CN113355362B - 化学修饰CRISPR/Cpf1复合物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及化学修饰CRISPR/Cpf1复合物的用途。本发明公开了CRISPR/Cpf1复合物在细胞的基因编辑中的应用，该复合物中化学修饰的Cpf1蛋白与crRNA偶联，记为cCpf1。以该复合物进行基因编辑能够提高基因编辑效率。将其应用于免疫细胞的制备，则能够提高CAR‑T的制备效率，更重要的是提高多位点基因编辑及通用型CAR‑T的制备效率。

Description

化学修饰CRISPR/Cpf1复合物的用途

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及化学修饰CRISPR/Cpf1复合物的用途。

背景技术

肿瘤是困扰人类健康的重大疾病。由于肿瘤的生物学特征的高度复杂性、多样性和可变性，认识肿瘤发生发展机制和寻找治疗肿瘤方法成为科学家面临的巨大挑战。近年来，随着人们对肿瘤与宿主的关系，特别是机体抗肿瘤免疫应答及肿瘤免疫逃逸机制的认识不断深入，将以免疫细胞、分子、基因为基础的干预手段应用于肿瘤治疗成为科学家关注的重大热点并取得了令人振奋的临床试验结果。肿瘤的免疫治疗成为继外科手术、放疗、化疗之后第四类已被证明具有显著临床治疗效果及优势的抗肿瘤疗法。其中基因工程的技术改造加强T细胞的特异性以提高其对肿瘤细胞的杀伤作用的研究方法(CAR-T)已取得了重大的进展。该疗法通过分离患者外周血液中的免疫T细胞，在体外培养，然后经过基因工程改造，也就是根据患者所患的肿瘤类型进行特异性的基因修饰和体外扩增，最后回输患者的体内，达到快速杀死肿瘤细胞的目的。

CAR-T细胞疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者中进行的早期临床试验已经显示出非常振奋人心的结果。宾夕法尼亚大学研究人员今年10月在世界顶尖医学杂志《新英格兰医学杂志》上发表的一项临床试验结果显示，在接受了CTL019输注(靶向CD19抗原的CAR-T疗法)的30名复发性或难治性ALL受试者中，治疗后1个月有27名患者获得完全缓解，其中甚至包括15位已经接受过骨髓干细胞移植的患者。6个月时无反复生存率为67％(20人)，总体生存率为78％(23人)。另外还有1名患者2年随访时仍然持续完全缓解。近些年CAR-T疗法在实体瘤的治疗中也取得了一系列令人振奋的进展，展现出免疫治疗的良好前景。

尽管CAR-T疗法目前已经取得了一系列振奋人心的临床结果，但是其仍存在着许多风险，如杀伤作用过强，细胞因子风暴，实体肿瘤微环境抑制，靶点选择性有限等等。此外，目前CAR-T的制备通常使用病毒系统进行外源CAR基因的整合，这种整合由于其具有随机性，无法控制外源基因的整合位置，可能存在致癌风险，在近期《科学》杂志中蓝鸟生物技术公司利用慢病毒载体进行血液干细胞的基因修饰后会输给人体用于治疗镰状细胞病的研究中，有两人在接受治疗五年后发展为白血病，被认为可能是基因随机导入引起的致癌风险。过往的临床实验中也证实逆转录病毒引起的随机整合存在致癌性，因此开发定点可控的高效定向基因整合T细胞的制备是未来CAR-T疗法的发展的重要方向之一，也是本领域主要关注的核心问题。

近些年基因编辑技术发展迅速，基因编辑技术是对某一核苷酸序列中的特定基因位点进行人为改变，插入、删除、替换或修饰基因组中的特定目的基因使其表达性状改变的一种新兴分子生物技术。随着技术的发展目前已有三代基因编辑技术被广泛应用，分别是锌指蛋白核酸酶，TALEN和CRISPR技术，其中CRISPR技术自2012年人们发现CRISPR-Cas9具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性以来，作为第三代基因编辑技术，在近十年获得了蓬勃的发展。与前两代基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9技术更易于设计与操作，靶向效率更高，具有独特的发展优势。根据效应核酸酶的性质，可将CRISPR-Cas系统分为两类，一类的效应核酸酶为多蛋白复合物，二类的效应核酸酶为单个蛋白。两类系统共分为6种类型和19种亚型，不同类型的系统具有不同的靶向底物和切割机制，为CRISPR-Cas系统的多样化应用提供了可能。一类系统常见于细菌和古细菌中，约占所有已确定的CRISPR-Cas基因座的90％，剩余约10％的二类系统几乎完全存在于细菌中。第二类CRISPR-Cas系统包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ三种类型，Ⅱ型核酸酶Cas9是第一个在哺乳动物细胞中用于基因组编辑的效应核酸酶，Ⅴ型核酸酶包括DNA靶向核酸酶Cpf1和Cas12b(之前分别被称为Cpf1和C2C1)，Ⅵ型核酸酶包括RNA介导的RNA核酸酶Cas13a和Cas13b。

在这之中，在哺乳动物细胞中使用最为广泛的是CRISPR/Cas9，由于其编辑效率高，且对于基因组的识别广度较宽而广泛应用于哺乳动物基因编辑和免疫细胞的制备中，利用CRISPR/Cas9针对T细胞TRAC基因进行敲除并进行原位的定点整入CAR基因制备成的CAR-T目前已经走入临床阶段，但CRISPR/Cas9系统由于其自身存在脱靶效应较高，且缺少临床长期安全性的评价，对于长期是否存在致癌风险仍未可知。

CRISPR/Cpf1是在CRISPR/Cas9之后发现的第二个可以应用于哺乳动物细胞编辑的CRISPR家族酶，由于其具有不同的基因组识别的偏好性且其脱靶效率显著低于Cas9，因此Cpf1成为Cas9的有力补充和更为有生物医药前景的CRISPR家族基因编辑工具。通常利用CRISPR进行体外T细胞的基因编辑采用向细胞中导入DNA或者mRNA进行编辑，进而通过引入外源供体DNA或者通过AAV递送供体的手段实现CAR-T细胞的制备，DNA递送编辑具有潜在的整合风险且其持续性表达可能会提高脱靶效率，mRNA递送编辑方式也存在表达量峰值较长易提高脱靶的不良影响，与此相比直接递送核糖核蛋白复合体(RNP)直接将蛋白和RNA导入细胞中能够快速响应产生切割同时在实现编辑之后蛋白迅速降解是目前已知的最为安全的基因编辑的递送手段，其脱靶编辑效率显著低于其他的递送方式，因此被广泛应用于CAR-T细胞的制备。利用CRISPR-Cpf1基于mRNA递送系统已有报道，通过系统性的优化可以实现定点TRAC基因的CAR-T制备并实现了多基因敲除的CAR-T的制备，利用RNP方式进行制备是一个更优的选择然而目前并没有文献报道相关方法。其原因在于Cpf1总体基因编辑效率并不理想，利用Cpf1-crRNA的RNP复合物进行CAR-T细胞的制备效率很低，大幅度限制了其广泛应用于免疫细胞CAR-T的制备，因而本领域迫切需要提供能够利用改进的Cpf1来通过RNP方式递送进行高效制备CAR-T细胞的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供化学修饰CRISPR/Cpf1复合物在免疫细胞基因编辑中的用途。

本发明提供了化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物在细胞的基因编辑中的应用。

在本发明中，所述细胞为干细胞、胚胎细胞、体细胞和/或免疫细胞。

本发明所述细胞为人类细胞或动物细胞。所述干细胞包括造血干细胞，胚胎干细胞，间充质干细胞。所述动物细胞来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猴子等模式动物。

本发明实施例以来自小鼠的胚胎细胞NIH-3T3细胞为例，对小鼠细胞的基因编辑效果进行验证。

本发明对人体细胞基因编辑效果的验证包括对体细胞、免疫细胞的验证。一些实施例中，所述体细胞为293T细胞或K562细胞。所述免疫细胞为Jurkat细胞、T细胞、NK细胞或Macrophage细胞等。

本发明中，所述化学修饰CRISPR/Cpf1复合物由Cpf1家族蛋白和crRNA组成；其中，Cpf1家族蛋白选自AsCpf1、SpCas9、FnCpf1、CmCpf1、MbCpf1、PcCpf1或LbCpf1。所述AsCpf1蛋白的第806、834、835、860和/或1086位中至少一位的氨基酸残基经化学修饰。

