KR20220092958A

KR20220092958A - 산물-관련 불순물을 제거하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피 동안의 고염 세척

Info

Publication number: KR20220092958A
Application number: KR1020227018752A
Authority: KR
Inventors: 말하 알. 암바이카; 루이스 디아즈; 나탈리아 고메즈; 벤자민 제이. 틸롯슨
Original assignee: 암젠 인크
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2022-07-04
Also published as: IL292602A; WO2021091933A1; CA3160208A1; MX2022005594A; EP4055042A1; AU2020377919A1; BR112022008782A2; AR120398A1; US20220372071A1; CL2022001169A1; JP2022554283A; TW202132323A; CN114651007A

Abstract

본 발명은 양이온 교환 정제 작업 동안 저등전위점 산물-관련 불순물의 제거 방법에 관한 것이다.

Description

산물-관련 불순물을 제거하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피 동안의 고염 세척

본 출원은 2019년 11월 7일자로 출원된 미국 가출원 제62/931,874호의 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.

개시의 분야

본 발명은 바이오약학 제조 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다중-특이적 단백질 양이온 교환 정제 작업의 산물-관련 불순물의 제거 방법에 관한 것이다.

항체 제품은 바이오약학 시장의 가장 큰 섹터이며 다음 십년 간 매출이 쉽게 수천 억에 달할 수 있다. 치료용 항체의 상업적 개발은 첫 번째 치료용 모노클로날 항체의 승인과 함께 1980년대에 시작되었으며 그 이래 계속해서 발전하고 확장되어 왔다. 모노클로날 항체는 높은 친화도 및 특이성으로 표적에 결합할 수 있고 일부 적응증을 치료하는 데 매우 성공적이었지만, 이는 또한 치료제로서 한계를 갖는다. 모노클로날 항체는 하나의 표적에만 결합할 수 있다; 그러나, 여러 질환은 다인자성이다. 암 면역치료법에서, 단일 표적을 목표로 하는 치료는 암 세포를 완전히 파괴하거나 부동화하는 데 충분하지 않을 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 치료법을 수여받는 일부 환자는 치료에 반응하지 못하거나 심지어 일정 시간 후 약물 내성이 발생할 수 있다.

새로운 항체-유사 구조, 예컨대 항체 Fab 단편, Fc-융합 단백질, 항체-약물 콘주게이트, 글리콜-조작된 항체, 및 가장 구체적으로, 이중특이적 및 다른 다중특이적 항체-유사 구조가 이러한 난해함에 대처하기 위해 개발되었다. 이러한 항체-유사 구조, 특히 이중특이적 항체는 전통적인 모노클로날 항체 치료제에 비해 개선, 예컨대 다중-표적 친화도를 부여하며, 더욱 더 난해한 치료 적응증에 대처하기 위해 개발될 수 있는 매우 다양한 포맷을 갖는 효과적인 차세대 바이오치료제인 것으로 증명되고 있다.

이중특이적 항체는 더욱 폭넓은 범위의 치료 적응증의 난해함에 대처하기 위해 계속 증가하는 다양한 프레임워크를 갖는 이러한 항체-유사 구조의 가장 다양한 그룹이다. 이러한 구조는 항체의 결합 특성을 표적화된 질환 적응증의 필요성에 적합하게 하는 프레임워크로 조작된 추가적인 분자적 특성과 조합한다. 이중특이적 항체는 다양한 적응증 및 용도, 예컨대 암에 대한 면역 반응을 위한 면역 효과기 세포의 종양 세포로의 재유도, 신호전달 경로의 차단, 종양 혈관신생의 표적화, 사이토카인의 차단, 혈액-뇌 장벽의 통과, 진단 검정, 병원체의 치료를 위해, 및 전달제로서 개발되고 있다(Sedykh et al., Drug Design, Development and Therapy 18(12), 195-208, 2018; Walsh, Nature Biotechnology, 32(10), 992-1000, 2014; Ecker et al., mAbs 7(1), 9-14, 2015; Spiess et al., Mol Immunol 67, 95-106, 2015; Fan et al., J Hematol & Oncology 8:130-143, 2015; Williams et al., Process Design for Bispecific Antibodies, Biopharmaceutical Processing, Development, Design and Implementation of Processes, Jagschies et al., editors, Elsevier Ltd, pages 837-855, 2018).

이러한 다중특이적 단백질의 개발은 특히 산물 불안정성 및 낮은 발현 수율을 포함하는, 새로운 바이오제조에 있어서의 난해함을 야기한다. 특히, 다중특이적 단백질의 정제는 산물-관련 변이체, 예컨대 동종이량체, 절반-항체, 응집물, 고분자량종 및 저분자량종 등의 형성에 의해 복잡해진다. 이러한 산물-관련 변이체는 관심 다중특이적 단백질과 유사한 구조적 및 물리적 특성, 예컨대 전하를 공유하여, 이를 정제 동안 분리하기 어렵게 만든다. 이러한 산물-관련 불순물은 다중특이적 완제 의약품의 수율 및 활성을 낮춘다.

관심 다중특이적 단백질과 유사한 전하(등전위점, pI)를 갖는 산물-관련 불순물은 양이온 교환 크로마토그래피 단위 작업 동안 다중특이적 단백질과 공동-용출되어, 정제를 복잡하게 만들고 수율을 낮출 수 있다. 용출 전에 저 pI 산물-관련 불순물을 분리하는 것이 유익할 것이다. 본원에서 기재된 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 동안 이러한 저 pI 산물-관련 불순물의 제거를 위한 고염 세척 조건을 제공함으로써 이러한 필요성에 대처한다.

본 발명은 다중특이적 단백질을 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 매질 상으로 로딩하는 단계; 양이온 교환 매질을 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척 완충액으로 세척하는 단계; 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계를 포함하는, 다중특이적 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, pH 4.91 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, pH 4.9, 5.0, 또는 5.1을 포함한다. 또 다른 관련된 구현예에서 세척 완충액은 100 mM 아세테이트를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서, 양이온 교환 매질은 적어도 3개의 세척 완충액으로 세척된다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척되며, 세척 완충액 중 적어도 하나는 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 관련된 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척되며, 세척 완충액 중 적어도 하나는 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 2개의 세척 완충액, 즉 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척 완충액, 그 다음으로는 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 관련된 구현예에서 양이온 교환 매질은 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 100 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 아세테이트, 105 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 또는 아세테이트, 125 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 관련된 구현예에서 양이온 교환 매질은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 또 다른 관련된 구현예에서 양이온 교환 매질은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 3개의 세척 완충액, 즉, 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제1 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 제2 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제3 세척 완충액 또는 아세테이트, 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 관련된 구현예에서 양이온 교환 매질은 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제1 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 100 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 아세테이트, 105 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 아세테이트를 포함하는 세척 완충액, 또는 아세테이트, 125 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제3 세척 완충액으로 세척된다. 관련된 구현예에서 양이온 교환 매질은 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제1 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 147 mM 염화나트륨을 포함하는 제2 세척 완충액, 이어서 아세테이트 를 포함하는 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 70 mM 염화나트륨을 포함하는 제3 세척 완충액으로 세척된다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 147 mM 염화나트륨을 포함하는 2.5 mM/CV의 세척 완충액으로 세척된다.

하나의 구현예에서 다중특이적 단백질은 구배에 의해 양이온 교환 매질로부터 용출된다. 관련된 구현예에서 구배는 선형 또는 단계 구배이다. 관련된 구현예에서 구배는 염 구배이다. 관련된 구현예에서 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액은 0 M 내지 1 M 염화나트륨을 포함한다. 또 다른 관련된 구현예에서 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액 중 적어도 하나는 70 mM 내지 500 mM 염화나트륨을 포함한다. 또 다른 관련된 구현예에서 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액 중 적어도 하나는 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액 및 하나의 용출 완충액은 125 mM 염화나트륨을 포함한다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 10 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 10 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서 양이온 교환 매질은 15 g/L 내지 30 g/L로 로딩된다. 관련된 구현예에서 양이온 교환 매질은 25 g/L 내지 40 g/L로 로딩된다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 10 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 105 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척되고 8 mM/CV의 염 구배로 용출된다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 15 g/L 내지 30 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 25 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 적어도 하나의 세척 완충액 및 하나의 용출 완충액은 125 mM 염화나트륨을 포함한다.

하나의 구현예에서 적어도 하나의 산물-관련 불순물은 동종이량체, 고분자량종, 절반 항체, 응집물, 저분자량종, 항체 단편, 또는 경쇄 미스-어셈블리이다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 단위 작업이 포함되는 정제 공정을 상술된 방법에 따라 수행하였다.

하나의 구현예에서 상기 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 및/또는 후에, 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼, 및/또는 혼합-모드 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 다중특이적 단백질을 정제하기 위한 하나 이상의 단위 작업을 추가로 포함한다.

하나의 구현예에서 다중특이적 단백질은 이중특이적 단백질이다. 하나의 구현예에서 다중특이적 단백질은 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서 정제된, 다중특이적 단백질을 상술된 방법에 따라 제조하였다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 수지이다.

본 발명은 다중특이적 단백질 및 다중특이적 단백질보다 낮은 pI를 갖는 적어도 하나의 산물-관련 불순물을 포함하는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 매질 상으로 로딩하는 단계; 양이온 교환 매질을 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계, 양이온 교환 매질을 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계를 포함하는, 양이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액 중 저 pI 산물-관련 불순물을 감소시키는 방법을 제공하며; 양이온 교환 크로마토그래피 용출액은 염화나트륨이 세척 완충액 제형에 포함되지 않은 대응하는 방법에서 회수된 양이온 교환 크로마토그래피 용출액에 비해 감소된 저 pI 산물-관련 불순물을 갖는다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 제3 세척 완충액으로 세척된다.

본 발명은 다중특이적 단백질 및 적어도 하나의 산물-관련 불순물을 포함하는 조성물을 평형화된 양이온 교환 칼럼 상으로 로딩하는 단계; 양이온 교환 매질을 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척하는 단계로서, 하나의 세척 완충액은 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는, 단계; 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 결합된 다중특이적 단백질을 용출하는 단계를 포함하는, 산물-관련 불순물을 감소시키기 위해 고염 세척 조건 하에 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서 조성물을 로딩하기 전에, 양이온 교환 매질은 염화나트륨을 함유하지 않는 완충액으로 평형화된다.

본 발명은 다중특이적 단백질을 발현하는 숙주 세포를 이용하여 생물반응기에서 세포 배양을 확립하는 단계; 다중특이적 단백질을 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계; 세포 배양으로부터 재조합 다중특이적 단백질을 수확하는 단계; 재조합 다중특이적 단백질을 친화도 정제하는 단계; 친화도 정제된 재조합 다중특이적 단백질을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 상으로 로딩하는 단계; 양이온 교환 수지를 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척으로 세척하는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계; 및 플로우 쓰루 모드(flow through mode)로 추가적인 크로마토그래피 매질 상으로 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피 용출액을 로딩하는 단계를 포함하는, 단리된, 정제된, 재조합 다중특이적 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서 추가적인 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 크로마토그래피 매질, 다중-모드 크로마토그래피 매질, 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 친화도 정제된 다중특이적 단백질은 용출액 풀에 있으며, 양이온 교환 매질 상으로 로딩하기 전에 저 pH 바이러스 불활성화, 이어서 중화를 거친다. 하나의 구현예에서 제3 크로마토그래피 매질로부터의 플로우 쓰루는 초여과 및 투석여과 단위 작업을 거친다. 하나의 구현예에서 단리되고 정제된, 재조합 다중특이적 단백질은 상술된 방법에 따라 제조된다. 하나의 구현예에서 단리되고 정제된, 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 약학 조성물을 상술된 방법으로 제조하였다.

