CN113332281A

CN113332281A - 卫茅碱在抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移中的用途

Info

Publication number: CN113332281A
Application number: CN202110563215.4A
Authority: CN
Inventors: 陈鹏; 喻卓; 沈志强; 张莉; 杨仁华; 蔡乙明; 金浩楠
Original assignee: Kunming Medical University
Current assignee: Kunming Medical University
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明公开了昆明山海棠提取物卫茅碱(Euonymine,TH‑1)在抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移中的用途，属于生物医药技术领域，本发明通过体外培养OX‑LDL诱导血管平滑肌细胞(A7r5)损伤模型，结果证实TH‑1能够抑制A7r5的增殖，同时诱导A7r5的凋亡，为进一步验证TH‑1预防经皮腔内冠状动脉介入治疗术(PCI)后支架内再狭窄(intra‑stent restenosis，ISR)的价值，我们建立临床前猪冠状动脉支架模型，研究结果证实TH‑1涂层支架可有效抑制猪冠状动脉内膜增生，显示出良好的组织相容性和安全性，本发明为TH‑1作为天然来源的药物在制备抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物、药物组合物以及含药材料设备，含药材料设备具体的如药物洗脱支架，以及临床用于防治PCI术后ISR提供理论依据和实验支持。

Description

卫茅碱在抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种卫茅碱在抑制血管平滑肌细胞增殖或迁移中的用途。

背景技术

经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention，PCI) 是目前全球范围内应用最广泛的心肌再灌注疗法，可有效提高冠心病和心肌梗死患者的生存率，改善患者的生存质量。然而，PCI术后由于支架内新生的内膜逐渐增厚演变为不稳定的动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块，导致支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR),甚至可破裂进展为急性心血管不良事件，严重影响患者预后。目前，临床上主要采用药物洗脱支架(drug-eluting stents，DES)来防治ISR。2014年，欧洲心脏病协会指南强调DES是ISR的最佳治疗策略之一。DES是指表面结合有涂层药物的载体支架，在植入病变部位后成为一个药物池，不断向病变局部位释放药物，具有靶向性好、有效治疗时间长、全身副作用小等优点；DES通过与血管壁持续接触，发挥治疗作用，减少ISR 的发生。临床上较为常用的支架涂层药物是紫杉醇(paclitaxel)和雷帕霉素(西罗莫司，sirolimus)及其衍生物等，使再狭窄率显著下降，但仍然存在着内皮愈合延迟，支架内血栓形成增加等问题，严重影响其治疗效果。因此，寻找疗效肯定、不良反应较少的抗ISR的支架涂层药物是十分必要和迫切的。

研究发现PCI术导致的血管内膜损伤可促进平滑肌细胞增殖、迁移，最终引起血管新生内膜形成及重塑而发生血管内再狭窄(ISR)，所以有效抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖，并尽快恢复内皮细胞(ECs)活性及加速其修复是防治ISR的关键。目前就ISR的发生机理，已基本上把VSMCs过度增殖、迁移及凋亡不足致使细胞大量积聚，平衡被破坏，导致细胞增殖-凋亡失衡，从而最终导致新生内膜增生作为引起ISR的主要原因，调节VSMCs增殖与凋亡之间的平衡将有助于治疗再狭窄的发生。

昆明山海棠(Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch)又名火把花、断肠草、紫金皮等，为卫矛科雷公藤属植物，在我国主要分布在云南、贵州、四川等西南地区。研究表明，昆明山海棠中含有生物碱、萜类及其糖苷类化合物等活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗生育及抗移植排斥等药理作用，在临床上长期用于治疗类风湿关节炎、红斑狼疮、慢性肾炎及银屑病等自身免疫性疾病方面。大量研究表明，昆明山海棠(THH)提取物在抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡方面具有良好的效果，而在对针对抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移中的效果目前还未见报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移的药物，以解决背景技术中存在的问题。

为实现以上目的本发明提供一种药物卫矛碱TH-1，其结构如图1所示，该药物可用于在制备抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物、药物组合物以及含药材料设备中的应用。

经研究，THH提取物THW-4能有效抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖，并呈浓度和时间依赖性，提示THW-4有可能有预防经皮冠状动脉腔内成形术后血管再狭窄的作用。为进一步探讨THH在预防ISR方面的潜在价值，本发明研究过程中采用THH根部提取物中另一种有效成分卫茅碱(TH-1)是一种从昆明山海棠根木中提取的活性单体成分，是昆明山海棠中活性最高的雷公藤次碱化合物。我们用卫茅碱作为研究对象，研究其对ox-LDL诱导损伤人血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响，探讨其在防治ISR中的可能机制。