所述LbCpf1蛋白的第3、757、759、768、785和/或786位中至少一位的氨基酸残基经化学修饰。

所述化学修饰的氨基酸为pAcF、AcF、NAEK、p-AzF、o-AzbK、AzK、ACPK、PrpF、PrpK、CpOK、TetF、Tet1、Tet2或Tet3。

本发明中，所述crRNA靶向内源基因。

一些实施例中，所述靶向内源基因包括TRAC，β2M，PD1，CTLA4或mHPRT1中至少一种。

本发明还提供了一种细胞的基因编辑方法，其包括：将化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物转化入细胞中，经培养获得基因编辑的细胞。

本发明中，所述转化的方法为电转化或化学转化。

本发明所述基因编辑还联合质粒载体、慢病毒或腺病毒介导的基因转化方法。

本发明还提供由所述基因编辑方法制备获得的细胞。

本发明还提供了化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物在制备治疗疾病的药物中的应用。

本发明还提供了由所述基因编辑方法制备获得的细胞在制备治疗疾病的药物中的应用。

所述疾病包括：免疫系统疾病或肿瘤。所述治疗包括：自体细胞治疗或异体细胞治疗。

所述肿瘤为膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌中至少一种。

本发明一种治疗疾病的药物，其包括化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物和/或由所述基因编辑方法制备获得的细胞。

本发明还提供了一种疾病的治疗方法，其包括给予本发明所述基因编辑方法制备获得的细胞。或以所述化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物编辑自体免疫细胞或异体免疫细胞后再给予患者。

本发明公开了CRISPR/Cpf1复合物在细胞的基因编辑中的应用，该复合物中化学修饰的Cpf1蛋白与crRNA偶联，记为cCpf1。以该复合物进行基因编辑能够提高基因编辑效率。将其应用于免疫细胞的制备，则能够提高CAR-T的制备效率，更重要的是提高多位点基因编辑及通用型CAR-T的制备效率。

附图说明

图1示非天然氨基酸AeF合成路线；

图2示非天然氨基酸AeF修饰的M806的蛋白纯度和活性验证；

图3示非天然氨基酸AeF修饰的M806的体外偶联和活性验证；

图4示cCpf1系统的基因编辑效率评价；

图5示cCpf1系统的安全性评价；

图6示cCpf1系统提高精准敲入片段效率实现精准基因修复；

图7示cCpf1联合AAV用于CAR-Jurkat细胞的制备；

图8示基因组水平评价cCpf1在TRAC基因中定点引入CAR基因；

图9示cCpf1应用于T细胞的制备定点整合的CAR-T；

图10示cCpf1制备CAR-T细胞的免疫学评价；

图11示cCpf1应用于多位点基因敲除及敲入制备通用型CAR-T；

图12示cCpf1提高在基因编辑，定点精准修复，CAR-T制备效率的模式图。

具体实施方式

本发明提供了化学修饰CRISPR/Cpf1复合物的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中，所述化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物是将CRISPR家族蛋白进行非天然氨基酸的定点突变，然后再与核酸进行偶联制得的，在本发明中，其亦记做cCpf1。其中，CRISPR家族蛋白包括但不限于不同种属来源的Cas9蛋白、Cpf1蛋白、CasX蛋白、Casφ蛋白、Cas12g蛋白、Cas13X蛋白或其相关不具有切割活性但保留结合活性的失活的同种蛋白(例如dCas9蛋白，dCpf1蛋白，或ddCpf1蛋白等)。本发明中，所述CRISPR家族蛋白为SpCas9，其在SEQ ID NO.2的第K3位，D39位，H41位，H116位，D576位，E945位，K1151位，G1367位中的一个或多个位点存在突变。或者，所述CRISPR家族蛋白为AsCpf1，也记为AsCas12a，其在以下位点突变：SEQ ID NO.1的第M806位，L834、S835、K860、K1086位中的一个或多个位点；所述CRISPR家族蛋白为LbCpf1，也记为LbCas12a，其在以下位点突变：SEQ ID NO.3的第3、757、759、768、785或第786位。

所述的非天然氨基酸具有正交化学反应活性。非天然氨基酸包含叠氮、炔基、醛基、酮基、环丙烯或四嗪基团，一些实施例中，所述非天然氨基酸选自：

一些实施例中，所述非天然氨基酸选自：pAcF、AeF、PrpF、NAEK或TetF。在本发明中，所述CRISPR家族蛋白为非天然氨基酸AeF修饰的也记为Cpf1(M806)。即AeF修饰的806位氨基酸发生突变的Cpf1蛋白。

本发明中，cCpf1复合物中，核酸包括oligo DNA、供体DNA、crRNA及其相关修饰核酸。本发明中，cCpf1复合物中的核酸为crRNA，其通过与靶DNA形成碱基配对，将CRISPR家族蛋白引导至靶区附近，并使之构象发生变化，成为具有DNA切割活性的核糖核蛋白复合体(RNP)，活化的Cas9或者Cpf1可以切割靶DNA，使之形成双链缺口(double strand break，DSB)。本发明中，所述crRNA靶向目的基因。本发明中，在构建基因编辑的细胞系或动物模型的情况下，所述crRNA可靶向任意需要敲除和/或敲除的内源基因。一些实施例中，在构建用于细胞治疗的细胞时，所述crRNA可靶向与免疫等功能相关的基因。一些实施例中，所述靶向内源基因包括T细胞内源TCRα恒定区(TRAC)，T细胞β2微球蛋白(β2M)，T细胞程序性死亡受体1(PD1)，T细胞细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)或mHPRT1中至少一种。

本发明提供的基因编辑方法中，编辑效率的提高主要依赖于CRISPR/Cpf1复合物。因此，本发明中对crRNA的具体序列不做限定，凡符合本领域的设计规则的crRNA序列都可以实现预期效果。

本发明提供了化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物在细胞的基因编辑中的应用。所述动物细胞来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猴子等模式动物。本发明实施例以来自小鼠的胚胎细胞NIH-3T3细胞为例，对小鼠细胞的基因编辑效果进行验证。本发明对人体细胞基因编辑效果的验证包括对体细胞、免疫细胞的验证。一些实施例中，所述体细胞为293T细胞或K562细胞。所述免疫细胞为Jurkat细胞、T细胞、NK细胞或Macrophage细胞等。

本发明所述的基因编辑包括基因的敲除和/或敲入。在进行基因敲除时，电转化的系统中，仅包括本发明所述的复合物，其中crRNA针对靶基因进行设计。在进行基因敲入时，除所述复合物外，还需提供敲入基因的同源臂片段。

本发明实施例中，提供了基因编辑的方法。该方法中，首先制备化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物。该复合物的制备方法包括：(1)采用基因密码子扩展技术表达含有非天然氨基酸的Cpf1蛋白；(2)将5’端含有修饰的crRNA和含有非天然氨基酸的Cpf1蛋白通过正交反应偶联。然后利用该复合物对细胞进行编辑。

本发明所述的基因编辑方法中，还联合腺相关病毒载体介导的基因编辑手段、慢病毒载体介导的基因编辑手段、腺病毒介导的基因编辑手段，或采用质粒载体或者单链/双链DNA导入目的基因。或者也可以联合RNA干扰技术，使目的基因的表达降低或沉默。例如，在本发明实施例中，利用腺病毒载体在细胞中整合CAR基因，再将该细胞中免疫抑制因子敲除。构建用于细胞治疗的免疫细胞。该手段可应用于T细胞、NK细胞、Macrophage细胞等。在本发明实施例中，以T细胞作为实验对象。

本发明提供的方法能够提高基因编辑效率，从而使获得的细胞能够更有效的用于细胞治疗。本发明所述的细胞治疗包括对免疫系统疾病或肿瘤的治疗。所述治疗的手段包括自体细胞治疗或异体细胞治疗。本发明中，通过对K562细胞进行编辑，从而将其作为治疗血液肿瘤疾病的药物；对造血干细胞进行编辑，从而将其作为治疗血液瘤的药物；对免疫细胞进行编辑，从而将其作为治疗免疫系统疾病或者肿瘤的药物。例如，对Jurkat细胞进行编辑，从而将其用于治疗肿瘤。

本发明提供的基因编辑方法，还可以用于细胞系和/或动物模型的构建。例如，通过对3T3细胞进行编辑，从而获得特定基因编辑的小鼠细胞系。

本发明一种治疗疾病的药物，其包括化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物和/或由所述基因编辑方法制备获得的细胞。