도 1은 주요 산물, 이중-특이적 #1로 용출되는 산물-관련 불순물(동종이량체, NCG)을 나타낸다.
도 2는 고염 세척 조건 이후, 주요 산물보다 pI가 낮은 모든 산물-관련 불순물은 제2 및 제3 세척 단계 간의 칼럼에서 세척 제거되었음을 나타낸다. 기준선은 용출 전에 0으로 복귀하였다. 용출 피크는 하나의 피크로 감소되었다.
도 3은 여러 불순물이 칼럼 상에 잔류하였고 주요 산물과 함께 용출되었음을 나타낸다. 이러한 불순물에는 절반 항체(약 50% 절반 항체를 포함하는 분획 1 내지 4), 2X 경쇄-미스-어셈블리(분획 5 및 6), 및 고분자량(분획 12 내지 21)이 포함되었다.
도 4는 고염 세척이 용출 프로파일에서 4개의 피크에서 1개의 피크로 2X LC2 미스페어링된 종을 여전히 함유하는 작은 쇼울더를 가지며, 피크 수 감소를 초래하였음을 나타낸다(예상된 비 1과 비교하여 LC1/LC2가 0.11 미만임).
도 5는 가파른 용출 구배로 높은 로딩 밀도로부터 생성된 하나의 용출 피크를 나타낸다. 저 pI 산물-관련 불순물은 높은 로딩 밀도 하에 주요 산물로부터 분해되지 않았으며 환원 CE-SDS에 의해 나타난 바와 같이 대부분 분획 1 내지 3에 있다.
도 6은 더 얕은 구배를 이용한 로딩 밀도 저하가 주요 저 pI 산물-불순물을 미스페어링된 LC1 종을 함유하는 구별되는 피크로의 분리를 초래하였음을 나타낸다.
도 7은 고염 세척의 결과를 나타낸다. 용출 프로파일에서 불순물의 피크 수 감소가 존재하며, 대부분의 불순물은 제2 및 제3 세척 단계 동안 제거되었다. 제3 세척 단계는 용출의 시작 전에 UV 기준선을 0으로 재확립하여, 용출 프로파일을 좁히고, 훨씬 더 효율적인 수집 및 더 우수한 주요 산물의 품질을 초래하였다.
도 8은 고염 세척 조건 이후, 모든 저 pI 산물-관련 불순물(pI 6.8을 갖는 동종이량체종 및 저 pI를 갖는 임의의 응집된 종)이 칼럼을 통해 폐기물로 흐르거나 이의 함량을 시험하기 위한 "세척 풀"에 별도 수집되었음을 나타낸다. 기준선은 용출 전에 0으로 복귀하였다. 용출 피크는 하나의 피크로 감소되었다.

다중특이적 단백질의 다운스트림 처리와 관련된 문헌 내 정보가 많지 않으므로 모노클로날 항체용으로 개발된 플랫폼이 종종 적용된다(Shulka and Norman, Chapter 26 Downstream Processing of Fc Fusion Proteins, Bispecific Antibodies, and Antibody-Drug Conjugates, in Process Scale Purification of Antibodies Second Edition, Uwe Gottswchalk editor, p559-594, John Wiley & Sons, 2017). 다중특이적 단백질은 고도로 조작되며 이러한 단백질로 항체에 대해 전형적인 조건 하에 결합 및 용출 모드로 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 거치는 것은 다중특이적 단백질을 안정화하고/하거나 주요 산물과 함께 용출되는 산물-관련 불순물을 관리하기에는 충분하지 않을 수 있다. 이러한 산물-관련 불순물은 주요 산물보다 낮은 및 높은 등전위점을 모두 갖는다. 주요 산물보다 낮은 pI를 갖는 이들 산물-관련 불순물은 전-피크로서, 주요 산물과 함께 용출되는 것으로 확인되었다. 이러한 용출 프로파일은 강력하고, 지속 가능하며, 상업적인 규모의 제조 공정의 개발을 뒷받침하지 않는다.

고염 세척 전략의 사용은 주요 산물의 더 우수한 수율 및 순도를 초래하며 제조 공정을 개선하는 것으로 확인되었다. 고염 세척의 추가는 용출액 풀 중 낮은 pI 산물-관련 불순물을 용출 단계 전에 제거함으로써 이를 감소시켰다. 105 mM 내지 147 mM 범위의 염화나트륨을 이용한 세척 단계의 추가는 주요 산물보다 낮은 pI를 갖는 산물-관련 불순물이 세척 제거되거나, 용출 단계 전에 양이온 교환 매질로부터 용출되도록 하여, 용출 프로파일에서의 피크 수를 감소를 초래하였다. OD에 기반한 용출액의 자동 풀링은 전-피크가 존재하는 경우 어려워진다. 양이온 교환 크로마토그래피 프로토콜로의 고염 세척 단계의 포함은 용출 전 저 pI 산물-관련 불순물과 연관된 전-피크를 감소시켜, 용출 동안에 주요 산물의 수집 동안 보다 보존적 전략이 사용될 필요성을 줄이는 것으로 확인되었고, 이는 더 낮은 수율 및 덜 강력한 제조 공정을 초래할 가능성이 있었다.

본 발명은 다중특이적 단백질을 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 매질 상으로 로딩하는 단계; 양이온 교환 매질을 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척 완충액으로 세척하는 단계; 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계를 포함하는, 다중특이적 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 다중특이적 단백질 및 다중특이적 단백질보다 낮은 pI를 갖는 적어도 하나의 산물-관련 불순물을 포함하는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 매질 상으로 로딩하는 단계; 양이온 교환 매질을 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계, 양이온 교환 매질을 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계를 포함하는, 양이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액 중 저 pI 산물-관련 불순물을 감소시키는 방법을 제공하며; 양이온 교환 크로마토그래피 용출액은 염화나트륨이 세척 완충액 제형에 포함되지 않은 대응하는 방법에서 회수된 양이온 교환 크로마토그래피 용출액에 비해 감소된 저 pI 산물-관련 불순물을 갖는다.

본 발명은 다중특이적 단백질 및 적어도 하나의 산물-관련 불순물을 포함하는 조성물을 평형화된 양이온 교환 칼럼 상으로 로딩하는 단계; 양이온 교환 매질을 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척하는 단계로서, 하나의 세척 완충액은 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는, 단계; 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 결합된 다중특이적 단백질을 용출하는 단계를 포함하는, 산물-관련 불순물을 감소시키기 위해 고염 세척 조건 하에 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 방법을 제공한다.

본 발명은 다중특이적 단백질을 발현하는 숙주 세포를 이용하여 생물반응기에서 세포 배양을 확립하는 단계; 다중특이적 단백질을 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계; 세포 배양으로부터 재조합 다중특이적 단백질을 수확하는 단계; 재조합 다중특이적 단백질을 친화도 정제하는 단계; 친화도 정제된 재조합 다중특이적 단백질을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 상으로 로딩하는 단계; 양이온 교환 수지를 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척으로 세척하는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계; 및 플로우 쓰루 모드로 제3 크로마토그래피 매질 상으로 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피 용출액을 로딩하는 단계를 포함하는, 단리된, 정제된, 재조합 다중특이적 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에서 개시된 방법에 따라 사전 형성되는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 단위 작업이 포함되는 정제 공정을 제공한다.

본 발명은 본원에서 개시된 방법에 따라 제조된 정제된, 다중특이적 단백질을 제공한다.

본 발명은 본원에서 기재된 임의의 방법에 따라 제조된, 단리되고 정제된, 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 70 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 0 mM, 70 mM, 100 mM, 101 mM, 102 mM, 103 mM, 104 mM, 105 mM, 106 mM, 107 mM, 108 mM, 109 mM, 110 mM, 111 mM, 112 mM, 113 mM, 114 mM, 115 mM, 116 mM, 117 mM, 118 mM, 119 mM, 120 mM, 121 mM, 122 mM, 123 mM, 124 mM, 125 mM, 126 mM, 127 mM, 128 mM, 129 mM, 130 mM, 131 mM, 132 mM, 133 mM, 134 mM, 135 mM, 136 mM, 137 mM, 138 mM, 139 mM, 140 mM, 141 mM, 142 mM, 142 mM, 144 mM, 145 mM, 146 mM, 또는 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 0 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 70 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 105 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 147 mM 염화나트륨을 포함한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, pH 5.0 ± 0.05 내지 5.0 ± 0.1을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트 pH, 4.9, 5.0, 또는 5.1을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트 pH, 4.9, 5.0, 또는 5.1을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트 pH, 5.0을 포함한다. 세척 완충액은 산물-관련 불순물을 강력히 제거하기 위해 전도성의 변동성을 포함하여 0.05 내지 0.1 pH 단위만큼 더 높거나 더 낮을 수 있다.

하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 70 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 관련된 구현예에서, 아세테이트 농도는 100 mM이다.

하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 70 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 관련된 구현예에서, 아세테이트 농도는 100 mM이다.

하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 70 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 5.00 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.00 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서, 아세테이트 농도는 100 mM이다.

관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 염화나트륨, pH 5.00 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 70 mM 염화나트륨, pH 5.00 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 염화나트륨, pH 5.00 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 염화나트륨, pH 5.00 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 염화나트륨, pH 5.00 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 147 mM 염화나트륨, pH 5.00 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함한다. 관련된 구현예에서, 아세테이트 농도는 100 mM이다.

관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 70 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서, 아세테이트 농도는 100 mM이다.

관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 70 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 147 mM 염화나트륨, pH 4.9 내지 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서, 아세테이트 농도는 100 mM이다.

관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 70 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서, 아세테이트 농도는 100 mM이다.

관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 70 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 105 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 125 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 147 mM 염화나트륨, pH 4.9, 5.0 또는 5.1을 포함한다. 관련된 구현예에서, 아세테이트 농도는 100 mM이다.

