比较双特异性T细胞衔接子和单克隆抗体
使用病毒过滤器和深层过滤器的组合，针对过程和产品质量性能比较了半衰期延长的双特异性T细胞衔接子
Figure BDA0003180349690000601
A、和单克隆抗体(Mab A)。对于
Figure BDA0003180349690000602
A和Mab A，病毒过滤器是
Figure BDA0003180349690000603
Pro(VPro)，聚醚砜(PES)(3.1cm2)细小病毒滞留过滤器，将其与吸收式深层过滤器
Figure BDA0003180349690000604
预过滤器，(VPF)(5cm2)组合进行了测试，所有均来自密理博西格玛公司(马萨诸塞州伯灵顿)。
还使用VPro病毒过滤器和合成式深层过滤器
Figure BDA0003180349690000611
HC Pro X0SP(X0SP)(5cm2/3.1cm2)的组合测试了
Figure BDA0003180349690000612
A，两者均来自密理博西格玛公司(马萨诸塞州伯灵顿)。
Figure BDA0003180349690000613
A的负载浓度为低浓度(1.75g/L)，中点pH 5.0和中点电导率23mS/cm，参见实例5(运行6和9)。对于Mab A，将含有Mab A的洗脱液池调整至中点pH 6.7，电导率20mS/cm，和负载浓度为12.4g/L。
水力性能
对于Mab A，病毒过滤器和吸收式深层过滤器的组合能够达到>1000L/m2，其中通量衰减大约为约40％(4小时的处理时间)，而
Figure BDA0003180349690000614
A(与病毒过滤器/预过滤器组合)能够达到>250L/m2，但通量衰减大约为约10％。由于加料的限制，无法获得
Figure BDA0003180349690000615
A的更多数据。图11显示了pH和加料流浓度的归一化通量衰减与体积载量(L/m2)的关系。在低浓度和中至高pH[5或更高]，BiTE A(甚至在实例7中为BiTE B)下，使用VPF或合成式预过滤器时获得的体积载量类似于抗体。
产品质量
对于Mab A，负载池和病毒滤液池的样品显示HMW％实际上没有差异。对于
Figure BDA0003180349690000616
A，病毒过滤器和合成式深层过滤器的组合降低了病毒过滤器池中的聚集体水平(HMW％)，参见表12(运行9和行(A))。
使用VPro病毒过滤器和合成式深层过滤器(X0SP)的组合，还对
Figure BDA0003180349690000617
A进行了更高的负载浓度、pH和电导率(7g/L，pH，6.0和28mS/cm)的测试，如实例5(运行16)中所描述。图11显示了高pH和高加料流浓度的归一化通量衰减与体积载量(L/m2)的关系。对于Mab A，负载池和病毒滤液池显示HMW％实际上没有差异。对于更高的浓度和pH
Figure BDA0003180349690000621
A，病毒过滤器与合成式深层过滤器的组合能够显著降低病毒滤液池中的聚集体水平，参见表12(运行16和行(D))，图10A。
与在高浓度
Figure BDA0003180349690000622
A(7g/L)、高pH(6.0)和电导率(28mS/cm)下(具有较低的体积载量和显著的通量衰减)相比，在中点pH(6.7)和电导率(20mS/cm)下更容易过滤包含Mab A(12.7g/L)的加料流，从而实现相对较高的体积载量以及最小通量衰减，参见表11(运行13、15和16)。可能是在高浓度下，
Figure BDA0003180349690000623
A的聚集体含量与Mab A有所不同，后者在过滤前和过滤后池中的聚集体(％HMW)含量没有变化。对于
Figure BDA0003180349690000624
A，预过滤器去除了一些聚集体，但可能残留一些更高形式的聚集体，这可能是导致过滤性低的原因。
低加料浓度
Figure BDA0003180349690000625
A和Mab A的过滤性相似，参见图11。然而，即使加料浓度低，预过滤器也能去除一些与
Figure BDA0003180349690000626
A相关的聚集体，并且残留的聚集体的含量可能使得
Figure BDA0003180349690000627
A的过滤性相对较高，并且在较小通量衰减(10％)下实现了高体积载量[>250L/m2]，参见图10A和表12(运行9)。对于
Figure BDA0003180349690000628
合成式深层过滤器对从负载中去除聚集物非常敏感，在滤液池中为2.96％(参见表12，行(A))至0.92％(参见表12，运行9)，而吸收式深层过滤器在相同条件下降低至2.37％(参见表12，运行6)。吸收式深层过滤器和合成式深层过滤器之间的总体差异在于，一个是合成式，在这些条件下，所述合成式过滤器可能更适合去除
Figure BDA0003180349690000629
形成的聚集体类型。
实例7