本发明通过建立体外ox-LDL诱导的A7r5损伤模型，结果证实TH-1能够抑制A7r5的增殖，同时诱导VSMCs的凋亡，为进一步验证TH-1预防PCI术后ISR 的价值，建立临床前猪冠状动脉支架模型，将不同剂量的TH-1涂层在支架表面，以雷帕霉素涂层支架为阳性对照组，裸金属支架为阴性对照组，光学相干断层扫描技术(OCT)评估TH-1涂层支架预防PCI术后再狭窄的安全性和有效性，研究结果证实:TH-1涂层支架可有效抑制猪冠状动脉内膜增生，显示出良好的组织相容性和安全性。本发明为TH-1作为天然来源的药物在制备抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物、药物组合物以及含药材料设备，以及临床用于防治PCI 术后ISR提供理论依据和实验支持。

进一步地，卫矛碱TH-1在使用时是可药用盐的形式。

进一步地，所述抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物、药物组合物的药剂剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微胶囊制剂或注射剂。

进一步地，卫矛碱TH-1在制备预防或治疗血管壁增厚和/或管腔狭窄性心脑血管疾病的药物、药物组合物以及含药材料设备中的应用，所述的血管壁增厚和/或管腔狭窄性心脑血管疾病是以平滑肌细胞增殖和/或迁移为病理学基础。

进一步地，所述的血管壁增厚和/或管腔狭窄性心脑血管疾病选自动脉粥样硬化性疾病、血管成形术后再狭窄、高血压、肺动脉高压、糖尿病血管病变引起的疾病。

本发明还提供了一种药物洗脱支架，所述药物洗脱支架的药物涂层中含有如式1所示的卫矛碱TH-1。

优选的，卫矛碱TH-1的用量不小于0.35μg/mm²。本发明提供的使用量为参考使用量，具体的还得结合所应用的动物或人，或疾病的性质，严重程度个体情况等，其给药途径和剂型可以有很大的变化范围。

目前就ISR的发生机理，已基本上把平滑肌细胞过度增殖、迁移及凋亡不足致使细胞大量积聚，平衡被破坏，导致细胞增殖-凋亡失衡，从而最终导致新生内膜增生作为引起ISR的主要原因，调节VSMCs增殖与凋亡之间的平衡将有助于防治ISR的发生。本发明通过体外培养建立OX-LDL诱导损伤血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖模型，结果证实TH-1能够抑制VSMCs的增殖，同时诱导VSMCs 的凋亡。为进一步验证TH-1预防经皮腔内冠状动脉介入治疗术(PCI)后支架内再狭窄(intra-stent restenosis，ISR)的价值，我们建立临床前猪冠状动脉支架模型，研究结果证实TH-1涂层支架可有效抑制猪冠状动脉内膜增生，显示出良好的组织相容性和安全性。本发明为TH-1作为天然来源的药物在制备抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物、药物组合物以及含药材料设备，含药材料设备具体的如药物洗脱支架，以及临床用于防治PCI术后ISR提供理论依据和实验支持。

附图说明

图1为本发明卫茅碱TH-1的化学结构式显示图；

图2卫茅碱TH-1涂层支架可有效抑制猪冠状动脉内膜增生效果图(A,裸金属支架组(Bare Metal Stent group,BMS)，低剂量TH-1涂层支架组，中剂量TH-1涂层支架组可见不同程度的内膜增生，管腔缩小。高剂量TH-1涂层支架组，雷帕霉素涂层支架组(Sirolimus-eluting Stent,SES)未见明显内膜增生.B, OCT测量定量分析结果)。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