하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 염화나트륨, pH 5.0 ±0.5% 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 105 mM 염화나트륨, pH 5.0 ±0.5% 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 125 mM 염화나트륨, pH 5.0 ±0.5% 내지 ± 0.1을 포함한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ±0.5% 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 70 mM 염화나트륨, pH 5.0 ±0.5% 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨, pH 5.0 ±0.5% 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 70 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 세척 완충액은 산물-관련 불순물을 강력히 제거하기 위해 전도성의 변동성을 포함하여 0.05 내지 0.1 pH 단위만큼 더 높거나 더 낮을 수 있다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액은 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 0 mM, 70 mM, 100 mM, 105 mM, 125 mM, 또는 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 세척 완충액은 아세테이트를 포함한다. 하나의 구현예에서 세척 완충액은 100 mM 아세테이트를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액의 pH는 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%이다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액의 pH는 4.9 내지 5.1이다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액의 pH는 4.9, 5.0, 또는 5.1이다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척되며 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함하며, 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 적어도 2개의 세척 완충액, 즉 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 하나의 세척 완충액, 그 다음으로는 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 적어도 2개의 세척 완충액, 즉 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 하나의 세척 완충액, 그 다음으로는 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척되며, 제1 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM NaCl을 포함하고, 제2 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액의 염화나트륨 농도는 100 mM, 105 mM, 125 mM, 및 147 mM 염화나트륨로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척되며, 제1 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM NaCl을 포함하고, 제2 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액의 염화나트륨 농도는 100 mM, 105 mM, 및 147 mM 염화나트륨로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 제1 완충액의 농도는 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨이며, 제2 세척 완충액의 농도는 100 mM 아세테이트, 125 mM 염화나트륨이다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 3개의 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액은 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 0 mM, 70 mM, 100 mM, 105 mM, 125 mM, 또는 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 세척 완충액은 아세테이트를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액은 100 mM 아세테이트를 포함한다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액의 pH는 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%이다. 하나의 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액의 pH는 4.9 내지 5.1이다. 하나의 구현예에서 적어도 세척 완충액의 pH는 4.9, 5.0, 또는 5.1이다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 적어도 3개의 세척 완충액으로 세척되며, 세척 완충액 중 적어도 2개는 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함하며, 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 적어도 3개의 세척 완충액, 즉 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 하나의 세척 완충액; 그 다음으로는 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액; 그 다음으로는 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM NaCl을 포함하며; 제2 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하고; 제3 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액의 염화나트륨 농도는 0 mM 염화나트륨이다. 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액의 염화나트륨 농도는 100 mM, 105 mM, 및 147 mM 염화나트륨로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액의 염화나트륨 농도는 0 mM 및 70 mM 염화나트륨로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 제1 세척 완충액 농도는 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨이며; 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 염화나트륨 및 100 mM 아세테이트, 105 mM 염화나트륨로부터 선택되고; 제3 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨이다. 하나의 구현예에서 제1 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨이며; 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 147 mM 염화나트륨이고 제3 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 70 mM 염화나트륨이다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 수지는 147 mM 염화나트륨을 포함하는 2.5 mM/CV의 세척 완충액으로 세척된다.

하나의 구현예에서 다중특이적 단백질은 구배에 의해 양이온 교환 매질로부터 용출된다. 관련된 구현예에서 구배는 선형 또는 단계 구배이다. 관련된 구현예에서 구배는 염 구배이다. 관련된 구현예에서 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액 중 적어도 하나는 0 M 내지 1 M 염화나트륨을 포함한다. 관련된 구현예에서 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액 중 적어도 하나는 70 mM 내지 500 mM 염화나트륨을 포함한다.

하나의 구현예에서 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액 중 적어도 하나는 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 관련된 구현예에서 적어도 하나의 세척 완충액 및 하나의 용출 완충액은 125 mM 염화나트륨을 포함한다.

하나의 구현예에서 조성물을 로딩하기 전에, 양이온 교환 매질은 염화나트륨을 함유하지 않는 완충액으로 평형화된다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 매질은 10 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 105 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척되고 8 mM/CV로 염 구배로 용출된다.

하나의 구현예에서 적어도 하나의 산물-관련 불순물은 동종이량체, 고분자량종, 절반 항체, 응집물, 저분자량종, 항체 단편, 또는 경쇄 미스-어셈블리이다.

하나의 구현예에서 친화도 정제된 다중특이적 단백질은 용출액 풀에 있으며, 양이온 교환 매질 상으로 로딩하기 전에 저 pH 바이러스 불활성화, 이어서 중화를 거친다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 수지이다.

하나의 구현예에서 제3 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 크로마토그래피 매질, 다중-모드 크로마토그래피 매질, 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 제3 크로마토그래피 매질로부터의 플로우 쓰루는 초여과 및 투석여과 단위 작업을 거친다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 및/또는 후에, 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼, 및/또는 혼합-모드 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 다중특이적 단백질을 정제하기 위한 하나 이상의 단위 작업이 제공된다.

하나의 구현예에서 다중특이적 단백질은 이중특이적 단백질이다. 하나의 구현예에서 다중특이적 단백질은 이중특이적 항체이다.

"다중특이적", "다중특이적 단백질" 및 "다중특이적 항체"는 동일한 항원 상의 적어도 2개의 상이한 항원 또는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합하고 이를 중화하도록 재조합적으로 조작된 단백질을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 다중특이적 단백질은 세포독성제의 종양 또는 감염제로의 표적화와 조합하여 면역 효과기를 표적화하도록 조작될 수 있다. 이러한 다중특이적 단백질은, 면역 효과기 세포를 종양 세포로 재유도하고, 신호전달 경로를 차단하여 세포 신호전달을 변형하고, 종양 혈관신생을 표적화하고, 사이토카인을 차단하기 위해, 그리고 약물의 사전 표적화된 전달 비히클, 예컨대, 화학치료제, 방사성 표지(검출 감도를 개선하기 위한) 및 나노입자(암 세포와 같은 특정 세포/조직에 대한)의 전달로서, 암 면역치료법에서와 같이, 다양한 적용 분야에 유용한 것으로 확인되었다.

다중특이적 단백질의 가장 일반적이고 가장 다양한 그룹은 본원에서 "이중특이적", "이중특이적 단백질" 및 "이중특이적 항체"로 나타내는, 2개의 항원에 결합하는 것들이다. 이중특이적 단백질은 하기 2개의 광의의 범주: 면역글로불린 G(IgG)-유사 분자 및 비-IgG-유사 분자로 그룹화될 수 있다. IgG 유사 분자는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC), 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 의존적 세포 포식작용(ADCP)과 같은 Fc 매개 효과기 기능을 보유하며, Fc 영역은 용해도 및 안정성을 개선하는 데 도움을 주며, 일부 정제 작업을 용이하게 한다. 비 IgG 유사 분자는 더 작아서, 조직 침투를 증진시킨다(Sedykh et al., Drug Design, Development and Therapy 18(12), 195-208, 2018; Fan et al., J Hematol & Oncology 8:130-143, 2015; Spiess et al., Mol Immunol 67, 95-106, 2015; Williams et al., Chapter 41 Process Design for Bispecific Antibodies in Biopharmaceutical Processing Development, Design and Implementation of Manufacturing Processes, Jagschies et al., eds., 2018, pages 837-855 참고). 이중특이적 단백질은 때때로 상이한 항원 또는 다수의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 추가 성분에 대한 프레임워크로서 사용되어, 분자의 결합 특이성을 증가시킨다.

이중특이적 항체가 포함되는 이중특이적 단백질의 포맷은 지속적으로 발전하고 있으며 쿼드로마(quadroma), 노브-인-홀(knob-in-hole), 크로스-맙(cross-Mab), 이중 가변 도메인 IgG(DVD-IgG), IgG-단쇄 Fv(scFv), scFv-CH3 KIH, 이중 작용 Fab(DAF), 절반분자 교환, κλ-바디, 탠덤 scFv, scFv-Fc, 디아바디, 단쇄 디아바디(sc디아바디), sc디아바디-CH3, 삼중체, 미니항체, 미니바디, TriBi 미니바디, 탠덤 디아바디, sc디아바디-HAS, 탠덤 scFv-독소, 이중 친화도 재표적화 분자(DART), 나노바디, 나노바디-HSA, DNL(dock and lock), 가닥 교환 조작된 도메인 SEED바디, 트리오맙(Triomab), 류신 지퍼(LUZ-Y), XmAb^®; Fab-아암(arm) 교환, DutaMab, DT-IgG, 하전된 쌍, Fcab, 직교 Fab, IgG(H)-scFv, scFV-(H)IgG, IgG(L)-scFV, IgG(L1H1)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFV-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, 자이바디(Zybody), DVI-Ig4(4-in-1), Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFV, F(ab')2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCAb, sc디아바디-Fc, 디아바디-Fc, 인트라바디, ImmTAC, HSA바디, IgG-IgG, Cov-X-바디, scFv1-PEG-scFv2, 이중특이적 T 세포 인게이저(BITE^®) 및 반감기 연장된 이중특이적 T 세포 인게이저(HLE BITE^®)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다(Fan 상기 문헌; Spiess 상기 문헌; Sedykh 상기 문헌; Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36(6) 458-67, 2010; Shulka and Norman, Chapter 26 Downstream Processing of Fc Fusion Proteins, Bispecific Antibodies, and Antibody-Drug Conjugates, in Process Scale Purification of Antibodies Second Edition, Uwe Gottswchalk editor, p559-594, John Wiley & Sons, 2017; Moore et al., MAbs 3:6, 546-557, 2011).

일부 구현예에서, 이중특이적 단백질에는 블리나투모맙, 카투막소맙, 에르투막소맙, 솔리토맙, 타고miR, 루티키주맙(ABT981), 바누시주맙(RG7221), 렘톨루맙(ABT122), 오조랄릭수맙(ATN103), 플로테우즈맙(MGD006), 파소툭시주맙(AMG112, MT112), 림포문(FBTA05), (ATN-103), AMG211(MT111, Medi-1565), AMG330, AMG420(B1836909), AMG-110(MT110), MDX-447, TF2, rM28, HER2Bi-aATC, GD2Bi-aATC, MGD006, MGD007, MGD009, MGD010, MGD011(JNJ64052781), IMCgp100, 인듐-표지된 IMP-205, xm734, LY3164530, OMP-305BB3, REGN1979, COV322, ABT112, ABT165, RG-6013(ACE910), RG7597(MEDH7945A), RG7802, RG7813(RO6895882), RG7386, BITS7201A(RG7990), RG7716, BFKF8488A(RG7992), MCLA-128, MM-111, MM141, MOR209/ES414, MSB0010841, ALX-0061, ALX0761, ALX0141; BII034020, AFM13, AFM11, SAR156597, FBTA05, PF06671008, GSK2434735, MEDI3902, MEDI0700, MEDI7352뿐만 아니라 이의 분자 또는 변이체 또는 유사체 및 상기 중 임의의 바이오시밀러가 포함될 수 있다.

다중특이적 단백질에는 또한 삼중특이적 항체, 4가 이중특이적 항체, 디아-, 트리아- 또는 테트라바디, 미니바디, 및 다중 표적에 결합할 수 있는 단쇄 단백질과 같은 항체 성분이 없는 다중특이적 단백질이 포함된다(Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163).

일부 구현예에서, 관심 다중특이적 단백질은 하나 이상의 CD 단백질, HER 수용체 패밀리 단백질, 세포 부착 분자, 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 전환 성장 인자(TGF), 인슐린-유사 성장 인자, 골유도 인자, 인슐린 및 인슐린 관련 단백질, 응고 및 응고 관련 단백질, 콜로니 자극 인자(CSF), 기타 혈액 및 혈청 단백질 혈액형 항원; 수용체, 수용체 관련 단백질, 성장 호르몬, 성장 호르몬 수용체, T-세포 수용체; 신경영양 인자, 뉴로트로핀, 릴렉신, 인터페론, 인터류킨, 바이러스 항원, 지단백질, 인테그린, 류마티스 인자, 면역독소, 표면 막 단백질, 수송 단백질, 호밍 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 및 면역어드헤신에 특이적으로 결합하고/하거나, 이를 중화하고/하거나 이와 상호작용한다.