本发明所述的治疗疾病的药物中，包括所述基因编辑方法制备获得的细胞和药学上可接受的辅料。例如，细胞缓冲液、渗透压调节剂。更具体的，该药物中，可以包括细胞、生理盐水。还可以包括白蛋白、透明质酸等。

本发明所述的治疗疾病的药物中，包括化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物。该药物中还包括电转化过程中所需试剂。还可以包括细胞培养基等。

本发明还提供了一种疾病的治疗方法，其包括给予本发明所述基因编辑方法制备获得的细胞。或以所述化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物编辑自体免疫细胞或异体免疫细胞后再给予患者。

本发明旨在提高Cpf1系统的基因编辑效率，同时拓宽其在免疫细胞制备如CAR-T方面的制备效率。以往科学家通过改造Cpf1蛋白质或者通过RNA的工程改造已经可以实现Cpf1基因编辑效率的提升，本发明人从Cpf1蛋白质和crRNA的相互作用的视角出发，发明人认为Cpf1和其crRNA的亲和力较低，在低浓度的RNP形式下在细胞中会导致复合物的解离，进而失去基因编辑的功能，因此本发明人基于蛋白质化学修饰的策略，将用于基因编辑的Cpf1和crRNA通过非天然氨基酸定点偶联技术和生物正交反应的策略实现两个分子的共价偶联，通过将亲和力增加到无限大，来提高Cpf1在基因编辑及CAR-T领域的应用。详细来说，本发明人研发了一种将CRISPR/Cpf1家族蛋白定点与核酸通过化学共价键偶联的方式，将蛋白与核酸作为一个整体递送至T细胞内发挥其基因编辑功能，同时通过AAV病毒导入含有同源臂及插入片段的供体，在T细胞基因的特定位置发生定点基因整合，高效获得定点整合的CAR-T细胞，同时发明人证明该策略不仅可以应用于自体CAR-T细胞的制备，还可以通过多位点的同时敲除和敲入实现通用型异体CAR-T的高效制备。发明人通过化学偶联Cpf1进行T细胞的编辑，使用目前最为安全的RNP递送的方式实现CAR-T细胞的高效制备，从而解决现有技术中定点整合CAR-T细胞制备效率低下的问题。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。实施例所用试剂包括如下：

2×Phanta Max Master Mix(诺唯赞)，KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO)，DpnI(New England Biolabs,NEB)，壮观霉素(Inalco Pharmaceuticals)，氨苄霉素(Inalco Pharmaceuticals)，IPTG(Inalco Pharmaceuticals)DMEM培养基(Macgene)，RPMI-1640培养基(Macgene)，X-VIVOTM15培养基(Lonza)，1XTrypsin-EDTA 0.25％(Macgene)，1XPBS(Macgene)，镍介质(GE healthcare),c-Myc mouse monoclonalantibody(Invitrogen)，Anti-mouse IgG(H+L),F(ab')2 Fragment(Alexa

647Conjugate)(Cell Signaling Technology)，APC anti-human CD3(Biolegend)，FITCanti-humanβ2-microglobulin(Biolegend)，PE anti-human CD279(Biolegend)，PE/Cyanine7 anti-human CD152(Biolegend)，RNA转录试剂盒(NEB)，细胞基因组提取试剂盒(诺唯赞)，Fetal Bovine Serum(Gibco)，Dynabeads^TM Untouched^TM Human T Cells Kit(Invitrogen)，Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)，XYbeads Human CD3/CD28 T CellActivator(SAILY BIO)，T7 Endonuclease I(诺唯赞)，ELISA试剂盒(Invitrogen)，LDH检测试剂盒(Promega)

实施例所用仪器包括如下：

PCR仪(Bio-Rad)，电泳仪(Tanon)，天能凝胶成像系统(Tanon)，超声破碎仪(SONICS)，高压灭菌锅(STIK)，纯水仪(Millipore)，Nanodrop(Thermo)，台式离心机(Thermo)，亚超速离心机(Beckman)，AKTA蛋白纯化系统(GE healthcare)，流式细胞仪(BeckmanCytoFLEX)，细胞培养箱(Thermo)，酶标仪(BioTek)，磁力架(Invitrogen)，细胞电转仪(Celetrix)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：包含定点突变AsCpf1的基因载体的构建

(1)辅助质粒的获得

pUltra-MjPolyRS(由Addgene公司购买)(以下简称辅助质粒)，该质粒可以表达用于特异性识别及插入非天然氨基酸AeF的tRNA和tRNA合成酶。

(2)AsCpf1的质粒的获得

pET22b-AsCpf1质粒中蛋白序列由Addgene质粒#102565中通过PCR获得，进而利用PCR引物在末端引入酶切5’NdeI，3’XhoI，通过酶切连接构建得到完整质粒序列，可以在大肠埃希氏菌中重组表达AsCpf1蛋白。

所用引物序列如表1：

表1

引物名称	引物序列(5’-3’)
		Cpf1-2NLS-FW	gggaattgtgagcggataacaattcccc
SV40-RV	cccactttacgtttctttttaggactgccctttttcttttttgcctggccgg
		Cpf1-2NLS-RV	cagtggtggtggtggtggtgctcgagggatcccactttacgtttctttttaggactgc

(3)AsCpf1突变质粒的获得

根据对AsCpf1蛋白晶体结构进行解析的结果进行分析，本发明人选择了M806位点，作为定点突变的靶氨基酸，用含有叠氮基团的非天然氨基酸AeF置换原先的氨基酸残基，然后可以以此为原料，与含有DBCO修饰的crRNA在体外进行反应，制备获得共价修饰的Cpf1-crRNA偶联复合物(cCpf1)，以解决Cpf1和其crRNA亲和力低下的问题，进而提高Cpf1系统在T细胞中的编辑效率。

本发明人针对AsCpf1的M806位设计能够使编码所述氨基酸的相应密码子突变为TAG的引物，具体引物如下表所示。

表2：突变引物列表

引物名称	引物序列(5’-3’)
		M806TAG-FW	accggctgggagagaagtagctgaacaagaagctgaagg
M806TAG-RV	ccttcagcttcttgttcagctacttctctcccagccggt

以pET22b-AsCpf1质粒为模板，使用以上引物及KOD酶进行18个循环的PCR扩增，并将所获得的PCR产物进行DpnI消化，所得到的产物转化DH5α菌株，复苏后涂在相应抗性的平板上，次日挑取单克隆测序，以得到pET22b-AsCpf1-M806TAG质粒

(4)定点突变的AsCpf1-M806TAG表达菌株的构建

将步骤(1)中所得的辅助质粒pUltra-MjPolyRS(壮观霉素抗性)和步骤(3)中所得的pET22b-AsCpf1-M806TAG突变质粒(氨苄霉素抗性)共同通过化学转化的方式转入大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)中，经双抗性平板(壮观霉素和氨苄霉素)筛选出同时转化了两种质粒的阳性菌株，命名为表达菌株BL21-pET22b-AsCpf1-M806TAG。同时构建野生型表达菌株BL21-pET22b-AsCpf1-WT(经氨苄霉素抗性筛选)作为对照。

实施例2：化学修饰Cpf1(AzCpf1)的表达纯化及体外活性验证

1：氨基酸来自发明人合成

合成路线见图1，合成步骤参照文献进行操作。

2：化学修饰Cpf1(AzCpf1)蛋白的表达

将实施例1步骤(4)中获得的表达菌株BL21-pET22b-AsCpf1-M806TAG在2YT培养基(含壮观霉素和氨苄霉素)中，于37℃，220rpm恒温摇床中培养过夜。次日按照1:100接种至新鲜的2YT培养基(含壮观霉素和氨苄霉素)中，于37℃，220rpm恒温摇床中培养，待培养至对数生长早期时，加入1mM AeF氨基酸继续培养，待培养至OD值为0.6-1.0时，加入0.2mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)，于18-20℃，220rpm恒温摇床中诱导表达16-18小时后收集菌体。此表达实验采用的阳性对照为菌株BL21-pET22b-AsCpf1-WT，表达条件与突变菌株相同。