Figure BDA00031803496900006210
B的病毒过滤性能
本实验评估了在恒定压力模式下正常流动过滤中的病毒过滤，以及在有和没有各种预滤器的情况下，加料条件[pH、电导率和浓度]对病毒过滤器水力性能和产品质量属性的影响，针对半衰期延长的双特异性T细胞衔接子(
Figure BDA00031803496900006211
B)分子加料流，如实例6中所描述。
如实例6中所描述，测试单独的
Figure BDA0003180349690000631
Pro(VPro)、聚醚砜(PES)(3.2cm2)细小病毒滞留病毒过滤器，以及与以下的组合：表面改性的聚醚砜膜预过滤器
Figure BDA0003180349690000632
ProShield H(Shield H)(3.2cm2)；以及两个深层过滤器，一个吸附式深层过滤器
Figure BDA0003180349690000633
预过滤器(VPF)(5cm2)和一个合成式深层过滤器
Figure BDA0003180349690000634
HC Pro X0SP(X0SP，由双层硅胶纤维和聚丙烯腈纤维组成)(5cm2)，均来自密理博西格玛公司(马萨诸塞州伯灵顿)。过滤病毒后，针对产品质量和性能评估
Figure BDA0003180349690000635
B。实验中使用的加料条件示于表13中，且基于加料条件的运行条件提供于表14中。
表13加料设计条件
Figure BDA0003180349690000636
表14实验运行条件
Figure BDA0003180349690000637
仅针对病毒滤液池中的高分子量聚集体获得
Figure BDA0003180349690000642
B的产品质量特征，表16。对于中点pH和低电导率条件(pH 5.9，1.81g/L，31.36mS/cm)(表14，运行17-20)，与病毒过滤器和吸收式深层过滤器(VPF)或表面改性的预过滤器(Shield H)的组合相比，病毒过滤器与合成式深层过滤器(X0SP)的组合去除了更高百分比的聚集体(表15，运行17-20)。病毒过滤器与任一个预过滤器的组合都不会导致显著的通量衰减(参见图13，表15(运行17-20))。
对于低pH、低电导率条件(1.81g/L，pH 4.2，31.36mS/cm)(运行23、24)，与病毒过滤器和表面改性的预过滤器的组合的80％通量衰减相比，病毒过滤器和合成式深层过滤器的组合具有20％的通量衰减(参见图14，表15，运行23-24)。从产品质量的角度来看，与合成式深层过滤器组合的病毒过滤器(1.6％)(参见表16，运行24)比与表面改性的预过滤器组合的病毒过滤器(2.1％)(表16，运行23-24)在去除高分子量聚集体方面稍好，参见图15。
对于高pH、高电导率条件(1.81g/L，pH 5.9，45mS/cm)(表14，运行21-22)，与合成式深层过滤器或表面改性的预过滤器组合的病毒过滤器具有非常低的通量衰减，分别为3.7％和5.2％(参见图14，表15(运行21-22))，但是从产品质量的角度来看，病毒过滤器与合成式预过滤器的组合在去除高分子量聚集体方面的效果非常好，最终值为0.3％，而病毒过滤器与表面改性的预过滤器的组合为1.8％，效果不是很好(参见表16(运行21-22)，图15)。在中点pH、低电导率条件下，较高的电导率似乎并未显著改变水力性能和聚集体去除性能(表16，运行20与运行22相比)。
表15显示了体积载量和通量衰减％的总结
Figure BDA0003180349690000641
Figure BDA0003180349690000651
表16：产品质量结果
Figure BDA0003180349690000652
对于BiTE B，在中点pH条件下，单独病毒过滤器能够在相对较低的通量衰减下提供良好的体积载量，添加预过滤器可以降低通量衰减。然而，合成式预过滤器可显著减少聚集体。在中点pH和高电导率下，表面改性和合成式深层预滤器在低通量衰减下均表现良好，具有高体积载量，但只有合成式深层过滤器能够显著去除聚集体。
在低pH和低电导率下，只有合成式深层过滤器提供高体积载量以及最小通量衰减，而表面改性的预过滤器则具有显著的通量衰减，并且与合成式深层预过滤器相比，达到的载量相对较小。在这种条件下，所有测试的预过滤器都无法显著去除聚集体。

Claims (71)

1.一种用于生产重组生物治疗剂的整体化、连续的方法，所述方法包括
提供纯化的重组目的蛋白；
通过超滤来浓缩或稀释所述纯化的重组蛋白；
通过渗滤对所述纯化的重组蛋白进行缓冲液交换至所需配制品；
通过超滤进一步稀释或浓缩配制的重组蛋白，直到达到目标浓度；
一旦达到所述目标浓度，就添加或组合至少一种增强稳定性的赋形剂；
对所得的原料药物物质进行过滤以减少生物负载；
对所得的原料药物产品进行无菌过滤；和
对无菌的原料药物产品进行填充和精加工操作；