일부 구현예에서, 관심 다중특이적 단백질은 단독으로 또는 임의의 조합으로 하기 중 하나 이상에 결합하고/하거나, 이를 중화하고/하거나 이와 상호작용한다: CD 단백질(CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD40, CD70, CD123, CD133, CD138, CD171, 및 CD174가 포함되지만 이에 제한되지 않음), HER 수용체 패밀리 단백질(예를 들어 HER2, HER3, HER4 포함), 및 EGF 수용체, EGFRvIII, 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 및 알파 v/베타 3 인테그린, 성장 인자(예를 들어 혈관 내피 성장 인자("VEGF")가 포함되지만 이에 제한되지 않음); VEGFR2, 성장 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 뮬러관-억제 물질, 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파), 에리트로포이에틴(EPO), 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들어 aFGF 및 bFGF 포함), 표피 성장 인자(EGF), 크립토(Cripto), 전환 성장 인자(TGF)(특히 TGF-α 및 TGF-β(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함) 포함), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 및 골유도 인자, 인슐린 및 인슐린 관련 단백질(인슐린, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 프로인슐린, 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질이 포함되지만 이에 제한되지 않음); (응고 및 응고 관련 단백질, 예를 들어 특히, 인자 VIII, 조직 인자, 폰빌레브란트(von Willebrand) 인자, 단백질 C, 알파-1-항트립신, 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 유로키나아제 및 조직 플라스미노겐 활성화제("t-PA"), 봄바진, 트롬빈, 트롬보포이에틴, 및 트롬보포이에틴 수용체, 콜로니 자극 인자(CSF)(특히 하기 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF 포함), 기타 혈액 및 혈청 단백질(알부민, IgE, 및 혈액형 항원이 포함되지만 이에 제한되지 않음), 수용체 및 수용체 관련 단백질(예를 들어 flk2/flt3 수용체, 비만(OB) 수용체, 성장 호르몬 수용체, 및 T-세포 수용체 포함); 신경영양 인자(골-유래 신경영양 인자(BDNF) 및 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6)이 포함되지만 이에 제한되지 않음); 릴렉신 A-사슬, 릴렉신 B-사슬, 및 프로릴렉신, 인터페론(예를 들어 인터페론-알파, -베타, 및 -감마 포함), 인터류킨(IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-23, IL-12/IL-23, IL-2Ra, IL1-R1, IL-6 수용체, IL-4 수용체 및/또는 수용체에 대한 IL-13, IL-13RA2, 또는 IL-17 수용체, IL-1RAP,; 바이러스 항원(AIDS 외피 바이러스 항원이 포함되지만 이에 제한되지 않음), 지단백질, 칼시토닌, 글루카곤, 심방 나트륨이뇨 인자, 폐 계면활성제, 종양 괴사 인자-알파 및 -베타, 엔케팔리나아제, BCMA, STEAP1, Ig카파, ROR-1, ERBB2, 메소텔린, RANTES(정상적으로 발현 및 분비된 T-세포의 활성화 시에 조절됨), 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드, Dnase, FR-알파, 인히빈, 및 액티빈, 인테그린, 단백질 A 또는 D, 류마티스 인자, 면역독소, 골형성 단백질(BMP), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 표면 막 단백질, 분해 가속 인자(DAF), AIDS 외피, 수송 단백질, 호밍 수용체, MIC(MIC-a, MIC-B), ULBP 1-6, EPCAM, 어드레신, 조절 단백질, 면역어드헤신, 항원 결합 단백질, 소마트로핀, CTGF, CTLA4, 에오탁신-1, MUC1, CEA, c-MET, 클라우딘(Claudin)-18, GPC-3, EPHA2, FPA, LMP1, MG7, NY-ESO-1, PSCA, 강글리오시드 GD2, 글랑글리오시드 GM2, BAFF, OPGL(RANKL), 미오스타틴, Dickkopf-1(DKK-1), Ang2, NGF, IGF-1 수용체, 간세포 성장 인자(HGF), TRAIL-R2, c-Kit, B7RP-1, PSMA, NKG2D-1, 세포예정사 단백질 1 및 리간드, PD1 및 PDL1, 만노스 수용체/hCGβ, TNF, TL1A, C형 간염 바이러스, 메소텔린 dsFv[PE38 콘쥬게이트, 레지오넬라-뉴모필라(lly), IFN 감마, 인터페론 감마 유도 단백질 10(IP10), IFNAR, TALL-1, 흉선 기질 림포포이에틴(TSLP), 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9(PCSK9), 줄기 세포 인자, Flt-3, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), OX40L, α4β7, 혈소판 특이적(혈소판 당단백질 Iib/IIIb(PAC-1), 전환 성장 인자 베타(TFGβ), 투명대 정자-결합 단백질 3(ZP-3), TWEAK, 혈소판-유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα), 스클레로스틴, 및 상기 중 임의의 생물학적 활성 단편 또는 변이체.

일부 구현예에서, 관심 다중특이적 단백질에는 CD3 및 CD19, EpCAM, CEA, PSA, CD33, BCMA, Her2, CD20, P-카드헤린, CD123, gpA33, 또는 B7H3이 포함되는 조합에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 이중특이적 항체에는 IL1α + IL1β가 포함되는 조합에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체가 포함될 수 있다.

다중특이적 단백질, 특히 이중특이적-기반 치료제는 과학적 또는 상업적 관심사일 수 있다. 다중특이적 단백질은 다양한 방식으로, 가장 일반적으로는 세포 배양 방법을 사용하여 재조합 동물 세포주에 의해 제조될 수 있다. 다중특이적 단백질은 세포내 제조되거나 이것이 회수되고/되거나 수집될 수 있는 배양 배지 내로 분비될 수 있고 "재조합 다중특이적 단백질", "재조합 다중특이적 항체", "재조합 이중특이적 단백질", 및 "재조합 이중특이적 항체"로 나타낼 수 있다. 용어 "단리된 다중특이적 단백질", "단리된 재조합 다중특이적 항체", "단리된 이중특이적 단백질", 및 "단리된 이중특이적 항체"는 이중특이적 단백질이 포함되는 다중특이적 단백질을 나타내며, 그 치료, 진단, 예방, 연구 또는 다른 용도를 방해할 단백질, 폴리펩티드, DNA 및/또는 다른 오염물 또는 불순물, 예컨대 산물-관련 불순물, 특히 저 pI 산물-관련 불순물로부터 정제 제거되었다. 관심 다중특이적 단백질에는 2개 이상의 표적, 특히 이로부터 유래된 표적, 이와 관련된 표적, 및 이의 변형이 포함되는, 하기 열거된 것 중의 표적에 결합함으로써 치료 효과를 발휘하는 다중특이적 항체가 포함된다.

"정제하기"란 조성물로부터 (부분적으로 또는 전체적으로) 적어도 하나의 산물-관련 불순물을 제거함으로써 조성물 중 다중특이적 단백질의 순도 정도를 증가시키는 것을 의미한다. 다중특이적 단백질의 회수 및 정제는 다운스트림 단위 작업, 특히, 이온 교환 크로마토그래피가 관여되는 작업에 의해 달성되어, 수율 및 산물 품질 표적(예컨대 감소된 산물-관련 불순물 및 증가된 산물 품질)에 부합하는 보다 "균일한" 다중특이적 단백질 조성물을 생성한다.

"산물-관련 불순물"은 관심 다중특이적 단백질의 산물-관련 변이체를 나타낸다. 일부 경우에서, 이러한 불순물은 용출 피크에서 주요 산물보다 낮은 pI를 갖는다. 산물-관련 불순물에는, 예를 들어, 동종이량체, 고분자량(HMW)종, 절반 항체, 응집물, 저분자량(LMW)종, 항체 단편 및 다양한 조합의 항체 단편, 및 경쇄 미스-어셈블리, 예컨대 2XLC, 3XLC, 또는 4XLC가 포함된다. "절반 항체"는, 예를 들어, 2개의 중쇄 폴리펩티드 간 불완전한 어셈블리 또는 상호작용의 손상으로 인해 형성될 수 있는 산물-관련 불순물을 나타낸다. 절반 항체는 단일 경쇄 폴리펩티드 및 단일 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. "동종이량체"는 산물-관련 불순물을 나타내며, 이는, 예를 들어, 동일한 표적에 대한 특이성을 갖는 중쇄 및 경쇄가 서로 페어링하는 대신 요망되는 이중특이적 이종이량체를 형성하기 위해 재조합하는 경우 형성될 수 있다. 이는 전형적으로 숙주 세포에서의 발현 동안에 일어난다. 조작된 잔기(예컨대 하전된 페어링된 돌연변이, 노브-홀(knob-hole) 등)를 통해 정확히 페어링하기 위해 다중쇄(예컨대 경쇄, LC)를 필요로 하는 다중특이적 작제물에 있어서, LC 및 HC 간 미스매치가 존재하는 경우 여전히 불순물을 가질 수 있으며, LC1은 HC1과 페어링하는 대신, HC2와 부정확하게 페어링할 수 있고(2xLC1), 또한 그 반대일 수 있다(2x LC2). 다중 특이적 단백질이 2가로, 각각의 관심 항원에 결합하기 위한 2개의 부위를 갖는 경우, 3X LC1, 4X LC1, 및 다른 조합의 미스페어링된 종을 가질 수 있다.

본원에서 개시된 바와 같이, 산물-관련 불순물의 pI는 요망되는 다중특이적 단백질의 pI보다 낮을 수 있고 주요 산물과 함께 용출될 수 있다. 더 낮은 pI를 갖는 산물-관련 불순물은 전-피크로서, 주요 산물 전에 용출된다. 단백질의 "등전위점" 또는 "pI"는 양전하가 단백질의 음전하와 균형잡힌 pH를 나타낸다. pI는 알려진 방법을 사용하여, 예컨대 단백질의 아미노산 잔기의 순 전하로부터 또는 등전위 초점형성에 의해 계산될/결정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 산물-관련 불순물 및 주요 산물의 pI간 차이는 적어도 0.5 pI 단위이다. 또 다른 구현예에서, 차이는 0.5 내지 3 pI 단위이다. 또 다른 구현예에서, 차이는 0.5 내지 2 pI 단위이다. 또 다른 구현예에서, 차이는 0.5 내지 1 pI 단위이다. 또 다른 구현예에서, 차이는 1 내지 3 pI 단위이다. 또 다른 구현예에서, 차이는 2 내지 3 pI 단위이다. 또 다른 구현예에서, 차이는 적어도 0.5, 1, 2, 또는 3 이상의 pI 단위이다.

관심 다중특이적 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 발현 시스템 및 작제물뿐만 아니라 이러한 발현 시스템 또는 작제물을 포함하는 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 다중특이적 단백질 인코딩 정보를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 내의 특정 위치 및/또는 구획으로 전달하고/하거나 수송하는 데 사용하기에 적합한 임의의 분자 또는 엔티티(entity)(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 바이러스 캡시드, 비리온, 네이키드(naked) DNA, 복합 DNA 등)를 의미한다. 벡터에는 바이러스 및 비 바이러스 벡터, 비 에피솜 포유류 벡터가 포함될 수 있다. 벡터는 종종 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 및 클로닝 벡터로 나타낸다. 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 벡터 자체의 복제를 허용하고, 이에 의해 그 안에 함유된 폴리뉴클레오티드의 복제물을 증폭시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 일반적으로 복제 원점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 및 선별 마커가 포함되지만, 이에 제한되지 않는 서열 성분을 함유할 수 있다. 이러한 요소는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

"세포" 또는 "세포들"에는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포가 포함된다. 세포는 별개로 또는 조직 또는 기관과 같은 고차 구조의 일부로서, 생체 외, 시험관 내, 또는 생체 내에 있을 수 있다. 세포에는 상업적 또는 과학적 관심사인 다중특이적 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작되는 "세포주"라고도 하는 "숙주 세포"가 포함된다. 숙주 세포는 전형적으로 무한한 시간 동안 배양에서 유지될 수 있는 1차 배양에서 발생하는 계통으로부터 유래된다. 숙주 세포의 유전적 조작에는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 이용한 세포의 형질감염, 형질전환, 또는 형질도입, 및/또는 달리 숙주 세포가 요망되는 재조합 다중특이적 단백질을 발현하게 하는 (예를 들어, 상동 재조합 및 유전자 활성화 또는 재조합 세포와 비재조합 세포의 융합에 의한) 변경이 관여된다. 관심 다중특이적 단백질을 발현하도록 세포 및/또는 세포주를 유전적으로 조작하는 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다.