3：化学修饰Cpf1(AzCpf1)蛋白的纯化

1)将步骤2中收集的菌体用缓冲buffer(50mM Tris，pH8.0，1M KCl)重悬，超声破碎15min

2)将步骤1)中超声破碎产物进行高速离心，取上清中可溶性蛋白进行蛋白纯化

3)将步骤2)中上清用Ni亲和柱纯化，用高浓度咪唑洗脱。

4)将步骤3)中的纯化产物置换到缓冲液PBS中，通过尺寸排阻色谱进一步纯化，使用Superdex200 10/300GL Increase(GE healthcare)分子筛，收集目的蛋白组分。

经过上述纯化，可以获得SDS-PAGE级纯度＞95％的AsCpf1野生型及突变体蛋白，结果见图2中A。

4：化学修饰Cpf1(AzCpf1)蛋白的体外活性验证

为验证步骤3中纯化所得AzCpf1是否在CrRNA的引导下，具有切割双链DNA的功能，本发明人对AzCpf1蛋白的体外活性进行了验证。

1)体外活性验证双链DNA模板的获得

以EGFP基因作为切割靶基因，通过PCR扩增含有切割靶序列的EGFP基因片段，作为体外活性验证模板。所用引物如下：

表3：

引物名称	引物序列(5’-3’)
		IVD-EGFP-FW	catctgcaccaccggcaagc
IVD-EGFP-RV	gacggcgctattcagatcctcttctgag

2)体外活性验证CrRNA的获得

靶向EGFP基因的CrRNA由体外转录得到。首先设计T7启动子+CrRNA序列的互补引物，通过引物梯度退火的方式获得体外转录模板，进而使用体外转录试剂盒对CrRNA进行转录，使用RNA纯化试剂盒(Zymo)对CrRNA进行纯化。

EGFP靶向序列为cgtcgccgtccagctcgaccagg，所用互补引物序列如下：

表4：

引物名称	引物序列(5’-3’)
		Cpf1-crRNA-FW	taatacgactcactataggaatttctactcttgtagatcgtcgccgtccagctcgaccagg
Cpf1-crRNA-RV	cctggtcgagctggacggcgacgatctacaagagtagaaattcctatagtgagtcgtatta

模板DNA序列如下：

catctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagaattccaccacactggactagtggatccgagctcggtaccaagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtc

所用梯度退火程序如表5所示：

表5：引物梯度退火程序

温度	时间
		95℃	5min
95-85℃	-2℃/sec
		85-25℃	-0.1℃/sec
4℃	∞

3)AsCpf1蛋白的活性验证

将AsCpf1的野生型蛋白与突变体蛋白分别稀释至3μM，将CrRNA稀释至9μM，按照Cpf1:CrRNA摩尔比为1:3制备核糖核蛋白复合物，按照表3配制体外切割体系。之后将反应体系在37℃孵育1小时，并在65℃，10min条件下进行热失活，最后将反应产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，结果见图2中B，AzCpf1具有与WT Cpf1一致的切割活性，该结果表明，非天然氨基酸的插入并不会影响蛋白对双链DNA的识别以及切割活性。

表6：体外切割反应体系

实施例3：AzCpf1与DBCO修饰RNA分子的共价偶联与活性评价

当在AsCpf1的M806位点引入AeF后，AeF中的叠氮基团可以与含有DBCO修饰的核酸分子通过无铜催化的click反应进行共价偶连，以下对AzCpf1与DBCO修饰的RNA分子的共价偶连以及偶联后体外切割活性进行了验证。本验证中仍以EGFP靶序列作为双链DNA模板进行切割。

1：DBCO修饰的CrRNA的合成

本验证所用WT-EGFP CrRNA与5’端修饰DBCO基团的DBCO-EGFP CrRNA均由安徽通用生物公司合成。

2：AzCpf1与DBCO修饰RNA分子的共价偶联

按照摩尔比为1:1.2将蛋白与CrRNA进行混合，4℃反应3小时后进行SDS-PAGE检测，同时将反应后的核糖核蛋白复合物(RNP)按照实施例2步骤4与模板双链DNA在缓冲体系内进行混合孵育，以验证偶联复合物的体外活性。结果如图3所示。根据实验结果，AzCpf1与DBCO-CrRNA在4℃，3小时内可以实现几乎完全的共价偶连，同时偶连后核糖核蛋白复合物的体外活性并未受到影响，证明非天然氨基酸AeF的插入及偶连CrRNA并不影响AsCpf1蛋白对双链DNA的识别以及切割活性。将定点偶连CrRNA后的Cpf1-CrRNA复合物命名为cCpf1(conjugated Cpf1)。

实施例4：定点偶联cCpf1的体内基因编辑效率评价

本发明人选取了四种不同的细胞系以及多种靶基因对定点偶连cCpf1的体内基因效率进行了评估。

1)293T细胞的体内基因编辑效率评价，以293T-EGFP-Teton作为报告细胞系进行评价，具体过程如下：

首先在体外制备cCpf1复合物，按照Cpf1:CrRNA摩尔比为1:1.2(60pmol:72pmol)进行RNP复合物的制备，将Cpf1蛋白与CrRNA在室温孵育5分钟后，置于4℃反应3小时以制备cCpf1，反应结束后用于细胞电转，同法制备野生型WT Cpf1复合物作为对照。将贴壁293T细胞吸去培养基，用PBS洗一次后用胰酶进行消化，用培养基终止消化后悬浮计数。取1×10⁶个细胞，用20μL电转缓冲液(Celetrix，使用前将A液和B液等比例混合后使用)悬浮，将RNP与细胞混合后缓缓加入20μL电击杯中，按照优化的参数(420V，30ms，1pulse)进行电击，电击结束后，迅速将细胞加入已预热的DMEM培养基中，放入培养箱中进行培养(37℃，5％CO₂)。24小时后，加入终浓度为10μg/ml的多西环素盐酸盐溶液。48小时后，将细胞消化悬浮，PBS洗一次后进行流式分析。编辑后的细胞由于EGFP基因被切割破坏，无法在DOX的诱导下产生EGFP荧光，而未发生编辑的细胞可以产生荧光，对流式结果进行分析后结果如图4中A所示，表明偶联后cCpf1相较于WT Cpf1可将EGFP的切割效率由～20％提升至～70％。

2)K562细胞的体内基因编辑效率评价，靶向内源基因hHPRT1基因座进行编辑，具体过程如下：

首先在体外制备cCpf1复合物，按照Cpf1:CrRNA摩尔比为1:1.2(60pmol:72pmol)进行RNP复合物的制备，将Cpf1蛋白与CrRNA在室温孵育5分钟后，置于4℃反应3小时以制备cCpf1，反应结束后用于细胞电转，同法制备野生型WT Cpf1复合物作为对照。对K562细胞进行计数，取1.5×10⁶个细胞，用20μL电转缓冲液(Celetrix，使用前将A液和B液等比例混合后使用)悬浮，将RNP与细胞混合后缓缓加入20μL电击杯中，按照优化的参数(380V，30ms，1pulse)进行电击，电击结束后，迅速将细胞加入已预热的RPMI-1640培养基中，放入培养箱中进行培养(37℃，5％CO₂)。48小时后收集细胞，使用细胞基因组提取试剂盒(诺唯赞)进行细胞基因组提取。之后以所提取基因组为模板，通过PCR扩增得到含靶位点的基因座片段，进而通过T7E1的方式检测基因编辑效率。取200ngPCR产物片段于T7E1 reaction buffer(诺唯赞)中进行梯度退火，程序如表2所示，退火结束后加入T7E1酶，在37℃孵育30分钟后通过琼脂糖凝胶检测切割条带，通过凝胶定量软件Tanon Gis对切割条带进行计算分析。结果如图4中B所示，表明偶联后cCpf1相较于WT Cpf1可将基因组切割效率由～10％提升至44％，对于白血病展现出更大的治疗潜力。基因编辑效率＝100×(1-切割条带DNA量/泳道总DNA量)。所用CrRNA的序列与基因组PCR所用引物如下所示：

表7

名称	序列(5’-3’)
		hHPRT1 CrRNA	gguuaaagaugguuaaaugau
Geno-hHPRT1-FW	catggtacactcagcacggatgaaatg
		Geno-hHPRT1-RV	gctgttcaactatttcagccaacaagaagtg

3)jurkat细胞的体内基因编辑效率评价，同为靶向内源基因hHPRT1基因座进行编辑，具体过程除电转条件(jurkat细胞电转条件为400V，30ms，1pulse)不同外，其余与K562细胞电转过程相同。对jurkat细胞的体内基因编辑效率评价结果如图4中C所示，表明偶联后cCpf1相较于WT Cpf1显示出两倍的编辑效率，对于高效制备T细胞展示出更佳的潜力。