卫矛碱TH-1由中国科学院昆明植物研究所提取，纯度99.5％，分子式，C38H47NO18，分子量：805.783。

实施例1：

本发明卫茅碱TH-1抑制VSMCSs增殖及诱导凋亡的实验。

1.大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)的培养和传代

(1)大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)，购自中国科学院昆明动物研究所。将购买所得的A7r5细胞珠转移至细胞间，收集瓶内的原有培养液，加入PBS清洗两次。按原有培养液：新配培养液＝7：3重新加液，在37℃，5％CO2，95％饱和湿度培养箱中培养12h。弃去培养液，加入PBS清洗两次，以原有培养液：新配培养液＝1：1加液培养12h。弃去培养液，加入PBS清洗两次，再以原有培养液：新配培养液＝3：7加液培养12h。弃去培养液，加入PBS清洗两次，最后全部以新配培养液培养细胞。显微镜下观测，取75cm2培养瓶中生长融合密度达80％-90％的A7r5细胞，弃去原有培养液，加入4ml的PBS清洗两次。然后加入 3ml胰酶，置于孵箱中消化3min，取出至显微镜下观察，用手拍打培养瓶，待大部分细胞从长行贴壁细胞转化为圆形悬浮细胞后，加入3ml完全培养液终止消化。摇晃培养瓶，使瓶内液体混合均匀，收集瓶内液体至50ml离心管，随后加入5ml的PBS清洗培养瓶壁，将清洗液一并收集至离心管，1000r，离心5min。弃去上清，加入1ml完全培养液重悬细胞沉淀，按1:2的比例分瓶传代，放于37℃， 5％CO2，95％饱和湿度培养箱中培养，每2天换一次液。

(2)实验分组：

将细胞随机分为8个组

①对照组(control)：正常血管平滑肌细胞(A7r5)

②模型组(model)：ox-LDL+A7r5

③TH-1组：TH-1 25umol/L+ox-LDL+A7r5

④TH-1组：TH-1 50umol/L+ox-LDL+A7r5

⑤TH-1组：TH-1 100umol/L+ox-LDL+A7r5

6)辛伐他汀组：10ug/mL+simvastatin15ng/mL+A7r5

以上各组细胞置于含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM高糖培养基，37℃， 5％CO2、饱和湿度培养箱内培养。

2.CCK-8检测TH-1对OX-LDL诱导的A7r5增殖的影响

取贴壁生长密度达80％-90％的A7r5，加入胰酶将贴壁细胞消化下来，用完全培养基制成3×104个/ml浓度的细胞混悬液，以每孔90ul均匀接种在96孔板上，每组6个复孔。在37℃，5％CO2，95％饱和湿度的CO2培养箱中培养贴壁24h 后，模型组、实验组和阳性对照组给予75mg/L的ox-LDL，10ul/孔，其余组加入 10ul无血清培养基，造模培养24h。弃去原有培养液，实验组和阳性对照组加入含药培养液，实验组分别加入25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L浓度的卫茅碱，阳性对照组加入15umol/L辛伐他汀，正常对照组和模型组加入不含药的培养液，均为100ul每孔。分别培养24h、48h和72h，取出培养板，每孔加入10ul的CCK8 溶液，将培养板重新放回在培养箱内孵育2小时后，用酶标仪测定在450nm处的 OD值结果，按照以下公式计算细胞存活率：

，分析卫茅碱对ox-LDL诱导损伤的A7r5细胞活性的影响。

3.细胞凋亡测定

采用Annexin V-FITC/PI双标记法。将A7r5接种于6孔培养板中，在含有不同浓度的灯盏乙素(25、50、100μmol/L)培养液中孵育56h，收集细胞并用1ml 冷PBS制成1×106细胞悬液，1000r/min，4℃离心10min，弃上清，将细胞重悬于200μL Binding Buffer，加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，轻轻混匀，闭光室温反应15min，加入300μL BindingBuffer，于1h内用流式细胞仪进行检测，以激发波长488nm进行检测FITC和PI荧光。每样本计数20000个细胞，用CELL Quest软件分析细胞凋亡率。

4结果

3.1 TH-1抑制A7r5的增殖

用CCK-8法测量各组光密度(OD)值，OD值反映细胞生长与增殖情况。 OX-LDL模型组OD值与对照组相比明显升高，(P<0.01)，提示OX-LDL可促进A7r5平滑肌细胞的增殖，造模成功，见表1。

表1 CCK-8法检测TH-1对A7r5平滑肌细胞增殖的影响

分组	OD值
		空白对照组	0.634±0.03
模型组	0.865±0.03**

空白对照组与模型组比较，**P<0.01

分别用含有不同浓度(25,50,100μmol/L)TH-1的完全培养液与A7r5平滑肌细胞共同孵育48小时，分析结果显示随着药物浓度的增加细胞存活率逐渐下降，与模型组的差异有显著的统计学意义(P<0.01)，证实灯盏乙素有明显抑制A7r5 平滑肌细胞增殖的作用，见表2。