숙주 세포는 임의의 원핵 세포(예를 들어, 대장균(E. coli)) 또는 진핵 세포(예를 들어, 효모, 곤충, 또는 동물 세포(예를 들어, CHO 세포))일 수 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입될 수 있다.

숙주 세포는 적절한 조건 하에 배양되는 경우 관심 다중특이적 단백질을 발현하며, 이는 후속적으로 배양 배지로부터(숙주 세포가 이를 배지 내로 분비하는 경우) 또는 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접(이것이 분비되지 않는 경우) 수집될 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 요망되는 발현 수준, 활성을 위해 요망되거나 필요한 단백질 변형(예컨대, 글리코실화 또는 인산화), 및 생물학적 활성 분자로의 폴딩의 용이성과 같은 다양한 요인에 의존할 것이다.

"배양" 또는 "배양하기"란 다세포 유기체 또는 조직 외부에서의 세포의 성장 및 증식을 의미한다. 포유류 세포에 적합한 배양 조건은 당분야에 알려져 있다. 세포 배양 배지 및 조직 배양 배지는 시험관 내 세포 배양 동안 숙주 세포의 성장에 적합한 배지를 나타내기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 전형적으로, 세포 배양 배지는 완충액, 염, 에너지원, 아미노산, 비타민 및 미량 필수 원소를 함유한다. 배양에서 적절한 숙주 세포의 성장을 뒷받침할 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다. 특히 배양된 숙주 세포에서 세포 성장, 세포 생활성 및/또는 재조합 단백질 생성을 최대화하기 위해 다른 성분이 추가로 보충될 수 있는 세포 배양 배지가 상업적으로 이용 가능하며, RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지 이글, F-12K 배지, Ham F12 배지, 이스코브 변형 둘베코 배지, 맥코이 5A 배지, 레이보비츠 L-15 배지, 및 특히, American Type Culture Collection 또는 SAFC Biosciences 및 기타 공급업체에서 얻을 수 있는 무혈청 배지, 예컨대, EX-CELL^TM 300 시리즈가 포함된다. 세포 배양 배지는 무혈청, 무단백질, 무성장인자, 및/또는 무펩톤 배지일 수 있다. 세포 배양은 또한 영양소의 첨가에 의해 풍부화될 수 있고, 보통의 권장 농도보다 높은 농도로 사용될 수 있다.

예를 들어, 한 단계(예를 들어, 성장 단계 또는 성장기)에서 또 다른 단계(예를 들어, 생산 단계 또는 생산기)로의 전이를 용이하게 하고/하거나 세포 배양 동안 조건(예를 들어, 관류 배양 중에 제공되는 농축된 배지)을 최적화하기 위해 배양의 수명 동안 다양한 배지 제형이 사용될 수 있다. 세포 성장을 촉진하고 단백질 발현을 최소화하기 위해 성장 배지 제형이 사용될 수 있다. 관심 단백질의 생산 및 세포의 유지(이때 새로운 세포 성장은 최소임)를 촉진하기 위해 생산 배지 제형이 사용될 수 있다. 활성 배양, 특히 유가식, 반관류식, 또는 관류식으로 작동되는 배양을 보충하고 유지하기 위해 피드(feed) 배지, 전형적으로 보다 농축된 성분, 예컨대 영양소 및 아미노산(이는 세포 배양의 생산기 과정 동안 소비됨)을 함유하는 배지가 사용될 수 있다. 이러한 농축된 피드 배지는 세포 배양 배지의 대부분의 성분을, 예를 들어 정상량의 약 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 12배, 14배, 16배, 20배, 30배, 50배, 100배, 200배, 400배, 600배, 800배, 또는 심지어 약 1000배 함유할 수 있다.

성장기는 생산기보다 높은 온도에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 성장기는 약 35℃내지 약 38℃의 제1 온도에서 발생할 수 있고, 생산기는 약 29℃ 내지 약 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 약 36℃ 또는 약 30℃ 내지 약 34℃의 제2 온도에서 발생할 수 있다. 또한, 단백질 생산의 화학적 유도제, 예컨대 카페인, 부티레이트, 및 헥사메틸렌 비스아세트아미드(HMBA)는 온도 변화와 동시에, 온도 변화 전에, 및/또는 온도 변화 후에 첨가될 수 있다. 유도제가 온도 변화 후에 첨가되는 경우, 이는 온도 변화 1시간 내지 5일 후, 선택적으로 온도 변화 1일 내지 2일 후에 첨가될 수 있다.

숙주 세포는 현탁 배양되거나, 고체 기재에 부착된 부착 형태로 배양될 수 있다. 세포 배양은 마이크로캐리어를 이용하거나 이용하지 않고 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러병, 진탕 플라스크, 또는 교반 탱크 생물반응기에서 확립될 수 있다.

세포 배양은 회분식, 유가식, 연속식, 반연속식, 또는 관류식으로 작동될 수 있다. CHO 세포와 같은 포유류 세포는 생물반응기에서 100 ml 미만 내지 1000 ml 미만의 더 소규모로 배양될 수 있다. 대안적으로, 1000 ml 내지 20,000 리터 초과 배지를 함유하는 더 대규모의 생물반응기가 사용될 수 있다. 단백질 치료제의 임상적 및/또는 상업적 규모의 바이오제조와 같은 대규모 세포 배양은 세포가 요망되는 단백질(들)을 생산하는 동안 수 주 및 심지어 수 개월 동안 유지될 수 있다.

산물-관련 불순물, 예컨대 동종이량체, 절반 항체 등이 요망되는 다중특이적 단백질과 유사할 수 있으므로, 전략 및 기법, 예컨대 노브 및 홀, 크로스맙(CrossMab), DVD IgG 등이 세포 배양 동안 요망되는 다중특이적 단백질에 대한 선택성을 증가시키기 위해 개발되었다. 그러나, 다운스트림 처리 동안 제거되어야 하는 제조된 일부 산물-관련 불순물은 여전히 존재할 것이다.

그 후, 생성되는 발현된 재조합 다중특이적 단백질은 세포 배양 배지로부터 수확될 수 있다. 현탁 세포로부터 단백질을 수확하는 방법은 당분야에 알려져 있으며, 산 침전, 가속화된 침강, 예컨대, 응집, 중력을 사용하는 분리, 원심분리, 음파 분리, 한외여과기, 마이크로필터, 접선류 필터, 교대 접선류, 심층, 및 충적 여과 필터를 사용하는 여과(막 여과 포함)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 원핵생물에 의해 발현되는 재조합 단백질은 당분야에 알려진 산화환원 폴딩 공정에 의해 세포질에서 봉입체로부터 회수된다.

그 후, 수확된 다중특이적 단백질은 하나 이상의 다운스트림 단위 작업을 통해, 잔류 세포 배양 배지, 세포 추출물, 요망되지 않는 성분, 숙주 세포 단백질, 부적절하게 발현된 단백질, 산물-관련 불순물 등과 같은 임의의 불순물로부터 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다.

수확된 세포 배양액으로부터 다중특이적 단백질의 정제는 포획 크로마토그래피를 이용하여 시작될 수 있다. 포획 크로마토그래피, 예를 들어 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 등은 관심 재조합 다중특이적 단백질에 결합할 매질, 예컨대 수지, 막, 겔 등을 사용한다. 이러한 물질은 당분야에 알려져 있으며 상업적으로 이용 가능하다. 친화도 크로마토그래피 옵션은, 예를 들어, 기질-결합 포획 기전, 앱타머-결합 포획 기전, 또는 보조인자-결합 포획 기전을 포함할 수 있다. Fc 성분을 함유하는 다중특이적 단백질에 있어서, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 기전, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 및 단백질 L이 사용될 수 있다. 관심 재조합 단백질은 폴리히스티딘 태그 또는 에피토프, 예컨대 FLAG^®로 태그화될 수 있고, 후속적으로 이러한 에피토프에 대한 특이적 항체를 사용하여 정제될 수 있다.

다운스트림 공정의 임의의 지점에서 바이러스 불활성화 및/또는 바이러스 여과가 관심 다중특이적 단백질을 포함하는 조성물로부터 바이러스 물질을 제거하기 위해 수행될 수 있다. 바이러스 불활성화를 달성하는 하나의 방법은 바이러스 불활성화를 달성하기 위한 낮은 pH 또는 기타 적합한 용액 조건에서의 인큐베이션이다. 낮은 pH 바이러스 불활성화에는 바이러스 불활성화된 용액을 하기 단위 작업의 요건에 더 적합한 pH로 재조정하는 중화 작업이 이어질 수 있다. 전형적으로, 중화는 pH 5 내지 7에서이다. 바이러스 불활성화되거나 중화된 바이러스 불활성화된 풀에는 또한, 임의의 생성 탁도 또는 침전을 제거하기 위해 여과, 예컨대 심층 여과가 이어질 수 있다. 바이러스 여과는 마이크로- 또는 나노-필터, 예컨대 Asahi Kasei(Plavona^®) 및 EDM Millipore(VPro^®)로부터 이용 가능한 필터를 사용하여 수행될 수 있다.

용어 "폴리싱"은 요망되는 최종 순도에 가까운 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 유체 조성물로부터 잔류 오염물 및 불순물, 예컨대 DNA, 숙주 세포 단백질, 산물-특이적 불순물, 변이체 산물 및 응집물, 그리고 바이러스 흡착을 제거하기 위해 수행되는 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 폴리싱은 유체 조성물에 존재하는 오염물 또는 불순물 또는 표적 재조합 다중특이적 단백질에 선택적으로 결합하는 크로마토그래피 칼럼(들) 또는 막 흡수체(들)를 통해 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 유체를 통과시킴으로써 결합 및 용출 모드로 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 크로마토그래피 칼럼(들) 또는 막 흡수체(들)의 용출액/여과액에는 재조합 다중특이적 단백질이 포함된다.

폴리싱 크로마토그래피는 플로우-쓰루 모드(다중특이적 단백질이 수지/막을 통해 흐르고 오염물 및 불순물이 크로마토그래피 매질에 결합되는 동안 플로우-쓰루 용리액 중에 함유됨), 전방 또는 오버로드된 크로마토그래피 모드(흡착 부위가 점유되고 정지상(관심 단백질)에 대해 최소 친화도를 갖는 종이 용출되기 시작할 때까지 관심 단백질을 함유하는 용액이 칼럼 상으로 로딩됨), 또는 결합 및 용출 모드(관심 단백질이 크로마토그래피 매질에 결합되고 오염물 및 불순물이 플로우 쓰루되거나 크로마토그래피 매질에서 세척 제거된 후 용출됨)로 사용될 수 있는 제제를 함유하는 매질, 예컨대 수지 및/또는 막을 사용한다. 이러한 크로마토그래피 작업의 예에는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)가 포함되는 이온 교환 크로마토그래피(IEX); 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC); 혼합 모드 또는 다중 모드 크로마토그래피(MM), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(HA); 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 및 겔 여과가 포함된다. 하나의 구현예에서 크로마토그래피 방법은 양이온 교환 크로마토그래피이다. 하나의 구현예에서, 양이온 교환 매질은 수지이다.