4)NIH-3T3细胞的体内基因编辑效率评价，靶向内源基因mHPRT1基因座进行编辑，具体过程如下：

首先在体外制备cCpf1复合物，按照Cpf1:CrRNA摩尔比为1:1.2(60pmol:72pmol)进行RNP复合物的制备，将Cpf1蛋白与CrRNA在室温孵育5分钟后，置于4℃反应3小时以制备cCpf1，反应结束后用于细胞电转，同法制备野生型WT Cpf1复合物作为对照。将贴壁NIH-3T3细胞吸去培养基，用PBS洗一次后用胰酶进行消化，用培养基终止消化后悬浮计数。取1×10⁶个细胞，用20μL电转缓冲液(Celetrix，使用前将A液和B液等比例混合后使用)悬浮，将RNP与细胞混合后缓缓加入20μL电击杯中，按照优化的参数(400V，30ms，1pulse)进行电击，电击结束后，迅速将细胞加入已预热的DMEM培养基中，放入培养箱中进行培养(37℃，5％CO₂)。48小时后收集细胞，使用细胞基因组提取试剂盒(诺唯赞)进行细胞基因组提取。按照步骤2)进行基因组编辑效率的检测与评价，结果如图4中D所示，可将编辑效率由～8％提升至～25％。所用CrRNA的序列与基因组PCR所用引物如下所示：

表8

名称	序列(5’-3’)
		Mouse HPRT1 CrRNA	ggauguuaagagucccuaucu
Geno-mHPRT1-FW	gttcaattcccagcaaccacatgttg
		Geno-mHPRT1-RV	gtatacacaaaatctcaccacaattcacacagag

实施例5：定点偶联cCpf1的体内脱靶效率评估

本发明采用目前比较公认的Guide-seq的策略及近些年报道的PEM-seq的策略对CRISPR/cCpf1系统基因编辑进行安全性的评估。其中Guide-seq由鼓润医疗有限公司进行评价，通过加入dsODN通过同源重组进行基因编辑切割位点的示踪，并且利用dsODN特异性扩增实现切割位点的富集，利用二代测序平台实现切割位点的识别，进而分析靶位点与脱靶位点的位置和数量。脱靶测序结果如图5中A所示，可以看到野生型Cpf1的能够在靶序列检测到了1359个编辑位点，同时产生了一个脱靶位点，而在偶联cCpf1组中，其在靶序列检测到了2816个编辑位点，同时并没有检测到脱靶位点的产生，表明cCpf1系统可以提高基因编辑效率同时不会产生额外的脱靶效应。

为了进一步检测CRISPR/cCpf1可能产生的染色体重排或者额外的大片段缺失，发明人采用PEM-Seq的技术方案对切割进行测试，用特定引物对序列进行扩增，其扩增引物如下，进而通过二代测序平台进行测序。脱靶测序结果如图5中B所示，使用野生型Cpf1和cCpf1的均会检测到1个位点的脱靶，并没有检测到额外的大片的删除插入或者缺失，表明了cCpf1系统的安全性和有效性。

实施例6：定点偶联crRNA的AsCpf1在细胞内进行同源重组水平的评价

本例通过对人源细胞内保守基因HPRT基因进行切割，在切割位点处引入含有左右各40bp同源臂6个bp特定序列，该序列为EcoR1特异性识别位点，如果成功实现基因编辑并且发生精准同源重组可以通过基因组特异性扩增对应片段，进而进行片段酶切评价。EcoR1切割的效率可以直接反应同源重组的水平。具体操作如下，使用40/60pmol AsCpf1蛋白与对应的crRNA(1.2倍当量)在体外孵育10分钟形成RNP后，置于4度反应3小时后，加入0.6倍当量的单链供体DNA形成复合物进行后续的转染。转染使用的是CTX-1500A LE型号电转仪，根据说明书按照buffer A及B等比例混合配置，对于单次反应使用20ul电转buffer重悬1*10⁶个细胞，将预先配置好的偶联复合物加入到细胞悬液中进行电转，电转条件为420V30ms，电转后立刻将细胞吸出置于预热的DMEM培养基中继续培养48h。在转染后48小时，将细胞收集，使用诺唯赞公司提供的基因组提取试剂盒提取细胞基因组，对目标区域进行PCR扩增后，扩增得到的产物使用Cycle pure纯化试剂盒纯化后进行定量。同源重组效率的评价利用酶切进行鉴定，具体操作如下，按照PCR产物200ng/反应进行加样，酶切体系为10ul，加入1ul CutSmart溶液，200ng模板及1ulEcoRI-HF酶，用水补齐至10ul，在37度反应1h后使用1％琼脂糖凝胶电泳进行产物的鉴定，并对条带进行定量分析。结果如图6所示，在40pmol及60pmol的RNP切割浓度下均可以看到偶联组(cCpf1)能够显著提高7-8倍同源重组效率，证明了发明人所创立的这套RNP上定点偶联crRNA方法确实可以提高基因编辑中的同源重组修复效率。

在本例中所用的核酸序列如下表所示：

表9

实施例7：定点偶联cCpf1联合AAV制备CAR-Jurkat细胞及其细胞水平评价

本发明采用Jurkat细胞电转的方式靶向TRAC基因座进行编辑，随后将anti-CD19CAR通过腺相关病毒(血清型6)进行递送，从而在TRAC基因座实现CAR基因的定点整合与敲入。具体过程如下：

1：腺相关病毒的生产及纯化

本发明中所用整合递送的CAR基因序列如SEQ ID NO.4所示。其中小写下划线为TRAC基因的同源臂，便于定点整合；小写粗体为SFFV promoter以启动CAR基因的表达；大写粗体为Myc-tag，便于对CAR基因的表达进行检测；小写斜体为bGH polyA信号；大写部分为anti-CD19 CAR的基因序列。该基因序列由安徽通用生物公司合成，之后通过PCR引物在末端引入限制性内切酶酶切位点5’MluI与3’RsrII，通过酶切连接连入pAAV-MCS载体中得到质粒pAAV-SFFV-CD19CAR用于腺相关病毒的包装。病毒包装辅助质粒pAAV-RC6及pAAV-helper购自丰晖生物公司。用于病毒包装的AAV-293细胞系购自南京赛泓瑞生物科技有限公司。pAAV-SFFV-CD19CAR质粒构建所用引物如下所示：

表10

名称	序列(5’-3’)
		Mlu1-FW	ccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtgatgtaaggagctgctgtgacttgc
RsrII-RV	cactaggggttcctgcggccgctcggtccggtgggttaatgagtgactgcgtgag

将pAAV-SFFV-CD19CAR，pAAV-RC6，pAAV-helper以质量比1:1:1利用PEI共同转染AAV-293细胞，转染后72小时收集病毒，病毒纯化及titer由Vigene Biosciences完成，命名为AAV-CD19-CAR。

2：CAR-jurkat细胞的制备

首先在体外制备cCpf1复合物，按照Cpf1:CrRNA摩尔比为1:1.2进行RNP复合物的制备，将Cpf1蛋白与CrRNA在室温孵育5分钟后，置于4℃反应3小时以制备cCpf1，反应结束后用于细胞电转，同法制备野生型WT Cpf1复合物作为对照。对jurkat细胞进行计数，取1.5×10⁶个细胞，用20μL电转缓冲液(Celetrix，使用前将A液和B液等比例混合后使用)悬浮，将RNP与细胞混合后缓缓加入20μL电击杯中，按照优化的参数(400V，30ms，1pulse)进行电击，电击结束后，迅速将细胞加入已预热的RPMI-1640培养基中，放入培养箱中进行培养(37℃，5％CO₂)。电转4小时后将AAV-CD19-CAR以MOI＝1×10⁶加入培养基中感染jurkat细胞。电转48小时后可收集细胞，提取基因组，利用之前所述T7E1的方法检测TRAC靶位点的基因敲除效率。

3：CAR-jurkat细胞的制备效率评价

电转后5天，收集所制备的CAR-jurkat细胞用于流式检测以评价CAR-jurkat细胞的制备效率。具体过程如下：

1)取1×10⁶个细胞收集至1.5ml Ep管中用于检测；

2)离心去除细胞培养基，PBS洗一次后用200μL PBS+2％FBS将细胞重悬，4℃封闭1小时以减少非特异性结合；

3)封闭结束后离心，将细胞用100μL PBS+1％FBS重悬，按照1:100稀释加入c-Mycmouse monoclonal antibody(Invitrogen)，4℃孵育1.5小时，使一抗与myc标签孵育结合；