表2 不同浓度灯盏乙素作用于VSMCs 48h后对细胞存活率的影响

注：各实验组与模型组相比，*表示P<0.05

为测定不同时间点TH-1对A7r5的作用，于加药(25，50,100μmol/L)后的第24、48、72小时进行CCK-8法测定，结果证实各浓度组均具有显著抑制作用(P<0.01)。TH-1对A7r5的存活率的影响随着孵育时间的延长而逐渐下降，至72小时各浓度给药组A7r5的存活率分别达17.8％、9.6％、5.3％，证实TH-1 对A7r5的抑制作用呈浓度和时间依赖性，(表3)。

表3 不同浓度和时间TH-1作用于A7r5后对细胞存活率的影响

注：各实验组与模型组相比，*表示P<0.05

3.2 TH-1诱导A7r5的凋亡

流式细胞术检测不同浓度TH-1处理A7r5细胞48h后发生细胞调亡的变化。 50μmol/L和100μmol/L灯盏乙素处理A7r5 48h后发生晚期调亡的细胞比例分别为7.68土3.22％和22.46土3.63％；正常活细胞的比例分别为82.41土2.43％和 62.56土4.35％，与空白对照组相比，P<0.01，结果有显著的统计学差异；100 μmol/L灯盏乙素处理VSMC 48h后发生早期调亡的细胞比例为8.31土2.92％， P<0.05,有统计学差异，见表4。实验结果提示，TH-1诱导A7r5细胞凋亡，具有潜在的抗ISR作用。

表4 流式细胞术检测TH-1处理A7r5细胞48h细胞凋亡的变化

TH-1	Q1(％)	Q2(％)	Q3(％)	Q4(％)
					Control	0.25±0.05	0.36±0.20	0.90±0.10	93.70±1.29
25μmol/L	0.38±0.40	1.60±1.05**	2.26±1.13	92.80±2.16
					75μmol/L	0.36±0.50	7.68±3.22**	2.85±2.58	83.26±2.43△△
100μmol/L	0.43±0.18	22.46±3.63**	5.91±1.92#	63.65±4.31△△

与空白对照组(Control)相比，#p＜0.05，有统计学差异；*p＜0.01，有显著的统计学差异；^△△p＜0.001，有显著的统计学差异。

实施例2：临床前猪冠状动脉支架模型的建立及OCT评估ISR相关参数

1.临床前猪冠状动脉支架模型的建立

(1)将20头小型猪随机平均分为阴性对照组(bare metal stent,BMS)、TH-1低剂量支架组(0.35μg/mm²)、TH-1中剂量支架组(0.70μg/mm²)、TH-1高剂量支架组(1.4μg/mm²)、阳性对照组(sirolimus-eluting stent,SES)，并记录小型猪身上所标记的数码。

(2)冠脉造影及支架植入术冠脉造影

实验动物全麻后通过右股动脉或左股动脉途径行左、右冠状动脉造影，于前降支(left anterior descending branch,LAD)、右冠状动脉(right coronary artery,RCA)或回旋支(left circumflex,LCX)分别置入同一类型支架各一枚，支架血管直径比率为1.1-1.2:1，应用OCT技术观察支架贴壁情况，同时行光学相干断层扫描(OCT)，测量新生内膜厚度、支架内面积、管腔面积，新生内膜面积、计算狭窄程度＝新生内膜面积/内弹力膜截面积)，比较各实验组上述指标28天时有无统计学差异。

2.观察终点行OCT检查并评估ISR相关参数

OCT检查：术前准备基本与前期冠状动脉支架置入术相同，经股动脉穿剌后送入6F动脉鞘管，并将6F导引导管经造影导丝送至冠状动脉口行冠脉造影，经多个体位造影粗率评估有无明显狭窄或闭塞。

按支架置入术的方法将BMW或Runthrough导丝送至所置支架冠状动脉远端，将LightLabC7XR 0CT成像系统连接单元(DOC)放在消毒的专用DOC保护罩内，确定绿色指示灯稳定亮起，从包装圈内取出Dragonfly成像导管，取5ml 注射器抽取5ml纯碘佛醇造影剂冲洗歧管排除歧管中所有空气直至导管末端尖端流出3-5滴造影剂，将其白色接头和DOC接头对齐并顺时针旋转1/8周锁紧，绿色指示灯开始闪动时说明DOC内部自动光学对接完成。将Dragonfly成像导管头端轻轻放置在两个手指间，点击start scanning开始扫描，从而获取测试图像来验证校准。OCT成像系统准备完善后，将Dragonfly成像导管沿导丝送至指引导管再次进行校准，在透视仪器的指引下，向前移动导管直至近端标记(镜头标记)位于支架远端10mm处，再次通过歧管注射0.5ml造影剂来清洗Dragonfly 成像导管，用注射泵向血管管腔内注射造影剂冲洗血管管腔排除目标血管的血液，点击开始成像，成像导丝以1.0mm/s速度自动回撤，用视频显示器实时成像，成像速度15.6帧/s，完成整个支架扫描后结束成像。OCT成像及分析通过 C7XR OCT成像系统(圣犹达公司)来完成。