其中所述纯化的重组蛋白和所述原料药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述增强稳定性的赋形剂同时添加到所述配制的重组蛋白中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述增强稳定性的赋形剂直接添加到超滤和渗滤(UFDF)滞留物加料槽中。
4.根据权利要求3所述的方法，其中一旦达到所述目标浓度，就将所述增强稳定性的赋形剂直接同时添加到所述UFDF滞留物加料槽中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述增强稳定性的赋形剂是非离子型洗涤剂或表面活性剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述增强稳定性的赋形剂是基于聚氧乙烯(PEO)的表面活性剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述增强稳定性的赋形剂选自聚山梨酯80和聚山梨酯20。
8.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种增强稳定性的赋形剂的浓度为从0.001％至0.1％(重量/体积)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中将所述原料药物产品收集在储存容器中。
10.根据权利要求1所述的方法，其中将所述原料药物产品递送到无菌处理设施。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述无菌处理设施包括至少一个填充站。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述无菌处理设施包括至少一个不戴手套的无菌隔离器。
13.根据权利要求1所述的方法，其中将所述原料药物产品收集在储存容器中，并直接递送到所述无菌处理设施。
14.根据权利要求10所述的方法，其中将所述储存容器连接到所述无菌处理设施。
15.根据权利要求12所述的方法，其中将含有所述原料药物产品的储存袋、或处理所述原料药物产品的过滤器的输出连接到不戴手套的无菌隔离器。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述无菌处理设施具有与含有所述原料药物产品的储存容器、或处理所述原料药物产品的过滤器单元的输出的连接。
17.根据权利要求1所述的方法，其中用无菌的原料药物产品填充初级药物产品容器。
18.根据权利要求17所述的方法，其中将所述初级药物产品容器密封、贴标签和包装。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在一个或多个步骤之间存在连续流。
20.根据权利要求1所述的方法，其中将来自UFDF和/或减少生物负载过滤的池收集到储存容器中。
21.根据权利要求1所述的方法，其中将所述配制的重组蛋白稀释，直到达到目标浓度。
22.根据权利要求1所述的方法，其中将所述配制的重组蛋白通过超滤浓缩，直到达到目标浓度。
23.根据权利要求1所述的方法，其中使用稳定的纤维素基亲水性膜进行所述超滤，所述膜负载高达72g/m2膜面积。
24.根据权利要求1所述的方法，其中在目标浓度小于或等于3.20mg/ml下，使用稳定的基于亲水性膜进行所述超滤。
25.根据权利要求1所述的方法，其中使用稳定的纤维素基亲水性膜进行所述超滤，所述膜的目标过量浓度为初始浓度的1.1x至2.5x。
26.根据权利要求1所述的方法，其中使用再生纤维素、碱稳定的膜进行所述超滤和渗滤，所述膜负载高达170g/m2膜面积。
27.根据权利要求1所述的方法，其中使用再生纤维素、碱稳定的膜进行所述超滤和渗滤，所述膜的中间目标过量浓度小于或等于9g/L、具有高达13个渗滤体积。
28.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括至少一个病毒过滤操作。
29.根据权利要求28所述的方法，其中在所述UFDF操作之后进行至少一个病毒过滤操作。
30.根据权利要求28所述的方法，其中在将所述增强稳定性的赋形剂同时添加到所述配制的重组蛋白中或在将所述增强稳定性的赋形剂增强稳定性的赋形剂添加到UFDF滞留物槽中后，进行至少一个病毒过滤操作。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中对具有5g/L或更小的配制品浓度的双特异性T细胞衔接子进行所述病毒过滤操作。
32.根据权利要求28所述的方法，其中病毒过滤器选自亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纤维过滤器、铜铵再生纤维素中空纤维过滤器、或聚醚砜(PES)细小病毒滞留过滤器。
33.根据权利要求28所述的方法，其中至少一个病毒过滤操作还包括预过滤器。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述预过滤器是深层过滤器。