4)一抗孵育结束后，将细胞用PBS洗两次，尽量去除残留抗体，随后以100μL PBS重悬细胞，按照1:1000稀释加入Anti-mouse IgG(H+L),F(ab')2Fragment(Alexa

647Conjugate)(Cell Signaling Technology)，4℃避光孵育30分钟，使二抗与一抗结合；

5)二抗孵育结束后，将细胞用PBS洗两次，尽量去除残留二抗以降低荧光背景，之后以100μL PBS重悬细胞；

5)使用六激光流式细胞仪(CytoFLEX LX Flow Cytometer)进行检测，检测通道为R660-APC，使用分析软件CytExpert对结果进行分析。

流式分析结果如图7所示，结果表明与WT Cpf1组相比，cCpf1均显示出CAR-jurkat细胞制备效率的提高，且在电转60pmol RNP时便具有高达80％的制备效率。实验中所用靶向TRAC基因的CrRNA序列以及基因组PCR引物如下所示：

表11

名称	序列(5’-3’)
		Human TRAC CrRNA	gagtctctcagctggtacac
Geno-TRAC-FW	cgagcagctggtttctaagatgc
		Geno-TRAC-RV	ctggactgccagaacaaggc

实施例8：定点基因整合CAR-Jurkat基因水平整合效率评价

本发明采用In-Out PCR的方式对TRAC基因座中CAR定点整合的效率进行半定量评价。具体过程如下：

1：In-Out PCR引物设计

针对TRAC基因座的整合设计三条特异性引物TRAC-1st-FW，CART-PCR-FW，TRAC-2st-RV，其中引物TRAC-1st-FW与TRAC基因座5’端同源臂结合，引物CART-PCR-FW与定点整合的CAR基因结合，引物TRAC-2st-RV与TRAC基因座3’端的同源臂结合。In-Out PCR中所用PCR引物序列如下所示：

表12

名称	序列(5’-3’)
		TRAC-1st-FW	cccttgtccatcactggcat
CART-PCR-FW	ggagtacgacgtgctggataag
		TRAC-2st-RV	gcacacccctcatctgactt

2：基因水平整合效率评价

取实施例7步骤3中电转5天后的jurkat细胞，使用基因组提取试剂盒(诺唯赞)提取细胞基因组，以基因组DNA为模板，将三条引物混合于同一管PCR反应液中进行PCR反应。若未发生定点整合，则仅有由引物TRAC-1st-FW、TRAC-2st-RV扩增所得的长度为843bp的条带；若部分定点整合，则分别存在由引物TRAC-1st-FW、TRAC-2st-RV扩增所得的长度为843bp的条带，及由引物CART-PCR-FW、TRAC-2st-RV扩增所得的长度为1278bp的条带。PCR反应体系如表13所示。

表13 In-Out PCR反应体系

基因组模板	50ng
		引物TRAC-1st-FW	1.5μL
引物CART-PCR-FW	1.5μL
		引物TRAC-2st-RV	1.5μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix(TOYOBO)	25μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50μL

PCR反应结束后用1％琼脂糖凝胶按照150V,20min的条件进行电泳，随后用凝胶定量软件TanonGis对PCR条带进行分析定量，结果如图8所示，表明cCpf1组比野生型Cpf1组具有更高的基因水平整合效率，且在30pmol RNP(低剂量)时，偶联复合物cCpf1即具有与高剂量组相当的基因水平整合效率，具有更佳的CAR-jurkat细胞制备潜力。

实施例9：定点偶联cCpf1联合AAV制备CAR-T细胞及其细胞水平评价

在实施例7和8中已经验证了cCpf1联合AAV在制备CAR-jurkat细胞中具有较高的制备效率，随后在制备CAR-T细胞中验证该方法的制备效果，具体过程如下：

1：PBMC细胞的分离培养

使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)对外周血中单核淋巴细胞进行分离，按照说明书进行操作，首先将血样与平衡盐溶液按照体积比1:1混合对血样进行稀释，在15ml管中加入3ml Ficoll-Paque PLUS铺底，小心在上层加入稀释后血样。按照400×g，30min，20℃进行梯度离心，随后小心吸走血浆层后转移单核细胞层到新的离心管中，加入平衡盐溶液洗两次后，重悬于T细胞分离缓冲液(不含钙离子和镁离子的PBS+0.1％BSA+2mMEDTA)中进行下一步操作

2：原代T细胞的分离

使用Dynabeads^TM Untouched^TM Human T Cells Kit(Invitrogen)从步骤1所分离的PBMC中分离原代T细胞，具体过程如下：

1)取500μL PBMC(≤5×10⁷个细胞)转移至15ml管中；

2)加入100μL热失活的胎牛血清，混匀，以减少抗体的非特异性结合；

3)加入100μL antibody-mix，混匀后4℃孵育20min；

4)加入4ml步骤1中所述的T细胞分离缓冲液，混匀后，按照350×g，4℃，8min条件进行离心；

5)以500μL T细胞分离缓冲液重悬细胞，加入500μL预先使用T细胞分离缓冲液洗涤的Dynabeads，混匀后室温孵育15min；

6)加入4ml T细胞分离缓冲液，混匀后将离心管置于磁力架上，静置2分钟，将上清转移至新的离心管中，即为分离后的原代T细胞。

3：原代T细胞的刺激培养

使用XYbeads Human CD3/CD28 T Cell Activator(SAILY BIO)对原代T细胞进行刺激培养。将步骤2中所分离的原代T细胞计数，离心后去除T细胞分离缓冲液，使用T细胞培养基(X-VIVO+10％热失活FBS+30U/ml IL-2+5ng/ml IL-7+5ng/ml IL-15+1％ps)将细胞重悬至密度为8×10⁵个细胞/ml，置于六孔细胞培养板中进行培养。按照细胞数：磁珠数为1:1向细胞中加入预先用T细胞培养基清洗的CD3/CD28磁珠，置于细胞培养箱(37℃。5％CO₂)中进行培养。

4：CAR-T细胞的制备

与CAR-jurkat细胞的制备类似，首先在体外制备cCpf1复合物，按照Cpf1:CrRNA摩尔比为1:1.2(30pmol:42pmol)进行RNP复合物的制备，将Cpf1蛋白与CrRNA在室温孵育5分钟后，置于4℃反应3小时以制备cCpf1，反应结束后用于细胞电转，同法制备野生型WT Cpf1复合物作为对照。取刺激后第三天的T细胞进行电转，首先将T细胞重悬置于15ml离心管中，用磁力架去除培养液中的磁珠，该过程重复一次以确保磁珠去除完全，将磁珠用PBS清洗完全后保存于4℃备用。对原代T细胞进行计数，取1.5×10⁶个细胞，用20μL电转缓冲液(Celetrix，使用前将A液和B液等比例混合后使用)悬浮，将RNP与细胞混合后缓缓加入20μL电击杯中，按照优化的参数(420V，20ms，1pulse)进行电击，电击结束后，迅速将细胞加入已预热的T细胞培养基中，放入培养箱中进行培养(37℃，5％CO₂)。电转4小时后将AAV-CD19-CAR以MOI＝1×10⁶加入培养基中感染T细胞。电转24小时后，对T细胞的电转存活率以及细胞密度进行记录，将之前留存备用的CD3/CD28磁珠以细胞数：磁珠数＝1:1的条件加入电转后的T细胞中，对T细胞进行再刺激培养。电转48小时后可收集细胞，提取基因组，利用之前所述T7E1的方法检测TRAC靶位点的基因敲除效率。

5：CAR-T细胞的制备评价

电转后5天，收集所制备的CAR-T细胞用于流式检测以评价CAR-T细胞的制备效率。具体过程如下：

1)取1×10⁶个细胞收集至1.5ml Ep管中，用磁力架将培养液中的磁珠去除完全以免影响流式检测；

2)离心去除细胞培养基，PBS洗一次后用200μL PBS+2％FBS将细胞重悬，4℃封闭1小时以减少非特异性结合；

3)封闭结束后离心，将细胞用100μL PBS+1％FBS重悬，按照1:100稀释加入c-Mycmouse monoclonal antibody(Invitrogen)，4℃孵育1.5小时，使一抗与myc标签孵育结合；