"양이온 교환 크로마토그래피"는 음으로 하전되고 고상 상에 또는 이를 통해 통과되는 수용액 중 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고상 매질 상에서 수행되는 크로마토그래피를 나타낸다. 전하는, 예를 들어, 공유 결합에 의해, 고상으로 하나 이상의 하전된 리간드를 부착함으로써 제공될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 전하는 고상의 내재적 특성일 수 있다(예를 들어, 전체 음전하를 갖는, 실리카의 경우에서와 같이). 상업적으로 이용 가능한 양이온 교환 매질이 이용 가능하며 특히 아가로스 상에 고정화된 설포프로필(SP)(예를 들어, SP-SEPHAROSE FAST FLOW^TM, SP-SEPHAROSE FAST FLOW XL^TM 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE^TM, GE Healthcare 판매), CAPTO S^TM, CAPTO SP ImpRes^TM, CAPTO S ImpAct^TM(GE Healthcare), FRACTOGEL-SO3^TM, FRACTOGEL-SE HICAP^TM, FRACTOPREP^TM(EMD Merck), Fractogel^® EMD SO3-(M), Fractogel^® EMD SE Hicap(M), Eshmuno^® CPX, Eshmuno^® S 수지, Fractogel^® EMD COO-(M), Mustang S Acrodisc와 Mustang S AcroPrep과 Mustang S, CM Ceramic HyperD^® F AcroSep과 CM Ceramic HyperD^® F가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법을 위해, 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용출 모드로 수행된다. 이전 다운스트림 단계로부터의 용출액 또는 저장 풀 중 다중특이적 단백질은 관심 다중특이적 단백질이 양이온 교환 매질에 결합되도록 양이온 교환 매질 상으로 로딩된다. 양이온 교환 매질에 대한 다중특이적 단백질의 "결합"이란 다중특이적 단백질이 관심 다중특이적 단백질 및 양이온 교환 매질의 하전된 기 또는 하전된 기들 간 이온성 상호작용에 의해 양이온 교환 매질 내에 또는 상에 가역적으로 고정화되도록 적절한 조건(pH/전도성) 하에 양이온 교환 매질로 다중특이적 단백질을 노출시키는 것을 의미한다. 용출액 또는 풀은 이전 단위 작업, 예컨대 친화도 크로마토그래피, 중화된 저 pH 바이러스 불활성화, 심층 여과, 또는 수확 및/또는 폴리싱 크로마토그래피 작업으로부터 유래되었을 수 있다. 추가적인 완충액은 다중특이적 단백질의 최종 로드가 요망되는 농도에 있도록 용출액 또는 풀에 첨가될 수 있다.

이어서 로딩된 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 적어도 하나의 세척 단계를 거친다. 양이온 교환 매질의 세척은 양이온 교환 매질을 통해 또는 그 상으로의 적절한 세척 완충액의 통과를 의미한다. 세척 완충액의 기능은 관심 다중특이적 단백질의 실질적 용출 없이, 양이온 교환 매질로부터 하나 이상의 오염물을 제거하는 것이다. "완충액"이란 그 산-염기 콘주게이트 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 저항하는 용액을 의미한다. 하나의 구현예에서 완충액은 아세테이트이다. 하나의 구현예에서 100 mM 아세테이트가 제공된다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액의 pH는 5.0 ± 0.05% 내지 5.0 ± 0.1% 범위이다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액의 pH는 4.9 내지 5.1의 범위이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액의 pH는 4.9, 5.0, 또는 5.1이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액은 아세테이트, pH 5.0을 포함한다. 세척 완충액은 산물-관련 불순물을 강력히 제거하기 위해 전도성의 변동성을 포함하여 0.05 내지 0.1 pH 단위만큼 더 높거나 더 낮을 수 있다.

적어도 하나의 세척 완충액은 염을 또한 포함한다. 하나의 구현예에서, 염은 염화나트륨이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는0 mM 내지 147 mM이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는70 mM 내지 147 mM이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는100 mM 내지 147 mM이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는100 mM 내지 125 mM이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는100 mM 내지 105 mM이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는105 mM 내지 147 mM이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는105 mM 내지 125 mM이다. 하나의 구현예에서 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는125 mM 내지 147 mM이다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는 0 mM이다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는 70 mM이다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는 100 mM이다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는 105 mM이다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는 125 mM이다. 하나의 구현예에서, 세척 완충액 중 염화나트륨의 농도는 147 mM이다.

세척 단계는 로딩 후에 그리고 관심 다중특이적 단백질의 용출 전에 양이온 교환 매질을 세척한다. 본 발명은 고염 농도 세척 완충액을 포함하는 적어도 하나의 세척 단계를 제공한다. 고염 세척 완충액은 주요 산물의 용출 전에 양이온 교환 매질로부터 저 pI 산물-관련 불순물을 세척하거나 용출하는 것으로 확인되었다. 고염 세척 단계에 부가하여, 염을 함유하지 않는 완충액 및/또는 고염 세척 완충액에 비해 더 낮은 농도로 염을 함유하는 완충액을 사용하는 하나 이상의 추가적인 세척 단계가 존재할 수 있다. 바람직하게는 UV 기준선은 용출의 시작 전에 마지막 세척 단계의 종료 시 0으로 복귀했거나 0에 매우 가깝다. 본 발명의 하나의 구현예에 따르면 적어도 2개의 세척 단계가 존재한다. 하나의 구현예에서 "제1 세척 완충액" 및 "제2 세척 완충액"이 존재한다. 본 발명의 하나의 구현예에 따르면 적어도 3개의 세척 단계가 존재한다. 하나의 구현예에서 "제1 세척 완충액", "제2 세척 완충액", 및 "제3 세척 완충액"이 존재한다. 용어 "제1 세척", "제2 세척", 및/또는 "제3 세척"은 하나 이상의 세척 단계 간 하나 이상의 추가적인 세척 또는 다른 완충액의 사용을 제외하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 세척 완충액은 관심 다중특이적 단백질의 용출 전에 양이온 교환 물질을 세척하거나 재평형화하기 위해 사용된다. 세척 완충액 제형 중 하나 이상은 평형 및/또는 최종 컨디셔닝된 로딩 완충액 제형과 동일할 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 세척은 아세테이트, pH 5.0 ± 0.5 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함하는 세척 완충액을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액은 pH 4.9 내지 5.1의 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액은 pH 4.9, 5.0, 또는 5.1의 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액은 pH 5.0의 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액은 100 mM 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, pH 5.0을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 세척은 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.5 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함하는 세척 완충액을 포함한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척은 아세테이트, pH 5.0 ± 0.5 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함하는 세척 완충액을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 pH 4.9 내지 5.1의 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 pH 4.9, 5.0, 또는 5.1의 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, pH 5.0을 포함한다.

본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 70 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 125 mM 염화나트륨을 포함한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 70 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 125 mM 염화나트륨, pH 5.0 ± 0.05 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다.

관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 70 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 105 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 125 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다. 관련된 구현예에서, 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 147 mM 염화나트륨, pH 5.0을 포함한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척은 아세테이트, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함하는 세척 완충액을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액은 pH 4.9 내지 5.1의 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액은 100 mM 아세테이트를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, pH 5.0 ±0.5% 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액은 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액은 0 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨, pH 5.0 ±0.5% 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액은 70 mM 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 70 mM 염화나트륨, pH 5.0 ±0.5% 내지 pH 5.0 ± 0.1을 포함한다.

하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 적어도 3개의 세척 완충액, 즉 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 하나의 세척 완충액; 그 다음으로는 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액; 그 다음으로는 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM NaCl을 포함하며; 제2 세척 완충액은 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하고; 제3 세척 완충액은 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1 세척 완충액의 염화나트륨 농도는 0 mM 염화나트륨이다. 하나의 구현예에서, 제2 세척 완충액의 염화나트륨 농도는 100 mM, 105 mM, 및 147 mM 염화나트륨로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 제3 세척 완충액의 염화나트륨 농도는 0 mM 및 70 mM 염화나트륨로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 제1 세척 완충액 농도는 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨이며; 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 100 mM 염화나트륨 및 100 mM 아세테이트, 105 mM 염화나트륨로부터 선택되고; 제3 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨이다. 하나의 구현예에서 제1 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 0 mM 염화나트륨이며; 제2 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 147 mM 염화나트륨이고; 제3 세척 완충액은 100 mM 아세테이트, 70 mM 염화나트륨이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 양이온 교환 매질은 적어도 10 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 양이온 교환 매질은 10 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 15 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 20 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 25 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 본 발명의 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 35 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 15 g/L 내지 35 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 15 g/L 내지 25 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 하나의 구현예에서, 양이온 교환 매질은 15 g/L 내지 20 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 15 g/L 내지 35 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 20 g/L 내지 35 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 20 g/L 내지 30 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 20 g/L 내지 25 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 25 g/L 내지 35 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다. 관련된 구현예에서, 양이온 교환 매질은 25 g/L 내지 30 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩된다.

하나의 구현예에서 본 발명은 양이온 교환 매질이 10 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 105 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척 완충액으로 세척되고 8 mM/CV의 염 구배로 용출되는 것을 제공한다.

하나의 구현예에서 본 발명은 양이온 교환 매질이 15 g/L 내지 30 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 147 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척 완충액으로 세척되는 것을 제공한다.

하나의 구현예에서 본 발명은 양이온 교환 매질이 25 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 적어도 하나의 세척 완충액 및 하나의 용출 완충액은 125 mM 염화나트륨을 포함한다.

이어서 결합된 다중특이적 단백질은 양이온 교환 크로마토그래피 매질의 고상으로부터 용출된다. 다중특이적 단백질은 구배에 의해 용출될 수 있다. 구배는 선형 또는 단계 구배일 수 있다. 구배는 염 구배일 수 있다. 구배는 선형 염 구배 또는 단계 염 구배일 수 있다. 염 구배에 있어서, 염 농도(이온 강도)는 구배 동안 경시적으로 변화된다. 다중특이적 단백질의 결합을 손상시키고 이를 용출액 내로 방출시키기 위해 적절한 염 농도가 요구된다. 사용될 수 있는 염의 예에는 염화나트륨, 칼륨 클로라이드, 및 아세테이트가 포함된다.

양이온 교환 크로마토그래피 용출액은 추가 다운스트림 폴리싱 크로마토그래피 정제 단위 작업을 거칠 수 있다. 하나의 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 후에, 관심 다중특이적 단백질은 플로우-쓰루 모드로 폴리싱 크로마토그래피 매질에 적용된다.

폴리싱 크로마토그래피 작업 후에, 정제된 다중특이적 단백질의 농도 및 원료 의약품의 벌크 보관을 위해 요망되는 제형 완충액으로의 완충액 교환은 초여과 및 투석여과 작업에 의해 달성될 수 있다.