35.根据权利要求1所述的方法，其中在无菌过滤之前，添加一种或多种另外的纯化的重组目的蛋白或药物物质。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化的目的蛋白是抗原结合蛋白。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是多特异性蛋白。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述多特异性蛋白是双特异性抗体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述双特异性蛋白是双特异性T细胞衔接子。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述双特异性T细胞衔接子的一个结合结构域对选自EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、CD19、CD33、CD38、FLT3、CDH3、BCMA、PSMA、MUC17、CLDN18.2、或CD70的靶细胞上的肿瘤相关表面抗原具有特异性。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述双特异性T细胞衔接子选自博纳吐单抗、帕妥昔珠单抗、AMG103、AMG330、AMG212、AMG160、AMG420、AMG-110、AMG562、AMG596、AMG427、AMG673、AMG675、或AMG701。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的药物产品。
44.一种用于生产重组蛋白药物产品的方法，所述方法包括
将表达目的蛋白的细胞扩增到N-1期；
用所扩增的细胞接种和/或加料生物反应器，并培养所述细胞以表达重组目的蛋白；
通过收获单元操作回收所述重组蛋白；
通过至少一个捕获色谱单元操作纯化所述收获的重组蛋白；
通过至少一个精制色谱单元操作纯化所述重组蛋白；
对所述纯化的重组蛋白进行超滤和渗滤单元操作，所述超滤和渗滤单元操作包括
通过超滤来浓缩或稀释所述纯化的重组蛋白；
通过渗滤对所述纯化的重组蛋白进行缓冲液交换至所需配制品；
通过超滤进一步稀释或浓缩配制的纯化的重组蛋白，直到达到目标浓度，
将一种或多种增强稳定性的赋形剂直接添加到含有所述配制的纯化的重组蛋白的UFDF滞留物加料槽中，得到配制的药物物质；
对所述配制的药物物质进行单一单元操作以降低生物负载，得到过滤的原料药物产品；
无菌过滤所述原料药物产品；
用无菌的原料药物产品填充初级药物产品容器；和
对所述初级药物产品容器进行密封、贴标签和包装；
其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。
45.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求44所述的重组蛋白药物产品。
46.一种用于减少药物产品生产过程的制造空间占用的方法，所述方法包括
对纯化的重组目的蛋白进行超滤和渗滤(UFDF)单元操作直至达到目标浓度；
将至少一种增强稳定性的赋形剂直接添加到所述UFDF滞留物加料槽中；
对所述原料药物物质进行单一单元操作以降低生物负载，然后进行无菌过滤；
对无菌的原料药物产品进行填充和精加工单元操作；
其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。
47.根据权利要求46所述的方法，其中将含有所述原料药物产品的储存容器连接到无菌处理设施。
48.根据权利要求46所述的方法，其中无菌处理设施具有与含有所述原料药物产品的储存容器、或处理所述原料药物产品的过滤器的输出的连接。
49.根据权利要求46所述的方法，其中在一个或多个步骤之间存在连续流。
50.根据权利要求46所述的方法，其中在所述UFDF单元操作之后进行至少一个病毒过滤单元操作。
51.一种用于在重组治疗蛋白制造期间减少药物物质损失和/或不稳定的方法，所述方法包括
对纯化的重组目的蛋白进行UFDF单元操作；
一旦达到目标浓度，就将至少一种增强稳定性的赋形剂添加到UFDF滞留物加料槽中；
对UFDF池进行单一过滤以降低生物负载，得到原料药物物质；
其中所述重组蛋白和所述药物物质都不经过冷冻和解冻单元操作。
52.一种用于减少包含重组双特异性T细胞衔接子的组合物中病毒污染物的方法，所述方法包括
提供样品，所述样品包含小于7.0g/L的重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH小于或等于6.0、具有23-45mS/cm的电导率；