4)一抗孵育结束后，将细胞用PBS洗两次，尽量去除残留抗体，随后以100μL PBS重悬细胞，按照1:1000稀释加入Anti-mouse IgG(H+L),F(ab')2Fragment(Alexa

647Conjugate)(Cell Signaling Technology)，4℃避光孵育30分钟，使二抗与一抗结合；

5)二抗孵育结束后，将细胞用PBS洗两次，尽量去除残留二抗以降低荧光背景，之后以100μL PBS重悬细胞；

5)使用六激光流式细胞仪(CytoFLEX LX Flow Cytometer)进行检测，检测通道为R660-APC，使用分析软件CytExpert对结果进行分析。

流式分析结果如图9B所示，cCpf1组相较于野生型Cpf1组可将CAR-T细胞的制备效率由30％提升至53％，后续对所制备的CAR-T细胞的免疫学功能进行了评价。

实施例10：定点偶联cCpf1联合AAV制备CAR-T细胞的免疫学评价

本发明使用CD19阳性的NALM6(成人B型急性淋巴细胞白血病细胞株)来检测所制备CAR-T细胞的靶向杀伤功能以及杀伤性细胞因子的分泌。使用LDH检测试剂盒LDH-Glo^TMCytotoxicity Assay(Promega)来检测NALM6细胞死亡后培养基中乳酸脱氢酶LDH的释放，使用ELISA检测试剂盒(Invitrogen)对CAR-T细胞所分泌的细胞因子干扰素γ(IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行检测，具体过程如下：

取所制备的CAR-T细胞，用RPMI-1640细胞培养基(NALM-6细胞培养所用培养基)将细胞洗两次备用。分别对CAR-T细胞与NALM-6细胞进行计数，将两种细胞在96孔板中按照1:10进行共孵育，即每孔中加入1×10⁴个NALM-6细胞与1×10⁵个CAR-T细胞，以未进行CAR改造的T细胞为对照，每个孵育组设置三个复孔平行。在37℃培养箱中孵育24-48小时后，离心取培养基上清进行LDH以及ELISA的检测。

1：LDH的释放检测

取培养基上清用LDH储存缓冲液(200mM Tris-HCl,pH7.3+10％甘油+1％BSA)进行1:100稀释，取其中50μL加入96孔板中进行检测。按照96孔板中每个反应使用50μL Enzymemix及0.25μL检测底物配制LDH检测试剂，加入待检测样品中，室温孵育60min后用酶标仪检测化学发光，整合时间为1ms。细胞杀伤效率＝100×(实验组LDH释放量-培养基背景)/(对照组LDH释放量-培养基背景)，对CAR-T细胞的细胞毒性分析结果如图10A所示，野生型Cpf1组所制备的CAR-T细胞的细胞杀伤效率为24.5％，而本发明人所发展的偶连复合物cCpf1组所制备的CAR-T细胞的细胞杀伤效率为42.5％。

2：细胞因子IFN-γ及TNF-α分泌检测

本实验中使用Human IFN gamma Uncoated ELISA kit(Invitrogen)及Human TNFalpha Uncoated ELISA kit(Invitrogen)分别对共孵育后培养基上清中IFN-γ及TNF-α的含量进行检测，根据标准曲线进行培养基中细胞因子含量的定量。实验结果如图10B和图10C所示，可以看出与WT Cpf1组相比，cCpf1组的IFN-γ及TNF-α释放量分别提升了2倍和1.5倍。

实施例11：基于cCpf1的多位点敲除CAR-T细胞的评价

本发明人利用cCpf1系统对T细胞的TRAC，β2M，PD1，CTLA4四个位点同时进行了敲除，同时在TRAC位点利用AAV递送实现CAR基因的定点整合，成功制备了可以打破免疫抑制同时定点敲入CAR基因的通用型T细胞，结果如图11所示，可以看出cCpf1组在双位点编辑、三位点编辑以及四位点编辑中与野生型相比均表现出较高的编辑效率。

具体评价过程如下：

1：靶向不同位点的RNP复合物的制备

将靶向不同位点的RNP复合物分别反应制备，按照Cpf1:CrRNA摩尔比为1:1.2进行RNP复合物的制备，将Cpf1蛋白与CrRNA在室温孵育5分钟后，置于4℃反应3小时以制备cCpf1，同法制备野生型WT Cpf1复合物作为对照。

2：多重基因编辑的CAR-T细胞的制备

与实施例8步骤4中CAR-T细胞的制备过程类似，取1.5×10⁶个细胞，用20μL电转缓冲液(Celetrix，使用前将A液和B液等比例混合后使用)悬浮，分别取不同多重基因编辑组合中的RNP混合，随后将总RNP与细胞混合后缓缓加入20μL电击杯中，按照优化的参数(420V，20ms，1pulse)进行电击，电击结束后，迅速将细胞加入已预热的T细胞培养基中，放入培养箱中进行培养(37℃，5％CO₂)。电转4小时后将AAV-CD19-CAR以MOI＝1×10⁶加入培养基中感染T细胞。电转24小时后，对T细胞的电转存活率以及细胞密度进行记录，将之前留存备用的CD3/CD28磁珠以细胞数：磁珠数＝1:1的条件加入电转后的T细胞中，对T细胞进行再刺激培养。电转48小时后可收集细胞，提取基因组，利用之前所述T7E1的方法检测TRAC靶位点的基因水平敲除效率。实验中所用靶向β2M，PD1，CTLA4基因的CrRNA序列以及基因组PCR引物如下所示：

表14

名称	序列(5’-3’)
		Human β2M CrRNA	ccgatattcctcaggtactc
Human PD1 CrRNA	gcacgaagctctccgatgtg
		Human CTLA4 CrRNA	cctggagatgcatactcacacac
IVD-β2M-FW	gaggaattatgagggaaagataccaagtcacgg
		IVD-β2M-RV	caaaggcctataccttcttgagatgttcgttcag
IVD-PD1-FW	cagcagagacttctcaatgacattccagc
		IVD-PD1-RV	ggacagagatgccggtcaccattc
IVD-CLTA4-FW	gctggaaaacagttgagagatggaggg
		IVD-CLTA4-RV	catgatggttagcactccagagcgag

3：多重基因编辑T细胞的评价

在步骤2中电转5天后的T细胞，通过流式检测编辑后T细胞的β2M，PD1，CTLA4蛋白表达水平，以此表征T细胞多重基因编辑的效率。首先取2×10⁶个细胞收集至1.5ml Ep管中，用磁力架将培养液中的磁珠去除完全以免影响流式检测，将细胞分为两份，一份用于检测基因敲除效率，另一份用于检测CAR的定点敲入效率。检测CAR定点整合效率使用myc标签染色的方法进行，如实施例8步骤5所述，在此不再描述。基因敲除效率的流式检测过程如下：

1)离心去除细胞培养基，PBS洗一次后用200μL PBS+2％FBS将细胞重悬，4℃封闭1小时以减少非特异性结合；

2)封闭结束后离心，将细胞用80μL PBS+1％FBS重悬，分别加入5μL APC anti-human CD3(Biolegend)，5μL FITC anti-humanβ2-microglobulin(Biolegend)，5μL PEanti-human CD279(Biolegend)，5μL PE/Cyanine7 anti-human CD152(Biolegend),约100μL染色体积中含1×10⁶个细胞，4℃避光孵育1小时，使抗体与相应的细胞表面蛋白结合；

4)孵育结束后，将细胞用PBS洗两次，尽量去除残留抗体，之后以100μL PBS重悬细胞；

5)使用六激光流式细胞仪(CytoFLEX LX Flow Cytometer)进行检测，检测通道为B525-FITC，Y585-PE，R660-APC，Y763-PC7，使用分析软件CytExpert对T细胞总敲除效率进行分析，如四位点基因敲除效率＝100×APC-FITC-PE-PY7-的细胞数/总细胞数，其余位点的敲除效率以此类推。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 化学修饰CRISPR/Cpf1复合物的用途

<130> MP21006798

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1342

<212> PRT

<213> AsCpf1(AsCpf1)

<400> 1

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Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp

820 825 830

Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly

835 840 845

Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn

850 855 860

Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu

865 870 875 880

Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile

885 890 895

Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys

900 905 910

Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn

915 920 925

Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

930 935 940

Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys

945 950 955 960

Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile

965 970 975

Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe

980 985 990

Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr

995 1000 1005

Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp Ser

1010 1015 1020

Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro Glu Glu

1025 1030 1035 1040

Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser Arg Thr Asp

1045 1050 1055

Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Arg Ile

1060 1065 1070

Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val Phe Asp Trp Glu Glu

1075 1080 1085

Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu Phe Asn Lys Tyr Gly Ile

1090 1095 1100

Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp

1105 1110 1115 1120

Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln

1125 1130 1135

Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser

1140 1145 1150

Pro Val Lys Asn Ser Asp Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu

1155 1160 1165

Ala Gln Glu Asn Ala Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala

1170 1175 1180

Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys

1185 1190 1195 1200

Ala Glu Asp Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys

1205 1210 1215

Glu Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His Lys Arg Pro Ala

1220 1225 1230

Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Pro Lys

1235 1240 1245

Lys Lys Arg Lys Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His

1250 1255 1260

<210> 4

<211> 3706

<212> DNA

<213> AAV递送供体(AAV Delivery donor)

<400> 4

gatgtaagga gctgctgtga cttgctcaag gccttatatc gagtaaacgg tagtgctggg 60

gcttagacgc aggtgttctg atttatagtt caaaacctct atcaatgaga gagcaatctc 120

ctggtaatgt gatagatttc ccaacttaat gccaacatac cataaacctc ccattctgct 180

aatgcccagc ctaagttggg gagaccactc cagattccaa gatgtacagt ttgctttgct 240

gggccttttt cccatgcctg cctttactct gccagagtta tattgctggg gttttgaaga 300

agatcctatt aaataaaaga ataagcagta ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc 360

ttgagtggca ggccaggcct ggccgtgaac gttcactgaa atcatggcct cttggccaag 420

attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc agtccatcac gagcagctgg tttctaagat 480

gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg acttgccagc cccacagagc cccgcccttg 540

tccatcactg gcatctggac tccagcctgg gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt 600

cctaaccctg atcctcttgt cccacagata tccagaaccc tgaccctgcc gtaacgccat 660

tttgcaaggc atggaaaaat accaaaccaa gaatagagaa gttcagatca agggcgggta 720

catgaaaata gctaacgttg ggccaaacag gatatctgcg gtgagcagtt tcggccccgg 780

cccggggcca agaacagatg gtcaccgcag tttcggcccc ggcccgaggc caagaacaga 840

tggtccccag atatggccca accctcagca gtttcttaag acccatcaga tgtttccagg 900

ctcccccaag gacctgaaat gaccctgcgc cttatttgaa ttaaccaatc agcctgcttc 960

tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgcttcccg agctctataa aagagctcac aacccctcac 1020

tcggcgcgcc agtcctccga cagactgagt cgcccgggtt aattaagcca ccatggccct 1080

gcctgtgacc gcactgctgc tgcccctggc cctgctgctg cacgctgctc gacccgacat 1140

tcagatgact cagacaacaa gctccctgtc cgcctctctg ggcgacagag tgaccatcag 1200

ctgccgggcc tctcaggata tcagcaagta tctgaactgg taccagcaga agcctgacgg 1260

cacagtgaag ctgctgatct atcacacctc cagactgcac tctggagtgc caagcaggtt 1320

cagcggatcc ggatctggca cagactactc cctgaccatc tctaacctgg agcaggagga 1380

tatcgccaca tatttctgtc agcagggcaa tacactgcca tacacctttg gcggcggcac 1440

aaagctggag atcacccggg cagacgcagc accaaccgtg tctatctttc ccccttctag 1500

caacggcgga ggaggatccg gaggaggagg atctggcggc ggcggcagcg aggtgaagct 1560

gcaggagagc ggaccaggcc tggtggcacc cagccagtcc ctgtctgtga catgcaccgt 1620

gtccggcgtg tctctgcctg attacggcgt gtcttggatc aggcagccac caaggaaggg 1680

cctggagtgg ctgggcgtga tctggggcag cgagacaaca tactataata gcgccctgaa 1740

gtccagactg accatcatca aggacaacag caagtcccag gtgttcctga agatgaacag 1800

cctgcagaca gacgataccg ccatctacta ttgcgccaag cactactatt acggcggcag 1860

ctatgccatg gattactggg gccagggcac atccgtgacc gtgtcctcta tcgatgagca 1920

gaagctgatc agcgaggagg atctgaagcc aaccacaacc cctgcaccaa ggcctccaac 1980

accagcacct accatcgcct ctcagcctct gagcctgcgg cccgaggcct gtaggcccgc 2040

agcaggcggc gccgtgcaca cacgcggcct ggacttcgcc tgcgattttt gggtgctggt 2100

ggtggtggga ggcgtgctgg cctgttattc cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt 2160

ttgggtgcgc agcaagcgga gccggctgct gcactctgac tacatgaaca tgacaccaag 2220

acggcccgga ccaacccgga agcactatca gccttacgcc ccacctaggg atttcgcagc 2280

atatcggtcc aagagaggca ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc cctttatgcg 2340

ccctgtgcag acaacccagg aggaggacgg ctgcagctgt cggttcccag aggaggagga 2400

gggaggatgt gagctgcgcg tgaagttttc tcggagcgcc gatgcacctg catatcagca 2460

gggacagaat cagctgtaca acgagctgaa tctgggcagg cgcgaggagt acgacgtgct 2520

ggataagagg agaggccggg accccgagat gggaggcaag cctaggcgca agaacccaca 2580

ggagggcctg tataatgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg 2640

catgaaggga gagcggagaa ggggcaaggg acacgatggc ctgtatcagg gcctgtccac 2700

agccaccaag gacacctacg atgccctgca catgcaggcc ctgccaccaa ggtaagaatt 2760

ctgcagatat ccagcacagt ggcggccgct cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg 2820

atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 2880

ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 2940

atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 3000

gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggtaaa 3060

tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa 3120

agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac aaaactgtgc tagacatgag gtctatggac 3180

ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc 3240

ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc ttcttcccca gcccaggtaa gggcagcttt 3300

ggtgccttcg caggctgttt ccttgcttca ggaatggcca ggttctgccc agagctctgg 3360

tcaatgatgt ctaaaactcc tctgattggt ggtctcggcc ttatccattg ccaccaaaac 3420

cctcttttta ctaagaaaca gtgagccttg ttctggcagt ccagagaatg acacgggaaa 3480

aaagcagatg aagagaaggt ggcaggagag ggcacgtggc ccagcctcag tctctccaac 3540

tgagttcctg cctgcctgcc tttgctcaga ctgtttgccc cttactgctc ttctaggcct 3600

cattctaagc cccttctcca agttgcctct ccttatttct ccctgtctgc caaaaaatct 3660

ttcccagctc actaagtcag tctcacgcag tcactcatta acccac 3706

Claims (10)

1.化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物在细胞的基因编辑中的应用; 所述化学修饰CRISPR/Cpf1复合物由Cpf1家族蛋白和DBCO修饰的crRNA制得；其中，Cpf1家族蛋白为AsCpf1且其M806位点为AeF，所述AsCpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为干细胞、胚胎细胞、体细胞和/或免疫细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞为NIH-3T3细胞、293T细胞、K562细胞、Jurkat细胞、T细胞、NK细胞或Macrophage细胞。

4.一种非治疗目的的细胞的基因编辑方法，其包括：将权利要求1所述的化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物转化入细胞中，经培养获得基因编辑的细胞；所述化学修饰CRISPR/Cpf1复合物由Cpf1家族蛋白和DBCO修饰的crRNA制得；其中，Cpf1家族蛋白为AsCpf1且其M806位点为AeF，所述AsCpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求4所述的基因编辑方法，其特征在于，所述转化的方法为电转化或者化学转化。

6.根据权利要求4或5所述的基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑还联合质粒载体、慢病毒或腺病毒介导的基因转化方法。

7.化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物在制备治疗疾病的药物中的应用；所述化学修饰CRISPR/Cpf1复合物由Cpf1家族蛋白和DBCO修饰的crRNA制得；其中，Cpf1家族蛋白为AsCpf1且其M806位点为AeF，所述AsCpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疾病包括：免疫系统疾病或肿瘤。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述治疗包括：自体细胞治疗或异体细胞治疗。

10.一种治疗疾病的药物，其特征在于，包括化学修饰的CRISPR/Cpf1复合物；

所述化学修饰CRISPR/Cpf1复合物由Cpf1家族蛋白和DBCO修饰的crRNA制得；其中，Cpf1家族蛋白为AsCpf1且其M806位点为AeF，所述AsCpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

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