정제된 다중특이적 단백질의 중요한 속성 및 성능 파라미터가 측정되어 제조 동안 각 단계의 성능에 관한 결정을 더 잘 알릴 수 있다. 이러한 중요한 속성 및 파라미터는 실시간, 거의 실시간 및/또는 사후에 모니터링될 수 있다. 소비되는 배지 성분(예컨대, 글루코스), 축적되는 대사 부산물(예컨대, 락테이트 및 암모니아)의 수준뿐만 아니라 용존 산소 함량과 같은 세포 유지 및 생존과 관련된 것들과 같은 핵심 중요 파라미터가 세포 배양 동안 측정될 수 있다. 비 생산성, 생존 가능한 세포 밀도, pH, 삼투압 농도, 외관, 색상, 응집, 수율 백분율 및 역가와 같은 중요한 속성은 제조 공정에서 적절한 단계 동안 모니터링될 수 있다. 모니터링 및 측정은 알려진 기법 및 상업적으로 이용 가능한 장비를 사용하여 수행될 수 있다.

약학 조성물(용액, 현탁액 등)에는 하기 중 하나 이상이 포함될 수 있다: 완충액, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 글루타치온; 아주반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록시드); 및 보존제; 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정 오일, 예컨대 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노- 또는 디글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트, 또는 인산염와 같은 완충액; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성(tonicity) 조정제. 비경구 제조물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기, 또는 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 용어는 당분야에서의 표준 용어이지만, 소정 용어의 정의가 청구범위의 의미에 대한 명확성과 정의를 확실히 하기 위해 본원에서 제공된다. 단위, 접두사, 및 기호는 이의 SI 허용 형태로 표시될 수 있다. 본원에서 인용되는 수치 범위는 범위를 한정하는 수치를 포함하며 정의된 범위 내의 각 정수를 뒷받침한다. 일반적으로, 본원에서 기재된 방법 및 기법은 달리 명시되지 않는 한, 당분야에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참고한다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 및 조약이 포함되지만 이에 제한되지 않는, 본 출원에서 인용되는 모든 문헌 또는 문헌의 일부가 본원에 명시적으로 참조로 포함된다.

본 발명의 개별 양태의 단일 예시로서 의도된 본원에서 기재된 특정 구현예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 성분은 본 발명의 범위 내에 속한다. 본 발명의 하나의 구현예에 기재된 것은 본 발명의 다른 구현예와 조합될 수 있다. 실제로, 본원에서 나타내고 기재된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변형은 첨부되는 청구범위의 범위 내에 속하는 것이다.

수행된 실험 및 달성된 결과가 포함되는 하기 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며 첨부되는 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1 단회 무염 세척, 이중-특이적 #1

아세테이트 완충액 중 완전 인간 이중-특이적, 조작된 면역글로불린(이중-특이적 #1)을 함유하는 중화된 단백질 A 풀을 표 1에 개략된 조건 하에 Capto-SP ImpRes^®양이온 교환 크로마토그래피 수지(GE Healthcare Bio-Science, Marlborough, MA) 상으로 로딩하였다.

[표 1]

저염 세척을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피 조건

도 1은 용출 프로파일에서 3개의 피크를 나타내어, 다중 불순물이 칼럼 상에 잔류하며 주요 산물과 함께 용출되었음을 시사한다. 이러한 불순물에는 동종이량체, NCG(비-공통 글리코실화), 및 고분자량종(HMW)이 포함되었다.

실시예 2 고염 세척, 이중-특이적 #1

아세테이트 완충액 중 이중-특이적 #1을 함유하는 중화된 바이러스 불활성화 풀을 표 2에 기재된 조건 하에 Capto-SP ImpRes^®양이온 교환 크로마토그래피 수지 상으로 로딩하였다.

[표 2]

고염 세척을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피 조건

고염 세척이 추가되는 경우, 용출 용출액 중 이전에 제거된 더 낮은 pI 불순물이 이제 용출 전 세척에서 수지로부터 제거됨이 확인되었다. 도 2는 고염 세척의 추가가 용출 프로파일에서 불순물의 피크 수의 3개의 피크에서 1개의 피크로의 감소를 초래하였음을 나타낸다. 대부분의 불순물은 제2 및 제3 세척 단계 간에, NCG의 68% 이상 및 동종이량체의 80% 이상 제거되었다. 동종이량체 및 NCG는 제2 세척 동안 수지로부터 대부분 제거되었거나 수지에 최소로 결합되었다. 제3 세척 단계는 용출의 시작 전에 UV 기준선을 0으로 재확립하여, 용출 프로파일을 좁히고, 훨씬 더 효율적인 수집 및 더 우수한 주요 산물의 품질을 초래하였다. 고염 세척 단계의 추가는 정제를 최적화하여 이를 산물 품질에 대한 사양 결과에서 벗어나는 것을 감소시키고 허용 가능한 수율을 유지하는 보다 강력하고 제조 친화적인 공정으로 만들었다.

이러한 조건은 15 g/L 내지 30 g/L의 이중-특이적 #1의 로딩 농도로 효과적이었다.

또한, 세척 완충액의 pH 5.0의 0.05 pH 단위 위 및 아래(pH 4.95 내지 5.05)를 시험하였고 상기 결과와 일치하게, 저 pI 산물-관련 불순물의 제거에 효과적임을 확인하였다.

2.5 칼럼 부피의 제2 세척 완충액의 사용이 양이온 교환 매질의 산물-관련 불순물을 세척/용출해내기에 충분함이 확인되었다. 더 적은 칼럼 부피는 산물-관련 불순물의 제거에서 효율적이 아니었으며 2.5 칼럼 부피 초과의 사용은 주요 산물을 용출하기 시작하였다.

실시예 3 단회 무염 세척, 이중-특이적 #2

조작된 완전 인간 항-헤테로-IgG 이중특이적 항체(이중-특이적 #2)를 함유하는 중화된 단백질 A 용출액 풀(100 mM 아세테이트, pH 5.0)을 표 3에 개략된 조건 하에 Capto-SP ImpREs^®양이온 교환 크로마토그래피 수지(GE Healthcare Bio-Science, Marlborough, MA) 상으로 로딩하였다.

[표 3]

저염 세척 조건 하의 양이온 교환 크로마토그래피 조건

도 3은 여러 불순물이 칼럼 상에 잔류하였고 주요 산물과 함께 용출되었음을 나타낸다. 이러한 불순물에는 절반 항체(약 50% 절반 항체를 포함하는 분획 1, 2, 3, 4), 2X 경쇄-미스-어셈블리(LC2가 HC1과 부정확하게 어셈블리되었음을 시사하는 LC1 대 LC2 비가 0.4 미만인 분획 5 및 6), 및 고분자량(HMW, 분획 12 내지 21)이 포함된다. 크로마토그래피 분리의 분해는 불순물을 함유하는 구별되는 전-피크를 가지면서 허용 가능했지만, 제조 공정은 OD 기반 자동 풀링을 사용하였다; 이를 위해 전-피크에 대해 최고 OD 초과에서 시작하여 용출액을 수집하는 것이 필요할 것이어서, 수율을 낮추고, 이러한 공정을 제조 작업에서 사용하기 불충분하게 만들 것이다.

실시예 4 고염 세척, 이중-특이적 #2

이중-특이적 #2를 함유하는 중화된 단백질 A 용출액 풀(100 mM 아세테이트, pH 5.0)을 표 4에 개략된 조건 하에 Capto-SP ImpREs® 양이온 교환 크로마토그래피 수지(GE Healthcare Bio-Science, Marlborough, MA) 상으로 로딩하였다.

[표 4]

고염 세척 조건 하의 양이온 교환 크로마토그래피 조건

고염 세척 단계가 추가된 경우(100 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 2), 절반 항체 불순물이 용출 전에 CEX 수지로부터 제거됨이 확인되었다(100% 절반 항체가 수집된 세척 2 및 3에서 검출됨). 도 4는 고염 세척이 용출 프로파일에서 4개의 피크에서 1개의 피크로 2X LC2 미스페어링된 종을 여전히 함유하는 작은 쇼울더를 가지며, 피크 수 감소를 초래하였음을 나타낸다(LC1 및 LC2가 각각 HC1 및 HC2와 정확히 어셈블리되는 경우의 예상된 비 1과 비교하여 LC1/LC2가 0.11 미만임). 제3 세척 단계는 또한 용출의 시작 전에 UV 기준선을 0으로 재확립하여, 용출 프로파일을 좁히고, 훨씬 더 효율적인 수집 및 더 우수한 주요 산물의 품질을 초래하였다. 더 높은 염 세척을 이용하는 이러한 최적화된 절차는 제조 단계에서 사용하기 적합하다. CEX 정제 수율은 저수준의 절반 항체, 미스페어링된 LC2 종(1에 가까운 LC1 대 LC2 비에 의해 입증됨), HMW 및 LMW, 및 흡광도-기반 풀링 기준을 갖는 정제된 풀을 수집하기 위해 적절한 용출 프로파일을 가지며, 65%에서 73%로 증가하였다.

실시예 5 단회 무염 세척, 이중-특이적 #3

완전 인간, 조작된 IgG/Fab 융합 단백질(이중-특이적 #3)을 함유하는 중화된 단백질 A 용출액 풀을 표 5에 개략된 조건 하에 Capto-SP ImpREs^®양이온 교환 크로마토그래피 수지(GE Healthcare Bio-Science, Marlborough, MA) 상으로 로딩하였다.

[표 5]

무염 로딩 컨디셔닝을 이용한 높은 로딩 밀도 양이온 교환 크로마토그래피 조건

도 5는 가파른 용출 구배로 높은 로딩 밀도로부터 생성된 하나의 용출 피크를 나타낸다. 저 pI 산물-관련 불순물은 높은 로딩 밀도 하에 주요 산물로부터 분해되지 않았으며 환원 CE-SDS LC1 대 LC2 비 4 내지 7(미스페어링된 LC 종) 및 LMV 종 2% 내지 4%에 의해 나타난 바와 같이 대부분 분획 1, 2, 및 3에 있다.

실시예 6 더 낮은 로딩 밀도, 단회 무염 세척, 이중-특이적 #3

완전 인간, 조작된 IgG/Fab 융합 단백질(이중-특이적 #3)을 함유하는 중화된 단백질 A 용출액 풀을 표 6에 개략된 조건 하에 Capto-SP ImpREs^®양이온 교환 크로마토그래피 수지(GE Healthcare Bio-Science, Marlborough, MA) 상으로 로딩하였다.

[표 6]

무염 로딩 조건 하의 더 낮은 로딩 밀도 양이온 교환 크로마토그래피 조건

실시예 5의 높은 로딩 밀도, 가파른 용출 구배 조건이 저 pI 산물-관련 불순물로부터 주요 산물의 충분한 분해를 제공하지 않았으므로, 로딩 밀도 및 구배 조건을 감소시켰다. 도 6은 더 낮은 로딩 밀도(10 g/L 대 25 g/L) 및 더 얕은 구배(8 mM/CV 대 16 mM/CV)가 주요 저 pI 산물-불순물의 분획 1 내지 4에 의해 형성된 구별되는 피크로의 분리를 허용하였음을 나타낸다. 이러한 분획은 LC1 대 LC2 비 3 내지 10을 나타내어, 미스페어링된 LC1 종을 시사하였다. 대조적으로, 주요 피크는 누적 LC1 대 LC2 비 1.2를 나타내었다. 분해가 더 우수하고 수율이 44%에서 73%로 증가하였지만, OD 기반 자동 풀링이 여전히 요구되었으므로, 전-피크에 대한 최고 OD 초과에서 시작하여 용출액을 수집하는 것이 여전히 필요할 것이어서, 수율을 낮추고, 이러한 공정을 제조 공정에서 사용하기 불충분하게 만들 것이다.