对所述样品进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括单独的病毒过滤器、或与深层过滤器或表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器；和
在池中或作为流收集包含所述重组双特异性T细胞衔接子的病毒过滤器洗脱液。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述样品包含色谱柱池或流出物流。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述池或流的pH是4.2-6。
56.一种根据权利要求52所述生产的纯化的、重组半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
57.一种用于在制造重组双特异性T细胞衔接子期间减少高分子量种类的方法，所述方法包括
提供样品，所述样品包含小于7g/L重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH小于或等于6.0、具有23-45mS/cm的电导率；
对所述样品进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括与深层过滤器组合的病毒过滤器；和
在池中或作为流收集所述病毒过滤器洗脱液；
其中与使用包括单独的病毒过滤器、或与表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器的病毒过滤单元操作相比，过滤器洗脱液池中高分子量种类的百分比降低。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
59.一种用于在制造重组双特异性T细胞衔接子期间在病毒过滤单元操作中减少通量衰减和降低高分子量种类的方法，所述方法包括
提供样品，所述样品包含小于或等于1.75g/L的重组双特异性T细胞衔接子，所述衔接子的pH为4.2-6.0，电导率为23-45mS/cm；
对所述纯化的重组双特异性T细胞衔接子进行病毒过滤单元操作，所述病毒过滤单元操作包括与深层过滤器组合的病毒过滤器；和
在池中或作为流收集所述过滤器洗脱液；
其中与包括单独的病毒过滤器、或与表面改性的膜预过滤器组合的病毒过滤器的病毒过滤单元操作相比，过滤器洗脱液池或流中高分子量种类的百分比降低。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
61.一种用于生产纯化的、配制的重组双特异性T细胞衔接子的方法，所述方法包括；
通过一种或多种色谱单元操作纯化收获的重组双特异性T细胞衔接子；
对所述纯化的重组双特异性T细胞衔接子进行超滤和渗滤单元操作，得到浓度≤5g/L的配制的双特异性T细胞衔接子，并且
对所述配制的双特异性T细胞衔接子进行病毒过滤单元操作；
获得纯化的、配制的重组双特异性T细胞衔接子。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述配制的双特异性T细胞衔接子的浓度为≤3.2g/L。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述配制的双特异性T细胞衔接子的浓度为≤1.79g/L。
64.根据权利要求61所述的方法，其中所述双特异性T细胞衔接子是半衰期延长的双特异性T细胞衔接子。
65.根据权利要求61所述的方法，其中用稳定的纤维素基亲水性膜或再生纤维素膜进行超滤渗滤单元操作。
66.根据权利要求61所述的方法，其中用稳定的纤维素基亲水性膜进行所述超滤渗滤单元操作，所述膜在初始超滤目标浓度高达3.20g/L下负载高达71.4g/m2膜面积。
67.根据权利要求61所述的方法，其中用再生纤维素膜进行所述超滤渗滤单元操作，所述膜负载高达170g/m2膜面积、具有高达9g/L的中间目标过量浓度、具有高达13个渗滤体积。
68.根据权利要求61所述的方法，其中用亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纤维过滤器、铜铵再生纤维素中空纤维过滤器、或聚醚砜(PES)细小病毒滞留过滤器进行所述病毒过滤单元操作。
69.根据权利要求61所述的方法，其中使用铜铵再生纤维素中空纤维过滤器和浓度≤3.2g/L的配制的双特异性T细胞衔接子进行所述病毒过滤单元操作。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述配制的双特异性T细胞衔接子的浓度为≤1.79g/L。
71.根据权利要求61所述的方法，其中使用亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纤维过滤器和浓度≤1.79g/L的配制的双特异性T细胞衔接子进行所述病毒过滤单元操作。
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