3.结果

支架置入术后28天，OCT评估再狭窄参数的结果

通过OCT连续、全程观察了每枚支架的内膜增殖情况，可见到所有支架金属支撑杆均完全内皮化，无血栓形成。测量最窄处各组(阴性对照组、低剂量 TH-1组、中剂量TH-1组、高剂量TH-1组、阳性对照组)新生内膜厚度，新生内膜面积，管腔残余面积，支架面积，并计算狭窄程度。

3.1 OCT测量各组内膜增生厚度

术后28天测量各实验组内膜厚度，阴性对照组0.49±0.10mm，低剂量TH-1 组0.46±0.02mm，中剂量TH-1组0.30±0.11mm，高剂量TH-1组0.26±0.11mm，阳性对照组0.23±0.05mm。经完全随机设计的方差分析，阴性对照组、低剂量 TH-1组、中剂量TH-1组、高剂量TH-1组、阳性对照组新生内膜厚度差异有统计学意义(P＝0.002)，见表5，图2。

表5 支架置入28天后血管新生内膜厚度

注：和阴性对照组相比,*P<0.05,**P<0.01

3.2 OCT测量各组支架面积

各组支架面积测量平均值为：阴性对照组5.16±0.13mm²，低剂量TH-1组 5.67±0.11mm²，中剂量TH-1组5.41±0.16mm²，高剂量TH-1组5.24±0.22mm²，阳性对照组5.31±0.16mm²；经完全随机设计的方差分析，五组支架面积总体比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表6，图2。

表6 支架置入术后28天各组支架面积

注：各实验组两两比较，P>0.05。

3.3 OCT测量残余管腔面积

各组支架残余管腔面积：阴性对照组3.26±0.11mm²；低剂量TH-1组 3.57±0.12mm²；中剂量TH-1组3.43±0.01mm²；高剂量TH-1组3.89±0.21mm²阳性对照组3.92±0.32mm²；经完全随机设计的方差分析，五组残余管腔面积总体比较差异有统计学意义(P<0.001),见表7，图2。

表7 支架置入术后28天残余管腔面积

注：和阴性对照组相比,*P<0.05,**P<0.01

3.4 OCT测量新生内膜面积

各组新生内膜面积：阴性对照组2.01±0.18mm²，低剂量TH-1组 2.18±0.19mm²，中剂量TH-1组2.17±0.52mm²，高剂量TH-1组1.91±0.42mm²，阳性对照组1.89±0.35mm²,表8，图2。

表8 支架置入术后28天新生内膜面积(mm)

注：和阴性对照组相比,*P<0.05,**P<0.01

OCT提示：和阴性对照组相比，TH-1中、高剂量涂层支架组新生内膜面积及狭窄程度均减小(P<0.05)，且高剂量TH-1涂层支架组和阳性对照组残余管腔面积，均明显大于其他实验组(P<0.05)。同时观测到阴性对照组、TH-1低、中剂量组均见不同程度内膜增生，管腔缩小，高剂量组和阳性对照组未见明显内膜增生,见图2。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.如式1所示的卫矛碱TH-1在制备抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物、药物组合物以及含药材料设备中的应用

2.权利要求1所述的应用，其中卫矛碱TH-1是可药用盐的形式。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物、药物组合物的药剂剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微胶囊制剂或注射剂。

4.如式1所示的卫矛碱TH-1在制备预防或治疗血管壁增厚和/或管腔狭窄性心脑血管疾病的药物、药物组合物以及含药材料设备中的应用，其特征在于，所述的血管壁增厚和/或管腔狭窄性心脑血管疾病是以平滑肌细胞增殖和/或迁移为病理学基础

5.如权利要求4的应用，其特征在于，所述的血管壁增厚和/或管腔狭窄性心脑血管疾病选自动脉粥样硬化性疾病、血管成形术后再狭窄、高血压、肺动脉高压、糖尿病血管病变引起的疾病。

6.一种药物洗脱支架，其特征在于，所述药物洗脱支架的药物涂层中含有如式1所示的卫矛碱TH-1。

7.如权利要求6所述的一种药物洗脱支架，其特征在于，所述药物涂层中卫矛碱TH-1的用量不小于0.35μg/mm²。