실시예 7 고염 세척, 이중-특이적 #3

이중-특이적 #3을 함유하는 중화된 바이러스 불활성화 풀을 표 7에 개략된 조건 하에 Capto-SP ImpREs^®양이온 교환 크로마토그래피 수지(GE Healthcare Bio-Science, Marlborough, MA) 상으로 로딩하였다.

[표 7]

고염 로딩 하의 양이온 교환 크로마토그래피 조건

고염 세척 단계가 추가되는 경우(세척 2), 불순물이 용출 전에 CEX 수지로부터 제거됨이 확인되었다. LC1 및 LC2가 정확히 어셈블리되고 페어링되는 경우 예상되는 비 1에 비해, 수집된 세척 2 및 세척 3 상의 LC1 대 LC2 비가 8.0이었음을 고려하면, 이러한 불순물은 미스페어된 LC1 종에 대응할 가능성이 있었다. 도 7은 고염 세척이 용출 프로파일에서 2개의 피크에서 1개의 피크로 미스페어링된 종을 여전히 함유하는 작은 쇼울더를 가지며, 불순물의 피크 수 감소를 초래하였음을 나타낸다(LC1/LC2 = 2 내지 4). 대부분의 불순물은 제2 및 제3 세척 단계 동안 제거되었다. 제3 세척 단계는 또한 용출의 시작 전에 UV 기준선을 0으로 재확립하여, 용출 프로파일을 좁히고, 훨씬 더 효율적인 수집 및 더 우수한 주요 산물의 품질을 초래하였다. 더 낮은 로딩 수준 및 더 얕은 구배와 조합된 더 높은 염 세척을 포함하는 이러한 최적화된 절차는 제조 단계에서 사용하기 적합하다. CEX 정제 수율은 저수준의 미스페어링된 LC1 종(1에 가까운 LC1 대 LC2 비에 의해 입증됨), HMW 및 LMW, 및 흡광도-기반 풀링 기준을 갖는 정제된 풀을 수집하기 위한 용출 프로파일을 가지며, 44%에서 66%로 증가하였다.

실시예 8 고염 세척, 이중-특이적 #4

완전 인간 조작된 면역글로불린 이중-특이적 항체(이중-특이적 #4)를 함유하는 중화된 저 pH 바이러스 불활성화 단백질 A 용출액 풀을 표 7에 기재된 조건 하에 Capto-SP ImpREs^®양이온 교환 크로마토그래피 수지 상으로 로딩하였다.

[표 7]

고염 세척 조건 하의 양이온 교환 크로마토그래피 조건

고염 농도에서의 세척 단계가 추가되는 경우(세척 2), 저 pI 산물-관련 불순물(동종이량체 및 응집된 종)이 용출 전에 양이온 교환 매질로부터 제거됨이 확인되었다. 도 8은 고염 세척이 용출 프로파일에서 하나의 피크로 불순물의 피크 수 감소를 초래하였음을 나타낸다. 염화나트륨을 포함하지 않는 제1 세척은 전도성을 기준선으로 가져갔다. 저 pI 산물-관련 불순물은 이후 고염 세척 단계 동안 제거되어 전도성 기준선을 용출 전에 0으로 복귀시켰다. 전도성은 용출 완충액 A로 유지되었고, 이는 고염 세척 완충액과 동일한 고염 제형을 가졌다. 이는 용출이 시작되기 전 안정한 전도성의 유지 및 용출 프로파일의 좁힘을 허용하였고, 분리가 pI에 기반하였으므로, 주요 산물의 훨씬 더 강력하고 효율적인 수집 및 더 우수한 품질을 초래하였다.

또한, 세척 완충액의 pH 5.0의 0.1 pH 단위 위 및 아래(pH 4.9 내지 5.1)를 시험하였고 저 pI 산물-관련 불순물의 제거에 동일하게 효과적임을 확인하였다.

또한, 25 g/L-r 내지 40 g/L-r의 이중-특이적 #4의 로딩 농도를 시험하였고 상술된 35 g/L-r 조건과 유사한 불순물 제거를 가짐이 확인되었다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 다중특이적 단백질을 정제하는 방법:
다중특이적 단백질을 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 매질 상으로 로딩하는 단계;
양이온 교환 매질을 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척 완충액으로 세척하는 단계; 및
양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트를 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트, pH 5.0 ± 0.05% 내지 pH 5.0 ± 0.1%를 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트, pH 4.91 내지 5.1을 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트, pH 4.9, 5.0, 또는 5.1을 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 세척 완충액이 100 mM 아세테이트를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트, 100 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트, 100 mM 내지 105 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트, 105 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트, 105 mM 내지 125 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액이 아세테이트, 125 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 적어도 3개의 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제18항에 있어서, 양이온 교환 매질이 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척되며, 세척 완충액 중 적어도 하나는 0 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 양이온 교환 매질이 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척되며, 세척 완충액 중 적어도 하나는 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 적어도 2개의 세척 완충액, 즉 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척 완충액, 그 다음으로는 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제21항에 있어서, 양이온 교환 매질이 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 100 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 아세테이트, 105 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 또는 아세테이트, 125 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제21항에 있어서, 양이온 교환 매질이 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 0 mM 내지 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제23항에 있어서, 양이온 교환 매질이 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제23항에 있어서, 양이온 교환 매질이 아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 이어서 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제18항에 있어서, 양이온 교환 매질이
아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제1 세척 완충액, 이어서
아세테이트, 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 제2 세척 완충액, 이어서
아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제3 세척 완충액 또는 아세테이트, 70 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액
의 적어도 3개의 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제26항에 있어서, 양이온 교환 매질이
아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제1 세척 완충액, 이어서
아세테이트, 100 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 아세테이트, 105 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액, 또는 아세테이트, 125 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2 세척 완충액, 이어서
아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제3 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제26항에 있어서, 양이온 교환 매질이
아세테이트, 0 mM 염화나트륨을 포함하는 제1 세척 완충액, 이어서
아세테이트, 147 mM 염화나트륨을 포함하는 제2 세척 완충액, 이어서
아세테이트, 70 mM 염화나트륨을 포함하는 제3 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 147 mM 염화나트륨을 포함하는 2.5 mM/CV의 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제1항에 있어서, 다중특이적 단백질이 구배에 의해 양이온 교환 매질로부터 용출되는, 방법.
제30항에 있어서, 구배가 선형 또는 단계 구배인, 방법.
제30항에 있어서, 구배가 염 구배인, 방법.
제30항에 있어서, 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액 중 적어도 하나가 0 M 내지 1 M 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제33항에 있어서, 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액 중 적어도 하나가 70 mM 내지 500 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제33항에 있어서, 용출 구배를 형성하기 위해 사용되는 완충액 중 적어도 하나가 125 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 세척 완충액 및 하나의 용출 완충액이 125 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 적어도 10 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 10 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되는, 방법.
제38항에 있어서, 양이온 교환 매질이 15 g/L 내지 30 g/L로 로딩되는, 방법.
제38항에 있어서, 양이온 교환 매질이 25 g/L 내지 40 g/L로 로딩되는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 10 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 105 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척되고 8 mM/CV의 염 구배로 용출되는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 15 g/L 내지 30 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 147 mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 매질이 25 g/L 내지 40 g/L의 다중특이적 단백질로 로딩되고, 적어도 하나의 세척 완충액 및 하나의 용출 완충액은 125 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 산물-관련 불순물이 동종이량체, 고분자량종, 절반 항체, 응집물, 저분자량종, 항체 단편, 또는 경쇄 미스-어셈블리인, 방법.
제1항의 방법에 따라 사전 형성되는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 단위 작업이 포함되는 정제 공정.
제1항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 및/또는 후에, 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼, 및/또는 혼합-모드 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 다중특이적 단백질을 정제하기 위한 하나 이상의 단위 작업을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 다중특이적 단백질이 이중특이적 단백질인, 방법.
제1항에 있어서, 다중특이적 단백질이 이중특이적 항체인, 방법.
제1항의 방법에 따라 제조되는 정제된, 다중특이적 단백질.
제1항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 매질이 수지인, 방법.
양이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액 중 저 pI 산물-관련 불순물을 감소시키는 방법으로서, 하기 단계:
다중특이적 단백질 및 다중특이적 단백질보다 낮은 pI를 갖는 적어도 하나의 산물-관련 불순물을 포함하는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 매질 상으로 로딩하는 단계;
양이온 교환 매질을 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계,
양이온 교환 매질을 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계;
양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계;
를 포함하며, 양이온 교환 크로마토그래피 용출액은 염화나트륨이 세척 완충액 제형에 포함되지 않은 대응하는 방법에서 회수된 양이온 교환 크로마토그래피 용출액에 비해 감소된 저 pI 산물-관련 불순물을 갖는, 방법.
제51항에 있어서, 양이온 교환 매질이 제3 세척 완충액으로 세척되는, 방법.
하기 단계를 포함하는, 산물-관련 불순물을 감소시키기 위해 고염 세척 조건 하에 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 방법:
다중특이적 단백질 및 적어도 하나의 산물-관련 불순물을 포함하는 조성물을 평형화된 양이온 교환 칼럼 상으로 로딩하는 단계;
양이온 교환 매질을 적어도 2개의 세척 완충액으로 세척하는 단계로서, 하나의 세척 완충액은 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는, 단계; 및
양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 결합된 다중특이적 단백질을 용출하는 단계.
제53항에 있어서, 조성물을 로딩하기 전에, 양이온 교환 매질이 염화나트륨을 함유하지 않는 완충액으로 평형화되는, 방법.
하기 단계를 포함하는, 단리되고 정제된, 재조합 다중특이적 단백질을 제조하는 방법:
다중특이적 단백질을 발현하는 숙주 세포로 생물반응기에서 세포 배양을 확립하는 단계;
다중특이적 단백질을 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계;
세포 배양으로부터 재조합 다중특이적 단백질을 수확하는 단계;
재조합 다중특이적 단백질을 친화도 정제하는 단계;
친화도 정제된 재조합 다중특이적 단백질을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 상으로 로딩하는 단계;
양이온 교환 수지를 100 mM 내지 147 mM 염화나트륨을 포함하는 적어도 하나의 세척으로 세척하는 단계;
양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 다중특이적 단백질을 용출하는 단계; 및
플로우 쓰루 모드(flow through mode)로 추가적인 크로마토그래피 매질 상으로 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피 용출액을 로딩하는 단계.
제55항에 있어서, 추가적인 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 크로마토그래피 매질, 다중-모드 크로마토그래피 매질, 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 선택되는, 방법.
제55항에 있어서, 친화도 정제된 다중특이적 단백질이 용출액 풀에 있으며, 양이온 교환 매질 상으로 로딩하기 전에 저 pH 바이러스 불활성화, 이어서 중화를 거치는, 방법.
제56항에 있어서, 제3 크로마토그래피 매질로부터의 플로우 쓰루가 초여과 및 투석여과 단위 작업을 거치는, 방법.
제55항의 방법에 따른 단리되고 정제된, 재조합 다중특이적 단백질.
제55항의 방법으로 제조되는 단리되고 정제된, 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 약학 조성물.